DE69433615T2

DE69433615T2 - Präzise Bestimmung von Molekulargewichten

Info

Publication number: DE69433615T2
Application number: DE69433615T
Authority: DE
Inventors: David W. Santa Barbara Shortt
Original assignee: Wyatt Technology LLC
Current assignee: Wyatt Technology LLC
Priority date: 1994-01-27
Filing date: 1994-12-14
Publication date: 2005-03-24
Anticipated expiration: 2014-12-15
Also published as: JPH0835961A; DE69433615D1; JP3580380B2; US5528366A; EP0665433B1; EP0665433A1

Description

Literatur

L. A. Papazian and T.D. Murphy, "Long and short range precision in HPSEC," J. Liq. Chrom. 13 (1), 25–49 (1990)
W. N. Press, B. P. Flannery, S. A. Teukolsky und W. T. Vetterling, Numerical Recipes in C. (Cambridge University Press, Cambrdige, 1988)
John R. Taylor, An Introduction to Error Analysis, (University Science Books, Mill Valley, 1982)
B. H. Zimm, "The scattering of light and the radial distribution function of high polymer solutions," J. Chem. Phys. 16 1093–1099 (1948)
B. N. Zimm und W. N. Stockmayer, "The dimensions of chain molecules containing branches and rings," J. Chem. Phys. 17, 1301–1314 (1949).

Definitionen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, mit dem die Genauigkeit von mitgeteilten Molekulargewichte von chromatographisch getrennten Molekülen abgeschätzt werden kann. Einige der auf dem Gebiet der Chromatographie eingesetzten Spezialbegriffe sind die folgenden:

Der Begriff „Basislinie" bedeutet die relativ flachen Bereiche eines Chromatogramms vor und nach der Elution eines Peaks.
Der Begriff „Kalibrierkurve" bedeutet die Kurve, die traditionell eingesetzt wird, um ein chromatographisches System zu kalibrieren, normalerweise eine Auftragung des Logarithmus des Molekulargewichts gegen das Elutionsvolumen oder die Elutionszeit.
Der Begriff „Chromatogramm" bedeutet einen Graphen eines Detektorsignals gegen das Elutionsvolumen oder die Elutionszeit.
Der Begriff „Chromatograph" bedeutet ein System, welches eine Trennung auf der Grundlage der physikalischen Eigenschaften der Probe durchführt.
Der Begriff „Chromatographie" bedeutet die Auftrennung einer Probe, die ein Materialgemisch enthält, mit einem Verfahren, welches empfindlich ist für bestimmte physikalische Eigenschaften der Materialien. Beispielsweise trennt die größenabhängige Chromatographie (size exclusion chromatography, SEC) Moleküle nach ihrer hydrodynamischen Größe.
Der Begriff „Elutionsvolumen" bedeutet das Lösemittelvolumen, welches seit Injektion der Probe durch den Detektor oder die Detektoren gelaufen ist. Das Elutionsvolumen ist gleich dem Produkt aus Elutionszeit und Flussgeschwindigkeit des Lösemittels.
Der Begriff „mobile Phase" bedeutet das durch das Chromatographiesystem fließende Lösemittel.
Das „Molekulargewicht" eines Moleküls ist die Molekülmasse, gemessen in g/mol. Beispielsweise beträgt das Molekulargewicht des Toluolmoleküls etwa 92 g/mol.
Der Begriff „Polydispersivität" bedeutet das Verhältnis des Gewichtsmittels des Molekulargewichts zum Zahlenmittel des Molekulargewichts. Die Polydispersivität ist stets größer oder gleich 1. Ein Wert von 1 bedeutet eine monodisperse Verteilung (d.h. Gewichts- und Zahlenmittel sind gleich). Polymere können als eng oder breit charakterisiert werden, und zwar in Abhängigkeit davon, ob die Polydispersivität in der Nähe von 1 bzw. weit davon entfernt ist.
Der Begriff „Rayleigh-Verhältnis" bedeutet eine Zahl, die proportional ist zur Menge des von einer Probenlösung unter einem bestimmten Winkel gestreuten Lichtes. Der Begriff „Rayleigh-Überschussverhältnis" bezieht sich auf den Teil des nur von den Lösemittelmolekülen gestreuten Lichts; die Lichtstreuung aufgrund der mobilen Phase ist nicht umfasst.
Der Begriff „Rms-Radius" bedeutet das quadratische Mittel des Radius eines Moleküls. Es ist die Quadratwurzel des mittleren Radiusquadrats und stellt das massengewichtete mittlere Abstandsquadrat der Molekülsegmente vom Mittelpunkt der Molekülmasse dar.
Der Begriff „Scheibe" bedeutet die Daten, die zu einem Zeitpunkt von allen Detektoren (Lichtstreuung und Konzentration) gesammelt werden. Die Daten werden normalerweise zu gleichen Zeitintervallen gesammelt.

Hintergrund
Die Flüssigkeitschromatographie, insbesondere die größenabhängige Hochleistungschromatographie (HPSEC) ist ein geeignetes Werkzeug für die Charakterisierung von Polymeren. Typischerweise werden Proben hergestellt und in einen Chromatographen eingespritzt, wo sie durch Säulen gepumpt werden, die die Moleküle auftrennen. Im Fall der HPSEC werden Moleküle nach ihrer hydrodynamischen Größe aufgetrennt; kleinere Moleküle neigen dazu, länger in den Zwischenräumen der Säulen zu verbleiben und werden deshalb später eluiert als große Moleküle. Historisch gesehen wurden Chromatographen sowie die Trennsäulen und konzentrationsempfindliche Detektoren unter Einsatz von nahezu monodispersen Polymerstandards kalibriert, die einen breiten Bereich des Molekulargewichts (MW) überspannten und diejenigen überbrückten, die in Bezug auf die verarbeiteten und zu analysierenden unbekannten Proben erwartet wurden. Die in der unbekannten Probe vorhandenen MW wurden deshalb durch eine Messung der Zeit erhalten, die die abgetrennten Probenfraktionen benötigten, um durch den Chromatographen zu laufen, und zwar in Bezug auf die entsprechende Zeit der engen Kalibrierungsstandards. Weil die mobile Phase normalerweise mit konstanter Geschwindigkeit durch den Chromatographen gepumpt wird, kann die Laufzeit einer Probe durch das System dargestellt werden in Äquivalenten zum kumulierten Volumen des eluierten Fluids, d.h. des sogenannten Elutionsvolumens.
Kalibrierabhängige Verfahren enthalten eine Reihe von Fehlerquellen, sowohl zufällige als auch systematische Fehler. Zufällige Fehler entstehen durch Verän derung der chromatographischen Bedingungen von Versuch zu Versuch und durch die Unterschiede der Basislinie und des Auftretens der Peaks. Systematische Fehler haben mehrere Ursachen. Zunächst ist die Kalibrierungskurve selbst im Allgemeinen nur eine Annäherung an die Beziehung zwischen dem Logarithmus des MW und dem Elutionsvolumen. Die MW-Werte der Standards enthalten Unsicherheiten, die vielfach durch andere Messungen auf der Grundlage von Kalibrierkurven entstehen. Zweitens führen die konstitutionellen Unterschiede zwischen den Kalibrierstandards und den unbekannten Substanzen zu Elutionszeiten, die, beträchtlich von denen abweichen, von denen erwartet wird, dass sie dem wahren MW der unbekannten Substanzen entsprechen; sie verschlimmern außerdem diese systematischen Fehler und machen ihre Erfassung relativ schwierig. Schließlich werden Abweichungen (Drifts) in Bezug auf die Systemparameter wie Flussgeschwindigkeit und Temperatur bedeutsam, weil selbstverständlich zwischen der Kalibrierung und der Messung etwas Zeit verstreichen wird.
Selbst wenn jedoch die mit Standards erhaltenen Ergebnisse ungenau waren, bildete die Reproduzierbarkeit solcher Messungen eine wichtige Basis für ihre Brauchbarkeit. Wie von Papazian und Murphy in ihrem Artikel im Journal of Liquid Chromatography aus dem Jahr 1990 dargelegt wurden, werden Wiederholungsanalysen der gleichen Probe nach Monaten und selbst Jahren verwendet, um die relativen Ungenauigkeiten der dargestellten Ergebnisse abzuschätzen. Diese Unsicherheiten konnten eingesetzt werden, um die Stabilität der Kalibrierverfahren wie auch den Abbau der Säulen selbst zu bestimmen. Praktisch jede Messung mit HPSEC-Auftrennung von der in der Literatur berichtet wird, präsentiert MW ohne jegliche Abschätzung der Genauigkeit der mitgeteilten Ergebnisse. Softwarepakete, die die gesammelten Daten verarbeiten, präsentieren oft Ergebnisse mit sechs oder mehr signifikanten Stellen, die völlig außer Acht lassen, dass eine solche Genauigkeit unmöglich ist.
Mit dem Aufkommen der Online-Lichtstreudetektoren entfiel die Notwendigkeit einer Kalibrierung, weil ein mit einem Konzentrationsdetektor kombinierter Lichtstreudetektor es gestattete, die MW-Größen und ihre Verteilungen auf absoluter Basis zu bestimmen. Die systemimmanenten Ungenauigkeiten beruhten auf den Kalibrierstandards selbst, die nahezu die gleiche Konstitution wie die analysierten unbekannten Substanzen hatten und beeinflussten die Endergebnisse nicht mehr. Dies beseitigt viele der vorstehend erwähnten systematischen Fehler, es verbleiben jedoch die zufälligen Fehler. Bei Online-Lichtstreumessungen, insbesondere solchen mit vielen Winkeln zur gleichen Zeit, wie z. B. dem System von Lichtstreudetektoren, die von der Wyatt Technology Corp. unter der Marke DAWN hergestellt werden, werden im Allgemeinen so viele Daten erzeugt, dass es natürlich reizt zu fragen, ob die Daten geeignet sind, unmittelbar ein Maß für die Genauigkeit der Daten eines einzigen chromatographischen Laufs zu berechnen. Obwohl solche Datenmengen seit einiger Zeit verfügbar sind, wurde bis jetzt nicht erkannt, dass eine Abschätzung der Genauigkeit möglich ist. Bei unseren Studien vieler dieser Datenmengen wurden deutlich, wie solche kritischen Zahlen erzeugt werden konnten.
Unter normalen Bedingungen gibt jeder Detektor eines Chromatographen ein Signal ab, welches einen Peak oder mehrere Peaks aufweist, die von einer flachen Basislinie ansteigen. 1 zeigt ein Signal eines der Lichtstreudetektoren zusammen mit dem des konzentrationsabhängigen Detektors. Um MW und Rms-Radien für eine solche Scheibe zu berechnen, muss das Verhältnis des Lichtstreusignals für jeden Winkel des Konzentrationssignals berechnet und diese Daten einer Modellfunktion als Funktion des Winkels angepasst werden. Bei geeigneter Skalierung besteht eine Beziehung des Wertes beim Winkel Null (als „Interzept" bezeichnet) mit MW, und es besteht eine Beziehung zwischen der Steilheit zum Interzept beim Winkel Null und dem mittleren Radiusquadrat. Diese Verfahren wurden in der Literatur gründlich entwickelt, beispielsweise in den Aufsätzen von Zimm, welche Anfang 1948 im Journal of Chemical Physics erschienen sind.
Wir betrachten nun insbesondere die vom Chromatographen abgetrennten Moleküle, die bei einem bestimmten Volumen eluiert werden, welches einer bestimmten Scheibe i entspricht. Diese Moleküle sind mit einer Konzentration c_i gelöst, die mit dem konzentrationsempfindlichen Detektor gemessen werden kann. Zusätzlich kann das durch die Moleküle gestreute Licht mit dem Lichtstreudetektor bei einem Satz von Winkeln θ_j gemessen werden. Das von den Molekülen ge streute Licht wird durch Überschuss-Rayleighverhältnisse R(θ_j) beschrieben. Bei hinreichend kleinen Konzentrationen gibt es eine Beziehung zwischen diesen gemessenen Überschuss-Rayleighverhältnissen und dem Gewichtsmittel des Molekulargewichts M_i und dem zweiten Virialkoeffizienten A₂ durch die Gleichung
Die Größe K* ist dabei definiert durch K* = 4π2n0 2(dn/dc)2λ0 –4NA –1 (2)wobei n₀ der Brechungsindex des Lösemittels, dn/dc die spezielle Zunahme des Brechungsindex der Lösung, λ₀ die Vakuumlichtlänge des auffallenden Lichts und N_A die Zahl von Avogadro ist. Der Term P_t(θ) wird als Streufunktion oder Formfaktor der Scheibe i und kann stets als Polynom in sin²(θ/2) geschrieben werden:
wobei <r²>_t der mittlere Quadratradius des an der Scheibe i vorhandenen und über die Verteilung gemittelten mittleren Quadratradius der streuenden Moleküle ist. Wenn bekannt ist, dass die Moleküle eine bestimmte Gestalt aufweisen, kann der Term P_i(θ) in geschlossener Form geschrieben werden. Wenn die Moleküle beispielsweise einer Random-Coil-Verteilung gehorchen wie üblicherweise viele Polymermoleküle, kann die Streufunktion geschrieben werden
wobei
Die Berechnungen können auch mit einer reziproken Form von Gleichung (1) durchgeführt werden, nämlich
Das nachfolgend beschriebene Analysenverfahren betrifft sowohl Gleichung (1) als auch (6).
Lichtstreudetektoren bei sehr kleinen und sehr großen Winkeln sind mitunter unbrauchbar aufgrund des hohen Rauschpegels von Teilchen oder aufgrund von Streulicht. Selbst wenn sie brauchbar sind, weisen diese Detektoren oft höhere Rauschpegel auf als solche mittlerer Winkelbereiche. Dieser Rauschpegel zeigt sich in der Basislinie wie auch bei den Peaks. Der Rauschpegel der Konzentrationsdetektoren ist typischerweise (jedoch nicht immer) kleiner als der von Lichtstreudetektoren.
Idealerweise wäre es sehr wünschenswert, wenn die Unsicherheit des MW und des Rms-Radius jeder Scheibe berechnet werden könnte, von denen mit Standardverfahren der Fehlerfortpflanzung vergleichbare Unsicherheiten für einen gesamten Peak ermittelt werden könnten. Dies ergäbe eine statistische Abschätzung der typischen Variation, die man bei wiederholten Messungen der gleichen Probe erwarten würde. Eine solche Berechnung könnte beträchtlich viel Zeit einsparen und ergäbe auch ein unabhängiges Maß für die Messgenauigkeit. Bedauerlicherweise erfordert die Messung der mit einer einzigen Scheibe verknüpften Ungenauigkeiten, dass mit dem Eluieren jeder Scheibe wiederholte Messungen angestellt werden. Solche Messungen wären über lange Zeiträume zu machen, damit das Sammeln von vielen Werten möglich ist, aus denen mit statistischen Standardverfahren die entsprechenden Standardabweichungen berechnet werden könnten. Jedoch beruht das fundamentale Konzept der chromatographischen Auftrennung auf dem Erfordernis, dass die eluierte Probe in Scheiben un terteilt wird, die jeweils über einen Zeitraum erfolgt, der im Vergleich zur gesamten Probe sehr klein ist. Die Messung einer einzelnen Scheibe kann nicht eingefroren werden, um ihre Fluktuation zu quantifizieren.
Trotz dieser offensichtlichen Widersprüche zeigt unsere Erfindung klar, wie die Messgenauigkeit der chromatographischen Auftrennung nunmehr leicht abgeschätzt werden kann. Obwohl das Verfahren fast ausschließlich auf die Analyse von Daten setzt, die bei der bevorzugten Ausführungsform eines Online-Mehrwinkel-Lichtstreudetektors anfallen, kann unsere Erfindung vom Fachmann mit Sicherheit bei anderen lichtstreuenden Detektorsystemen eingesetzt werden, die einen, zwei, drei oder mehr Winkel für die Messung einsetzen, wie auch für die Messung und für die Genauigkeitsbestimmung von viskosimetrischen Mengen.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 zeigt typische Chromatogramme, die das Lichtstreusignal bei 90 °C zeigen, wobei das Signal des Konzentrationsdetektors überlagert ist. Deutlich sichtbar sind die vorderen und hinteren Basislinienbereiche und der Peak.
2 zeigt eine vergrößerte Ansicht des nachfolgenden Basislinienbereichs 4 von 1, die typisches Rauschen enthält.
Kurzbeschreibung der Erfindung
1 zeigt ein typisches Chromatogramm, welches das Streulicht bei 90° dem Signal 2 des konzentrationsempfindlichen Berechungsindexdetektors gegenüberstellt. Die Probe war ein Polystyrenolstandard mit enger Verteilung und einem MW von etwa 30.000 g pro mol. Die mobile Phase war Toluol, wobei eine Gesamtmenge von 0,2 mg in Gestalt eines Volumens von 100 μl in die Säure eingespritzt wurde. Die relativ flachen Basislinienbereiche 3 und 4 liegen auf jeder Seite des Peakbereichs 5. Die Erfindung beruht auf den folgenden Beobachtungen:
Die Berechnung des Molekulargewichts und nur der Größe verwenden Peakbereich 5, wo das Signal wesentlich größer ist als das Basislinienrauschen, wie in 1 angegeben. Mit anderen Worten enthalten die Basislinienbereiche 3 und 4 keine Information über das MW und die Rms-Radien und werden von der Probe nicht beeinflusst. Die einzigen zum Rauschen der Probe beitragenden Faktoren, die anders sind als die in der mobilen Phase anwesenden, die den Basislinienbereich 3 und 4 entsprechen, sind Aggregate und Agglomerate, die mit der Probe selbst zugeführt werden. Wegen der Auftrennung beim Lauf der Probe durch die chromatographische Säule werden solche störende Fremdkörper im Allgemeinen von der Probe selbst abgetrennt und leisten keinen Beitrag zum Chromatogramm des Peakbereiches.
Weil die mit der Probe eingeführten schädlichen Bestandteile von der Säule entfernt werden, ist das Rauschen in den Basislinienbereichen 3 und 4 ein direktes Maß für dasjenige im Peakbereich 5. Die Anwesenheit der Peak fügt nichts hinzu und zieht nichts davon ab.
Eine geeignete Analyse der Basislinienbereiche liefert die Standardabweichungen der Lichtstreudetektoren eines Mehrfachwinkelgerätes wie auch die Standardabweichungen des Konzentrationsdetektors. Der Basislinienbereich 4 ist in 2 vergrößert gezeigt. Das Lichtstreusignal 1 unter 90° liefert klar den Beweis von Rauschveränderungen, wogegen das Brechungsindexsignal 2 eine geringe Verschiebung (shift) und sehr wenig Rauschen zeigt.
Die Anwendung der Standardabweichungen der Basislinie auf dem Peakbereich 5 erlaubt die Berechung von Standardabweichungen für die Konzentration, MW und den Rms-Radius, und zwar durch statistische Standardverfahren, die als Fehlerfortpflanzung bezeichnet werden. Die Basislinienbereiche 3 und 4 ergeben somit keine Information in Bezug auf die Werte von MW und den Rms-Radius, enthalten jedoch eine Information, aus der die Standardabweichung des MW und des Rms-Radius bestimmt werden können.
Wenn die statistischen Verfahren in Bezug auf das Rauschen einigen vernünftigen Annahmen gehorchen, können die für MW und den Rms-Radius erhaltenen Standardabweichungen als typisch für die Fluktuation angesehen werden, die bei mehreren Durchläufen der gleichen Probe auftreten.
Durch Analyse sowohl der Basislinienbereiche 3 und 4 wie auch des Peakbereichs 5 können deshalb Standardabweichungen für die berechneten Größen erhalten werden. Historisch gesehen wurden die Basislinienbereiche 3 und 4 nur eingesetzt, um die Basislinienwerte zu ermitteln, die von den Daten vor der Analyse zu subtrahieren sind; eine driftende oder rauschende Basislinie zeigte ein Problem im Zusammenhang mit einem Detektor oder mit dem Chromatorgraphen selbst an. Die statistische Signifikanz der Information, die dem Basislinienrauschen innewohnt, wurde bis heute weder beachtet noch für die statistische Analyse eingesetzt.
Unser Verfahren wird nachfolgend detailliert beschrieben; es weist eine Reihe von wichtigen Vorteilen auf, wie zum Beispiel die folgenden:
Das Verfahren erlaubt die Berechnung der Standardabweichungen der Konzentration MW und des Rms-Radius jeder Scheibe einer chromatographischen Eluierung unter Einsatz eines Mehrwinkel-Lichtstreuelements und eines konzentrationsempfindlichen Detektors. Wo nur ein einziger LS-Detektor verfügbar ist, können keine Werte für den Rms-Radius berechnet werden, und die Werte von MW könnten fehlerhaft sein: Jedoch wäre die Genauigkeit der MW-Ergebnisse trotzdem berechenbar.
Das Verfahren erlaubt die Berechnung der Standardabweichungen für MW und den Rms-Radius als Mittel für einen Bereich von Scheiben, die einen Peak definieren.
Rauschende Lichtstreudetektoren werden automatisch identifiziert, ihr Beitrag zu den berechneten Ergebnissen wird automatisch herabgesetzt.
Das Verfahren kann auf jedes theoretische Model in Bezug auf die molekulare Struktur angewandt werden, und zwar unter Einschluss (jedoch ohne Begren zung darauf) auf Random-Coil, Kugel, fester Stab oder ähnliche Polynome jeglicher Ordnung.
Das Verfahren kann auch auf die Messung und Interpretation von viskometrischen Online-Bestimmungen angewandt werden.
Detailbeschreibung der Erfindung
Wie im einleitenden Teil der Beschreibung erörtert wurde, erfordert die Berechnung der Genauigkeit des erhaltenen Molekulargewichts oder der Größe unter Einsatz von Fehlerfortpflanzungsverfahren, dass die Standardabweichungen des Molekulargewichts und der Konzentration bei jeder Scheibe gemessen werden. Die grundsätzliche Schwierigkeit bei diesem Konzept besteht darin, dass mehrere Messungen der Lichtstreu- und Konzentrationssignale nicht bei der gleichen Scheibe durchgeführt werden können, weil sich die chromatographische Auftrennung ständig zeitlich ändert. Die Signalschwankungen bei einer bestimmten Scheibe erflogt normalerweise in einem Zeitrahmen, der viel größer ist als die Zeit, in der die Daten für eine einzelne Scheibe gesammelt werden, so dass der Versuch, innerhalb des Zeitrahmens einer einzelnen Scheibe mehrere Messungen im Allgemeinen dazu führt, dass mehrere Messungen des exakt gleichen Signals entstehen! Wenn mehrere Messungen der gleichen Scheibe erforderlich wären, wären mehrere identische Injektionen durchzuführen, und es wäre erforderlich, dass sich die Chromatogramme zwischen dem chromatographischen Läufen nicht ändern. Dieses Verfahren würde eine Stabilität und Reproduzierbarkeit erfordern, die in der Praxis nicht erreichbar wäre; es wäre äußerst schwierig zu wissen, ob die einzelnen Scheiben korrekt überlappen und ob sich die chromatographischen Bedingungen nicht ändern. Der Aufsatz von Papazian und Murphy beschreibt, wie Mittelwerte historisch durchgeführt wurden, d. h., aufgrund von Daten, die aus mehreren Injektionen gesammelt wurden, die über lange Zeiträume durchgeführt wurden. Dieses Verfahren kann jedoch dazu verwendet werden, die Genauigkeit der bestimmten physikalischen Größe zu bestimmen. Für einen bestimmten Polymerstandard können mit wiederholten Messungen unterschiedliche Mittelwerte über den eluierten Peak (z. B. das Gewichtsmittel des Molekulargewichts) bestimmt werden. Die Fluktuationsquellen der so er haltenen Mittelwerte können nur in seltenen Fällen bestimmt werden, und zwar auf Grund der praktischen Unmöglichkeit, die chromatographischen Bedingungen über den Zeitrahmen konstant zu halten, der zum Sammeln der Daten eingesetzt wird. Die Genauigkeit Scheibe zu Scheibe wurde mit anderen Verfahren bis jetzt noch nicht bestimmt; nicht einmal wenn es wirklich darum ginge, die Genauigkeit eines mittleren Molekulargewichts entlang des eluierten Peaks eines bestimmten Polymeres zur Zeit der Messung abzuschätzen, wäre dies vor der Erfindung nicht möglich gewesen, weil es keinen Weg gab, die Datenfluktuationen der betreffenden Scheibe zu bestimmen.
Um dies zu erläutern, wird das Gewichtsmittel des Molekulargewichts eines chromatographischen Peaks betrachtet, der über einen Zeitraum eluiert wird, wobei die Daten von N Scheiben gesammelt werden. Das Gewichtsmittel des Molekulargewichts ist definiert als
Wie kann die Genauigkeit von M_w selbst bestimmt werden, ohne dass mehrere Injektionen und wiederholte Experimente durchgeführt werden, weil die übliche Einzelmessung sowohl von c_i und M_i a priori keine Fehler aufweisen? Die nachfolgende Gleichung (8) zeigt, wie die entsprechende Standardabweichung σ_M jedes M_i der Gleichung (7) berechnet werden kann, wenn man nach dem üblichen Verfahren zur Berechnung der Fehlerfortpflanzung vorgeht. Wenn wir üblicherweise die Genauigkeit des Molekulargewichts einer bestimmten chromatographischen Scheibe i bestimmen wollen, bestünde das Standardverfahren darin, M wiederholte Messungen (j = 1 bis M) des Lichtstreusignals bei der i-ten Scheibe, L_tj und die Konzentrationssignale c_ij der gleichen Scheibe durchzuführen. Aus diesen mehreren Messungen würde zunächst das mittlere Lichtstreusignal
und dessen Standardabweichung
wie auch einen ähnliche mittlere Konzentration
sowie die dazugehörige Standardabweichung σ_ci berechnet werden. Aus dem Verhältnis
dieser Mittelwerte würde das Mole kulargewicht M_i der i-ten Scheibe berechnet werden. Die Standardabweichung des Molekulargewichts der i-ten-Scheibe würde berechnet werden mit Standardverfahren der Fehlerrechnung und ergäbe
Dieses Ergebnis kombiniert mit den Standardabweichungen σ_ci der Konzentrationen
, der Standardabweichung des Gewichtsmittel des Molekulargewichts M_w der Gleichung (7) kann berechnet werden, wobei Standardverfahren der Fehlerrechnung eingesetzt werden.
Aus experimenteller Sicht jedoch erschien das obige Verfahren immer als unmöglich, weil es keine Möglichkeit gab, die Standardabweichungen der einzelnen Elemente zu ermitteln, die zu jeder Scheibe Beiträge leisten. Die vorliegende Erfindung zeigt ein Verfahren zum Abschätzen der Standardabweichung der erfassten Variablen für alle physikalischen Größen, die bei den einzelnen Scheiben gemessen werden, ohne dass die tatsächlich unmöglichen Wiederholungsexperimente durchgeführt werden müssen. Dies würde mehrere Konzentrationsdetektoren wie zum Beispiel Beugungsindexdetektoren, UV-Detektoren und Massenverdampfungsdetektoren wie auch Lichtstreudetektoren und Viskosimeterdetektoren erfordern. Wenn die Standardabweichungen einmal ermittelt sind, können herkömmliche Fehlerfortpflanzungsalgorithmen eingesetzt werden, um die Genauigkeit für alle abgeleiteten Größen zu erhalten. Dies ist eine wichtige Verbesserung, deren Notwenigkeit seid Langem erkannt wurde, deren Umsetzung jedoch bis jetzt nicht vorstellbar war.
Der Kernpunkt der Erfindung ist die Erkenntnis, dass die Fluktuationen im Basislinienbereich, die relativ einfach zu messen sind, den Fluktuationen in wiederholten Messungen einer einzelnen Scheibe entsprechen, die sehr schwierig zu messen sind. Dies ist so, weil Staub-, Aggregat-, und Fremdkörperkomponenten einer Probe, die in ein chromatographisches System eingespritzt werden, normalerweise von den molekularen Elementen der Probe abgetrennt werden. Diese Komponenten werden größtenteils vom chromatographischen Bereich ausgeschlossen, in dem die Hauptkomponenten der Probe zu liegen kommen. Wenn andererseits die mobile Phase selbst eine Verteilung von solchen rauscherzeugenden Elementen enthält, werden diese nicht aufgelöst, werden kontinuierlich selbst nach den Säulen eluiert und leisten deshalb in entsprechender Weise einen Beitrag zu den Scheiben der abgetrennten Probe. Die Basislinie selbst spiegelt alle Beiträge wieder die zu Unsicherheiten der entsprechenden Messungen in den Scheiben führen. Zusätzlich spiegelt die Basislinie alle Rauschelemente wieder die mit der Detektordrift und mit dem elektronischen Rauschen zusammenhängen. Die Fluktuationen des Basislinienbereichs sind deshalb bei wiederholten Messungen einer einzelnen Scheibe äquivalent mit den Fluktuationen. Durch sorgfältige Messung der Basislinienbereiche kann dadurch der Rauschpegel bestimmt werden, der jede Scheibe der abgetrennten Probe beeinflusst.
Die Anwendung der Erfindung kann in einzelne Schritte aufgeteilt werden. Es erfolgt eine Beschreibung der einzelnen Schritte.

1. Das Signal R_i(θ_j) der einzelnen Lichtstreudetektoren wie auch das Signal c_i der Konzentrationsdetektoren einer Scheibe i hat einen inhärenten Rauschpegel aufgrund von Staub, Kurzzeitdrift, Teilchen etc.. Dies trifft auch zu für einen viskosimetrischen Online-Detektor, soweit er eingesetzt wird. Das Rauschen hat im Allgemeinen für jeden Detektor unterschiedliche Größen. Zunächst bestimmt werden muss der Rauschpegel (als "Standardabweichung" bezeichnet) des Signals der Lichtstreudetektoren. 1 zeigt das Lichtstreusignal 1 unter 90° und das Konzentrationssignal 2. Der(die) chromatographische(n) Peak(s) im Bereich 5 können nahezu jede Gestalt haben und deshalb zum Auffinden des Rauschpegels ungeeignet sein. Jedoch sind die Basislinienbereiche 3 und 4, die abseits der Peaks liegen, relativ flach und können zur Bestimmung der Standardabweichungen der Detektorsignale eingesetzt werden. Typische Rauschfluktuationen beim Lichtstreusignal 1 unter 90° und beim Konzentrationssignal 2 sind in 2 gezeigt, die den Basislinienbereich 4 in vergrößertem Maßstab zeigt. Die Auswahl eines Basislinienbereiches kann durch den Bearbeiter oder mit einem Computeralgorithmus erfolgen. In jedem Fall wird der Basisli nienbereich des Detektors unter Einsatz des Verfahrens der kleinsten Fehlerquadrate an ein geeignetes Model angepasst. Weil die Daten in den Basislinienbereichen relativ konstant sind, sollte die Anpassung sehr gut sein. Standardbehandlungen der numerischen Analyse wie in dem Text "Numerical Recipes" von Press et al. erläutern, dass eine Abschätzung der Standardabweichung der zu erhaltenden Datenpunkte möglich ist, wenn man eine gute Anpassung annimmt. Die bevorzugte Ausführungsform eines Computeralgorithmus passt einen anfänglichen Teil oder Bereich der Daten an ein geeignetes Basislinienmodel an. Eine Möglichkeit besteht darin, die ersten 10 % der Daten (oder 100 Punkte in Abhängigkeit davon, was kleiner ist) an eine Polynom dritter Ordnung anzupassen. Dann sollte der Vorgang für die letzten 10 % der Daten (oder 100 Datenpunkte, in Abhängigkeit davon, was kleiner ist) wiederholt werden. Die Anpassung lediglich dieser Endbereiche der Daten maximiert die Wahrscheinlichkeit, dass die Bereiche nur Basisliniendaten enthalten und dass der Peak oder die Peaks vor dem vorauseilenden und nach dem darauffolgenden Basislinienbereich eluiert werden. Wenn beide Endbereiche angepasst und die kleinere Standardabweichung eingesetzt werden, wird das Verfahren unempfindlich gegenüber Ausreißer. Der Einsatz eines Polynom dritten Grades führt dazu, dass das Verfahren selbst dann funktionsfähig ist, wenn unbeabsichtigterweise ein Peakbereich eingeschlossen wird. Typischerweise enthält ein Datensatz 500 bis 2.000 Punkte oder mehr, so dass das Verfahren normalerweise mindestens 50 Punkte für die Basislinienanpassung einsetzt. Das Polynom dritter Ordnung wird deshalb innerhalb dieser Datenpunkte nicht erkennbar fluktuieren. Die Begrenzung der angepasst Punkte auf 100 führt zu einer kurzen Rechenzeit. Dieser automatischer Ansatz erfordert keinen Eingriff durch den Benutzer, sondern geht davon aus, dass mindestens 10 % oder 100 Punkte der Basisliniendaten entweder vor oder nach den Probenpeakbereichen gesammelt werden. Es sollte betont werden, dass die obwohl Auswahl von 10 %, 100 Datenpunkten, die Verwendung beider Endbereiche und ein Polynom dritter Ordnung geeignet sind, viele andere Optionen möglich sind, beispielsweise bei der der Benutzer die Möglichkeit hat, bestimmte oder alle dieser Parameter zu spezifizieren und selbst ein Model, bei dem zur Bestimmung der Standardabweichungen kein Polynom verwendet wird. Unterschiedliche Kombinationen können das Verfahren bei unterschiedlichen experimentellen Bedingungen optimieren, jedoch sind alle möglichen Kombinationen lediglich alternative Ausführungsformen der Erfindung. Die Anpassung der Basislinie wird bei einem Lichtstreuinstrument einmal für jeden Detektor durchgeführt und einmal für den Konzentrationsdetektor.
2. Für jede Scheibe i in jedem Peak berechnet die bevorzugte Computeranalyse für jeden Winkel θ_j das Verhältnis R_i(θ_j) / K*c_i des Lichtstreusignals zum Konzentrationssignal. Aus den Standardabweichungen der Überschuss-Rayleigh-verhältnisse R_i(θ_j) und dem Konzentrationssignal c_i, welches vorher in Schritt 1 ermittelt wurde, wird das statistische Standardverfahren der Fehlerfortpflanzung, wie es in der Literaturstelle von Taylor beschrieben wird, dazu verwendet, für jeden Winkel Standardabweichungen der Verhältnisse R_i(θ_j)/K*c_i zu ermitteln. Wenn beispielsweise zwei Größen a und b zusammen mit den jeweiligen Unsicherheiten σ_a und σ_b gegeben sind, kann das Verhältnis a/b erhalten werden, und die dazugehörige Unsicherheit ist
3. Dann werden die Verhältnisse R_i(θ_j)/K*c_i für jeden Winkel an ein geeignetes theoretisches Model der erwarteten Lichtstreuung angepasst, wobei die in Schritt 2 erhaltenen Standardabweichungen eingesetzt werden. Es existieren numerische Standardverfahren zum Anpassen der Daten an jedes Model selbst bei nichtlinearen Modellen, wenn die Standardabweichungen der Eingangsdaten bekannt sind. Solche Verfahren werden in der erwähnten Literaturstelle von Press et al beschrieben. Wenn Datenpaare (x_j y_j) sowie die Unsicherheiten σ_j für die y_j und ein Model y(x) bekannt sind, wird die Abweichung zwischen den Daten und dem Model gemäß dem Verfahren der kleinsten Quadrate berechnet. Ein Wert x² (als "chi Quadrat" bezeichnet) wird mit dem Ausdruck
berechnet und minimiert, indem die unterschiedlichen Parameter im Model angepasst werden. Wenn das Model y(x) bezüglich seiner Parameter linear ist, wie im Fall, wenn y(x) ein Polynom im x ist, wird die Minimierung in einem Schritt erhalten. Wenn das Model nicht linear ist, werden iterative Verfahren eingesetzt. In jedem Fall ist das Ergebnis ein Minimumswert von x² zusammen mit dem am besten angepassten Parametern und Ihren Unsicherheiten. Bei der vorliegenden Anmeldung bestehen für eine bestimmte Scheibe i die Eingangsdaten aus dem geordneten Paaren [sin²(θ_j/2), R_j(θ_j)/K*c_j]. Das Model besteht aus der rechten Seite von Gleichung (1) oder Gleichungen (6) mit einem entsprechend ausgewählten P(θ_j). Das numerische Verfahren minimiert die Abweichung zwischen den Daten und dem Model durch Anpassen der Modelparameter, nämlich dem Molekulargewicht M_i und dem mittleren Radiusquadrat <r²>_i. Wenn für jede Scheibe die Anpassung durchgeführt wird, sind geordnete Paare mit großen Standardabweichungen relativ weniger wichtig als solche mit kleinen Standardabweichungen. Somit werden rauschbehaftete Lichtstreudetektoren automatisch gewichtet, so dass sie für die Gesamtanpassung weniger bedeutsam sind. Das Ergebnis sinkt bestangepasste Werte für MW und dem mittleren Quadratradius zusammen mit Standardabweichungen für MW und dem mittleren Quadratradius. Um die Rms-Radien zu erhalten, verwendet man die Quadratwurzel des mittleren Quadratradius.
4. Wenn die Daten keinen systematischen Fehler enthalten, ist der in Schritt 3 erhaltene Wert von x² etwa gleich der Anzahl der Freiheitsgrade, die definiert wird als Differenz zwischen der Anzahl von Winkeldetektoren, die bei der Anpassung eingesetzt werden und der Anzahl der angepassten Para meter. Wenn andererseits bezüglich der Lichtstreudaten systematische Fehler existieren oder wenn das gewählte Model für die Daten ungeeignet ist, beschreibt das gewählte Model nicht die Daten, wie auch die Standardabweichungen vorgeben es zu tun, und der Wert von x² ist größer als die Anzahl der Freiheitsgrade. Die bevorzugte Computeranalyse berücksichtigt dies durch Vergrößern der Standardabweichungen der Lichtstreuung um den selben Faktor bei jedem Winkel, damit x² gleich der Anzahl der Freiheitsgrade wird. Dies vergrößert wirksam die Standardabweichungen der berechneten MW und des Rms-Radius. Es macht auch implizit die Annahme, dass das gewählte Model die Daten gut beschreibt. Die Schritt 2 bis 4 werden für jede Scheibe eines jeden Peaks durchgeführt.
5. Es existieren Standardausdrücke für die Kombination der Konzentration, MW und des mittleren Radiusquadrats für jede Scheibe, um die einzelnen Momente oder gewichteten Mittelwerte der MW und des Radiusquadrats für jeden Peak zu ermitteln. Mit statistischen Standardverfahren der Fehlerfortpflanzung werden die in Schritt 3 für jede Scheibe erhaltenen Standardabweichungen dazu verwendet, die Standardabweichungen der Momente zu berechnen. Dieser Schritt wird für jeden Peak einmal durchgeführt, nachdem alle Scheibendaten analysiert wurden. Selbstverständlich kann es andere funktionelle Kombinationen der Scheibenergebnisse gegen, die anstatt der erwähnten Massen- und Radiusmomente erforderlich sein können. Die Genauigkeit einer solchen funktionellen Kombination der Wert für Konzentration, MW und Radiusquadrat in einem gewählten Peakbereich kann in ähnlicher Weise berechnet werden. Die tatsächlich neuen und zusätzlichen Elemente der Erfindung sind die Schritte 1 und 4, die Schritte 2, 3 und 5 sind einfach Anwendungen von numerischen Standardanalyseverfahren auf die Lichtstreuung.

Obwohl wir uns ausschließlich auf die Anwendung des Verfahrens auf die Messung von chromatographisch getrennten Proben unter Einsatz von Lichtstreuung, kombiniert mit einer Konzentrationsmessung konzentriert haben, kann das Verfahren ebenso auf andere Online-Messtechniken angewandt werden, wie bei spielsweise die Viskometrie. Bei der Viskometrie erzeugt das Viskometer ein Signal proportional zur spezifischen Viskosität der Lösung. Durch Bilden des Verhältnisses von spezifischer Viskosität zur Konzentration kann die Eigenviskosität der Probe bestimmt werden. Das Verfahren kann offensichtlich auf diese Technik angewandt werden und liefert dabei Genauigkeitsabschätzungen für die Werte der Eigenviskosität wie auch für die Werte von MW und den hydrodynamischen Molekülradius, die mit Hilfe der sogenannte universellen Kalibrierkurven erhalten werden. Für andere Kombinationen von Verfahren (wie zum Beispiel Viskometrie und Lichtstreuung) können Molekulargewicht und Größen erhalten werden, deren Genauigkeit in ähnlicher Weise berechnet werden können, indem man das Verfahren auf die beigesteuerten Signalen anwendet und davon die entsprechenden berechneten Größen und die Standardabweichungen ableitet.

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Genauigkeit einer Molekulargewichtsmessung unter Verwendung von Daten, die von Lichtstreuungs- und Konzentrationsdetektoren erhalten werden, wobei das Verfahren die Schritte aufweist, dass man A) in eine Säule oder eine andere Trenneinrichtung eine Probe einspritzt; B) Lichtstreuungsdetektoren und einen Konzentrationsdetektor bereitstellt, durch die die eluierte Probe fließt; C) in den entstehenden chromatographischen Spuren, die der abgetrennten Probe entsprechen, Peakbereiche (5) festlegt, wobei jeder Punkt der jeweiligen Spur einer Scheibe der eluierten Probe entspricht; D) in jeder entstehenden chromatographischen Spur Basislinienbereich ermittelt, die Bereichen entsprechen, in denen die abgetrennte Probe nicht vorhanden ist; E) Basislinienbereiche (3,4) festlegt, die vom Konzentrationsdetektor und den Lichtstreuungsdetektoren erzeugt wurden und in denen die Probe nicht vorhanden ist, wobei die festgelegten Bereiche relativ flach sind; F) für die festgelegten Basislinienbereiche, in denen die Probe nicht vorhanden ist, eine funktionelle Abhängigkeit des Basislinienbereiches von der Eluierungszeit j oder, äquivalent vom Eluierungsvolumen j annimmt; G) von Datenpunkten innerhalb der festgelegten Basislinienbereichen (3, 4) nach Maßgabe der ausgewählten funktionelle Abhängigkeit Standardabweichung σ_cj der Basislinie für den Konzentrationsdetektor und σ_tj für die Lichtstreuungsdetektoren berechnet (i = 1 bis N, wobei N die Anzahl der Lichtstreuungsdetektoren ist); H) im gesamten Peakbereichen (5) den berechneten Standardabweichungen σ_cj und σ_tj der Basislinie (i = 1 bis N) eine Standardabweichung der Konzentrationsdetektorwerte bzw. des Lichtstreuungsdetektorwertes zuordnet; I) mit einem statistischen Standardverfahren der Fehlerfortpflanzung für jede Scheibe j und jeden Detektor i Standardabweichungen R_j(θ_i)/K*c_j der Verhältnisse berechnet; dabei ist c; der in den Peakbereichen (5) gemessene Konzentrationswert der Scheibe j, R_i(θ_i) das berechnete Überschuss-Reyleigh-Verhältnis der entsprechenden Scheibe j für den Detektor i, K* der optische Parameter 4π²n₀ ²(dn/dc)²λ₀ ^–4N_A ^–1, (dn/dc) der Zuwachs des Brechungsindex der Kombination Probe/gelöste Substanz, n₀ der Brechungsindex des Lösemittels im Vakuum bei der einfallenden Wellenlänge λ₀ und N_A die Avogadrosche Zahl; J) eine funktionelle Abhängigkeit y(x) einer Winkelveränderung der berechneten Verhältnisse bei jeder Scheibe in Gestalt von
auswählt; dabei ist M_j das Gewichtsmittel des Molekulargewichts, A₂ ein zweiter Virialkoeffizient, X_ij = R_j(θ_i)/K*c_j und der Formfaktor
K) mit dem Verfahren der kleinsten Fehlerquadrate x_j ² für jede Scheibe j minimiert; wobei
und die Werte x_ij mit ihren berechneten Standardabweichungen gewichtet werden, sowie durch Variieren der Parameter M_j, <r²>j, α_j2 und Parametern höherer Ordnung, wenn ausgewählt, von P_j(θ_i), um für jede Scheibe ein Minimum von x_j ² zu erhalten; und L) die Werte von M_j und <r²>_j, die einem Minimum von x_j ² entsprechen, als Molekulargewicht und mittleres Quadrat des Radius der Moleküle in Scheibe j festlegt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Konzentrationsdetektor als Brechungsindexdetektor ausgelegt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Konzentrationsdetektor als UV-Detektor ausgelegt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Konzentrationsdetektor als die verdunstbare Masse betreffende Detektor ausgelegt ist.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Formfaktor P_j(θ_i) dem Random-Coil-Modell entspricht, wobei
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die funktionelle Abhängigkeit des Basislinienbereiches ein Polynom ist.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Polynom die Ordnung Null hat.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Polynom die Ordnung drei hat.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Basislinienbereich (3,4) mindestens 10 % der Basislinie umfasst, die auf der einen oder anderen Seite des Peakbereiches (5) der abgetrennten Probe erhalten wird.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Basislinienbereich zwei Teile (3, 4) umfasst, die an jeder Seite des Peakbereiches (5) liegen, wobei beide Teile gesondert analysiert werden, um zwei gesonderte Standardabweichungen der Basislinie zu erhalten, wobei die kleinere davon gleichgesetzt wird mit der Standardabweichung der Basislinie des detektierten Signals an jede Scheibe innerhalb des chromatographischen Peaks der abgetrennten Probe.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Standardabweichungen der Lichtstreuung für jeden Winkel um den gleichen Faktor zunehmen müssen, damit der Wert von x_j ² gleich ist der Anzahl der Freiheitsgrade.