DE60319078T2 - Verfahren zur Bestimmung mittlerer Eigenschaften von in Lösung befindlichen Makromolekülen mittels des Injektionsverfahrens - Google Patents

Description

• Moleküle in einer Lösung werden im Allgemeinen anhand ihrer molaren Gewichtsdurchschnittsmasse M_w, ihres mittleren quadratischen Radius 〈r 2 / g〉 und des zweiten Virialkoeffizienten A₂ gekennzeichnet. Der letztere ist eine Messung der Interaktion zwischen den Molekülen und der Lösung. Für unfraktionierte Lösungen können diese Eigenschaften dadurch ermittelt werden, dass die Art und Weise gemessen wird, mit welcher sie Licht streuen, und zwar unter Verwendung des Verfahrens, das Bruno Zimm in seinem Seminarpapier von 1948 beschrieben hat, welches auf den Seiten 1093 bis 1099 der Ausgabe 16 im "Journal of Chemical Physics" erschien. Das von einem kleinen Lösungsvolumen gestreute Licht wird über einen Winkel- und Konzentrationsbereich gemessen. Die aus den Lichtstreumessungen abgeleiteten Eigenschaften werden durch die von Zimm entwickelte Formel in Beziehung gesetzt: R(θ) = K*MwcP(θ)[1 – 2A2MwcP(θ)] + O(c1), (1)wobei R(θ) das gemessene überschüssige Rayleigh-Verhältnis in der Richtung θ pro fester Winkeleinheit und als R(θ = [I_s(θ) – I_solv(θ)]r²/I₀V definiert ist, I_s(θ) die Intensität des durch die Lösung gestreuten Lichtes als Funktion des Winkels ist, I_solv(θ) die Intensität des von der Lösung gestreuten Lichtes als Funktion des Winkels ist, I₀ die Eigenintensität ist, r der Abstand vom Streuvolumen zum Detektor ist, V das beleuchtete Volumen aus der Sicht der Detektoren ist, P(θ) der Formfaktor der Streumoleküle und als

  

  K* = 4π²(dn/dc)²n 2 / 0/(N_aλ 4 / 0) definiert ist, N₀ die Avogadro'sche Zahl ist, dn/dc das Brechungsindexinkrement ist, n₀ der Lösungsbrechungsindex ist und λ₀ die Wellenlänge des einfallenden Lichtes im Vakuum ist. Der Formfaktor wird in Beziehung mit dem mittleren quadratischen Radius gesetzt durch

  
• Die Sammlung von Lichtstreudaten über einen Streuwinkelbereich wird gemeinhin eher als Mehrfachwinkellichtstreuung oder Multiangle Light Scattering MALS bezeichnet. Die Daten sind dann an Gleichung (1) anzupassen, um M_w, 〈r 2 / g〉 und A₂ zu ermitteln. Aus diesem Grunde wird der Reziprokwert der Gleichung (1) gemeinhin eher verwendet, welcher geschrieben werden kann als: K*c/R(θ) = 1/[MwP(θ)] + 2A2c + O(c2). (3)
• Es gibt verschiedene Methoden, wodurch die Daten an die Gleichung (3) angepasst werden können. Die historisch populärste Methode besteht darin, die von Zimm präsentierte grafische Methode in Software nachzuahmen. Diese wird deshalb häufig als Zimm-Plot-Methode bezeichnet. Alternativ kann man die globale nicht lineare Anpassungsmethode der kleinsten Quadrate verwenden, welche nachfolgend beschrieben wird.
• Eine leistungsstarke Methode zur Charakterisierung einer molekularen Lösung besteht darin, die Probe zunächst mit Hilfe chromatographischer Mittel, wie einer Korngrößenausschlusschromatographie SEC, zu fraktionieren und anschließend das gestreute Licht und die Konzentration als Funktion eines Elutionsvolumens v zu messen. Falls die Fraktionierung zu einer geeigneten Auflösung führt, kann jede Volumenprobe als im Wesentlichen monodispers betrachtet werden. Falls A₂ aus einem früheren Experiment bekannt ist und die Konzentrationen gering genug sind, dass der Einfluss von A₂ auf das gestreute Licht vernachlässigbar ist, kann man die Daten an die Gleichung (1) oder (3) anpassen, um die Verteilungen M(v) und r 2 / g(v) zu extrahieren. Dies wird routinemäßig mit Hilfe kommerzieller Software, wie dem von der Wyatt Technology Corporation von Santa Barbara, CA, entwickelten "ASTRA"-Programm durchgeführt.
• Man kann eine Güteziffer oder Figure of Merit FOM definieren, welche angibt, wann der A₂-Term vernachlässigt werden kann. Gleichung (1) zeigt, dass A₂ der Vorfaktor des c²-Terms ist. Durch Vergleich des Betrages der in Klammern gesetzten Terme in Gleichung (1) kann FOM definiert werden als FOM = 2A2Mwc. (4)
• Wenn FOM << 1 ist, wie in der Ableitung der Zimm-Gleichung vermutet wurde, hat der zweite Virialkoeffizient nur einen geringen Einfluss auf die Lichtstreusignale. Wenn man den zweiten Virialkoeffizienten durch Lichtstreuung messen will, muss FOM groß genug sein, dass sein Einfluss mit hoher Präzision messbar ist, jedoch darf er nicht so groß werden, dass Konzentrationsterme höherer Ordnung in Gleichung (1) erforderlich sind. Da die SEC-Säulen die Probe um etwa eine Größenordnung pro Säule verdünnen, ist es gewöhnlich so, dass die von den chromatographischen Separierungen resultierenden Konzentrationen klein genug sind, dass A₂ gewöhnlich vernachlässigt werden kann. Details zu den chromatographischen Separationsverfahren, den Definitionen und Berechnungen der Massen- und Größenmomente und eine Erklärung der Terminologie zur Beschreibung der zugehörigen Verteilungen können in dem Rezensionsartikel von 1993 von Wyatt auf den Seiten 1 bis 40 in der Ausgabe 272 der "Analytica Chimica Acta" gefunden werden.
• Zusammengefasst gibt es zwei Arten von Lichtstreumessungen. Im Batch-Modus wird eine Reihe von Lichtstreumessungen an einer einzigen Probe unter unterschiedlichen Konzentrationen durchgeführt. Die Konzentrations- und Winkelabhängigkeit der Streusignale ermöglicht die Ermittlung von M_w, 〈r 2 / g〉 und A₂. Im Chromatographie-Modus verändert sich die Probenzusammensetzung mit der Eluierung der Probe, so dass eine Vorab-Kenntnis von A₂ erforderlich ist, jedoch die Distributionen M(v) und 〈r 2 / g〉(v) gemessen werden können. Aus den Distributionen können die Mittelwerte M_w und 〈r 2 / g〉 berechnet werden. Es sei angemerkt, dass die aus den Messungen einer fraktionierten Probe berechneten Werte zu den aus Batch-Proben gemessenen Werten identisch sein sollten. Diskrepanzen entstehen aufgrund der Vermutung A₂ = 0 und Störungen aufgrund Bandbreitenerweiterung zwischen den Detektoren.
• Obwohl A₂ aus Batch-Messungen ermittelt werden kann, bleibt die Frage: Kann der zweite Virialkoeffizient genau gemessen werden, wenn sich die Probenkonzentration kontinuierlich über die Zeit verändert, wie es der Fall bei einer chromatographischen Elution ist? In der US-A-5 129 723 wurde ein Verfahren beschrieben, wodurch eine unfraktionierte Probe in einen MALS-Detektor im Anschluss an eine Verdünnung und eine starke Vermischung injiziert wurde. Dieses Verfahren produzierte einen durch den Lichtstreudetektor laufenden Probenspitzenwert, dessen Profil als proportional zum Konzentrationsprofil der verdünnten, noch unfraktionierten Probe vermutet wurde. Da die Massenverteilung an jedem Scheibchen dieselbe war, bestand die Vermutung, dass jeder Punkt des Profils an diesem Punkt proportional zur Probenkonzentration multipliziert mit der molaren Gewichtsdurchschnittsmasse war, indem auf Gleichung (3) Bezug genommen und A₂ = 0 gesetzt wurde. Auf dieser Grundlage konnte ein Zimm-Plot unter Verwendung einer Gruppe dieser Punkte erzeugt werden, und die zugehörige molare Gewichtsdurchschnittsmasse, der mittlere quadratische Radius und der zweite Virialkoeffizient wurde anschließend abgeleitet. Man dachte, dass ein Konzentrationsdetektor nicht benötigt wurde, da die Kenntnis der gesamten injizierten Masse für eine Umwandlung der Probenspitzenwertkurve in ein Konzentrationsprofil ausreichte. Jedoch war dieses Verfahren fehlerhaft, da die Vermutung, dass A₂ null war, dem abgeleiteten Resultat, bei welchem es nicht war, widersprach.
• Ein zweites Verfahren besteht in der Verwendung einer Chromatographiekonfiguration, bei welcher sowohl ein Lichtstreudetektor als auch ein Konzentrationsdetektor verwendet werden. Falls man eine monodisperse Probe injiziert oder die Chromatographiemethode entwickelt, um Spitzenwerte zu fraktionieren, welche monomerisch sind, sollte die molare Gewichtsdurchschnittsmasse bei jeder Eluierungsfraktion über jede Spitze konstant sein. Aus den MALS- und Konzentrationsdaten kann eine Zimm-Plot-Analyse an Werten auf verschiedenen Scheibchen oder Gruppen von Scheibchen des Eluierungsprofils durchgeführt werden. Die molare Gewichtsdurchschnittsmasse, der quadratische Radius und der zweite Virialkoeffizient können dann abgeleitet werden. Für die meisten Proteine jedoch ist der mittlere quadratische Radius für eine genaue Messung zu klein.
• Während dieses Verfahren im Prinzip arbeiten kann, gibt es praktische Schwierigkeiten, die einer allgemeinen Anwendung entgegenstehen. Der zuvor beschriebene experimentelle Aufbau erfordert zwei Detektoren. Da das Fluid durch Kapillaren und Kupplungsstellen auf seinem Weg zwischen den Detektoren fließen muss, veranlassen eine Vermischung und Diffusion eine "Bandbreitenerweiterung zwischen den Detektoren". Der "Flussabwärts"-Spitzenwert ist "breiter" als der "Flussaufwärts"-Spitzenwert. Dies bedeutet, dass eine monodisperse Probe eine gemessene Massenverteilung produziert, die polydispers erscheint, auch wenn der Verbreiterungseffekt nicht in Betracht gezogen wird. Dieser Effekt ist insbesondere für Proteine problematisch, da ihre FOM-Werte typischerweise viel kleiner als eins sind und der zweite Virialkoeffizient einen geringen Beitrag zum gestreuten Licht erzeugt. Der mit der Bandbreitenerweiterung verbundene Fehler dominiert gewöhnlich, und der abgeleitete zweite Virialkoeffizient wird signifikant geschwächt. Verschiedene analytische Korrekturen der Bandbreitenerweiterung sind über die Jahre entwickelt worden, da jedoch der A₂-Beitrag zu den Lichtstreusignalen so gering ist, hängen die resultierenden Werte von A₂ empfindlich von dem verwendeten exakten Modell der Bandbreitenerweiterung ab. Die empfindliche Abhängigkeit von dem Modell hat dieses Verfahren unzuverlässig gemacht.
• Da die molare Proteinmasse für eine monodisperse Probe in einer geeigneten Pufferprobe häufig leicht mit Hilfe von MALS, Massenspektroskopie oder direkter Sortierung gemessen wird, wurde in der US-B-6 411 383 die Zweckmäßigkeit einer Umgehung der Erzeugung der mehrfachen Konzentrationen betont, die zur Herstellung eines vollständigen Zimm-Plots erforderlich sind. Jedoch wird nun gezeigt, dass bei Ausweitung der hier beschriebenen Verfahren auf den allgemeineren Fall von Proben mit mehrfacher Konzentration das Verfahren nicht mehr länger eine Vorab-Kenntnis der molekularen Masse erfordert. Zusätzlich wird die Genauigkeit aufgrund der Mittelwertbildung verbessert, welche man durch das erweiterte Verfahren erzielt.
• Viele Wissenschaftler verwenden Online-Verfahren zur Herstellung von Zimm-Plots, und das zuvor erwähnte "ASTRA"-Programm macht die Ermittlung deutlich einfacher als frühere manuelle Methoden. Zur Zeit besteht die beste Möglichkeit zur Messung von A₂ einer unfraktionierten Probe darin, Aliquote unter verschie denen Konzentrationen vorzubereiten und sie sequenziell unter Verwendung einer Spritze oder Spritzenpumpe direkt in die Lichtstreuzelle eines MALS-Instrumentes zu injizieren. Relativ zur Grundlinienstreuung der reinen Lösung erzeugt jedes Aliquot eine Rampe bis zu einem Plateau, wenn die Injektion die Zelle füllt. Von einem ausgewählten Bereich von Punkten, gemeinsam als Spitze bezeichnet, auf jedem der Plateaus erhält die Software die entsprechenden Eingangswerte der vorbereiteten Konzentrationen und erzeugt einen Zimm-Plot. Diese Vorgehensweise hat verschiedene Nachteile, von denen nicht zuletzt einer in dem Erfordernis besteht, relativ große Mengen einer Probe vorzubereiten und zu verwenden. Bei Injektion in eine Fließzelle bedeutet die Forderung nach der Erzeugung flacher Plateaus, dass die Zelle mehrfach überfüllt werden muss. Für eine Fließzelle mit einem inneren Volumen von 80 μl sind mehr als 500 μl einer Probe für jedes Aliquot erforderlich. Für die moderne pharmazeutische Forschung macht dieses Erfordernis die Verwendung herkömmlicher Technik unmöglich. Häufig kann diese Menge einer Probe praktisch nicht synthetisiert werden. Zusätzlich muss für Proteine und ähnliche Biopolymere jede injizierte Probe vor einer Injektion dialysiert werden. Dies erhöht signifikant die Vorbereitungszeit und den Aufwand für die Durchführung der Messung.
• Letztlich zeigen wir in dieser Erfindung, dass durch Integration über die Spitzenwerte die Abhängigkeit von der Form der Spitze beseitigt wird und sich die Bandbreitenerweiterungskorrektur auf einen einzigen Parameter reduziert. Die empfindliche Abhängigkeit vom Modell der Erweiterung wird beseitigt, was das Verfahren praktisch und zuverlässig macht. Nicht nur A₂ kann mit großer Einfachheit bei Anwesenheit einer Bandbreitenerweiterung für monodisperse Proben wie Proteine, sondern auch für den Fall von unfraktionierten Proben, die direkt in eine Lichtstreumesszelle injiziert sind, gemessen werden.
• Es ist eine Hauptaufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Extrahierung von M_w, 〈r 2 / g〉 und A₂ direkt aus einer Sequenz von Injektionen mit unterschiedlichen Konzentrationen zu schaffen, wodurch das Erfordernis beseitigt wird, M_w a priori zu kennen. Wir offenbaren ebenfalls zwei Anpasstechniken, welche diese Parameter extrahieren. Eine Methode basiert auf einer globalen nicht linearen Methode kleinster Quadrate zur Anpassung der Daten. Von der zweiten Analysetechnik wird nach der grafischen Methode von Zimm ein Modell erstellt. Die resultierenden Plots werden als Trainoff-Wyatt-Plots oder TW-Plots zur expliziten Unterscheidung von den Zimm-Plots bezeichnet. Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, den Prozess zu automatisieren und die manuelle Probenvorbereitung so weit wie möglich zu beseitigen. Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung besteht darin, durch Auswertung des gemittelten implizierten Wertes in der Mehrfachinjektionstechnik die Messung genauer durchzuführen. Letztlich ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, derartige Ermittlungen unter Verwendung minimaler Mengen von Proben durchzuführen.
• Die US-B-6 411 383 betrifft ein Verfahren, durch das der zweite Virialkoeffizient einer Probe, bestehend aus einer monodispersen molaren Massenverteilung in einer Lösung, direkt aus einer einzigen Injektion ermittelt werden konnte. Dasselbe Verfahren konnte ebenfalls auf bestimmte Klassen von unfraktionierten Proben angewendet werden. Die vorliegende Erfindung ist auf eine allgemeinere Anwendung der Verwendung einer Reihe von Konzentrationsinjektionen gerichtet. Die US-B-6 411 383 erfordert eine Vorab-Kenntnis der molaren Gewichtsdurchschnittsmasse der Probe. Diese Erfindung ermittelt M_w, 〈r 2 / g〉 und A₂ unter Verwendung einer Analysetechnik analog zu der von Zimm.
• Zusätzlich wird in der US-B-6 411 383 vermutet, dass die Bandbreitenerweiterung zwischen den Detektoren vernachlässigbar ist. Es ist häufig gewünscht, die Menge einer in der Messung verwendeten Probe zu minimieren. Deshalb werden geringe Injektionen verwendet, um schmale Spitzen zu erhalten. In diesem Fall kann die Bandbreitenerweiterung zwischen den Detektoren nicht vernachlässigt werden. Die vorliegende Erfindung sieht mehrere Verfahren vor, um diese Beeinflussung zu berücksichtigen.
• Um die zuvor erwähnten und weiteren Aufgaben zu lösen, wird demnach gemäß der vorliegenden Erfindung geschaffen ein Verfahren zur Bestimmung der molaren Gewichtsdurchschnittsmasse M_w, des mittleren quadratischen Radius 〈r 2 / g〉 und des zweiten Virialkoeffizienten A₂ einer Probe, mit den Schritten
• A) eine Reihe von n Verdünnungen der Probe in einem geeigneten Lösungsmittel vorzubereiten, wobei die Verdünnungen in einem Konzentrationsbereich von etwa einer Größenordnung liegen;
• B) ein Lösungsmittelreservoir vorzusehen;
• C) eine Pumpeinrichtung vorzusehen, durch die das Lösungsmittel veranlasst werden kann, sequenziell durch eine Mehrfachwinkellichtstreuerfassungseinrichtung und eine Konzentrationserfassungseinrichtung zur Erzeugung von Mehrwinkellichtstreu- und Konzentrationsdaten zu fließen;
• D) einen Bruchteil von jeder der n Probenverdünnungen sequenziell zu injizieren;
• E) die Mehrfachwinkellichtstreu- und Konzentrationsdaten in einer Computereinrichtung in vorgewählten durchflussvolumetrischen inkrementalen Intervallen Δν zu sammeln und zu speichern, und zwar durch jede Elution des Bruchteils hindurch, wenn sie durch die Mehrfachwinkellichtstreu- und Konstellationserfassungseinrichtung laufen;
• F) die n Summen entsprechend den n Probeninjektionen durch die Computereinrichtung,
  
  mit j = 1 bis n, aus den gesammelten Konzentrationsdatenwerten c_ij über die gesamten Konzentrationselutionselemente ij jeder Probenverdünnung j zu bilden;
• G) die n Summen entsprechend den n Probeninjektionen durch die Computereinrichtung,
  
  mit j = 1 bis n, aus den gesammelten Konzentrationsdatenwerten c_j über sämtliche Konzentrationselutionselemente von jeder Probenverdünnung j zu bilden;
• H) die überschüssigen Rayleigh-Verhältnisse R_ij(θ_k) aus den gesammelten Lichtstreudaten bei jedem Streuwinkel θ_k für jede Probenverdünnung j und jede Elution i zu berechnen;
• I) die n Summen
  
  mit j = 1 bis n für jeden Streuwinkel θ_k und jede Probenverdünnung j durch die Computereinrichtung über sämtliche Lichtsteuelutionselemente i der Probenverdünnung j zu bilden;
• J) die Verhältnisse D_j/C_j = κ_j zu bilden;
• K) die Verhältnisse κ_j und die Summen
  
  für sämtliche Winkel k und n Probenverdünnungen zu verwenden, um die molare Gewichtsdurchschnittsmasse, den mittleren quadratischen Radius und den zweiten Virialkoeffizienten der unfraktionierten Probe abzuleiten.
• Weitere bevorzugte Ausführungen der vorliegenden Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
• Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung beginnt mit der Vorbereitung einer Reihe von j Verdünnungen der Probe für eine Injektion auf eine SEC-Säulengruppe. Falls ein Auto-Sampler verfügbar ist, kann eine einzige Probe für eine nachfolgende automatische Verdünnung auf bestimmte Konzentrationen verwendet werden. Es gibt zwei Wege zur Verwendung eines Auto-Samplers für die Vorbereitung der Verdünnungen. Als Erstes können zunehmend geringere Mengen der Probe in die Injektionsschleife injiziert werden, wobei sie unterfüllt wird. Alternativ kann der Auto-Sampler die Probe bereits vorab vor Füllen der Injektionsschleife verdünnen und dann sie vollständig füllen. Die letztere Methode wird bevorzugt, da sie zu kongruenten Konzentrationsprofilen bei unterschiedlichen Amplituden für jede Injektion führt.
• Die Analyse erfordert eine Reihe von abnehmenden Konzentrationen der zu messenden Probe. Für Proteine muss jedes Proben-Aliquot dialysiert werden. Die Einführung einer Gruppe von SEC-Säulen, durch die jede Probe fließt, vermeidet dieses Erfordernis, da eine Dialyse während des Flusses der Probe durch die Säule stattfinden wird. Nach den Säulen sind ein MALS-Detektor und ein Konzentrationsdetektor in Reihe geschaltet. Für kleine Moleküle, deren mittlere quadratische Radien für eine Messung zu klein sind, kann eine Messung unter einem einzigen Streuwinkel wie 90° ausreichen, obwohl die Präzision der Ermitt lung verringert sein dürfte. Dies sind die herkömmlichen Elemente einer Standard-Separierung durch SEC, welche zu einer absoluten Ermittlung der in der Probe vorhandenen eluierenden molekulare Massen führt. Falls weder eine Dialyse noch eine Fraktionierung erforderlich ist, kann auf Separierungssäulen verzichtet werden, und die Probe kann direkt in die Fließzelle des Lichtstreuinstrumentes injiziert werden. Alternativ kann eine Überwachungssäule zur Erzielung einer Dialyse ohne Separierung verwendet werden.
• 1 Zusammenschaltung der wichtigen chromatographischen Elemente der bevorzugten Ausführung der Erfindung.
• 2 Das 90°-Lichtstreusignal für die Reihe von Injektionen, die verwendet werden, um den Zimm-Plot eines 200-kD-Polystyren in Toluene zu erstellen, wie in 3 gezeigt ist. Dies zeigt die durch jede Injektion erzielten Plateaus und den zusammen gemittelten Bereich der Proben. Die vertikale Achse ist die grobe Detektorspannung minus der Lösungsgrundlinienspannung.
• 3 Ein herkömmlicher Zimm-Plot eines in Toluene gelösten schmalen 200-kD-Polystyeren-Standards. Diese Proben werden durch eine Verdünnung einer Stammlösung der Reihe nach erzeugt.
• 4 Eine einzige Injektion, die für den Trainoff-Wyatt-Plot verwendet wird, wie in 5 gezeigt ist. Der Kurvenverlauf 11 stellt das grobe 90°-Lichtstreusignal dar. der Kurvenverlauf 12 stellt das DRI-Signal dar. Es ist derart skaliert worden, dass seine Spitze bei 90% der Lichtstreuspitze liegt, und es ist zeitlich verschoben worden, um das Verzögerungsvolumen zwischen den Detektoren zu korrigieren. Das nachlaufende Merkmal im DRI-Signal basiert auf gelösten Gasen in der Probe, welche durch die Überwachungssäule separiert sind. Die geringfügige Differenz in den Spitzenformen resultiert aus der Bandbreitenerweiterung zwischen den Detektoren. Es ist zu beachten, dass es sich hierbei nicht um ein Plateau handelt. Dies ist eine von sechs Injektionen, die verwendet werden, um das Diagramm von 5 zu erzeugen.
• 5 Ein Trainoff-Wyatt-Plot unter Verwendung der Zimm-Anpassungsmethode. Die Linie 13 an der linken Seite des Plots steht für die Pro jektion der Daten für jede Injektion unter einem Streuwinkel von 0°. Die Neigung dieser Projektion bestimmt A₂. Die Linie 14 am unteren Rand des Plots steht für die Projektion der Daten für jeden Detektor unter κ gleich null. Die Neigung dieser Projektion bestimmt 〈r 2 / g〉. Die Schnittpunkte dieser beiden Linien bestehen für 1/M_w.
• 6 Ein Trainoff-Wyatt-Plot unter Verwendung der globalen Anpassungsmethode. Dieselben in 5 benutzten Daten wurden hier verwendet.
• Zunächst wird auf das Analyseverfahren eingegangen. Dabei wird eine Reihe von Injektionen j betrachtet, von denen jede einer insgesamt injizierten Masse m_j entspricht. Unter Bezugnahme auf Gleichung (1) wird für jede aufeinander folgende Spitze j und jeden Streuwinkel θ_k die Summe des überschüssigen Rayleigh-Verhältnisses und der Konzentrationsspitzen genommen:

  
• Jede Summe wird für sämtliche i innerhalb der Spitze j genommen. Es ist zu beachten, dass jede Summe eine unterschiedliche Anzahl von Termen haben kann. Der Grund hierfür liegt darin, dass jede Spitze eine unterschiedliche Breite haben kann und aufgrund der Wirkungen der Bandbreitenerweiterung zwischen den Detektoren gespreizt sein kann.
• Die Summenbildung auf der linken Seite von Gleichung (5), multipliziert mit dem Faktor Δν, bildet genau den Bereich unterhalb der Spitze des überschüssigen Rayleigh-Verhältnisses. Mit

  

  was direkt berechnet werden kann, kann Gleichung (5) umgeschrieben werden in

  

  wobei

  

  proportional zur eluierten Gesamtmasse und

  

  ist.
• Da der Konzentrationsdetektor c_ij bei jedem Eluierungsvolumen angibt, kann man leicht die Summen D_j und C_j von Gleichung (6) über den gesamten erweiterten Bereich der Konzentrationsspitzen errechnen. Die überschüssigen Rayleigh-Verhältnisse R_ij(θ_k) werden berechnet, indem zunächst die Lichtstreuwerte der reinen Lösung von den gemessenen Lösungswerten subtrahiert werden, wie zuvor unmittelbar nach der Gleichung (1) definiert worden ist. Einzelheiten sind in dem zuvor zitierten Artikel von Wyatt in "Analytica Chimica Acta" angegeben. Nun wird der Reziprokwert von Gleichung (6) genommen, um zu erhalten

  
• Somit ist

  

  mit κ_j = D_j/C_j. Gleichung (8) wird als Trainoff-Wyatt- oder TW-Gleichung bezeichnet.
• Gleichung (8) zeigt das Wesen der Erfindung. Von besonderer Wichtigkeit sind die Messung und Berechnung von C_j und D_j über einen Bereich von Eluierungsscheibchen, die geeignet sind, um sämtliche Elemente der Eluierungsprobe zu enthalten. Die in diesen Summen enthaltene Anzahl von Scheibchen wird im Wesentlichen größer als die in der Berechnung der Summen

  

  verwendeten Anzahl von Scheibchen aufgrund der zuvor erwähnten Einflüsse der Bandbreitenerweiterung sein.
• Bislang ist der Einfluss der Bandbreitenerweiterung zwischen den Detektoren am Stromabwärts-Detektor ignoriert worden. Nachfolgend wird der Einfluss auf Gleichung (8) untersucht. Dabei wird angenommen, dass der Konzentrationsdetektor stromabwärts vom Lichtstreudetektor sitzt. Außerdem wird angenommen, dass die Wirkungen der Vermischung und Diffusion linear sind, so dass man schreiben kann cm(γ) = ∫∞–∞ B(τ)c(γ – τ)dτ, (9)wobei c^m(t) das gemessene Konzentrationssignal, B(τ) der normalisierte Erweiterungskern und c(t) die Konzentration ist, die man bei vielen der Erweiterungen zwischen den Detektoren messen würde. Die Notation ist auf eine kontinuierliche Darstellung geändert worden, um die Darstellung zu vereinfachen. Es soll der Einfluss auf C und κ in Gleichung (8) betrachtet werden. Bei Berechnung von C aus dem gemessenen Signal erhält man Cm = ∫∞–∞ cm(t) = ∫∞–∞ ∫∞–∞ dtdτB(τ)c(t – τ) = ∫∞–∞ dτc(τ)∫∞–∞ dtB(t + τ) = C, (10)was folgt, da B(τ) normalisiert ist. Dies wird erwartet, da C proportional zur injizierten Masse ist und die Erweiterung keinen Einfluss auf die injizierte Masse hat. Jedoch wird gefunden, dass die Erweiterung einen Einfluss auf κ durch die gemessene Menge D^m hat, und zwar wegen Dm = ∫∞–∞ cm(t)2dt (11) Dm = ∫∞–∞ dt(∫∞–∞ B(τ)c(t – τ)dτ)2 (12) Dm = ∫∫∫∞–∞ dtdτdτ'B(t – τ)B(t – τ')c(τ)c(τ') (13) Dm = ∫∫∞–∞ dτdτ'c(τ)c(τ')∫∞–∞ duB(u)B(u – (τ – τ')). (14)
• Es soll das dritte Integral auf der rechten Seite betrachtet werden. Hierbei handelt es sich um die Form einer Faltung der Erweiterungsfunktion mit sich selbst. Es ist nur eine Funktion des Parameters τ – τ'. Das Faltungstheorem kann verwendet werden, um das dritte Integral in Gleichung (14) neu zu schreiben als

  

  wobei B(ω) die Fourier-Transformierte des Erweiterungskernes ist, und zwar definiert durch

  
• Nachfolgend wird angenommen, dass der charakteristische Zeitmaßstab der Erweiterungsfunktion viel kleiner als die der Konzentrationsspitze ist. Die beiden Zeitmaßstäbe sind als τ_b und τ_p entsprechend bezeichnet. Anschließend erhält man B(ω)² als eine breite Spitzenfunktion mit einer charakteristischen Breite von π/τ_b. Die Gleichungen (15) und (14) implizieren dies im Grenzbereich mit τ_b → 0, f(τ – τ')→ δ(τ – τ') und D^m → D, wie erwartet.
• Daraus wird gefolgert, dass die Interdetektor-Erweiterung nur den "κ"-Term in der TW-Gleichung negativ beeinflusst. Aus Gleichung (14) lässt sich feststellen, dass der Einfluss der Erweiterung darin besteht, den Maximalwert der Spitze zu unterdrücken und die Werte in den "Flügeln" bzw. Seitenbereichen anzuheben. Dies bedeutet, dass der gemessene Wert D_m ≤ D ist. Dies wiederum impliziert, dass der berechnete Wert von A₂ überbewertet wird. Es gibt verschiedene Maßnahmen, die Daten für die Erweiterung zu korrigieren. Die konzeptionell einfachste Methode, welche sich als am wenigsten nützlich herausgestellt hat, besteht darin, die Gleichung (9) zur Ermittlung des nicht erweiterten Konzentrationsprofils zu entfalten:

  

  wobei diese Gleichung anschließend zur direkten Berechnung von D verwendet werden kann. Es gibt verschiedene Probleme mit dieser Maßnahme. Eines besteht in dem Erfordernis, die vollständige Form der Erweiterungsfunktion zu ken nen. Ein anderes besteht darin, dass der Entfaltungsprozess numerisch instabil ist. Betrachtet werden soll das Verhältnis c ~^m(ω)/B ~(ω) für große Werte von ω. Da sowohl c ~^m(ω) und B ~(ω)) aus physikalischen Messungen ermittelt werden, welche Rauschen enthält, und für Werte von ω beide zu null tendieren, unterliegt das Verhältnis großen Schwankungen. Bei Durchführung einer inversen Fourier-Transformation enthält das Ergebnis ein verstärktes Hochfrequenzrauschen. Dies kann anschließend gefiltert werden, jedoch ist diese Maßnahme aus ersten Prinzipien nicht vertretbar. Schlechter ist, dass die inverse Fourier-Transformation Ergebnisse erzeugen kann, die physikalisch nicht möglich sind, und zwar beispielsweise negative Konzentrationswerte oder Schwingungen. In der Praxis machen diese Probleme dieses Verfahren unpraktisch. Schließlich sei noch darauf hingewiesen, dass zur Vermeidung dieser Probleme der Prozess zur Erzeugung einer Reihe von diskreten Injektionen eliminiert und stattdessen die kontinuierliche Konzentrationsveränderung entlang einer Injektionsspitze als unabhängiger Parameter in einer Anpassung an Gleichung (3) verwendet werden könnte.
• Für eine praktischere Methode soll der Spezialfall betrachtet werden, bei welchem sowohl c(t) und (B(τ) Gauß'sche Variablen sind. Für diesen Fall kann Gleichung (14) aus den Definitionen

  

  unmittelbar berechnet werden, wobei c proportional zur injizierten Gesamtmasse ist und sich für jede Injektion ändert. Das Einsetzen der Gleichung (18) in Gleichung (9) ergibt eine weitere Gauß'sche Variable mit der Breite τ 2 / cm = τ 2 / c + τ 2 / b. Daraus ergibt sich ebenfalls

  
• Jedoch sei daran erinnert, dass τ_c die Gauß'sche Breite der unverbreiterten Spitze und im Allgemeinen unbekannt ist. Jedoch kann im Grenzbereich, wo die Erweiterung gering ist (τ_b << τ_c) sie durch die Breite der Lichtstreuspitze abgeschätzt werden. Deshalb kann man schreiben

  
• Diese beiden Mengen sind direkt messbar. Falls die Spitzen und die Erweiterungsfunktion von einem Gauß'schen Profil abweichen, würde man erwarten, dass Gleichung (20) beginnen würde, zu versagen. Jedoch ist die Annahme vernünftig, dass Gleichung (20) im Fall τ_b << τ_c) gültig ist, was impliziert, dass τ_LS τ_c ist.
• Im Folgenden soll wieder das allgemeine Problem im Mittelpunkt stehen. Falls man einen Auto-Sampler zur Erzeugung von Verdünnungen verwendet, haben die Injektionen in guter Näherung dieselbe Form, jedoch unterschiedliche Amplituden.
• Unter der Annahme, dass sie dieselbe Form haben, kann man das j-te Konzentrationsprofil schreiben als

  

  wobei wieder m_j die injizierte Masse der j-ten Injektion ist. Das Einsetzen in Gleichung (11) ergibt

  
• Anschließend kann Gleichung (20) zur Annäherung an das Verhältnis D^m ₀/D₀ verwendet werden. Alternativ kann dieses Verhältnis gemessen werden, indem das traditionelle Plateau-Verfahren zum Messen von A₂ und der TW-Plot für einige Bezugsproben durchgeführt und anschließend das Verhältnis eingestellt werden, bis die beiden Verfahren übereinstimmen. Dieses Verhältnis basiert effektiv auf einer Messung der Interdetektor-Erweiterung und sollte von der verwendeten Probe unabhängig sein. Ist demnach das System durch eine Bezugsprobe charakterisiert worden, kann das gemessene Verhältnis in einer nachfolgenden Analyse von unbekannten Proben verwendet werden.
• Zur Ermittlung der molaren Gewichtsdurchschnittsmasse M_w, des mittleren quadratischen Radius 〈r 2 / g〉 und des zweiten Virialkoeffizienten A₂ einer molekularen Lösung wird eine Gruppe von j Proben von unterschiedlicher Konzentration der Reihe nach in ein chromatographisches System, wie beispielsweise in 1 gezeigt ist, injiziert. Eine Lösung wird durch eine Pumpeneinrichtung 1 aus einem Lösungsreservoir 2 durch einen Entgaser 3 gezogen und anschließend durch eine Filtereinrichtung 4 gepumpt. Der Entgaser wird hauptsächlich benutzt, um gelöste Gase aus der Lösung zu entfernen, da derartige Gase in der Lösung nacheinander kleine Blasen erzeugen könnten, die die gewünschten Messungen aus der Lösung selbst stören könnten. Die Filtereinrichtung 4 ist hauptsächlich vorgesehen, um, wie gezeigt, Restpartikelmaterial aus der Lösung zu entfernen, welches die gewünschten Messungen stören könnte. Aliquots der Probe 5, deren molare Gewichtsdurchschnittsmasse, mittlerer quadratischer Radius und zweiter Virialkoeffizient durch das Verfahren dieser Erfindung abzuleiten sind, werden durch eine Injektoreinrichtung 6 injiziert und bewegen sich direkt durch den Lichtstreu- oder MALS-Detektor 8. Die Verdünnungen können vorab vorbereitet und manuell injiziert werden.
• Man kann sie auch erzeugen, wenn man alternativ einen Auto-Sampler programmiert, um das Volumen der unverdünnten Probe herabzusetzen oder vorzugsweise die Probe zu verdünnen und ein konstantes Volumen zu injizieren. Typischerweise würden die Verdünnungen eine Größenordnung oder mehr überbrücken. Falls die Probe eine vorangegangene Dialyse und/oder Fraktionierung benötigt, kann eine ausgewählte Separierungssäulengruppe 7 vor den MALS-Detektor 8 angeordnet werden. Bei fehlenden Aggregaten kann eine Dialyse häufig nur mit der Verwendung einer Überwachungssäule erzielt oder falls eine Dialyse nicht erforderlich ist, weggelassen werden. Nachdem jede aufeinander folgende Probe 5 den MALS-Detektor 8 passiert hat, fließt sie durch einen Konzentrationsdetektor 9, der als ein Differenzialbrechungsindexdetektor DRI dargestellt ist, wodurch die Probenkonzentration an jedem Scheibchenintervall Δν_i gemessen wird. Falls die Erfassungsintervalle Δν_i äquidistant sind, ist Δν_i = Δν konstant. Die sich ergebenden Lichtstreu- und Konzentrationssignale werden anschließend gespeichert und durch eine Computereinrichtung 10 verarbeitet, um für jedes injizierte Aliquot j die überschüssigen Rayleigh-Verhältnisse R_ij(θ_k) für jedes Scheibchen i unter jedem gemessenen Streuwinkel θ_k zu berechnen. Die Computereinrichtung 10 berechnet ebenfalls die molekularen Eigenschaften einschließlich Masse und Korngröße und deren Verteilungen. Obwohl der Probenkonzentrationsdetektor 9 im Allgemeinen ein DRI-Detektor ist, kann ein Ultraviolettabsorptionsdetektor an die Stelle gesetzt werden. Ein Verdampfungslichtstreudetektor kann ebenfalls verwendet werden, um die Konzentration jeder eluierenden Probe zu überwachen, obwohl eine derartige Vorrichtung eine spezielle Kalibrierung benötigen kann, da sein Antwortverhalten im Allgemeinen nicht linear ist.
• Es gibt zwei grundlegende Methoden zur Anpassung der Lichtstreu- und Konzentrationsdaten, um M_w, 〈r 2 / g〉 und A₂ aus Gleichung (8) zu extrahieren. Die erste Methode basiert auf der grafischen Methode von Zimm und der starken Ähnlichkeit der Funktionsformen der Gleichungen (3) und (8). Sie besteht darin, Untergruppen der Daten anzupassen, um eine Extrapolation zu einem Streuwinkel von null und einer Konzentration von null durchzuführen. Zunächst werden die Daten für jeden Winkel als eine Funktion von κ_j angepasst an

  

  wobei a_l,k Anpassungsparameter sind und N_l für die Ordnung der Konzentrationsanpassung steht. Bei N_l = 1 wird eine lineare Anpassung durchgeführt, bei N_l = 2 wird eine quadratische Anpassung durchgeführt, etc. Es sei darauf hingewiesen, dass es bei a_0,k um das Ergebnis einer Extrapolation zu einer Konzentration des k-ten Winkels von null handelt. Als Nächstes werden die Daten für jede Injektion angepasst an

  

  wobei b_j,m Anpassungsparameter sind und N_m für die Ordnung der Winkelanpassung steht. Es ist zu beachten, dass es bei b_j,0 um das Ergebnis einer Extrapolation der Daten zu einem Streuwinkel von 0 handelt. Letztlich werden nach Zimm die Anpassungskoeffizienten dann angepasst an

  

  wobei u_m und ν_l Anpassungskoeffizienten sind. Sie werden in Bezug gesetzt zu den molekularen Eigenschaften durch 1/u0 oder Mw = 1/ν0, (27) A2 = νl/2, (28)

  
• Es sollte ersichtlich sein, dass die Anpassung der gemessenen Daten an die Form der Gleichungen (24), (25) und (26) im statistischen Sinne durchgeführt werden kann, wodurch die zur Durchführung dieser Anpassungen verwendeten Daten mit ihren gemessenen Standardabweichungen gewichtet werden können. Hierbei handelt es sich um Standard-Techniken, die keiner weiteren Erörterung bedürfen.
• Gleichung (27) impliziert, dass M_w sowohl aus den Winkelanpassungen als auch aus den Konzentrationsanpassungen berechnet werden kann. Diese beiden Verfahren sollten übereinstimmen, jedoch sind sie bei Vorliegen von experimentellem Rauschen ein wenig unterschiedlich. Dies kann als Übereinstimmungsprü fung verwendet werden, um die Genauigkeit des Verfahrens zu ermitteln. Eine Durchschnittsmenge kann definiert werden als

  
• Außerdem können die in den Gleichungen (25) und (26) beschriebenen Anpassungen mit Hilfe eines Plots ähnlich dem von Zimm präsentierten Plot gut visualisiert werden. Diese werden als Trainoff-Wyatt-Plots bezeichnet, um sie ausdrücklich von den Zimm-Plots zu unterscheiden. Zur Erzeugung eines TW-Plots sind die Daten und die Anpassungen in den Gleichungen (25) und (26) durch Plotten von sin²(θ_k/2) + kκ_j auf der Abszisse und

  

  auf der Ordinate, wie in 5 gezeigt ist. Der Wert k wird als Dehnungsfaktor oder "Stretch-Faktor" bezeichnet und so gewählt, dass die Daten von unterschiedlichen Injektionen nicht gegenseitig überlappen. Er beeinflusst nur den Maßstab des Plots und nicht die von den Anpassungen ermittelten Parameter.
• Die zweite Methode besteht darin, eine globale Anpassung an den gesamten Datensatz durchzuführen. Dies steht in Kontrast zur Zimm-Methode, eine Reihe von Anpassungen auf Untergruppen der Daten vorzunehmen. Die Zimm-Methode wurde in den 40er-Jahren des letzten Jahrhunderts ohne die Verwendung einer numerischen Anpassungssoftware entwickelt. Die globale Methode besteht darin, eine Anpassungsfunktion zu definieren, die die Daten modelliert, und ein nicht lineares Verfahren der kleinsten Quadrate zur Anpassung der Daten an die Anpassungsfunktion unter Verwendung eines Standard-Algorithmus wie beispielsweise der Marquart-Methode durchzuführen. Das Anpassungsmodell ist

  

  wobei a_lm die Anpassungsparameter sind und N_l und N_m für die Anpassungsordnungen des Winkels und κ-Anpassungen stehen. Die Anpassungsparameter werden in Bezug zu den physikalischen Mengen gesetzt durch Mw = 1/a∞, (32) A2 = a01/2, (33)

  
• Ein TW-Plot kann ebenfalls aus den Ergebnissen der globalen Anpassungsmethode erzeugt werden. Der einzige Unterschied besteht darin, dass in diesem Fall die Anpassung aus Gleichung (31) verwendet wird. Ebenfalls ist zu beachten, dass anders als die frühere Anpassungsmethode die molekulare Masse unzweideutig in Gleichung (32) berechnet wird.
• Um die Nützlichkeit des Verfahrens zu demonstrieren, wird die Messung der molekularen Parameter einer in Toluene gelösten Polystyren-Standardprobe präsentiert. Die Probe von der Pressure Chemical Corporation hat ein Molekulargewicht ungefähr von 200 kD und ist bekannt, dass sie eine lineare zufällige Spulengestaltung besitzt. Außerdem ist die Probe nahezu monodispers. Sie besitzt eine Polydispersivität von weniger als 1,01, wodurch das Fehlen von wesentlichen Mengen von Aggregaten belegt wird.
• Die Probe wurde unter Verwendung von zwei Methoden charakterisiert. Bei der ersten Methode handelt es sich um die traditionelle Zimm-Methode. Eine Stammprobe wurde mit einer Konzentration von 1,808 mg/ml vorbereitet. Eine Reihe von bekannten Verdünnungen wurde vorbereitet durch Verdünnung der Stammprobe. Die resultierenden Konzentrationen betrugen 1,808 mg/ml, 1,4582 mg/ml, 1,0703 mg/ml, 0,7342 mg/ml, 0,3745 mg/ml und 0,1879 mg/ml. Diese wurden unter Verwendung einer 500-μl-Injektionsschleife injiziert, so dass die Fließzelle des MALS-Instrumentes überfüllt wurde. Eine Überwachungssäule wurde verwendet, um Staub zu beseitigen und das gelöste Gas von der Probe zu separieren. Das Rohsignal 11 vom 90°-Lichtstreudetektor ist in 2 gezeigt. Die Plateaus sind eindeutig erkennbar, und ein kleiner Bereich von Daten auf dem Plateau jeder Spitze wurde gemittelt und verwendet, um den in 3 gezeigten Zimm-Plot zu erzeugen. Die gemessenen Quantitäten betragen M_w = 2,32 × 10⁵ g/mol,

  

  und A₂ = 4,84 × 10^–4 mol ml/g². Die Daten sind von hoher Qualität, jedoch werden große Mengen einer Probe benötigt.
• Bei der zweiten Methode handelt es sich um den Gegenstand dieser Erfindung. Dieselben Probenlösungen wurden injiziert, jedoch unter Verwendung einer 107-μl-Injektionsschleife, so dass die Fließzelle nicht vollständig gefüllt wurde und Plateaus nicht erzielt wurden. Die Daten von einer Injektion sind in 4 gezeigt. Sie zeigt das 90°-Lichtstreusignal 11, welches dem DRI-Signal 12 überlagert ist. Das DRI-Signal ist zeitlich verschoben worden, um die durch das Interdetektor-Volumen entstandene Verzögerung zu kompensieren. Bei beiden Signalen ist die Grundlinie subtrahiert worden. Zusätzlich ist der DRI-Spitzenwert für die Klarheit der Darstellung auf 90% des Lichtstreuspitzenwertes skaliert worden. Aus jeder Injektion wurden

  

  C_j und κ_j ohne Korrektur der Interdetektor-Bandbreitenerweiterung berechnet. Der daraus resultierende TW-Plot unter Verwendung der Zimm-Anpassungsmethode ist in 5 gezeigt. Die Linie 13 stellt die durch Gleichung (26) definierte Anpassung und die Linie 14 die durch Gleichung (25) definierte Anpassung dar. Die erzielten Ergebnisse betrugen M_w = 2,10 × 10⁵ g/mol,

  

  und A₂ = 5,13 × 10^–4 mol ml/g².
• Dieselben Daten wurden anschließend unter Verwendung der globalen Anpassungsmethode angepasst, wie in 6 gezeigt ist, was dieselben Ergebnisse für die Molekülparameter ergab. Letztlich wurde κ_j für die Bandbreitenerweiterung unter Verwendung der Gauß'schen Annäherung von Gleichung (20) korrigiert. Der sich daraus ergebende TW-Plot ist virtuell identisch mit 6. Die abgeleiteten Molekülparameter betragen M_w = 2,10 × 10⁵ g/mol,

  

  und A₂ = 4,69 × 10^–4 mol ml/g². Es ist festzuhalten, dass die Bandbreitenerweiterungskorrektur einen vernachlässigbaren Effekt auf M_w und

  

  hat, jedoch A₂ um etwa 10% verändert. Das Gauß'sche Annäherungsergebnis liegt innerhalb von 3% der traditionellen Zimm-Plot-Methode.
• Zum Schluss sollen die Ergebnisse der Gauß'schen Annäherung an die Interdetektor-Bandbreitenerweiterungskorrektur mit denen der Kalibrierungsmethode verglichen werden. In der früheren Analyse wurde die Gauß'sche Annäherung unabhängig für jeden Spitzenwert berechnet. Unter der Annahme, dass die Erweiterung einen Systemparameter darstellt und für jede Spitze identisch ist, kann der Durchschnitt von D^m/D = 1,099 berechnet werden. Aus der Kalibrierungsmethode lässt sich D^m/D = 1,060 ermitteln. Deshalb stimmen die beiden Methoden innerhalb von 4% überein, was im Rahmen des Versuchsfehlers liegt.

Claims (11)

1. Verfahren zur Bestimmung der molaren Gewichtsdurchschnittsmasse M_w, des mittleren quadratischen Radius 〈r 2 / g〉 und des zweiten Virialkoeffizienten A₂ einer Probe, mit den Schritten A) eine Reihe von n Verdünnungen der Probe in einem geeigneten Lösungsmittel vorzubereiten, wobei die Verdünnungen in einem Konzentrationsbereich von etwa einer Größenordnung liegen; B) ein Lösungsmittelreservoir vorzusehen; C) eine Pumpeinrichtung vorzusehen, durch die das Lösungsmittel veranlasst werden kann, sequenziell durch eine Mehrfachwinkellichtstreuerfassungseinrichtung und eine Konzentrationserfassungseinrichtung zur Erzeugung von Mehrwinkellichtstreu- und Konzentrationsdaten zu fließen; D) einen Bruchteil von jeder der n Probenverdünnungen sequenziell zu injizieren; E) die Mehrfachwinkellichtstreu- und Konzentrationsdaten in einer Computereinrichtung in vorgewählten durchflussvolumetrischen inkrementalen Intervallen Δν zu sammeln und zu speichern, und zwar durch jede Elution des Bruchteils hindurch, wenn sie durch die Mehrfachwinkellichtstreu- und Konstellationserfassungseinrichtung laufen; F) die n Summen entsprechend den n Probeninjektionen durch die Computereinrichtung,

   

   mit j = 1 bis n, aus den gesammelten Konzentrationsdatenwerten c_ij über die gesamten Konzentrationselutionselemente ij jeder Probenverdünnung j zu bilden; G) die n Summen entsprechend den n Probeninjektionen durch die Computereinrichtung,

   

   mit j = 1 bis n, aus den gesammelten Konzentrati onsdatenwerten c_j über sämtliche Konzentrationselutionselemente von jeder Probenverdünnung j zu bilden; H) die überschüssigen Rayleigh-Verhältnisse R_ij(θ_k) aus den gesammelten Lichtstreudaten bei jedem Streuwinkel θ_k für jede Probenverdünnung j und jede Elution i zu berechnen; I) die n Summen

   

   mit j = 1 bis n für jeden Streuwinkel θ_k und jede Probenverdünnung j durch die Computereinrichtung über sämtliche Lichtsteuelutionselemente i der Probenverdünnung j zu bilden; J) die Verhältnisse D_j/C_j = κ_j zu bilden; K) die Verhältnisse κ_j und die Summen

   

   für sämtliche Winkel k und n Probenverdünnungen zu verwenden, um die molare Gewichtsdurchschnittsmasse, den mittleren quadratischen Radius und den zweiten Virialkoeffizienten der unfraktionierten Probe abzuleiten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die molare Gewichtsdurchschnittsmasse, der mittlere quadratische Radius und der zweite Virialkoeffizient der Probe dadurch abgeleitet werden, dass a)

   

   durch statistische Mittel an die Funktion

   

   anzupassen, wobei N_θ der maximale Grad der angepassten Winkelabweichung und N_κ der maximale Grad der anzupassenden Abweichung von κ ist; b) hieraus die Koeffizienten a₀₀, a₀₁ und a₁₀ bestimmt werden; und c) die molare Gewichtsdurchschnittsmasse auf M_w = 1/a₀₀, den mittleren quadratischen Radius auf < r 2 / g > = a₀₁/2 und den zweiten Virialkoeffizienten auf

   

   zu setzen.
3. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die molare Gewichtsdurchschnittsmasse, der mittlere quadratische Radius und der zweite Virialkoeffizient der Proben aus einem Plot abgeleitet werden, wobei a) die Daten für jeden Winkel als eine Funktion von κ_j an

   

   angepasst werden, wobei a_l,k Anpassungsparameter sind und N_l die Ordnung der Konzentrationsanpassung ist; b) die Daten für jede Injektion an

   

   angepasst werden, wobei b_j,m Anpassungsparameter sind und N_m die Ordnung der Winkelanpassung ist; c) die Anpassungskoeffizienten anschließend an

   

   

   angepasst werden, wobei u_m und ν_l Anpassungskoeffizienten sind; und d) die molare Gewichtsdurchschnittsmasse von M_w= 1/u₀ oder M_w = 1/v₀ oder dem Durchschnittswert

   

   abgeleitet wird, e) der zweite Virialkoeffizient A₂ = v_l/2 ist und f) der mittlere quadratische Radius

   
4. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Faktoren D_j der Verhältnisse D_j/C_j = κ_j für eine Bandverbreiterung korrigiert worden sind.
5. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Mehrfachwinkellichtstreuerfassungseinrichtung durch eine Einzelwinkellichtstreuerfassungseinrichtung bei einem ausgewählten Winkel θ ersetzt wird und die Summen

   

   entsprechend für einen einzelnen Winkel gebildet werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem die Einzelwinkellichtstreuerfassungseinrichtung bei einem Winkel θ = 90° vorgesehen ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Konzentrationserfassungseinrichtung ein Differenzialbrechungsindex(DRI)-Detektor ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Konzentrationserfassungseinrichtung ein Ultraviolet(UV)-Absorptionsdetektor ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Konzentrationserfassungseinrichtung ein Verdampfungslichtstreudetektor ist.
10. Verfahren nach mindestens einem der vorangegangenen Ansprüche, bei welchem die Probe durch Dialyse und Fraktionierung vorbereitet wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, bei welchem eine Gruppe SEC-Säulen und/oder eine Überwachungssäule zur gleichzeitigen Dialyse und Fraktionierung der Probe und zur Beseitigung von Aggregaten verwendet werden.