-
GEBIET DER ERFINDUNG
-
Die vorliegende Erfindung betrifft
die Behandlung einer mit einer Helicobacter pylori-Infektion in
Verbindung stehenden Gastroduodenalerkrankung und sie betrifft insbesondere
die Verwendung einer aktiven Immunisierung als Behandlung einer
mit H. pylori in Verbindung stehenden Gastroduodenalerkrankung.
-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Das Bakterium Helicobacter pylori
ist nun als Hauptpathogen des Magen-Zwölffingerdarm-Trakts klar nachgewiesen,
und mehr als 50% der Weltbevölkerung
sind mit diesem Organismus, der Gastritis unterschiedlicher Schwere
verursacht, infiziert. Während
bei einem großen
Teil infizierter Personen keine Symptome offensichtlich sind, kann
dies bei einer signifikanten Zahl von mit H. pylori infizierten
Personen zu einer offenkundigen Erkrankung führen. Die Mehrheit (95 %) von
Zwölffingerdarmgeschwüren steht
in Verbindung mit einer H. pylori-Infektion; eine kausale Rolle
wird durch Behandlungsstudien gezeigt, die angeben, dass, wenn die Organismen
zum Zeitpunkt der Geschwürheilung
beseitigt werden können,
die Geschwüre
dann nicht wiederkehren - im Gegensatz zu einer Rate des Wiederauftretens
von 80% nach einem Jahr bei denjenigen, die mit den Organismen infiziert
bleiben. Ferner wird angenommen, dass bis zu 80% der Magengeschwüre mit H.
pylori in Verbindung stehen (Blaser, 1992).
-
Es gibt nun zunehmende Beweise für die schädlichen
Folgen einer langdauernden X. pylori-Infektion. In Ländern, wie China,
Kolumbien und Japan, wird das Bakterium sehr frühzeitig während des Lebens aufgenommen,
und bei diesen Personen schreitet die Gastritis langsam fort, bis
nach 30– 40
Jahren einer kontinuierlichen Infektion eine schwere Magenatrophie
auftritt. Es ist dokumentiert, dass Magenatrophie die Vorläuferschädigung für Magenkrebs
ist, obwohl der tatsächliche
Krebs, der sich in einem Magen mit Atrophie entwickelt, von einer
Vielzahl von anderen Faktoren einschließlich der Ernährung abhängt. Jedoch
legen alle bisherigen Anzeichen nahe, dass sich der Krebs nicht
entwickelt, wenn es möglich
ist, die H. pylori-Infektion in einem frühen Stadium, bevor sich die
Atrophie entwickelt hat, zu entfernen (Parsonnet et al., 1991).
-
Es gibt kein Labortiermodell einer
H. pylori-Infektion, das zum Testen neuer Anti-H. pylori-Therapien in
großem
Maßstab
verwendet werden kann. Jedoch wurde ein Helicobacter felis-Mausmodell einer
Magen-Helicobacter-Infektion entwickelt, das sich zum Screening
des Potentials neuer antimikrobieller therapeutischer Protokolle
als äußerst günstig erwies.
N. felis ist ein spiralförmiges
Bakterium, das mit H. pylori nahe verwandt ist. Dieses Bakterium
besiedelt den Magen von Mäusen
in einer zu H. pylori beim Menschen sehr ähnlichen Weise, d. h. die hauptsächliche ökologische
Nische ist die Magenschleimhaut und die Lokalisierung der Besiedelung
ist antral dominiert. Bei keimfreien Mäusen induziert eine H. felis-Infektion
eine Gastritis, die sehr ähnlich
der humanen H, pylori-Infektion mit einer chronischen Entzündung, die
von einer Infiltration polymorpher nukleärer Leukozyten begleitet ist,
ist. Eine Infektion mit jedem dieser Organismen führt zur
Induktion einer ähnlichen
entwickelten Immunantwort gegen H, pylori bzw. H. felis (Lee et
al., 1990).
-
Das H. felis-Mausmodell erwies sich
als sehr günstig
bezüglich
der Vorhersehbarkeit der Wirksamkeit von Anti-H. pylori-Mitteln
bei Menschen. So zeigt eine Monotherapie mit Mitteln mit hoher In-vitro-Aktivität, wie Erythromycin,
keine signifikante In-vivo-Wirkung gegen H. felis bei Mäusen, genauso
wie Erythromycin keine Anti-H. pylori-Wirkung bei Menschen trotz
hoher antimikrobieller Wirkungen in vitro hat. Im Gegensatz dazu führen die
Dreifachtherapieprotokolle mit einer Bismutverbindung, Metronidazol
und Tetracyclin oder Amoxycillin zu einer sehr hohen Beseitigungsrate
in mit X. felis infizierten Mäusen
(Dick-Hegedus und Lee, 1991). Derartige Dreifachtherapien sind die
erfolgreichsten humanen Anti-H. pylori-Protokolle und sie werden
derzeit als erste Wahl für
eine Anti-H. pylori-Therapie empfohlen. Entwickelte Helicobacter-Infektionen
sind jedoch schwierig zu behandeln und die derzeitigen chemotherapeutischen
Protokolle bleiben aufgrund von Problemen mit der Wirksamkeit, Toxizität, Arzneimittelresistenz
und Neuinfektion suboptimal (O'Connor,
1992).
-
Eine aktive Immunisierung von bereits
infizierten Patienten erwies sich für keine klinisch manifestierte humane
infektiöse
Erkrankung als wirksam (Burke, 1992). Da feststeht, dass H. pylori-Infektionen über lange Zeiträume, falls
nicht sogar über
die Lebensdauer des infizierten Individuums trotz des Vorhandenseins
einer kräftigen
Immunreaktion, die hohe Spiegel von zirkulierendem IgE-Antikörper im
Serum und den Nachweis von lokalem spezifischem IgA-Antikörper in
der Magenschleimhaut umfasst, bestehen bleiben, wurde angenommen,
dass es unwahrscheinlich ist, dass eine aktive Immunisierung bei
einer Therapie wirksam ist (Goodwin, 1993). Tatsächlich legten Czinn et al.
(1993), die vorschlugen, dass eine orale Impfung ein durchführbarer
Ansatz zur Prophylaxe einer X. pylori-Infektion bei Menschen sein
kann (auf der Grundlage der Bewertung eines oralen Immunisie rungsprotokolls
im H. felis-Mausmodell), nahe, dass, sobald eine Infektion erfolgt
ist, weder Antikörper
noch Antibiotoka zur Beseitigung sehr wirksam sind.
-
Varga et al. (1992) berichteten,
dass ein aus von einem Patienten stammenden Organismen hergestellter
X. pylori-Impfstoff, der parenteral dem Patienten injiziert wurde,
zu einer allergischen Reaktion und einem Nichterfolg zur Beseitigung
des Organismus führte.
-
Überraschenderweise
wurde nun zum erstenmal entdeckt, dass tatsächlich ein therapeutisches
Potential zur aktiven Immunisierung gegen eine Helicobacter-Infektion
vorhanden ist. Ferner wurde entdeckt, dass die orale Verabreichung
von H. pylori-Antigen mit einem geeigneten auf die Schleimhaut wirkenden
Adjuvans nicht zu allergischen oder Überempfindlichkeitssymptomen
führt,
sondern zu einer Unterdrückung
oder Beseitigung der infizierenden Organismen von der Magenschleimhaut
führt.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden
Erfindung erfolgt die Bereitstellung der Verwendung einer immunologisch
wirksamen Menge eines Helicobacter-Antigens zur Herstellung eines
Medikaments zur Verabreichung an einen Säugetierwirt in Verbindung mit
einem auf die Schleimhaut wirkenden Adjuvans zur Beseitigung oder
Unterdrückung
einer bereits bestehenden Helicobacter-Infektion in dem Wirt.
-
Durchgängig durch diese Beschreibung
und die folgenden Ansprüche
sollen, falls der Zusammenhang dies nicht anders erfordert, das
Wort "umfassen" oder Variationen,
wie "umfasst" oder "umfassend" implizieren, dass
eine angegebene ganze Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen eingeschlossen sind,
jedoch nicht jede andere ganze Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen
ausgeschlossen ist.
-
Die Verwendung des Ausdrucks "immunologisch wirksame
Menge" bedeutet
hier und im folgenden, dass die Verabreichung dieser Menge an einen
individuellen infizierten Wirt entweder in einer Einzeldosis oder als
Teil einer Reihe zur Behandlung einer Helicobacter-Infektion wirksam
ist. Diese Menge variiert in Abhängigkeit
von der Gesundheit und dem physischen Zustand des zu behandelnden
Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums,
der Fähigkeit
des Immunsystems des Individuums zur Synthese von Antikörpern, dem
Grad des gewünschten
Schutzes, der Formulierung des Impfstoffs, der Feststellung der
medizinischen Situation und anderen relevanten Faktoren. Es wird
angenommen, dass die Menge in einen relativ breiten Bereich, der
durch Routineversuche bestimmt werden kann, fällt.
-
DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Das Helicobacter-Antigen bzw. die
Helicobacter-Antigene, die gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, können
ein X. felis-Antigen bzw. H. felis-Antigene oder vorzugsweise ein
H. pylori-Antigen bzw. H. pylori-Antigene sein. In einem besonders
bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Impfstoffzusammensetzung,
die ein H. pylori-Antigen bzw. H. pylori-Antigene in Verbindung
mit einem auf die Schleimhaut wirkenden Adjuvans umfasst, zur Behandlung
einer H. pylori-Infektion bei einem Menschen als Patient verwendet.
-
Das Helicobacter-Antigen bzw. die
Helicobacter-Antigene umfassen zweckmäßigerweise ein Bakterienultraschallbehandlungsprodukt
und insbesondere ein Ultraschallbehandlungsprodukt von H. pylori.
Vorzugsweise umfassen das Helicobac ter-Antigen bzw. die Helicobacter-Antigene,
die gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendet werden, inaktivierte ganze Bakterienzellen von X. pylori.
-
Alternativ können das Helicobacter-Antigen
bzw. die He1icobacter-Antigene, die gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendet werden, ein oder mehrere individuelle Antigene, insbesondere
ein oder mehrere X. pylori-Antigene, wie H. pylori-Urease oder H.
pylori-Cytotoxin (CT), Cytotoxin Associated Immunodominant(CAI)-Antigen
oder Hitzeschockprotein (hsp), die beispielsweise in der internationalen
Patentveröffentlichung
Nr. WO 93/18150 offenbart sind, umfassen.
-
Ein auf die Schleimhaut wirkendes
Adjuvans, das optional und vorzugsweise mit dem Helicobacter-Antigen
bzw. den Helicobacter-Antigenen dem infizierten Wirt verabreicht
wird, ist Choleratoxin. Ein weiteres bevorzugtes, auf die Schleimhaut
wirkendes Adjuvans, das mit dem Helicobacter-Antigen bzw. den Helicobacter-Antigenen
verabreicht werden kann, ist wärmelabiles
Toxin von E. coli (E. coli HLT). Von Choleratoxin und E. coli HLT
verschiedene, auf die Schleimhaut wirkende Adjuvantien, die gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
umfassen nichttoxische Derivate von Choleratoxin, wie das chemisch
modifizierte B-Subeinheit
CTB-Choleratoxin (CTB) oder verwandte Proteine, die durch Modifizierung
der Aminosäuresequenz
des Choleratoxins gebildet wurden. Jedes dieser Moleküle mit Schleimhautwirkungs-
oder -abgabeeigenschaften können
dem Helicobacter-Antigen bzw. den Helicobacter-Antigenen zugesetzt
oder mit diesen konjugiert werden. Andere Verbindungen mit Schleimhautwirkungs-
oder -abgabeaktivität
können
verwendet werden, beispielsweise: Galle; Polykationen, wie DEAE-Dextran und Polyornithin;
Netzmittel, wie Natriumdodecylbenzolsulfat; lipidkonjugierte Materialien;
Antibiotika, wie Streptomycin; Vitamin A; und andere Verbindungen,
die die strukturelle oder funktionelle Integrität von Schleimhautoberflächen verändern. Andere schleimhautaktive
Verbindungen umfassen Derivate von mikrobiellen Strukturen, wie
MDP; Acridin und Cimetidin.
-
Helicobacter-Antigen bzw. Helicobacter-Antigene
können
gemäß der vorliegenden
Erfindung in ISCOMS (immunstimulierenden Komplexen), CTB enthaltenden
ISCOMS, Liposomen oder eingekapselt in Verbindungen, wie Acrylaten
oder Poly(DL-lactid-co-glycosid),
unter Bildung von Mikrokügelchen
einer zur Adsorption durch M-Zellen geeigneten Größe zugeführt werden.
Alternativ können
Mikro- oder Nanopartikel an Moleküle, wie Vitamin B12, die spezifische
Darmrezeptoren aufweisen, kovalent gebunden werden. Antigen bzw.
Antigene können
auch in Ölemulsionen
eingearbeitet und oral zugeführt
werden. Eine umfangreiche, wenn auch nicht erschöpfende Liste von Adjuvantien
findet sich bei Cox und Coulter, 1992.
-
Andere Adjuvantien sowie herkömmliche
pharmazeutisch akzeptable Träger,
Streckmittel, Puffer oder Verdünnungsmittel
können
ebenfalls in die therapeutische Impfstoffzusammensetzung eingearbeitet
werden. Die Impfstoffzusammensetzung kann beispielsweise in enterischen
beschichteten Gelatinekapseln, die Natriumbicarbonatpuffer zusammen
mit dem Helicobacter-Antigen bzw. Helicobacter-Antigenen und auf
die Schleimhaut wirkenden Adjuvans umfassen, formuliert sein.
-
Im allgemeinen umfasst die Impfstoffzusammensetzung
eine immunologisch wirksame Menge eines Helicobacter-Antigens bzw.
von Helicobacter-Antigenen und optional ein auf die Schleimhaut
wirkendes Adjuvans in Verbindung mit einem oder mehreren herkömmlichen
pharmazeutisch akzeptablen Trägern
und/oder Verdünnungsmitteln.
Der hier verwendete Ausdruck "pharmazeutisch
akzeptable Träger
und/oder Verdünnungsmittel" umfasst beliebig
Lösemittel,
Dispersionsmedien, wässrige
Lösungen,
Beschichtungen, antibakterielle und Antifungusmittel, isotonische
und Absorptionsverzögerungsmittel
und dgl. Die Verwendung derartiger Medien und Mittel für pharmazeutisch
wirksame Substanzen ist einschlägig
bekannt und beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage,
1990, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA beschrieben.
-
Die pharmazeutische Zusammensetzung
kann dem Säugetierwirt
beispielsweise mit einem inerten Verdünnungsmittel oder mit einem
assimilierbaren essbaren Träger
direkt oral verabreicht werden, oder sie kann in einer Gelatinekapsel
mit harter oder weicher Hülle
eingeschlossen sein oder zu Tabletten gepresst sein oder direkt
mit einem festen oder flüssigen
Nahrungsmittel der Ernährung
eingearbeitet sein. Zur oralen therapeutischen Verabreichung kann
die aktive Verbindung mit Streckmitteln versetzt sein und in Form
von einnehmbaren Tabletten, Lutschtabletten, Pastillen, Kapseln,
Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Oblaten und dgl. verwendet werden.
Der Prozentgehalt der aktiven Komponente in den Zusammensetzungen
und Zubereitungen kann natürlich
variiert werden und er ist derart, dass eine geeignete Dosis, die
immunologisch wirksam ist, erhalten wird.
-
Feste orale Dosierungseinheiten,
wie Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und dgl., können auch
die folgenden Bestandteile enthalten: ein Bindemittel, wie Tragantgummi,
Akaziengummi, Maisstärke
oder Gelatine; Streckmittel, wie Dicalciumphosphat; ein den Zerfall
förderndes
Mittel, wie Maisstärke,
Kartoffelstärke,
Alginsäure
und dgl.; ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat; und ein Süßungsmittel,
wie Saccharose, Lactose oder Saccharin, oder ein Aromatisierungsmittel,
wie Pfefferminze; Wintergrünöl oder Kirschgeschmack,
können
zugesetzt werden. Wenn die Dosierungseinheitsform eine Kapsel ist,
kann sie zusätzlich
zu den Materialien der obigen Art einen flüssigen Träger enthalten. Verschiedene
andere Materialien können
als Beschichtungen oder zur sonstigen Modifizierung der physischen
Form der Dosierungseinheit vorhanden sein. Beispielsweise können Tabletten,
Pillen oder Kapseln mit Schellack, Zucker oder beidem beschichtet
sein. Ein Sirup oder Elixier kann die aktive Komponente, Saccharose
als Süßungsmittel,
Methyl- und Propylparabene als Konservierungsmittel, einen Farbstoff
und Aromastoff, wie Kirsche oder Orangengeschmack, enthalten. Natürlich sollte
jedes Material, das bei der Herstellung einer Dosierungseinheit
verwendet wird, pharmazeutisch rein und in den verwendeten Mengen
im wesentlichen nichttoxisch sein.
-
Die Impfstoffzusammensetzung kann
oral (in Mengen, die von Personen üblicher Erfahrung auf diesem
Gebiet ohne weiteres bestimmt werden) verabreicht werden. So ist
eine geeignete Dosierung für
Erwachsene im Bereich von 10 μg
bis 10 g, beispielsweise 50 μg
bis 3 g. Ähnliche
Dosierungsbereiche sind für
Kinder verwendbar.
-
Wie im vorhergehenden angegeben,
ist ein geeignetes, auf die Schleimhaut wirkendes Adjuvans Choleratoxin.
Die zu verwendende Menge des auf die Schleimhaut wirkenden Adjuvans
hängt von
der Art des verwendeten, auf die Schleimhaut wirkenden Adjuvans
ab. Beispielsweise wird, wenn das auf die Schleimhaut wirkende Adjuvans
Choleratoxin ist, dieses günstigerweise
in einer Menge von 10 ng bis 50 μg,
beispielsweise 0,1 μg
bis 10 μg,
verwendet. Wenn das auf die Schleimhaut wirkende Adjuvans das wärmelabile
Toxin von E. coli ist, sind geeignete Mengen 1 μg bis 1 mg, beispielsweise 5 μg bis 50 μg.
-
Bei den zur vorliegenden Erfindung
führenden
Arbeiten führte
die aktive Immunisierung von zuvor mit H. felis infizierten Mäusen mit
oralen Dosisgaben von Choleratoxin oder E. coli-HLT-Adjuvans und
einem Ultraschallbehandlungsprodukt von ganzen Zellen von H. felis
oder H. pylori zur Clearance von H. felis von der Magenschleimhaut.
Es wird daher angenommen, dass die aktive Immunisierung von infizierten
Menschen mit oralen Dosisgaben eines auf die Schleimhaut wirkenden
Adjuvans mit H. pylori-Antigen bzw. H. pylori-Antigenen zur Clearance
von H. pylori von der Magenschleimhaut führt. Auf der Grundlage von
früheren
Untersuchungen mit diesem Modell unter Verwendung von Anti-H. pylori-Mitteln
wird angenommen, dass dies der erste Nachweis des therapeutischen
Potentials einer aktiven Immunisierung mit H. pylori-Impfstoffen
ist, und anzeigt, dass eine Impfstoffzusammensetzung zur Therapie
einer humanen, mit H. pylori in Verbindung stehenden Gastroduodenalerkrankung
eine Zubereitung von einem Helicobacter-Antigen bzw. Helicobacter-Antigenen,
die optional und vorzugsweise mit einem auf die Schleimhaut wirkenden
Adjuvans kombiniert sind, ist.
-
Fachleuten auf diesem Gebiet ist
klar, dass die wirksame Behandlung einer Helicobacter pylori-Infektion
bei Menschen mit einer oralen Impfstoffzusammensetzung mit einem
Helicobacter-Antigen bzw. Helicobacter-Antigenen, die die Infektion
beseitigt oder unterdrückt,
einen signifikanten therapeutischen Vorteil durch die Unterdrückung oder
Beseitigung von Gastritis, die Prävention des Neuauftretens von
Magengeschwüren und
die Verringerung der schädlichen
Folgen einer Helicobacter-pylori-Infektion einschließlich von
Magengeschwürbildung
und Magenkrebs bietet.
-
Die vorliegende Erfindung wird in
den folgenden nicht beschränkenden
Beispielen weiter erläutert.
-
BEISPIEL 1
-
160 weibliche SPF-Mäuse von
der Animal Breeding Unit der University of New South Wales, Australia, wurden
mit 4 oralen Dosisgaben von 109–1010 lebenden Helicobacter felis (ATCC-Kultur
49179), die im Abstand von zwei Tagen gegeben wurden, infiziert.
-
Die Bakterien wurden in Kunststoffpetrischalen
auf Blood Agar Base Nr. 2, 3,8% Gew/V (Oxoid, Basingstoke, UK) mit
7 (V/V) Vollpferdeblut (Oxoid), das 2,5 mg/l Amphothericin B (Fungizone,
Squibb, Princeton, N. J., USA) enthielt, 10 mg/l Trimethoprin (Sigma,
St. Louis, MO, USA) enthielt, gezüchtet. Die Platten wurden in
einer mikroaerophilen feuchten Atmosphäre (Oxoid, BR 56) bei 37°C während 48
h inkubiert.
-
Ultraschallbehandlungsprodukte wurden
durch Züchten
der Organismen wie im vorhergehenden beschrieben und anschließendes Ernten
der Organismen in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt.
Die Zellen wurden gewaschen, durch Zentrifugieren gewonnen, einmal
in PBS gewaschen und erneut in frischem PBS suspendiert. Die Zellen
wurden dann mit einer Rate von 1 min pro ml Zellsuspension (50%
Duty-Zyklus) unter Verwendung eines B-30 Branson Cell Disruptor
ultraschallbehandelt. Das Ultraschallbehandlungsprodukt wurde bei –20°C aufbewahrt.
-
An den Tagen 28, 42, 44 und 47 nach
der Verabreichung der letzten Infektionsdosis von H. felis erhielten
20 der Mäuse
oral 0,2 ml einer Suspension, die 10 μg Choleratoxin (Sigma C 3012)
und ein 1 mg Protein enthaltendes Ultraschallbehandlungsprodukt
von H. felis (BIO-RAD DC-Proteintest) enthielt.
-
Proben der antralen Mucosa wurden
unter Verwendung eines schnellen Mikrotiterureasetests, der bereits
beschrieben wurde (Lee et al., 1990), auf eine Infektion getestet.
Für diesen
Test war validiert worden, dass er eine Mageninfektion von H. felis
in hohem Maße
vorhersagt. Gruppen von 40 Mäusen
(20 Impflinge und 20 Kontrollen) wurden in Abständen von 1 Woche, 1 Monat,
2 Monaten und 3 Monaten nach der letzten Impfstoffdosis euthanasiert.
-
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1
angegeben.
-
Die Ergebnisse zeigen, dass eine
Behandlung von mit H. felis infizierten Mäusen mit einem oralen Impfstoff,
der Helicobacter-Antigene und ein auf die Schleimhaut wirkendes
Adjuvans umfasste, zur Heilung der Infektion in einem signifikanten
Anteil der Mäuse
führte.
Diese Wirkung ist eine Woche nach der Beendigung der Therapie offensichtlich
und sie dauert mindestens 3 Monate an, was belegt, dass die Mäuse von
ihrer Infektion geheilt wurden. TABELLE
1
-
BEISPIEL 2
-
Hundert weibliche BALB/c-Mäuse von
der Animal Breeding Unit der University of New South Wales, Australien,
wurden mit 3 oralen Dosisgaben von 108 lebenden
Helicobacter fells (ATCC-Kultur 49179), die im Abstand von 2 Tagen,
d. h. an den Tagen 1, 3 und 5, gegeben wurden, infiziert.
-
Die Bakterien wurden in Kunststoffpetrischalen
auf Blood Agar Base Nr. 2, 3,8% Gew/V (Oxoid, Basingstoke, UK) mit
7 (V/V) Vollpferdeblut (Oxoid), das 2,5 mg/l Amphothericin B (Fungizone,
Squibb, Princeton, N. J., USA), 10 mg/l Trimethoprim (Sigma, St.
Louis, MO, USA) enthielt, gezüchtet.
Die Platten wurden in einer mikroaerophilen feuchten Atmosphäre (Oxoid,
BR 56) bei 37°C
während
48 h inkubiert.
-
Ultraschallbehandlungsprodukte wurden
durch Züchten
der Organismen wie im vorhergehenden beschrieben und anschließendes Ernten
der Organismen in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt.
Die Zellen wurden gewaschen, durch Zentrifugieren gewonnen, einmal
in PBS gewaschen und erneut in frischem PBS suspendiert. Die Zellen
wurden dann mit einer Rate von 1 min pro ml Zellsuspension (50%
Duty-Zyklus) unter Verwendung eines B-30 Branson Cell Disruptor
ultraschallbehandelt. Das Ultraschallbehandlungsprodukt wurde bei –20°C aufbewahrt.
-
Am Tag 21, 35, 37 und 40 nach der
Verabreichung der letzten infizierenden Dosis von H. felis erhielten 20
Mäuse jeweils
oral 0,2 ml einer Suspension, die 10 μg Choleratoxin (Sigma C 3012)
enthielt, 20 Mäuse
jeweils oral 0,2 ml einer Suspension, die 10 μg Choleratoxin und ein Ultraschallbehandlungsprodukt
von H. fells, das 1 mg Protein enthielt (BIO-RAD DC-Proteintest), enthielt, 20 Mäuse jeweils
oral 0,2 ml einer Suspension, die ein Ultraschallbehandlungsprodukt
von X. felis, das 1 mg Protein enthielt, enthielt, 20 Mäuse jeweils
oral 0,2 ml einer Suspension, die 10 μg Choleratoxin und ein Ultraschallbehandlungsprodukt
von H. pylori (Stamm 921023), das 1 mg Protein enthielt, enthielt,
und 20 Mäuse
wurden nicht oral geimpft.
-
Eine Woche nach der letzten Immunisierungsdosis
wurden alle Mäuse
euthanasiert. Proben der antralen Mucosa wurden unter Verwendung
eines schnellen Mikrotiterureasetests, der bereits beschrieben wurde (Lee
et al., 1990), auf eine Infektion getestet. Für diesen Test war validiert
worden, dass er eine H. fells-Mageninfektion in hohem Maße vorhersagt.
-
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2
angegeben.
-
Diese Ergebnisse zeigen, dass die
orale Verabreichung von von entweder H. fells oder X. pylori stammenden
Helicobacter-Antigenen zusammen mit einem auf die Schleimhaut wirkenden
Adjuvans einen signifikanten Teil von mit H. fells infizierten Mäusen heilt. TABELLE
2
-
BEISPIEL 3
-
Hundert weibliche SPF-Mäuse von
der Animal Breeding Unit der University of New South Wales, Australien,
wurden mit 4 oralen Dosen von 109–1010 lebenden Helicobacter felis (ATCC-Kultur 49179), die
im Abstand von 2 Tagen gegeben wurden, infiziert. 20 weibliche SPF-Mäuse wurden
als negative Kontrollen ohne Infektion gelassen.
-
Die Bakterien wurden in Kunststoffpetrischalen
auf Blood Agar Base Nr. 2, 3,8% Gew/V (Oxoid, Basingstoke, UK) mit
7 (V/V) Vollpferdeblut (Oxoid), das 2,5 mg/l Amphothericin B (Fungizone,
Squibb, Princeton, N. J., USA), 10 mg/l Trimethoprim (Sigma, St.
Louis, MO, USA) enthielt, gezüchtet.
Die Platten wurden in einer mikroaerophilen feuchten Atmosphäre (Oxoid,
BR 56) bei 37°C
während
48 h inkubiert.
-
Ultraschallbehandlungsprodukte wurden
durch Züchten
der Organismen wie im vorhergehenden beschrieben und anschließendes Ernten
der Organismen in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt.
Die Zellen wurden gewaschen, durch Zentrifugieren gewonnen, einmal
in PBS gewaschen und erneut in frischem PBS suspendiert. Die Zellen
wurden dann mit einer Rate von 1 min pro ml Zellsuspension (50%
Duty-Zyklus) unter Verwendung eines B-30 Branson Cell Disruptor
ultraschallbehandelt. Das Ultraschallbehandlungsprodukt wurde bei –20°C aufbewahrt.
-
Beginnend zwischen 6 Wochen und 9
Wochen nach der letzten infizierenden Dosis von H. felis erhielten
20 Mäuse
jeweils oral 0,2 ml einer Lösung,
die 25 μg
wärmelabiles
Toxin (HLT) von E. coli (Sigma E 8015) enthielt, 20 Mäuse jeweils
oral 0,2 ml einer Suspension, die 25 μg HLT und 1 mg Protein (BIO-RAD
DC-Proteintest) enthaltendes Ultraschallbehandlungsprodukt von H.
pylori enthielt, 20 Mäuse
jeweils oral 0,2 ml einer Suspension, die ein 1 mg Protein enthal tendes
Ultraschallbehandlungsprodukt von H. pylori enthielt, und 40 Mäuse wurden
nicht oral geimpft.
-
Jede Gruppe erhielt 15, 17 und 20
Tage nach deren Anfangsdosis drei weitere Dosisgaben.
-
Vier Wochen nach der letzten Immunisierungsdosis
wurden alle Mäuse
euthanasiert. Proben der antralen Mucosa wurden unter Verwendung
eines schnellen Mikrotiterureasetests, der bereits beschrieben wurde (Lee
et al., 1990), auf eine Infektion getestet. Für diesen Test war validiert
worden, dass er eine H. felis-Mageninfektion in hohem Maße vorhersagt.
-
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3
angegeben.
-
Sie zeigen, dass eine orale Verabreichung
von von H. pylori stammenden Helicobacter-Antigenen zusammen mit
einem auf die Schleimhaut wirkenden Adjuvans von wärmelabilem
Toxin von E. coli einen signifikanten Teil von mit H. felis infizierten
Mäusen
heilt. TABELLE
3
-
LITERATURVERWEISE:
-
M. J. Blaser (1992). Helicobacter
pylori: Its role in disease. Clin. Infect. Dis. 15, 386–393.
D.
S. Burke (1993). Of postulates and peccadilloes: Robert Koch and
vaccine (tuberculin) therapy for tuberculosis. Vaccine, 11, 795–804.
J.
Cox and A. Coulter (1992). Advances in Adjuvant Technology and Application.
In Animal Parasite Control Utilising Biotechnology. Hrsg. W. K.
Yong, CRC Press.
S. J. Czinn, A. Cai and J. G. Nedrud (1993).
Protection of germ-free mice from infection by Helicobacter felis after
active oral or passive IgA immunization. Vaccine, 11, 637– 642.
E.
Dick-Hegedus and A. Lee (1991). Use of a mouse model to examine
anti-Helicobacter pylori agents. Scand. J. Gastroentol. 26, 909–915.
C.
S. Goodwin (1993). Overview of Helicobacter pylori gastritis, peptic
ulcer, and gastric cancer and the possible development of an H.
pylori vaccine. In Helicobacter pylori Biology and Clinical Practice.
Hrsg. Goodwin and Worsley. CRC Press.
A. Lee, J. G. Fox, G.
Otto and J. Murphy (1990). A small aminal model of human Helicobacter
pylori active in chronic gastritis. Gastroenterology, 99, 1316–1323.
H.
J. O'Connor (1992).
Eradication of Helicobacter pylori: Therapies and clinical implications.
Postgrad. Med. J. 68, 549–557.
J.
Parsonnet, G. D. Friedman, D. P. Vandersteen, Y. Chang, H. J. Vogeluran,
N. Orentreich und R. K. Sibley (1991). Helicobacter pylori infection
and the risk of gastric carcinoma. N. Engl. J. Med. 325, 1127–1131.
L.
Varga, Z. Löcsei,
Z. Döbrönte, F.
Lakatos, M. Brözik
und K. Meretey (1992). Helicobacter pylori allergy. Orv. Hetil.
133, 359-361.
