Erfindungsgebiet
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Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Durchmustern
prophylaktischer und therapeutischer Mittel für IgE-abhängige
Erkrankungen und dessen Verwendung.
Hintergrund der Erfindung
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Vor kurzem - als der Mechanismus allergischer Reaktionen
aufgeklärt worden ist - wurde der Rolle von IgE
Aufmerksamkeit zuteil, und die Entwicklung verschiedener
antiallergischer Medikamente mit einem Abzielen auf IgE wurde
nachdrücklich durchgeführt. Bei der Entwicklung eines
antiallergischen Medikaments ist das Durchmustern von
Kandidatensubstanzen von Wichtigkeit.
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Ein Ansatz hierfür umfaßt das Induzieren einer IgE-
vermittelten allergischen Reaktion und dem Testen, um zu
sehen, wie weit diese Reaktion gehemmt werden kann. So ein
Ansatz schließt ein Verfahren ein, daß die Verwendung von
Tieren umfaßt, die einer passiven Immunisierung mit
gereinigtem IgE unterworfen werden, oder Tiere, die einer
aktiven Immunisierung mit einem Antigen als Modelltiere
unterworfen werden. Beide Verfahren sind nützlich, sind aber
nicht dafür geeignet, eine allergische Reaktion wiederholt zu
induzieren, um die hemmende Wirkung der Testsubstanz zu
untersuchen.
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Daher muß in der zuerst genannten Methode IgE wiederholt
verabreicht werden, um wiederholt eine allergische Reaktion
induzieren zu können, mit dem Ergebnis, daß ein
Medikamentendurchmustern nicht zweckdienlicherweise
durchgeführt werden kann.
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Das zuletztgenannte Verfahren ist ebenfalls nachteilig, da,
obwohl eine allergische Reaktion wiederholt induziert werden
kann, nicht nur das Antigen-spezifische IgE, sondern auch
andere Antikörper, wie beispielsweise die eine Reaktion
beeinflussenden Antigen-spezifischen IgE etc. in dem Körper
produziert werden, so daß die inhibitorische Wirkung auf IgE-
vermittelte allergische Reaktionen nicht genau abgeschätzt
werden kann. E. Kilchherr et al. beschreiben die Regulierung
der humanen IgE-Antwort in hu-PBL-SCID-Mäusen (Cellular
Immunology 151, 241-256 (1993)).
Zusammenfassung der Erfindung
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Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist, die oben genannten
Probleme zu lösen, und ein Tiermodell zur Verfügung zu
stellen, das die wiederholte Beobachtung von IgE-vermittelten
allergischen Reaktionen und das zweckdienliche Durchmustern
von prophylaktischen und therapeutischen Mitteln für IgE-
abhängige Erkrankungen ermöglicht, und ein Verfahren zum
Durchmustern prophylaktischer und therapeutischer Mittel für
IgE-abhängige Erkrankungen unter dessen Verwendung.
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Das oben erwähnte Ziel kann, durch ein Verfahren zum
Durchmustern prophylaktischer und therapeutischer Mittel für
IgE-abhängige Erkrankungen unter Verwendung eines
Nagetiermodells erreicht werden, das konstruiert wird, indem
eine IgE-produzierende vegetative Zelle in einen nicht-
abstoßenden Nager implantiert wird, um eine IgE-abhängige
allergische Reaktion auszulösen, die durch die
transplantierten Zellen verursacht wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 zeigt graphisch den zeitlichen Verlauf von
Antitrinitrophenyl (TNP)·IgE-Niveaus im Blut, das von jeder
Maus gesammelt wurde, in die das anti-TNP·IgE-produzierende
Hybridem IGELa2 transplantiert worden ist, oder nicht
transplantiert worden ist. In Fig. 1 zeigt A die Ergebnisse
der nicht-transplantierten Gruppe, B zeigt die Ergebnisse von
10&sup6; IGELa2-transplantierten Gruppen und C zeigt die
Ergebnisse der 10&sup7; IGELa2-transplantierten Gruppe.
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Fig. 2 zeigt die Ergebnisse der Ohrschwellung in
Antigengeforderten Mäusen, in die anti-TNP·IgE-produzierende
Hybridome IGELa2 transplantiert worden ist, oder nicht
transplantiert worden ist. In Fig. 2 steht - - für die
Kontrollgruppe (n = 7), - o - für 10&sup6; IGELa2-transplantierte
Gruppe (n = 7) und - - für 10&sup7; IGELa2-transplantierte Gruppe
(n = 6 oder 7).
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Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Ohrschwellung in den ersten
Antigen-geforderten Mäusen, in die anti-TNP·IgE-
produzierendes Hybridom IGELa2 transplantiert worden ist,
oder nicht transplantiert worden ist. In Fig. 3, steht - o -
für 0,4% Picrylchlorid (PC)-geforderte untransplantierte
Gruppe (n = 12), - - für 4% PC-geforderte untransplantierte
Gruppe (n = 12), - - für 0,4% PC-geforderte IGELa2-
transplantierte Gruppe (n = 12), - - für 4% PC-geforderte
IGELa2-transplantierte Gruppe (n = 11).
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Fig. 4 zeigt die Ergebnisse der Ohrschwellung in den zweiten
Antigen-geforderten Mäusen, in die anti-TNP·IgE-
produzierendes Hybridom-IGELa2 transplantiert worden ist,
oder nicht transplantiert worden ist. Die Mäuse, die im
Experiment der Fig. 3 verwendet wurden, wurden 6 Tage später
wieder gefordert. In Fig. 4 steht - o - für IGELa2-
transplantierte zweimal geforderte Gruppe (n = 6), - - für
die nicht transplantierte zweimal geforderte Gruppe (n = 6),
- - für die IGELa2-transplantierte nicht geforderte Gruppe,
- - für die nicht transplantierte einmal geforderte
Gruppe.
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Fig. 5 zeigt die Ergebnisse der Ohrschwellung in anti-
TNP·IgE-produzierenden Hybridomen oder nicht produzierenden
Hybridom-transplantierten Mäusen. In Fig. 5 steht Säule A
für die nicht transplantierte Gruppe (n = 12), B für die a2-
transplantierte Gruppe (n = 12), C für die a2.1-transplantierte
Gruppe (n = 6), D für die a2.3-transplantierte Gruppe (n = 6), E
für die a2.4-transplantierte Gruppe (n = 6), F für die a2.15-
transplantierte Mäuse (n = 6) und G für die a2.16-
transplantierte Gruppe (n = 6).
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Fig. 6 zeigt die Ergebnisse der Ohrschwellung in
verschiedenen Antigen-geforderten anti-TNP·IgE-produzierenden
Hybridom IGELa2-transplantierten Mäusen. In Fig. 6 steht
Säule A für die 0,4% PC-geforderte untransplantierte Gruppe
(n = 12), Säule B für die 0,4% PC-geforderte transplantierte
Gruppe (n = 12), Säule C für die OX-geforderte transplantierte
Gruppe (n = 6) und Säule D für die FITC-geforderte
transplantierte Gruppe (n = 6).
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Fig. 7 zeigt die Ergebnisse der Ohrschwellung nach zwei
Stunden der ersten und zweiten Antigenforderungen bei
Kontrollmäusen und Mäusen, in die humane sFcεRIα verabreicht
worden ist. In Fig. 7 steht - - für die sPcεRIα-behandelte
IGELa2-transplantierte Gruppe, - o - für die sFcεRIα-
unbehandelte nicht transplantierte Gruppe, - - für die
unbehandelte IGELa2-transplantierte Gruppe, und - - für die
unbehandelte nicht transplantierte Gruppe.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Nagetiere, wie beispielsweise Mäuse, Ratte, Meerschweinchen
oder Kaninchen werden in der vorliegenden Erfindung benutzt.
Insbesondere werden bevorzugt Mäuse verwendet.
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Der Begriff "annehmen" bedeutet eine erfolgreiche
Transplantation, d. h., daß die transplantierten Zellen nicht
durch das Empfängertier abgestoßen werden und in seinem
Körper lebensfähig bleiben.
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Die IgE-produzierende vegetative Zelle wird ausgewählt aus
der Gruppe aus Hybridomen, die aus IGELa2 (ATCC-Nr. TIB142),
IGELb4 (ATCC-Nr. TIB141) und SE-1.3 (ATCC-Nr. HB137) und dem
Myelom U266B1 (ATCC-Nr. TIB 196) besteht.
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Das Mittel zum Erzeugen des Tiermodells ist nicht bedeutend,
aber die folgenden Verfahren werden empfohlen.
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Zuerst kann das Verfahren, daß das Transplantieren einer
Suspension an IgE-produzierenden Hybridomen oder Myelomen in
ein syngenes Tier umfaßt, genannt werden. Z. B. kann das
Verfahren zum Transplantieren des IGELa2-Hybridoms (anti-
2,4,6-Trinitrophenyl) (ATCC-Nr. TIB142) in BALB/c-Mäuse, des
IGELb4-Hybridoms (anti-2,4,6-Trinitrophenyl) (ATCC-Nr.
TIB141) in (C57BL/6 · BALB/c)F&sub1;-Mäuse oder (BALB/c ·
C57BL/6)F&sub1;-Mäuse, oder des SE-1.3-Hybridoms (anti-
Phenylarsonat) (ATCC-Nr. HB137) in (A/J · BALB/c)F&sub1;-Mäuse
oder (BALB/c · A/J)F&sub1;-Mäuse erwähnt werden.
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Zweitens kann das Verfahren, daß das Transplantieren von IgE-
produzierenden Hybridomen oder Myelomen in ein congenes
immundefizientes Tier erwähnt werden. Die Transplantation in
Nacktmäuse oder SCID-Mäuse ist ein typisches Beispiel.
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Drittens kann das Verfahren, daß das Transplantieren eines
IgE-produzierenden Hybridoms oder Myeloms in ein Tier umfaßt,
das künstlich immundefizient gemacht wurde, durch
Röntgenstrahlen oder eine andere Behandlung erwähnt werden.
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Das Transplantationsverfahren ist nicht besonders begrenzt,
aber allgemein werden die Zellen, die transplantiert werden
sollen, in Hanks-Lösung, PBS und in ähnlichem suspendiert,
und die erhaltene Suspension wird unter Verwendung einer
Spritze an der Transplantationsstelle injiziert.
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Die Transplantationsstelle eines IgE-produzierenden Hybridoms
oder Myeloms ist nicht von Bedeutung, aber die Zellen werden
bevorzugt subkutan oder intraperitoneal inokuliert.
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Die Größe des Inokulums des IgE-produzierenden Hybridoms oder
Myeloms ist im allgemeinen 10³ bis 10¹&sup0;, und bevorzugt 10&sup5;
bis 10&sup8; Zellen, die in 10 bis 1 000 ul an Hanks-Lösung und
ähnlichem suspendiert werden.
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In dem Tiermodell gemäß der Erfindung kann wiederholt ein
bemerkenswertes allergieähnliches Symptom durch das
Durchführen einer Antigenforderung nach 6 bis 10 Tagen
induziert werden, bevorzugt nach 7 bis 9 Tagen nach der
Transplantation der IgE-produzierenden Zellen.
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Die Antigenforderung kann durch eine konventionell verwendete
bekannte Methode ausgeführt werden, z. B. unter Verwendung des
Antigens gegen IgE, das durch die vegetativen Zellen
hergestellt wird, wie beispielsweise Picrylchlorid.
Zahlreiche Antigene, die nicht Picrylchlorid sind, können in
Abhängigkeit von der Stelle der Forderung und der
transplantierten Zellen, wie unten beispielhaft gezeigt wird
verwendet werden.
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Das Tier, in das die vegetativen Zellen transplantiert worden
sind, kann auf die gleiche Weise gefüttert werden wie vor der
Transplantation.
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Das Durchmustern auf prophylaktische und therapeutische
Mittel für IgE-abhängige Erkrankungen unter Verwendung des
erfindungsgemäßen Tieres wird durch das Überprüfen ob ein
allergieähnliches Symptom nach der Antigenforderung durch die
Verabreichung einer prophylaktischen oder therapeutischen
Kandidatensubstanz verhindert wird oder nicht ausgeführt
werden. Insbesondere induziert die Antigenforderung ein
Ohrödem, wenn es dem Ohr verabreicht wird, Konjunktivits-
artige Symptome, wenn es aufs Auge zielt oder Rhinitis-artige
Symptome, wenn es auf die Nasenhöhlen ausgerichtet ist,
dadurch ermöglichen daß das Mustern unter Verwendung der
Hemmung jeder dieser Antworten als Index durchgeführt wird.
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Die prophylaktischen und therapeutischen Mittel für IgE-
abhängige Erkrankungen, die unter Verwendung des
erfindungsgemäßen Tieres durchmustert werden, schließen
Zusammensetzungen oder Verbindungen ein, die nützlich zum
Verhindern oder Behandeln von IgE-abhängigen Typ I-
allergischen Erkrankungen, wie beispielsweise
Bronchialasthma, allergischer Konjunktivitis, allergischer
Rhinitis, Pollenallergie, atopischer Dermatitis, Urticaria
und allergischer Gastroenteritis.
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Das Durchmustern von prophylaktischen und therapeutischen
Mitteln für IgE-abhängig Erkrankung kann wirksam und
zweckdienlicherweise durch das Ausführen einer
Antigenforderung beim wiederholten Verwenden des
erfindungsgemäßen Tiermodell durchgeführt werden, um eine
IgE-vermittelte allergische Reaktion wiederholt zu
induzieren.
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Die vorliegende Erfindung wird in näheren Details unter
Bezugnahme auf das folgende Beispiel und die Testbeispiele
beschrieben, ist aber nicht darauf beschränkt.
Beispiel
Herstellung des Tiermodells
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Weiblichen BALB/c-Mäusen (8 Wochen alt oder älter) wurden
10&sup6; Zellen des anti-TNP·IgE-produzierenden Hybridoms IGELa2
(ATCC-Nr. TIB142) subkutan am Rücken inokuliert.
Testbeispiel 1
Bestimmung des anti-TNP·IgE-Niveaus in Mäuseblut
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Das anti-TNP·IgE-produzierende Hybridom IGELa2 (ATCC Nr.
TIBI142) wurde mit Hanks-Lösung gespült und in der gleichen
Lösung suspendiert. Die erhaltene Lösung (10&sup6; Zellen/200 ul)
wurde subkutan unter Verwendung einer Spritze in den Rücken
weiblicher BALB/c-Mäuse (8 Wochen oder älter) transplantiert.
(Die Transplantation wurde auf die gleiche Weise in den
folgenden Testbeispielen durchgeführt.) Die Blut-anti-
TNP·IgE-Niveaus der behandelten Mäuse wurden durch EIA im
Zeitverlauf bestimmt. EIA wurde unter Verwendung einer TNP-
HSA-beschichteten Platte (10 ug/ml, 50 ul/Vertiefung) wie
folgt durchgeführt.
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Das Testserum wurde 30- bis 3750-fach verdünnt mit 1%
BSA/TBS und 50 ul Aliquots wurden auf die Platte verteilt und
bei 4ºC über Nacht inkubiert. Die Platte wurde dann mit 0,9%
NaCl/0,05% Tween 20 gewaschen und das gebundene anti-TNP·IgE
wurde unter Verwendung von POD-markierter Schaf-anti-Maus-IgE
(1 : 1000, The Binding Site Ltd.) und 1 mg/ml
o-Phenylendiamin/0,006% H&sub2;O&sub2; nachgewiesen. Als gereinigter
IgE-Standard wurde IgE, das aus einem Kulturüberstand des
anti-TNP·IgE-produzierendem Hybridoms IGELb4 (ATCC-Nr.
TIB141) verwendet. Als Kontrolle wurden nicht mit dem
Hybridem transplantierte Mäuse, auf gleiche Weise wie oben
beschrieben, getestet.
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Die Ergebnisse werden in der Fig. 1 gezeigt. Das anti-
TNP·IgE-Niveau im Blut stieg mit dem Verlauf in den
Hybridomtransplantierten Mäusen, war aber in den Kontrollmäusen nicht
erhöht. Ein ähnliches Ergebnis wurde in Mäusen erhalten, die
mit 10&sup7; Zellen des Hybridoms transplantiert wurden.
Testbeispiel 2
Bestimmung des Verlaufs der Ohrschwellung in
Antigengeforderten Mäusen (I)
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Mäuse wurden auf gleiche Weise wie in Testbeispiel 1 mit 10&sup6;
IGELa2-Zellen subkutan am Rücken inokuliert. Am Tag 8 nach
der Inokulation wurden 10 ul an 4% Picrylchlorid in Aceton
auf das linke Ohr von der Maus und von nicht-behandelten
Mäusen (Antigenforderung) aufgetragen, und der Zeitverlauf
der Ohrschwellung wurde bestimmt. Der Unterschied zwischen
der Dicke des Ohr vor der Forderung und nach der Forderung
wurde als Index verwendet. Die Bestimmungen wurden unter
Verwendung einer Dialmeter-Gauge-PEACOCK, erhältlich von
Ozaki Seisakusho, durchgeführt.
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Die Ergebnisse werden in Fig. 2 gezeigt. Während die
Ohrschwellung 1 bis 2 Stunden nach der Antigen-Forderung in
den Hybridem-transplantierten Mäusen maximal wurde, wurde
innerhalb von 1 bis 2 Stunden nach der Antigenforderung in
den nicht-operierten Mäusen keine Schwellung beobachtet. In
Mäusen, die mit 10&sup7;-Hybridom-Zellen inokuliert wurden, war
die Ohrschwellung ebenfalls 1 bis 2 Stunden nach der
Antigenforderung maximal.
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Die oben gemachte Beobachtung der maximalen Ohrschwellung,
die nach 1 bis 2 Stunden nach der Antigenforderung in
Hybridom-transplantierten Mäusen auftritt, zeigte an, daß die
Effizienz eines antiallergischen Mittels aus dem Grad der
Hemmung der Ohrschwellung während dieses Zeitverlaufs
bestimmt werden kann.
Testbeispiel 3
Bestimmung des Zeitverlaufs der Ohrschwellung in
Antigengeforderten Mäusen (II)
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Wie in Testbeispiel 2 wurden Mäuse mit 10&sup6; IGELa2-
Hybridomzellen inokuliert, und die erste Antigenforderung
wurde unter Verwendung eines 0,4% oder 4% Picrylchlorid
(PC)-Lösung am Tag 8 nach der Inokulation durchgeführt.
Kontrollmäuse wurden ebenfalls einer Antigenforderung
unterworfen.
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Die Ergebnisse werden in Fig. 3 gezeigt. Es wurde
herausgefunden, daß die Ohrschwellung, wie im Testbeispiel 2,
2 Stunden nach der Antigenforderung maximal wurde.
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Dann wurde am Tag 6 nach der ersten Antigenforderung eine
zweite Antigenforderung auf die gleiche Weise wie die erste
Forderung durchgeführt und unter der Verwendung des Index,
der im Testbeispiel 2 beschrieben ist, wurde der Verlauf der
Ohrschwellung untersucht.
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Die Ergebnisse werden in Fig. 4 gezeigt. In den
Hybridomtransplantierten Mäusen wurde die Ohrschwellung wie nach der
ersten Antigenforderung nach 2 Stunden maximal und der
Indexwert war im wesentlichen dem nach 2 Stunden nach der
ersten Forderung ähnlich. Im Gegensatz dazu zeigten die
Kontrollmäuse keine Schwellung des Ohrs.
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Die oben genannten Ergebnisse zeigen, daß die Ohrschwellung
mit guter Reproduzierbarkeit wiederholt reproduziert werden
kann, selbst wenn die Antigenforderung mehr als einmal am
gleichen Ort in Hybridom-transplantierten Mäusen durchgeführt
wird.
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Die Ergebnisse deuten weiter darauf hin, daß die Verwendung
von solchen Hybridom-transplantierten Mäusen nicht nur die
Bestätigung des präventiven und inhibitorischen Effekts
antiallergischer Mittel auf eine primäre antiallergische
Reaktion ermöglicht, sondern auch die Bestätigung des
präventiven und inhibitorischen Effekts auf allergische
Reaktionen, aufgrund der zweiten und folgenden Expositionen
gegenüber dem Antigen.
Testbeispiel 4
Beweis einer anti-TNP·IgE-abhängigen Typ I Allergie
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(1) Wie in Testbeispiel 1 wurden Mäusen 10&sup6; Hybridomzellen
subkutan am Rücken inokuliert. Als Hybridome wurden die oben
genannten IGELa2 und deren Subklone a2.1, a2.3, a2.4, a2.15
und a2.6 verwendet. Von diesen Hybridomen, waren IGELa2, a2.4
und a2.16 anti-TNP·IgE-Produzenten, aber weder IGELa2.1, a2.3
oder a2.15 sezernierten anti-TNP·IgE.
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Die Antigenforderung wurde auf die gleiche Weise wie in
Testbeispiel 2 durchgeführt und der Indexwert wurde 2 Stunden
nach der Forderung bestimmt.
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Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt. Wie in Fig. 5
gezeigt, wird eine Ohrenschwellung nur mit den anti-TNP·IgE-
Produzenten beobachtet.
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(2) Eine Antigenforderung in 10 IGELa2-transplantierten
Mäusen wurde durchgeführt mit 1% Oxazolon (OX) bzw. 1%
Fluoreszinisothiocyanat (FITC) wie auch mit 0,4%
Picrylchlorid (PC).
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Die Ergebnisse werden in Fig. 6 gezeigt. Wie in Fig. 6
gezeigt wird, wurde die Ohrenschwellung nur bei Forderung mit
Picrylchlorid beobachtet und nicht mit anderen Antigenen
gefunden.
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In den Ergebnissen, die in (1) und (2) erhalten wurden wurde
herausgefunden, daß die Ohrenschwellung anti-TNP·IgE benötigt
und ein spezifisches Antigen, das durch IgE erkannt wird und
die Ohrschwellung in diesem Test ist vom anti-TNP·IgE
vermittelten Typ I allergische Reaktion.
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Das Tiermodell, das wir erzeugt haben, erlaubt häufiger als
einmal eine allergische Reaktion zu induzieren, nachdem eine
einzelne Inokulation mit Hybridomzellen durchgeführt wurde,
und ist sehr nützlich zum Bestätigen der Wirksamkeit der
Kandidaten prophylaktischer und therapeutischer Mittel für
IgE-abhängige Erkrankungen.
Testbeispiel 5
Inhibitorische Wirkung von sFcεRIα auf die sekundäre
allergische Reaktion
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Wie in Testbeispiel 3, wurde die erste Antigenforderung durch
das Auftragen von 10 ul 0,4% Picrylchlorid-Aceton auf das
linke Ohr der Mäuse am Tag 8 nach der Hybridom-
Transplantation durchgeführt, und die zweite Antigenforderung
wurde auf die gleiche Weise am Tag 14 durchgeführt.
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Andererseits wurde sFcεRIα (JP-A-169776) intravenös in einer
Dosis von 25 ug/Maus am Tag 7 und 8 nach der Transplantation,
und in einer Dosis von 100 ug/Maus an den Tagen 9, 11, 13 und
15 verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde anstelle von sFcεRIα
PBS verabreicht. Die Wirkung von sFcεRIα wurde unter
Verwendung des in Testbeispiel 2 beschriebenen Index
untersucht.
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Die Ergebnisse werden in Fig. 7 gezeigt. 2 Stunden nach der
ersten Antigenforderung gab es keinen Unterschied zwischen
der Kontrollgruppe und der humanen sFcεRIα-behandelten
Gruppe. 2 Stunden nach der zweiten Antigenforderung war die
Ohrschwellungsreaktion in den Mäusen die mit sFcεRIα
behandelt wurden, gehemmt, während die Kontrollmäuse eine
Ohrschwellung in einem Grad zeigten, der vergleichbar war mit
der der ersten Antigenforderung.
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Die oben gemachten Befunde zeigen, daß sFcεRIα allergische
Reaktionen aufgrund der zweiten Exposition vollständig
inhibiert und lassen vermuten, daß es das gleiche in den
gleichen folgenden weiteren Expositionen von Antigen an
Patienten mit Allergien tun und deswegen ein sehr
befriedigendes prophylaktisches Medikament ist.