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Die Erfindung betrifft im allgemeinen das Isolieren
zellulärer Proben aus flüssigen Proben und das anschließende
Analysieren auf eine Nukleinsäure wie z. B. DNS. Spezifischer
ausgedrückt; bezieht sich die Erfindung auf eine Vorrichtung zum
Sammeln von hochvolumigen flüssigen Proben, wie z. B. Urin oder
Mundspülungen, und zum Trennen der zellulären Komponenten von
der flüssigen Komponente, wobei die zelluläre Komponente zur
Nukleinsäureamplifiktion und -detektion verwendet wird.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die Sammlung flüssiger Proben zur Laboranalyse, um die
Anwesenheit spezifischer Krankheiten oder Leiden bei einem
Patienten nachzuweisen, ist gut bekannt. Es wird typischerweise
eine flüssige Probe oder ein Abstrich gesammelt und in
Abhängigkeit vom gewünschten Assay die entsprechende Komponente
der Probe extrahiert. In Fällen, in denen die gewünschte
Komponente zellulär oder subzellulär ist, werden die Proben im
allgemeinen zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Die
Zellenpellets werden wahlweise lysiert, um eine subzelluläre
Komponente freizusetzen. Alternativ kann die Lyse vor der
Zentrifugation stattfinden und können die pelletierten
Zelltrümmer analysiert werden. Weil Zentrifugationsgeräte nicht
ohne weiteres tragbar sind, hat die Probensammlung, insbesondere
die Sammlung hochvolumiger flüssiger Proben, im allgemeinen nur
in Kliniken oder Laboratorien stattgefunden. Während Abstrich
seit Jahren transportiert worden sind, erfordert der
Sammlungsvorgang im allgemeinen geschulte Techniker, um die
Sammlung einer nützlichen Probe und eine sorgfältige Lagerung
sowie einen sorgfältigen Transport resuspendierter Zellen aus
dem Abstrich zu garantieren.
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In letzter Zeit sind Mundspülungsproben als Verfahren zum
Sammeln zellulärer Proben von Patienten zur Analyse eingeführt
worden. Typischerweise wird dem Patienten ein Mundwasser oder
Mundspülungsmittel gegeben, das nach Abschluß des
Spülungsschritts in ein Sammelgefäß ausgespuckt wird. Die
resultierende Mundspülungsprobe enthält Speichel sowie abgelöste
Mundschleimhautzellen, die zusammen mit dem ausgespuckten
Mundwasser gemischt sind. Eine solche Mundspülungsprobe kann
analysiert werden, um ihre verschiedenen Komponenten oder
bestimmte Attribute des Patienten zu bestimmen.
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Wie in The Lancet, Band 340, 25. Juli 1992, S. 214-216,
berichtet wurde, ist im Vereinigten Königreich ein Verfahren des
Sammelns von Mundspülungsproben, um Patientenzellen zur
Untersuchung auf Mukoviszidose zu sammeln, untersucht worden.
Cellmark Diagnostics hat außerdem als Teil ihres CF Mutation
Analysis System ein Verfahren zur Extraktion von DNS aus
Mundspülungsproben entwickelt. Beim Cellmark-Verfahren wird,
nachdem die Mundspülungsprobe - gesammelt wurde, diese
zentrifugiert, und die gewünschten Komponenten werden aus den
pelletierten Zellen extrahiert.
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Der Zentrifugationsschritt wird normalerweise am
Sammlungsort ausgeführt. Um die Sammlung und Analyse unter
Verwendung dieses Systems durchzuführen, muß die Sammlung der
Probe an einem Ort stattfinden, wo Geräte zur Zentrifugation und
Extraktion verfügbar sind. Außerdem wird nur ein kleiner Teil
der gesamten Probe für Tests benötigt. Weil die gesamte Probe
lebensfähig gehalten werden muß, bedeutet dies, daß die gesamte
Probe gelagert werden muß, bis der Extraktionsschritt
abgeschlossen ist. In einem typischen Beispiel wird nur ein
Prozent der Probe für eine Analyse benötigt. Dies bedeutet, daß
99% der gelagerten Probe schließlich weggeworfen wird. Indem
eine solch große Probe gehalten wird, werden die Kosten des
Transports, der Lagerung und der Entsorgung der Probe kritisch.
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Während sich die Sammlung von Mundspülungen als ein
effizientes und wünschenswertes nichtinvasives Verfahren des
Sammelns von Zellproben von einem menschlichen Patienten
herausgestellt hat, haben die Transport-, Lagerungs- und
Entsorgungsprobleme ihre breite Akzeptanz minimiert. Außerdem
führt die Tatsache, daß die primären Zellensammlungsschritte an
einer zentralen Stelle durchgeführt werden müssen, zu einer
weiteren Verringerung des Werts dieses Sammlungsverfahrens.
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Um Mundspülungsproben korrekt zu analysieren, müssen die
Proben in flüssiger Form in einem sterilen Behälter gesammelt,
abgedichtet und zum zentralen Zentrifugations- und
Extraktionsort transportiert werden. Dies gilt auch für die
meisten anderen gesammelten flüssigen Proben von
Körperflüssigkeiten.
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Die Vorteile der Probensammlung werden deshalb oft von den
Nachteilen der umständlichen, unpraktischen und kostenintensiven
Schritte überwogen, die bei der Lagerungskonservierung und bei
dem Transport der Probe zu einem Analyseort erforderlich sind.
Wenn die Flüssigprobentechniken eine Akzeptanz auf breiter Basis
erlangen sollen, müssen die Schwierigkeiten beim Sammeln, Lagern
und Umfüllen der aus der flüssigen Lösung gewinnbaren Proben
minimiert werden.
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Das U. S. Patent Nr. 3,888,629 mit dem Titel "Performance of
Chemical or Biological Reactions within Absorbant Matrix Pad"
("Durchführung von chemischen oder biologischen Reaktionen in
einem absorbierenden Matrixbausch"), das am 10. Juni 1975 K. D.
Bagshawe erteilt wurde, zeigt ein System zum Ziehen einer
flüssigen Probe durch einen Bausch mit einer diskreten Matrix,
um eine antigene Komponente zu analysieren. Allerdings behandelt
es nicht die Sammlung der urspünglichen Probe oder die
Isolierung von Zellen zur Analyse. Dies gilt auch für die
Vorrichtung, die im U. S. Patent Nr. 4,891,134 mit dem Titel
"Specimen Filtration Device" ("Probenfiltrationsvorrichtung")
gezeigt und beschrieben wurde, das am 2. Januar 1990 J. Vcelka
erteilt wurde. In beiden dieser Dokumente werden die Zellen
lysiert, um die antigene Komponente, die von Interesse ist, vor
der Aufbringung auf den Matrixfilter freizusetzen.
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Während zahlreiche Beispiele verfügbar sind, um eine Probe
auf ein Testmedium wie z. B. einen Matrixpad oder dergleichen
aufzutragen, ist die klinische Verwendung solcher Systeme im
allgemeinen auf Grund des Erfordernisses begrenzt gewesen, daß
die gesamte flüssige Testprobe im flüssigen Zustand vom
Sammlungsort bis zur Analyseeinrichtung transportiert wird, was
abgedichtete, sterile Behälter und Versandpakete erfordert, die
mit großer Sorgfalt behandelt werden müssen. Dies gilt, ganz
gleich, ob die Probe unter Anwendung invasiver Techniken (wie
z. B. der Sammlung von Blutproben) oder auf eine nichtinvasive
Weise (wie z. B. mit Urin- oder Munsdspülungsproben) gewonnen
wird. Deshalb besteht weiterhin Bedarf daran, die klinische
Umgebung für die Sammlung und den Transport flüssiger Proben zu
verbessern.
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Der sogenannte "Guthrie-Spot" wird universell angewandt, um
neonatales Vollblut auf verschiedene Produkte metabolischer
Fehler zu untersuchen {R. Guthrie, Organization of a regional
newborn screening laboratory, in Neonatal screening for inborn
error of metabolism (Red. H. Bickel, R. Guthire und G.
Hammersen), S. 259-270, Springer Verlag, Berlin, 1980}. Die
getrockneten Blutflecke (spots) sind von großem Nutzen, weil sie
das Versenden, das Archivieren und das Durchführen mehrerer
Analysen an derselben Prüfmenge erleichtern. In letzter Zeit ist
der Nutzen solcher getrockneter Blutflecke auf Tests erweitert
worden, die DNS-Amplifikation und -Analyse involvieren (McCabe
ERB, 1991, Utility of PCR for DNA Analysis from Dried Blood
Spots on Filter Paper Blotters, in PCR Methods and Applications,
Band 1, S. 99-106). Die Anwendbarkeit der Technik ist aber
begrenzt, und sie ist nur bei der Analyse von Blutproben
angewandt worden. Überdies involviert sie keine Trennung von
Zellen von einer flüssigen Komponente. Sowohl die Zellen als
auch das Serum verbleiben auf dem Filter. Wie man sehen wird,
erweitert die vorliegende Erfindung den Nutzen und vermeidet sie
diese Nachteile des Guthrie-Spots.
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Das U. S. Patent Nr. 4,812,293 offenbart eine Vorrichtung für
den Assay eines Analyten, die eine Reaktionseinheit, eine
Sammeleinheit und eine Vakuumbetätigungseinheit umfaßt. Die
Reaktionseinheit weist eine durchlässige Membran auf, an der
eine Assaykomponente angebracht ist, die Membran wird getragen,
und das ganze befindet sich in Flüssigkeitsverbindung. Dieses
Dokument lehrt, daß die Sammeleinheit ein vorevakuiertes
Flüssigkeitssammelmittel einschließt. Die
Vakuumbetätigungseinheit schließt ein Mittel ein, um die
Sammeleinheit mit einer Nadel zu durchstoßen, wodurch eine
Flüssigkeitsverbindung zwischen dem Sammelmittel und dem
Membranträger hergestellt wird und ein Differentialdruck erzeugt
wird, um eine Flüssigkeitsprobe durch die Membran zu ziehen. Die
Trennung von Zellen von einer Flüssigkeit mittels dieser
Vorrichtung wird nicht gelehrt.
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Das U.S. Patent Nr. 4,427,415 offenbart eine Vorrichtung zur
Trennung von Materialien von einer Flüssigkeit, bei der
Substanzen auf einem Filtermedium abgelagert werden können. Eine
Flüssigkeit, die Substanzen enthält, wird in einen Behälter
gegeben, ein Vakuum wird angelegt, und die Flüssigkeit wird
durch das Filtermedium gezogen. Die Substanzen, die nicht durch
die Membran hindurchtreten können, werden auf der Membran
abgelagert. Die Membran ist aus der Vorrichtung entfernbar.
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DE-A-29 28 790 offenbart eine Vorrichtung zum Sammeln von
Zellen auf einer Membran zur anschließenden Betrachung mit einem
Mikroskop, nachdem die Membran aus der Vorrichtung entfernt
worden ist. Die Vorrichtung enthält einen Membranbehälter, der
die Membran zwischen einer Einlaß- und einer Auslaßöffnung
beherbergt. Die Zellensuspension wird durch eine Spritze, die
mit der Einlaßöffnung des Membranbehälters verbunden ist,
aufgebracht, wodurch die Flüssigkeit durch die Membran gedrängt
wird und die Zellen von der Membran zurückgehalten werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die Erfindung bezieht sich auf
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ein Verfahren zur Sammlung von Zellen aus einer flüssigen
Probe, die eine zelluläre Komponente besitzt, auf einem
Filtermedium und Detektion der Anwesenheit der zellulären
Komponente in der flüssigen Probe, wobei das Verfahren folgende
Schritte umfaßt:
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Aufgeben einer flüssigen Probe, von der vermutet wird, daß
sie eine zelluläre Komponente besitzt, in ein offenes Ende eines
Sammelbehälters mit einer Entnahmeöffnung;
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Platzieren der Entnahmeöffnung in Flüssigkeitsverbindung mit
einem Filtermedium durch ein abgedichtetes Verbindungsstück
dazwischen, wobei das Filtermedium eine Porengröße besitzt, die
ausreichend klein ist, um die gewünschten vermuteten Zellen aus
der flüssigen Probe zurückzuhalten, wobei das Filtermedium in
einem Filtercontainer zwischen einer Einlaß- und einer
Auslaßöffnung untergebracht ist, wobei die Einlaßöffnung
angepaßt ist, um in die Entnahmeöffnung des Sammelbehälters
abdichtend einzugreifen;
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Anlegen einer Druckdifferenz über das Filtermedium und bis
zu der flüssigen Probe durch das abgedichtete Verbindungsstück,
um die flüssige Probe durch die Entnahmeöffnung des
Sammelbehälters und durch das Filtermedium zu drängen, wobei die
Druckdifferenz angelegt wird, indem ein durchstechbares
Verschlußelement einer verschlossenen hypobaren Kammer mit der
Auslaßöffnung durchstoßen wird, um die Auslaßöffnung und die
geschlossene hypobare Kammer in abgedichtete
Flüssigkeitsverbindung zu bringen, wobei der Filtercontainer
unter ein relatives Vakuum gesetzt wird und wobei auf dem
Filtermedium eine Probe jeglicher zellulärer Komponente der
flüssigen Probe eingefangen wird;
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Entfernen von mindestens einem Teil des Filtermediums und
Extrahieren von Nukleinsäure aus der zellulären Komponente,
welche auf dem Filtermedium eingefangen wurde;
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Amplifizieren der extrahierten Nukleinsäure; und
Detektieren der amplifizierten Nukleinsäure als ein Zeichen
der Anwesenheit der zellulären Komponente in der Prüfmenge.
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Das Verfahren der Erfindung beschleunigt die Sammlung und
den Transfer zellulärer Komponenten von Körperflüssigkeiten, die
als eine flüssige Probe gesammelt werden. Die Erfindung ist
besonders nützlich bei der Isolierung zellulärer Komponenten
hochvolumiger flüssiger Proben, insbesonderer derer, die durch
nichtinvasive Methoden gesammelt werden, wie beispielsweise
Mundschleimhautzellen, die aus einer Mundspülungsprobe gesammelt
werden können, oder Pathogenzellen, die in Urin vorkommen
können. Es wird aber verstanden werden, daß die Erfindung auch
zur Sammlung und Analyse von anderen flüssigen Proben, die durch
invasive Techniken gesammelt werden, wie z. B. Blut- oder
Zerebrospinalflüssigkeitsproben oder dergleichen, angewandt
werden kann.
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Die Zellsammlungsapparatur umfaßt vorzugsweise ferner ein
Entnahmegefäß zum Aufnehmen der flüssigen Probe, die durch das
Filtermedium und die Ausgangsöffnung des Filtercontainers
hindurchtritt; und zwar ist das bevorzugteste Mittel zum
Erzeugen und Anlegen eines reduzierten Drucks ein hypobares
Gefäß, das angepaßt ist, um in abgedichtetem Eingriff mit der
Auslaßöffnung des Filtercontainers gekoppelt zu werden. Das
hypobare Gefäß kann somit gleichzeitig als das Mittel zum
Anlegen von Druck und als Entnahmegefäß dienen. Ein VacutainerTM-
Gefäß hat sich als kombiniertes Entnahmegefäß und Mittel zum
Anlagen eines reduzierten Drucks gemäß der vorliegenden
Erfindung als praktisch und geeignet herausgestellt.
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Die Zellsammlungsapparatur kann auch eine Hohlnadel
einschließen, die mit der Filtercontainerauslaßöffnung in
Verbindung steht, wobei die Nadel angepaßt ist, um eine
aufreißbare Dichtung auf dem hypobaren Gefäß zu durchboren,
wodurch an der Auslaßöffnung ein reduzierter Druck angelegt
wird.
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Das ganze Filtermedium oder ein Teil des Filtermediums ist
aus dem Filtercontainer entfernbar. Das Filtermedium kann aus
einem Material bestehen, das aus einer Gruppe, die
Glasfaserstoff, Papier und Zelluloseester umfaßt, ausgewählt
wird. Um die Entfernung des Filters zu erleichtern, kann das
Filtergehäuse ein Paar zusammenpassender Bauelemente umfassen.
In einem solchen Fall kann ein Bauelement ein Filterträgermittel
zum Tragen des Filtermediums einschließen. Das Filtergehäuse
schließt vorzugsweise auch Kanalmittel ein, um eine flüssige
Probe an diskrete Bereiche des Filtermediums zu verteilen.
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Die Druckdifferenz kann erzeugt werden, indem die
Auslaßöffnung des Filtercontainers unter ein relatives Vakuum
gesetzt wird, wie z. B. bewerkstelligt wird, indem eine
geschlossene hypobare Kammer mit der Auslaßöffnung in
Flüssigkeitsverbindung platziert wird. Die hypobare Kammer
schließt typischerweise ein durchstechbares Verschlußelement ein
und wird selektiv mit der Auslaßöffnung in
Flüssigkeitsverbindung platziert, indem eine Hohlnadel so an den
Filtercontainer montiert wird, daß die Bohrung der Nadel mit der
Auslaßöffnung in Flüssigkeitsverbindung steht, und das
Verschlußelement mit der Nadel durchstoßen wird, wodurch der
Filtercontainer unter hypobaren Druck gesetzt wird.
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Nachdem die Zellen in der obigen Weise gesammelt worden
sind, kann mindestens ein Teil des Filtermediums aus dem
Filtercontainer entfernt und die Prüfmenge auf dem Filtermedium
getrocknet werden. Die Entfernung kann erfolgen, indem die
zusammenpassenden Hälften des Filtercontainergehäuses geöffnet
werden oder indem Teile des Filtermediums herausgestanzt werden,
so daß sie außerhalb des Gehäuses gelangen. Die Zellenprüfmenge
kann dann gemäß den Wünschen des Klinikers geteilt, gelagert,
transportiert und/oder analysiert werden.
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Die Zellenprüfmenge wird auf ein Segment einer Nukleinsäure,
vorzugswiese RNS oder DNS aus den Zellen, analysiert. Eine
solche Nukleinsäure wird durch Amplifikation analysiert, wie
z. B. durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion) oder LCR (Ligase-
Kettenreaktion).
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Derzeit wird bevorzugt, daß die flüssige Probe eine
hochvolumige Probe ist, wie z. B. eine Mundspülungsprobe.
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Das Zellensammlungsverfahren und die
Zellensammlungsapparatur, die hier offenbart sind, erlauben die
schnelle Sammlung von Zellen auf einem Filtermedium in einer
Weise, die an jedem Ort und ohne eine besondere Ausrüstung oder
eine besondere Schulung durchgeführt werden kann, wobei eine
problemlos tragbare und transportfähige Filterpapierprobe
erzeugt wird, die getrocknet und für eine oder mehrere
anschließende Analysen archiviert werden kann. Das
Zellensammlungsverfahren und die Zellensammlungsapparatur, die
hier offenbart sind, haben ein unerwartetes gewünschtes
Ergebnis, nämlich daß eine Sammlung von Mundschleimhautzellen,
die kurze Zeit, nachdem die Mundspülungsprobe erzeugt wurde,
stattfindet, eine ungewöhnlich hohe und konsistente Ausbeute an
Zellen in jeder gesammelten Prüfmenge ergeben hat.
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Die Erfindung sieht ein wünschenswertes Verfahren vor, das
bei der DNS-Amplifikationstechnik nützlich ist, wie z. B. zur
Erforschung genetischer Defekte und des Trägerstatus
hinsichtlich genetischer Defekte sowie für forensische,
identitätsbezogene, militärische oder vaterschaftsbezogene
Anwendungen.
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Kits, mit denen klinische Techniker versehen werden, um die
ersten Schritte des Verfahrens der Erfindung durchzuführen,
enthalten einen integrierten Sammelbehälter, ein
Filtermediumpaket und ein hypobares Gefäß. Das Verfahren der
Probensammlung und des Prüfmengeneinfangens ist ohne eine
spezialisierte Schulung schnell erlernbar und ergibt durchweg
hervorragende Prüfmengen zur Analyse. Die Komponenten des Kits
sind preisgünstig und ihre Verwendung entspricht den weithin
bekannten, bewährten Labortechniken. Die
Probensammlungsapparatur des Kits ist zur Sammlung einer
zellenreichen Prüfmenge zum Archivieren und Transport und zur
anschließenden Analyse nützlich.
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Andere Ziele und Merkmale der Erfindung werden aus den
beiliegenden Zeichnungen und der beiliegenden detaillierten
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform leicht ersichtlich
sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGSFIGUREN
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Fig. 1 ist eine perspektivische Ansicht einer
Probensammlungsapparatur, die zur Verwendung in Verbindung mit
Mundspülungsproben besonders gut geeignet ist.
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Fig. 2 ist ein Längsquerschnitt der in Fig. 1 gezeigten
Probensammlungsapparatur.
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Fig. 3 ist eine Ansicht in dieselbe Blickrichtung wie in
Fig. 2, die die Sammlungsapparatur zeigt, nachdem die Probe
durch den Filtercontainer gezogen wurde, um eine Prüfmenge, die
die zelluläre Komponente der Probe enthält, auf dem Filtermedium
zu sammeln.
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Fig. 4 ist eine vergrößerte Teilansicht, die das Einfangen
der zellulären Komponente der flüssigen Probe auf dem
Filtermedium schematisch veranschaulicht.
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Fig. 5 veranschaulicht die Komponenten eines typischen Kits.
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Fig. 6 ist ein Querschnitt einer anderen Ausführungsform des
Filtercontainers.
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Fig. 7 ist ein Querschnitt wie Fig. 6, der den Behälter
zeigt, der in seine zusammenpassenden Hälften geteilt ist, um
Zugang zum Filtermedium zu gewähren.
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Fig. 8 ist ein allgemeiner Querschnitt entlang der Linie 8-
8 der Fig. 8.
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Fig. 9 ist Fig. 3 ähnlich, wobei der Filtercontainer der
Fig. 6, 7 und 8 verwendet wird.
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Fig. 10 veranschaulicht ein Verfahren zur Entfernung
gesammelter Zellen aus dem Filtermedium in ein Assayröhrchen.
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Fig. 11 veranschaulicht eine alternative Ausführungsform des
in der Kit-Zusammestellung der Fig. 5 gezeigten
Filtercontainers, wobei der Filtercontainer auseinandergebaut
ist, um Zugang zum Filtermedium zu gewähren.
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Fig. 12 ist eine Draufsicht der Vorrichtung der Fig. 11, die
die Unterseite der oberen Hälfte zeigt.
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Fig. 13 ist eine Draufsicht der Vorrichtung der Fig. 11, die
die Oberseite der unteren Hälfte zeigt.
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Fig. 14 ist ein vergrößerter allgemeiner Querschnitt entlang
der Linie 14-14 der Fig. 11, wobei aber die obere und die
untere Hälfte zusammengepaßt sind.
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Fig. 15 und 16 zeigen, wie sich die in den Beispielen 4 bzw.
5 verwendeten spezifischen LCR-Sonden auf ihre jeweiligen Zielen
ausrichten.
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Fig. 17 und 18 sind Fotografien von Streifen, auf denen DNS
getestet wurde, nachdem Zellen gesammelt wurden, und sind in den
Beispielen 4 bzw. 5 ausführlicher beschrieben.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die Erfindung wird nun im Einzelnen beschrieben; hierzu
gehört eine Erläuterung der Verfahren und der Theorie sowie
mehrerer unterschiedlicher Ausführungsformen und
Arbeitsbeispiele.
Teil I: Allgemeine Beschreibung
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Die Sammlungsapparatur ist zum Sammeln und Archivieren von
Zellen, die aus einer flüssigen Probe zur Analyse extrahiert
wurden, besonders gut geeignet. Bei der vorliegenden Erfindung
wird insofern zwischen einer flüssigen "Prüfmenge" und einer
"Probe" unterschieden, daß eine "Probe" das Rohmaterial ist, das
von einem Patienten gesammelt wird, wohingegen eine "Prüfmenge"
eine Probe bezeichnet, die auf irgendeine Weise aufbereitet
wurde, z. B. indem Prüfmengenzellen durch die Entfernung des
Großteils des flüssigen Teils der ursprünglichen Probe
konzentriert wurden. Flüssige Proben können durch invasive
Techniken gewonnen werden, wie im Fall von Blut oder
Zerebrospinalflüssigkeit, oder sie können nichtinvasiv gewonnen
werden, wie bei Urin oder Spülungen verschiedener Körperteile
oder -höhlen, die Scheidenspülungen, Mundspülungen und
dergleichen einschließen können, aber nicht darauf beschränkt
sind. "Spülung" bedeutet die Verwendung eines Volumens einer
Flüssigkeit, um einen Körperteil oder eine Körperhöhle zu
waschen oder auszuspülen, was in einem Gemisch aus Flüssigkeit
und Zellen aus dem Körperteil oder der Körperhöhle resultiert.
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Eine flüssige Probe wird als "hochvolumige" Probe
betrachtet, wenn die Menge der gewünschten Prüfmengenkomponente
relativ zur vorhandenen Flüssigkeitsquantität gering ist. Zum
Beispiel werden Urin und Mundspülungen als "hochvolumige" Proben
betrachtet, weil der erwartete zelluläre Gehalt (typischerweise
Bakterien- bzw. Mundschleimhaltszellen) relativ zum Volumen der
als Probe gewonnenen Flüssigkeit gering ist. Es sollte zwischen
hochvolumigen Proben und Proben wie Abstriche und
Zentrifugenpellets unterschieden werden, die oft in einer
begrenzten Menge einer Verdünnungsmittellösung resuspendiert
werden.
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Proben können aus fast jeder Quelle gesammelt werden, die
Menschen, Tiere, Lebensmittel, die Umgebung und dergleichen
einschließen kann, ohne darauf beschränkt zu sein. Diese
flüssigen Proben werden in einem Sammelbehälter gesammelt und
durch ein Filtermedium, das zur Extraktion einer zellulären
Komponentenprüfmenge aus der Probe ausgewählt ist, aus diesem
gezogen. Die Zellenprobe auf dem Filtermedium wird dann gemäß
dem Verfahren der Erfindung analysiert, indem darin enthaltene
Nukleinsäure extrahiert und amplifiziert und die amplifizierte
Nukleinsäure detektiert wird.
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Die Erfindung ist dazu vorgesehen, eine Methodik
einzubeziehen, die klinischen Technikern bekannt ist, und
gründet sich auf die Verwendung eines Drucks über das
Filtermedium, um die Probe durch dieses zu ziehen.
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Allgemein ausgedrückt, umfassen die Systeme, die verwendet
werden, um eine zelluläre Komponente zu sammeln, drei
Komponenten: einen Sammelbehälter, ein Filtermedium (im
allgemeinen in einem Gehäuse eingeschlossen) und ein
Flüssigkeitssammelröhrchen.
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Eine erste Ausführungsform der Sammlungsapparatur ist in
Fig. 1 bis 4 gezeigt. Die dort gezeigte Apparatur ist zur
Verwendung mit einem Sammelbehälter 10 gut geeignet, der eine
etwas vergrößerte Mündung 12 aufweist, durch die eine
hochvolumige Probe wie ein Mundwasser oder dergleichen
aufgegeben werden kann. Es wird leicht verstanden werden, daß
andere Sammelbehälter an Stelle des Behälters 10 verwendet
werden können, wodurch die Sammlungsapparatur verwendet werden
könnte, um andere flüssige Proben zu sammeln und zu archivieren.
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Wie am besten durch Fig. 1 und 2 gezeigt, umfasst die
Sammlungsapparatur einen Filtercontainer 18 zum Tragen eines
Filtermediums 20 zwischen einer Einlaßöffnung 24 und einer
Auslaßöffnung 26. Die Einlaßöffnung 24 ist angepaßt, um mit der
Entnahmeöffnung 14 des Sammelbehälters zu kommunizieren, wodurch
eine im Sammelbehälter 10 gesammelte flüssige Probe in die
Einlaßöffnung 24 entleert und durch das Filter 20 zur
Auslaßöffnung 26 übertragen werden kann. Indem die flüssige
Probe durch den Filtercontainer 18 fließt, wird die zelluläre
Komponente der Probe eingefangen und auf dem Filtermedium
gesammelt, um eine Zellenprüfmenge zu ergeben. Die auf dem
Filter 20 gesammelte Zellenprüfmenge kann dann für eine spätere
Analyse gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung
archiviert und/oder transportiert werden. Ein wichtiges Merkmal
der Apparatur besteht darin, daß das Filter 20 für einen
leichten Transport zu einer klinischen Analyseeinrichtung
getrocknet und gelagert werden kann.
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In experimentellen Tests ist festgestellt worden, daß
verschiedene handelsübliche Filterelemente beim Einfangen von
Hochausbeute-Zellenprüfmengen aus einer gesammelten flüssigen
Probe geeignete Ergebnisse bringen. Das Filtermedium wird eine
Tiefe und eine Porengröße (bzw. eine Teilchenrückhaltegröße)
aufweisen, die primär durch die Größe der zu extrahierenden und
zu untersuchenden zellulären Komponente diktiert werden. Es kann
wünschenswert sein, ein Kompositfiltermedium mit verschiedenen
Bemessungswerten zu verwenden, insbesondere um eine effiziente
Sammlung von Zellen aus einer Probe zu gewährleisten, die
Schleimmaterialien enthalten kann. In der bevorzugten
Ausführungsform der Erfindung ist das Filter ein
Glasfaserverbundtiefenfilter, wie z. B. der Typ, der häufig als
Vorfilter verwendet wird.
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Die physikalischen Eigenschaften ausgewählter Filtermedien
sind in der folgenden Tabelle dargestellt:
TABELLE
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* Die Herstellerspezifikationen wurden auf eine
gemeinsame Einheit zurückgeführt, nämlich die Zeit in Sekunden
für das Hindurchtreten von 100 ml durch einen Filter von 56 mm
(2, 2 Zoll) Durchmesser bei 0,13 Bar (1,9 psi).
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Obwohl keine Rückhaltegröße angegeben wurde, gibt der
Hersteller an, daß AP15 und AP25 als Vorfilter für Filter mit
dem aufgeführten Rückhaltebereich "gut geeignet" sind.
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Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß die Zusammensetzung
des Filtermediums 20 nicht entscheidend ist; es kann sich um
Papier, Glasfaserstoff, Celluloseester oder eine andere
Zusammensetzung handeln. Wichtiger ist, daß ein Filtermedium
ausgewählt wird, das eine Rückhaltegröße aufweist, die mit der
ungefähren Größe der zu filtrierenden Zellen kompatibel ist. Das
Auswählen des größten solcher geeigneter Medien wird die
schnellsten Durchflußgeschwindigkeiten ermöglichen. An Hand der
obigen Tabelle wird es dem Fachmann möglich sein, auf Grund
dieser Kriterien ein geeignetes Filtermedium auszuwählen,
vorausgesetzt, die ungefähre Größe der zu filtrierenden Zellen
ist bekannt oder kann bestimmt werden.
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Flüssige Proben im Sammelbehälter 10 werden durch die
Entnahmeöffnung 14, die Einlaßöffnung 24 und das Filtermedium 20
gedrängt, bevor sie den Filtercontainer 18 über die
Auslaßöffnung 26 verlassen. Die Auslaßöffnung ist vorzugsweise
mit einem Entsorgungsbehälter 40 verbunden, der das Filtrat
sammelt, das weggeworfen werden soll. Die treibende Kraft für
diese Flüssigkeitsbewegung ist eine Druckdifferenz über das
Filtermedium. Obwohl die Druckdifferenz durch einen Überdruck
von oberhalb des Filters 20 erzeugt werden kann, verwendet das
bevorzugte Verfahren einen Unterdruck oder ein Vakuum, der bzw.
das auf der Unterseite des Filters 20 angelegt wird. Dieser bzw.
dieses zieht die Flüssigkeit durch das Filtermedium, während die
zellulären Komponenten der Probe auf dem Filter gesammelt
werden.
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Gemäß einer bevorzugtesten Ausführungsform bewirkt das
Entsorgungsgefäß 40 auch den Unterdruck auf der Unterseite des
Filters. Dies kann durch die Verwendung eines evakuierten
Gefäßes oder Röhrchens leicht bewerkstelligt werden, das,
nachdem es mit der Auslaßöffnung 26 verbunden wurde, die
Flüssigkeit durch den Filter und in das Entsorgungsröhrchen 40
zieht. Ein solches evakuiertes Gefäß muß kein vollständiges
Vakuum darstellen, sondern es muß nur einen ausreichend
niedrigen Druck darstellen, um das Ziehen eines ausreichenden
Flüssigkeitsvolumens durch das Filtermedium zu erlauben. Ein
solches Gefäß wird somit im folgenden "hypobares" Gefäß oder
"hypobare" Kammer genannt. Ein geeignetes Beispiel eines
hypobaren Gefäßes ist das von Becton-Dickinson, Rutherford, NJ,
hergestellte und verkaufte evakuierte Röhrchen, das als
VacutainerTM bezeichnet wird.
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Das hypobare Gefäß schließt vorzugsweise einen Verschluß 38,
wie z. B. einen Stöpsel oder ein Septum ein, der bzw. das
selektiv zur Auslaßöffnung 24 des Filtercontainers 18 hin
geöffnet werden kann. Als Alternative könnte ein Ventilmittel
als selektiver Verschluß verwendet werden.
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Idealerweise stellen die Verbindungen zwischen der
Sammelbehälterentnahmeöffnung und der
Filtercontainereinlaßöffnung und zwischen dem
Filtercontainerauslaß und dem Mittel zum Erzeugen einer
Druckdifferenz über das Filter "abdichtende Eingriffe" dar,
womit gemeint ist, daß die Verbindung im wesentlichen luftdicht
ist. Es ist für eine korrekte Funktion wichtig, daß die
Verbindungen im wesentlichen luftdicht sind. Der reduzierte
Druck am Filtercontainerauslaß wird die flüssige Probe durch das
Filtermedium ziehen, wenn am offenen Ende des Sammelbehälters
die treibende Kraft - atmosphärischer Druck - über die
Flüssigkeit angelegt wird. Wenn Lecks oder schlechte
Abdichtungen erlauben, daß unter dem Spiegel der flüssigen Probe
atmosphärischer Druck in das System eindringt, werden der
Durchfluß und die Filtration ineffizient sein. Dieser Vorbehalt
gilt für Filtercontainergehäuse, die aus zwei zusammenpassenden
Hälften gebildet sind, sowie für die Verbindungen zwischen
Bauteilen der Apparatur.
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Die physikalischen Grundsätze, die für die Sammelvorrichtung
gelten, können an Hand der Theorie druckgetriebener Filtration
verstanden werden. Das Anlegen eines Druckgradienten P an ein
Filtermedium resultiert in dem Durchfluß eines
Flüssigkeitsvolumens V je Zeiteinheit t. Die Gleichung, die
diese Variablen zueinander in Beziehung setzt ist:
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dV/dt = KP/u,
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wobei u die Flüssigkeitsviskosität und K den
Durchflußkoeffizienten darstellt. In einem System, in dem der
Druckgradient durch eine evakuierte Kammer bewirkt wird, kann
angenommen werden, daß P 1 Atmosphäre entspricht. Der
Durchflußkoeffizient K ist gleich dem Kehrwert des Widerstands R
gegen den Durchfluß der Flüssigkeit durch die Membran; K = 1/R.
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Außerdem enthält das Probenflüssigkeitvolumen, das durch die
Sammlungsmembran hindurchtritt, Zellen. Indem die Zellen in der
Membran gefangen werden, nimmt der Widerstand gegen den
Flüssigkeitsdurchfluß, R, zu. Zur Vereinfachung des Modells wird
angenommen, daß sich der Widerstand gegen den
Flüssigkeitsdurchfluß linear mit der Membranbeladung ändert,
d. h. K = Km(1-CV/W), wobei Km der anfängliche Membrankoeffizient,
C die Anzahl Zellen pro Einheitsvolumen V und W die
Maximalanzahl Zellen, die die Membran halten kann, darstellt. In
dieser Annäherung fängt der Durchflußkoeffizient bei Km an und
fällt er auf Null ab, wenn das Flüssigkeitsvolumen, das durch
die Membran hindurchtritt, die Maxmimumanzahl Zellen enthält,
die die Membran halten kann. Das Phänomen zunehmenden
Membranwiderstands in Folge des Filtrationsvorgangs wird im
allgemeinen "Membranverschmutzung" genannt. Genauere
Beschreibungen von Membranverschmutzung können hergeleitet
werden, sie werden die qualitative Beschreibung der
Prüfmengensammlungsvorrichtung aber nicht wesentlich ändern.
-
Ein anderes Merkmal des vorliegenden Systems besteht in der
Verwendung eines hypobaren Gefäßes finiten Volumens, um die
treibende Kraft für die Filtration der Probe zu ergeben. Indem
die flüssige Probe in das hypobare Gefäß gezogen wird, wird sich
der Druck so ändern, wie durch die Gleichung PV = nRT
vorausgesagt, wobei P den Druck, V das Gefäßvolumen, n die
Gaskonzentration, R die Gaskonstante und T die Temperatur
darstellt. Die Gleichung, die das Füllen eines hypobaren Gefäßes
oder VacutainerTM-Röhrchens beschreibt, lautet:
-
wobei P&sub0; den Anfangsdruck in dem Gefäß mit einem Volumen V&sub0;
darstellt und Pi den Druck im Gefäß, nachdem ein Volumen V der
Probe filtriert worden ist, darstellt. Während es nicht möglich
ist, ein absolutes Vakuum zu erzeugen, werden große
Anstrengungen unternommen, das bestmögliche Vakuum zu erzeugen.
Für unsere Zwecke werden wir annehmen, daß P&sub0; = 0, d. h., wir haben
im hypobaren Gefäß ein absolutes Vakuum, so daß während der
Prüfmengensammlung Pi konstant und gleich Null bleibt. Aus diesem
Grund kann angenommen werden, daß die Filtration in der
Probensammlungsvorrichtung unter einem konstanten Druck von 1
Bar (1 Atmosphäre) durchgeführt wird.
-
Der Durchfluß der flüssigen Probe wird deshalb durch
folgende Gleichung beschrieben:
-
deren Lösung wie folgt lautet:
-
wobei S eine Geschwindigkeitskontante darstellt, die wie folgt
definiert wird:
-
Empirisch wird beobachtet, daß bei einer Mundspülungsprobe
der Durchfluß anfangs sehr schnell ist, was gefolgt wird von
einer rapiden Abnahme der Durchflußgeschwindigkeit nach etwa 30
Sekunden, nachdem etwa 10 cm³ der Flüssigkeit filtriert worden
ist. Das Langzeitverhalten des Systems ist durch einen sehr
langsamen Durchfluß oder - praktisch betrachtet - die Beendigung
des Durchflußes gekennzeichnet. Das beobachtete Verhalten ist
somit in völliger qualitativer Übereinstimmung mit unserem
einfachen exponentiellen Modell. Es kann außerdem für eine
typische Prüfmenge ein empirischer Schätzwert für S ermittelt
werden, weil allgemein anerkannt wird, daß das Langzeitverhalten
eines sich exponentiell entspannenden Systems mit 6 · S
ermittelt wird; somit ist S = 30/6 = 5 Sekunden.
-
An Hand dieses einfachen Modells können wir voraussagen, daß
die Apparatur unabhängig von der Ausgangszellenkonzentration
ungefähr die gleiche Anzahl Zellen sammeln wird. Wird zum
Beispiel bei einer gegebenen Prüfmenge 10 cm³ der Probe filtriert
und ist der Durchfluß nach 30 Sekunden beendet, dann wird bei
einer Probe mit der zweifachen Zellenkonzentration 5 cm³ in 15
Sekunden filtriert, und beide gesammelten Prüfmengen werden die
gleiche Anzahl Zellen enthalten.
-
Wenn eine Probe keine ausreichende Zellenkonzentration
enthält, wird wegen der endlichen Kapazität des hypobaren
Gefäßes die maximale Beladung der Membran W nicht erreicht.
Diese Situation kann aber vermieden werden, indem eine
Volumenmarkierung auf dem Entsorgungsgefäß vorgesehen wird und
jede Probe sowie die dazugehörige Prüfmenge weggeworfen wird,
die ein filtriertes Volumen ergab, das größer ist als dieser
Wert.
-
Natürlich ist in der Praxis ein absolutes Vakuum nicht
erforderlich und auch nicht erreichbar. Das Vakuum wird
typischerweise so kalibriert, daß ein definiertes Volumen
eingesaugt wird. Dies bedeutet, daß P&sub0; in Wirklichkeit nicht
gleich Null ist, und daß der treibende Druckgradient nicht
konstant ist und sich dem Wert 1 nähert, indem das
Entsorgungsröhrchen sein definiertes Flüssigkeitsvolumen
aufnimmt. Diese Tatsache macht die Modellgleichungen etwas
komplizierter, beeinflußt die Schlußfolgerungen aber nicht
qualitativ.
-
Sobald die zelluläre Komponente der Probe auf dem
Filtermedium abgelagert wurde, kann die Zellenprüfmenge für die
anschließende Analyse vorbereitet werden. Sowohl die
Vorbereitungsschritte als auch die anschließenden
Analyseschritte können in Abhängigkeit von der Situation sehr
unterschiedlich sein. Zum Beispiel wird die Zellenprüfmenge,
nachdem das gesamte Filtermedium oder ein Teil des Filtermediums
aus dem Filtercontainer 18 entfernt wurde, im allgemeinen auf
dem Filter getrocknet. Nach dem Trocknen können das Filter und
seine Zellenprüfmenge gelagert werden, und/oder sie können für
die anschließende Analyse gemäß dem Verfahren dieser Erfindung
zu einem Analyseort - der entweder in der Nähe oder in größerer
Entfernung sein kann - transportiert werden. Das Filtermedium
kann, wo gewünscht, in Teilmengen für mehrere Tests aufgeteilt
werden.
-
In manchen Fällen werden die Zellen durch Wiederauflösung in
einem Puffer oder Verdünnungsmittel aus dem Filter entfernt. Die
Zellen können wahlweise mit Detergenzien behandelt werden, wie
z. B. wenn Zellenlyse gewünscht ist, um interne Moleküle oder
Strukturen zur Analyse freizusetzen. Bei robusten Zellen, wie
z. B. Pflanzenzellen und Mycobakterien, kann es erforderlich
sein, die Zellen durch physikalische, mechanische oder
Ultraschall-Mittel aufzuspalten.
-
Zu den DNS-Analysen nach der Zielamplifikation gehören:
-
Standardhybridisierungen wie z. B. Dot-Blot und dergleichen,
mit oder ohne vorherige Signalamplifikation. Zu den
Signalamplifikationsschemata, die bei der DNS-Analyse nützlich
sind, gehören multimere oder kettenverzweigte Markierungen,
Enzymmarkierungen und dergleichen. Zu den
Zielamplifikationsschemata gehören LCR und PCR. Spezifische
Beispiele der Analyse der DNS-Moleküle gesammelter Zellen sind
in Teil III, weiter unten, gegeben.
-
Alternativ können die Zellen mit
Durchlässigkeitsverbesserern, Porenbildungsmitteln oder anderen
ähnlichen Fixiermitteln behandelt werden, wie z. B. wenn in-situ-
Hybridisierung das beabsichtigte Analyseverfahren ist. Solche
Analyseverfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt, wie z. B. durch
das U. S. Patent 5,225,326 gezeigt, das am 6. Juli 1993 an
Besser, et al. erteilt wurde. Kurz gesagt, es sollte deutlich
sein, daß bei Zellen, die gemäß der Erfindung gesammelt wurden,
praktisch jedes Nukleinsäure-Analyseverfahren angewandt werden
kann.
Teil II: Verschiedene spezifische Ausführungsformen
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Die oben beschriebenen allgemeinen Konzepte werden in drei
hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen weiter
veranschaulicht.
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In der in Fig. 1 bis 4 gezeigten Ausführungsform sind die
Komponenten leicht erhältliche, bekannte Teile. Zum Beispiel hat
man festgestellt, daß eine 20-ml- bis 50-ml-Injektionspritze -
mit entfernter Nadel - ein geeigneter Sammelbehälter 10 ist;
allerdings können andere Sammelbehälter ohne weiteres in der
einem Fachmann gut bekannten Weise dem Verfahren der Erfindung
angepaßt werden. Idealerweise werden die Konstruktion und
Konfiguration des Sammelbehälters 10 durch das Volumen und die
Quelle der flüssigen Probe bestimmt, die dieser sammeln muß. Zum
Beispiel kann die offene Mündung 12 speziell konfiguriert
werden, um einen engen Kontakt mit der Quelle der Probe zu
ermöglichen, um ein Verschütten oder einen Verlust an
Probenvolumen zu vermeiden.
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Die Entnahmeöffnung 14 des Injektionsspritzenbehälters 10
ist ein zylindrisches, hervorstehendes Element mit einem
Außengewinde bei 16. Das Gewinde ist so ausgestaltet, daß es in
die Einlaßöffnung 24 des Filtercontainers 18 abdichtend
eingreift. Die Entnahmeöffnung 14 kann wahlweise eine
entfernbare Dichtung oder einen Absperrhahn oder ein Ventil
enthalten (veranschaulicht bei 15 in Fig. 9, im Zusammenhang mit
einer anderen Ausführungsform), damit nach der Sammlung der
flüssigen Probe der Filtercontainer 18 ohne eine Leckage der
Probe mit dem Sammelbehälter verbunden werden kann. Alternativ
kann das Ventil, wenn es verwendet wird, direkt auf dem
Filtercontainer angeordnet werden.
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In den bevorzugten Ausführungsformen ist ein Filtercontainer
18 angepaßt, um ein Filtermedium wie ein Filterpapier 20
unterzubringen und zu umgeben. Wo gewünscht, kann das
Filterpapier 20 in einem Filterträger, wie z. B. dem peripheren
oder ringförmigen Kanal 22, der durch zwei in der inneren
Seitenwand des Behälters 18 vorgesehene ringförmige Flansche
definiert ist, getragen und festgehalten werden. Wie erwähnt,
ist die Einlaßöffnung 24 am Behälter 18 ein hohler Behälter mit
Innengewinde, der angepaßt ist, um mit der Entnahmeöffnung 14
des Behälters 10 verschraubt zu werden. Die Weise, auf die der
Behälter 10 mit dem Filtercontainer 18 verbunden wird, ist nicht
kritisch, vorausgesetzt, die Verbindung leckt nicht. Obwohl hier
die Verschraubung als Verbindungstechnik ausgewählt wurde, sind
andere bekannte Abdichtungstechniken (z. B. ein Luer-LokTM oder
eine Bajonettverbindung) auch anwendbar.
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Der Behälter 18 schließt eine Auslaßöffnung 26 ein, durch
die die filtrierte flüssige Probe den Filtercontainer verläßt.
In dieser Ausführungsform ist die Auslaßöffnung eine
zylindrische Verlängerung mit Außengewinde, die angepaßt ist, um
den Fuß 28 einer typischen Injektionsnadel 30 aufzunehmen. Der
Fuß 28 der Nadel 30 ist typischerweise mit einem Innengewinde
zum abdichtenden Eingriff in die Öffnung 26 versehen. Auch
typisch ist, daß die Injektionsnadel 30 eine hohle Bohrung 32
aufweist und, wie bei 34 gezeigt, schräg abgeschnitten ist, um
bei 36 eine scharfe Spitze zu bilden. Um Keimfreiheit zu
gewährleisten und die Nadel abzudichten, ist über der Öffnung am
Ende typischerweise eine dünne, brechbare Membran vorgesehen, um
den Rohrkanal 30 zu schließen.
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Der Filtercontainer 18 besteht vorzugsweise aus mindestens
zwei Abschnitten, die angepaßt sind, um so zusammenzupassen, daß
die Abschnitte getrennt werden können, um ohne Zerstörung das
Filtermedium 20 zu entfernen.
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In dieser ersten Ausführungsform wird zur Verwendung mit
einer hypobaren 14-ml-VacutainerTM-Kammer, die auch als
Entsorgungsgefäß 40 für die verbrauchte Probe dient, eine 16-
Gauge-Injektionsnadel an der Auslaßöffnung 26 des Behälters
befestigt. In der gezeigten Ausführungsform wird das Gefäß 40
mit der Auslaßöffnung 26 des Filtercontainers 18 in abgedichtete
Verbindung plaziert, indem die scharfe Spitze 36 der Nadel 30 in
und durch die Verschlußkappe oder den Stöpsel 38 des Gefäßes 40
gesteckt wird, wie in Fig. 2 und 3 gezeigt. Wenn sich die Nadel
mit dem hypobaren Innenraum des Gefäßes 40 in abgedichteter
Verbindung befindet, wird, wie vorher beschrieben, ein
Druckgradient über das Filtermedium 20 erzeugt. Dies zieht die
flüssige Probe 39 aus dem Sammelbehälter 10, durch das
Filtermedium 20 und schließlich in das Entsorgungsgefäß 40
(siehe Fig. 3). Während andere Mittel verwendet werden können,
um eine Strömung der Flüssigkeit aus dem Sammelbehälter, durch
den Filtercontainer und in die hypobare Kammer zu erzeugen,
bietet die Verwendung eines hypobaren Gefäßes, wie z. B. eines
VacutainerTM-Röhrchens, insofern einen bedeutenden Vorteil, als
es eine konsistente Anfangskraft zum Einziehen eines definierten
Flüssigkeitsvolumens bewirkt, was zu konsistenten und
voraussagbaren Sammlungsergebnissen führt.
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Wenn die Probe durch das Filter fließt, wird die zelluläre
Komponente der Probe durch dieses eingefangen und gesammelt,
wodurch eine Zellenprüfmenge 42 definiert wird (siehe Fig. 4).
Der entleerte Teil der Probe wird zur geeigneten Entsorgung im
Gefäß 40 gesammelt.
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Einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung besteht in der
Möglichkeit, an derselben Probe mehrere Analysen durchzuführen.
Die Konstruktionen der folgenden zwei Ausführungsformen sollen
diesen Vorteil vergrößern, indem die physikalische Manipulation
oder Segmentation des Filtermaterials selber vermieden oder
minimiert wird. Eine Ausführungsform ermöglicht das Stanzen von
Scheiben aus dem Filter, während dieses noch im Gehäuse
eingeschlossen ist; eine andere Ausführungsform dagegen erlaubt
die Sammlung auf mehreren separaten Filtern, die dann ohne
irgendeinen physikalischen Trennungs- oder Segmentationsvorgang
separat aufbereitet werden können.
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Eine zweite Ausführungsform der Sammlungsvorrichtung ist in
Fig. 9 gezeigt, wobei das Filter in Fig. 6 bis 8 detaillierter
gezeigt ist. In dieser Ausführungsform ist das Entsorgungsgefäß
40 eine hypobare Kammer, die im wesentlichen gleich ist wie in
der letzten Ausführungsform. Der Sammelbehälter 80 ist
trichterförmig und ist zum Sammeln von Urinproben und
dergleichen besonders gut geeignet. Er schließt eine
Entnahmeöffnung 14 ein, die angepaßt ist, um mit der
Einlaßöffnung 24 des Filtercontainers dieser Ausführungsform
abdichtend zusammenzupassen. Es sollte verstanden werden, daß
die verschiedenen Sammelbehälter, die Entsorgungsgefäße und die
Filtercontainer im Grunde zwischen den Ausführungsformen
austauschbar sind. Man muß lediglich sicherstellen, daß die
Entnahme- und Einlaßöffnungen abdichtend ineinandergreifen
können und daß die Auslaßöffnung und die hypobare Kammer
selektiv in abdichtbare Verbindung gesetzt werden können, wie
z. B. mittels einer Injektionsnadel 30 (siehe Fig. 9), die dann
in der vorher beschriebenen Weise in eine typische hypobare
Vorrichtung gesteckt werden kann, um die Flüssigkeit durch die
Entnahmeöffnung des Behälters 80 und in den Filtercontainer 58
zu ziehen.
-
Mit Bezug auf den in Fig. 6 bis 8 gezeigten Filtercontainer
58 umfaßt diese Ausführungsform des Filtercontainers ein Paar
zusammenpassender Abschnitte 60 und 62, die angepaßt sind, um im
Gebrauch abdichtend ineinanderzugreifen. Der (wie gezeigt) obere
Abschnitt 60 schließt eine Filterträgerplatte 70 zum Tragen
eines ringförmigen Filters 72 ein (siehe Fig. 8). Für ein
leichtes Einsetzen eines Filtermediums kann der Filterträger 70
vorzugsweise vom oberen Gehäuseabschnitt 60 abtrennbar sein. Das
ringförmige Filter 72 schließt eine zentrale Öffnung 74 ein, die
angepaßt ist, um in den erhöhten Vorsprung 71 aufgenommen zu
werden, der auf der Trägerplatte 70 vorgesehen ist, um einen
korrekten Sitz des Filters 72 relativ zur Trägeröberfläche zu
ergeben. Die Trägerplatte 70 schließt mehrere Öffnungen 76 ein,
durch die die flüssige Probe hindurchtreten kann, wenn sie durch
die Filterkammer 58 gezogen wird.
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Der untere Abschnitt 62 schließt eine scheibenförmige Platte
bzw. einen scheibenförmigen Träger 64 ein, die bzw. der an den
Träger 70 des oberen Abschnitts 60 anstößt, wenn der Behälter
58, wie in Fig. 6 gezeigt, zusammengebaut wird. Die Platte 60
schließt mehrere Öffnungen 66 ein, die mit Öffnungen 76 in der
Trägerfläche 70 fluchten. In einer Variation (in Fig. 10
gezeigt) kann die Trägerplatte 70 integral mit der Trägerplatte
60 gebildet oder verschmolzen sein. Ein poröser Zapfen 68 kann
in den Öffnungen 66, 76 angeordnet werden, um die Strömung
zusätzlich durch diese zu lenken. Dies gewährleistet einen
hinreichenden Kontakt zwischen dem Filtermedium und der
flüssigen Probe, um ein ausreichendes Einfangen der zellulären
Probe auf dem Filter zu bewirken, und kann auch dazu dienen, die
Sammlung von Zellen in diskrete Bereiche 77 auf dem Filter 72 -
die die Positionen der Öffnungen 76 umgeben - zu kanalisieren
und dort zu konzentrieren. Diese Sammlung in diskreten Zonen ist
in Fig. 8 veranschaulicht, die mit Fig. 4 verglichen werden
kann, in der die Zellen en masse in einem zentralen Bereich 42
gesammelt werden.
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Diskrete Zonen gesammelter Zellen bieten zwei Vorteile.
Erstens sind die Zonen einfacher in Teilmengen zu teilen oder zu
zerlegen, um mehrere Analysen durchzuführen. Zweitens kann die
Verteilung der Probenströmung auf diskrete Bereiche des Filters
72 die Membranverschmutzung minimieren und verzögern. Diese
Verteilung oder Kanalisierung kann durch Kanäle oder Öffnungen
unter dem Filtermedium (z. B. Öffnungen 76) oder durch Durchgänge
oder Sammelleitungen (z. B. Sammelleitung 106, die unten im
Zusammenhang mit Fig. 11 bis 14 beschrieben wird), die zum
Filtermedium hinführen, bewerkstelligt werden.
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Nach der Sammlung der Zellenprüfmenge 42 können die Hälften
60, 62 des Filtercontainers 58 getrennt und das Filter 72
entfernt werden. Dieses kann, wie beim anderen Filter 20, auf
jede gewünschte Weise getrocknet, zerlegt, transportiert
und/oder analysiert werden.
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Eine Verfahrensvariante zum Entfernen von Zellenprüfmengen
42 aus dem Filtercontainer 58 ist in Fig. 10 gezeigt. In dieser
Variation schließt der Filtercontainer 58 mehrere Öffnungen 84
um den Umfang der oberen Wand 83 des Filterhäusebauelements 60
ein. Die Öffnungen 84 fluchten axial mit den Öffnungen 66, 67
und den zugehörigen Zonen 77 und sind anfangs mit einer
entfernbaren Membran oder Dichtung 81 verschlossen. Nachdem die
Zellenprobe 42 in jeder der verschiedenen Zonen 77 auf dem
Filter gesammelt wurde, wird das untere Bauelement des Behälters
58 entfernt. Ein geeigneter Behälter, wie z. B. ein
Glasfläschchen 85, wird dann mit einer ausgewählten Zone 77 in
Verbindung plaziert, wie in Fig. 10 gezeigt. Das Glasfläschen 85
wird typischerweise eine offene Mündung mit einem äußeren Rand
oder einer äußeren Kante 87 einschließen, der bzw. die angepaßt
ist, um in eine entsprechende Öffnung 76 gesteckt oder mit einer
entsprechenden Öffnung 76 verbunden zu werden. Ein Werkzeug, wie
z. B. eine Stanze 86, schließt eine Spitze 89 ein, die angepaßt
ist, um die zugehörige Zellenprüfmengenzone 77 aus der Scheibe
und in das Glasfläschen 85 zu stanzen, wo sie zur Analyse
gelagert werden kann. Bevor die Stanze 86 verwendet wird, kann
die Dichtung 81 von Öffnungen 84 im oberen Gehäusebauelement 60
abgezogen werden, oder die Stanze kann angepaßt werden, um auch
die Dichtung 81 zu durchstoßen. Dieses alternative Verfahren zum
Entfernen von Zellenprüfmengen erfordert nicht, daß das gesamte
Filter aus dem Gehäuse entfernbar ist.
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Eine dritte Filtercontainerausführungsform ist in Fig. 11
bis 14 gezeigt. Wie dort gezeigt, umfaßt ein Sammelleitungs-
Filtergehäuse 88 ein Paar im wesentlichen rechteckige
Abschnittsbauelemente oder Hälften 91 und 92. Jeder dieser
Abschnitte kann in der einem Fachmann gut bekannten Weise aus
einer Einheitsform mit integralen Fließwegen gebildet werden.
Wie in Fig. 11 und 13 gezeigt, ist im Nippel 100, der sich vom
rechten Ende des unteren Abschnitts 92 nach außen erstreckt,
eine Einlaßöffnung 24 vorgesehen. Im Auslaßnippel 96, der sich
vom linken Ende des oberen Abschnitts 91 erstreckt, ist eine
Auslaßöffnung 26 vorgesehen (siehe Fig. 11 und 12). Im oberen
Abschnitt 91 sind Längsnuten 103 geformt, um die Längsstege oder
-rippen 104 zu definieren. Im unteren Abschnitt 92 sind ähnliche
Längsnuten 107 geformt, um die Längsstege oder -rippen 108 zu
definieren. Ein integraler durchgehender Kanal 102 ist im Nippel
96 vorgesehen und verbindet die oberen Filternuten 103 über die
Sammelleitung 105 mit der Auslaßöffnung 26. In der gleichen
Weise ist im Einlaßnippel 100 ein integraler durchgehender Kanal
106 vorgesehen, der die unteren Filternuten 107 über die
Sammelleitung 109 mit der Einlaßöffnung 24 verbindet. Die Rippen
104 und 108 sind vorzugsweise versetzt angeordnet (siehe Fig.
14), um diagonale Fließwege durch das Filtermedium-Element 110
zu bilden, um die Fläche, der die Probe ausgesetzt wird, indem
sie durch den Filtercontainer gezogen wird, zu maximieren, um
die Zellenausbeute in der eingefangenen Zellenprüfmenge zu
maximieren. Im Gebrauch wird (werden) das Filtermedium-Element
(die Filtermedium-Elemente) 110 in die Längsnuten an den Rippen
108 gelegt und zwischen dem oberen und dem unteren Abschnitt
eingeschlossen, wenn diese zusammengefügt werden, wie in Fig. 14
gezeigt. Der Einlaßnippel 96 ist angepaßt, um an der
Entnahmeöffnung eines geeigneten Sammelbehälters befestigt zu
werden, und der Auslaßnippel 100 ist angepaßt, um in der vorher
beschriebenen Weise an einem geeigneten Entsorgungsgefäß
befestigt zu werden.
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Im Gebrauch wird ein Filtermedium in jede Nut gelegt, und
die Hälften werden abdichtend miteinander verbunden. Einrastende
Zungen oder Klemmen (nicht gezeigt) können vorgesehen werden, um
die Behälterhälften in abdichtenden Eingriff zu bringen. Am
Einlaßende ist ein Sammelbehälter in abdichtendem Eingriff. Wenn
zwischen der Einlaßöffnung 24 und der Auslaßöffnung 26 eine
Druckdifferenz erzeugt wird, fließt die Flüssigkeit im
Sammelbehälter durch die integralen Kanäle, die durch die Rippen
und Nuten definiert werden, wie in Fig. 14 gezeigt, um die
Zellenprüfmengen einzufangen.
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Ein Vorteil dieser Ausführunsgform besteht darin, daß Zellen
oder Feststoffteilchen auch filtriert werden können, wenn das
Filterelement 110 nahe dem Einlaß verstopft wird, weil die
flüssige Probe durch die Nuten 103 fließen kann, bis sie einen
weniger verstopften Teil des Filtermediums erreicht. Es wird für
einen Fachmann leicht zu begreifen sein, daß die konkrete
Konfiguration der Rippen und Nuten eine konstruktive
Entscheidung ist und zu einem großen Teil von der Größe der
zellulären Struktur bestimmt wird.
-
Wie insbesondere in Fig. 5 gezeigt, kann die
Sammlungsapparatur in Form eines Kits zur schnellen Verwendung
in einer klinischen Umgebung zusammengesetzt werden. Der Kit
schließt typischerweise folgendes ein: einen Sammelbehälter 10,
einen oder mehrere Filtercontainer 58, 88, ein hypobares Gefäß
40 mit einer Dichtung wie z. B. dem Deckel 38 und ein Mittel zum
Anlegen der Druckdifferenz des Gefäßes 40 an der Auslaßöffnung
26 des Filtercontainers. Das Mittel zum Anlegen eines Drucks
kann die Nadelbaugruppe 30 sein, die angepaßt ist, um am
Entnahmeende 26 des betreffenden Filtercontainers befestigt zu
werden und um die Dichtung 38 des Gefäßes 40 zu durchstoßen. Der
Komponentenfiltercontainer 58, 88, der Sammlungsbehälter 10, die
Nadelbaugruppe 30 und die hypobare Kammer 40 sind alle oben im
Einzelnen beschrieben.
Teil III: Beispiele
-
Beispiele wurden unter Laborbedingungen durchgeführt und
sollen die Funktionalität der hier offenbarten Erfindung
demonstrieren. Die folgenden Abkürzungen werden mit Bezug auf
die Beispiele konsequent verwendet:
-
BSA: Rinderserumalbumin
-
CF: Muskoviszidose
-
CFTR: Muskoviszidose-Transmembranregler
-
EPPS: Ein Puffer, der aus N-(2-
Hydroxyethyl)-piperazin-N'-(3-
propansulfonsäure) besteht
-
Oligonucleotide: Oligonucleotide, im allgemeinen Oligo-
2-desoxyribonucleotide
-
NAD: Nicotinamid-adenin-dinucleotid
-
TRIS: Ein Puffer, der aus
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
besteht
-
Einheiten: Ein Maß der Konzentration von
Enzymen. Die Einheiten bei
Polymerase sind wie vom Hersteller
angegeben; die Einheiten bei Ligase
sind so definiert, daß 1 mg 95%ige
gereinigte DNS-Ligase eine
spezifische Aktivität von etwa
1·10&sup8; Einheiten aufweist.
Beispiel 1: allgemeine Zellsammlungsvorrichtung
-
Filtrations-Sammlungs-Vorrichtungen wurden wie folgt
zusammengebaut: Millipore-AP25-Glasfaservorfilter mit einem
Durchmesser von 25 mm (1 Zoll) (Millipore Corporation, Bedford,
Mass) wurden in 25-mm-Swinnex-Scheibenfilterhalter (Millipore,
Bedford, MA) gelegt, die dann zusammengefügt wurden. Diese
wurden dann über die Luer-Eintrittsöffnung an einer 20- oder 50-
ml-Standard-Injektionsspritze befestigt. Hohle 16-Gauge-
Injektionsnadeln mit einer länge von 25 mm (1 Zoll) wurden am
Luer-Anschlußstück an der Austrittsöffnung befestigt. Prüfmengen
werden in der Injektionsspritze gesammelt (für nähere
Einzelheiten siehe Beispiele unten), die als ein praktischer
Trichter funktioniert, und die Filtration wird erreicht, indem
die Nadel durch den Gummistöpsel eines VacutainerTM-Röhrchens
(Becton Dickinson, Rutherford, NJ) gesteckt und die Filtration
durchgeführt wird. Wenn der Filtrationsvorgang endet, wird die
überschüssige flüssige Prüfmenge weggeworfen, die Vorrichtung
auseinandergebaut und das Filter wie in den folgenden Beispielen
aufbereitet.
Beispiel 2: Probensammlung:
-
A. Spülung mit Wasser: Jede Person nahm 10 ml Trinkwasser,
spülte damit einige Male den Mund, um die flüssige Probe zu
bilden, und spuckte die Probe dann in die Öffnung eines
Sammelbehälters. Ein VacutainerTM-Gefäß wurde angeschlossen, um
einen Druckgradienten anzulegen, und die Zellenprüfmenge wurde
wie oben beschrieben auf den Filtern gesammelt. Nach der
Sammlung wurden die Filter aus der Sammlungsvorrichtung entfernt
und auf einer Laborbank luftgetrocknet. Die getrockneten Filter
wurden entweder aufbereitet oder - bis zur Aufbereitung - für
bis zu 47 Tage bei Raumtemperatur in einer Plastiktasche
gelagert.
-
B. Spülung mit antiseptischem Mundspülungsmittel: Prüfmengen
wurden wie in Teil A gesammelt, außer daß die Personen 10 ml
eines handelsüblichen Mundspülungsmittels (Scope®, Proctor &
Gamble, Cincinnati, OH) verwendeten, um die flüssige Probe zu
bilden. Die AP40-Filter fielen nach der Sammlung und
Prüfmengenaufbereitung auseinander (siehe unten).
Beispiel 3: Aufbereitung gesammelter Zellenprüfmengen:
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A. Einige der gesammelten Filter wurden in ein 1,7-ml-
Mikrozentrifugenröhrchen gelegt und 0,5 ml steriles HPLC-Wasser
wurde hinzugefügt. Das Röhrchen wurde dann 20 Minuten lang in
kochendem Wasser inkubiert und dann auf Raumtemperatur
abgekühlt. Es wurde schnell geschleudert, und die Flüssigkeit
wurde dann in ein anderes Glas entfernt.
-
B. Andere Prüfmengen wurden wie oben gesammelt, dann wurde
eine alternative KOH-Extraktion durchgeführt. Diese
Prüfmengenfilter wurden mit 0,5 ml 50 mM KOH aufbereitet. Nach
Inkubation in kochendem Wasser für 20 Minuten wurde 100 ul 0,1 M
Tris-HCl, pH 7,5, hinzugefügt, um die Lösung zu neutralisieren.
Die Lösung wurde dann 20 Minuten lang bei 14.000 U/min
zentrifugiert und der Flüssigkeitsüberstand in ein neues
Röhrchen umgefüllt.
Beispiel 4: LCR®-Amplifikation und Detektion des CFTR-Gens
-
A. Amplifikation: LCR®-Amplifikation wurde unter Anwendung
der sogenannten "Double gap"-Strategie, wie von Backman, et al.
in EP-A-0 439 182 (1991) beschrieben, durchgeführt. Vier Sonden
(Seq.-Id.-Nr. 1, 2, 3 und 4) wurden unter Anwendung von auf dem
Fachgebiet bekannten Standardtechniken synthetisiert und mit
Biotin- oder Fluoresceinhaptenen markiert, wie unten gezeigt.
-
Die Anordnung dieser Sonden mit Exon 10 des CFTR-Gens (Seq.-Id.-
Nr. 5) ist in Fig. 15 gezeigt. Das Ziel befindet sich im Bereich
1612-1679, wie von Zielenski et al., Genomics 10, 214-228 (1991)
numeriert. LCR wurde über 40 Zyklen mit jeder der vier Sonden
(Seq.-Id.-Nr. 1, 2, 3 und 4) in einem Gesamtvolumen von 100 ul
mit den folgenden Endkonzentrationen durchgeführt: 50 mM EPPS pH
7, 8, 20 mM Kalium (als KOH hinzugefügt, um den pH des Puffers
einzustellen, und als KCl hinzugefügt, um 20 mM K&spplus; zu erreichen),
30 mM MgCl&sub2;, 100 uM NAD, 10 uM Nucleosidtriphosphate dCTP und
dTTP, je 100 uM der vier Sonden, 3 Einheiten DNS-Polymerase
(Amplitaq®, Perkin-Elmer/Cetus, Emeryville, CA) und 3400
Einheiten Thermus-thermophilus-DNS-Ligase. 10 ul aufbereitete
Zellenprüfmenge aus dem Beispiel 3A wurde bei jeder
Amplifikation verwendet. Menschliche plazentare DNS (50 ng)
wurde als Kontrollsubstanz verwendet, um den
Amplifikationsvorgang zu überwachen. Der LCR®-Vorgang selber
erfolgte in einem Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT)
unter Anwendung eines Denaturierungsprofils von 3 Minuten bei
95ºC gefolgt von einem Temperaturwechselprofil von 30 Sekunden
bei 85ºC und 60 Sekunden bei 57ºC.
-
B. Detektion durch Immunchromatographie: Antisera gegen
Adamantan, Fluorescin und Biotin wurden gegen Adamantan-BSA,
Fluorescin-BSA oder Biotin-BSA in Kaninchen gezüchtet. Diese
Antisera wurden gereinigt, indem sie durch das Protein A
Sepharose® oder das Protein G Sepharose® (Pharmacia, Piscataway,
NJ) hindurchgeleitet wurden, und in 0,1 M Tris, pH 7,8, 0,9%
NaCl, 0,1% BSA, 1% Sucrose und einer sehr geringen Menge
Phenolrot verdünnt. Teile (0,2 ul) dieser verdünnten Antisera
gegen Adamantan und Fluorescein wurden auf 7, 3 mm · 40 mm große
Nitrozellulosestreifen (AE98, 5 um, Schleicher und Schuell,
Dassel, Deutschland) gespritzt.
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Antiserum gegen Biotin wurde mit Polystyrol gleichmäßig
gefärbten blauen Latex-Teilchen (Bangs Laboratories, Carmel, IN)
konjugiert. Teilchen (Durchmesser 380 nm) wurden in 1.25 in
Wasser verdünnt, um 1 ml mit 0,4% Feststoffen zu ergeben, und 10
ul Biotin-Antiserum mit einer Konzentration von 1 mg/ml wurde
hinzugefügt. Die Suspension wurde 45 Sekunden lang auf einem
Wirbelmischer gemischt, und 5 ul 5%iges Kasein in 0,1 M Tris, pH
7, 8, wurde hinzugefügt.
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Zur Detektion wurde 21 ul des Biotin-Gegenserum-Konjugats
(blauer Latex) mit 16 ul Puffer (0,1 M Tris, pH 7,8, 0,9% NaCl,
3% alkalibehandeltes Kasein) verdünnt und mit 5 ul LCR®-
Amplifikationsprodukt gemischt. Ein Nitrozellulosestreifen, der
Fluorescein-Antiserum oder Adamantin-Antiserum oder beides
enthielt, wurde in die Konjugat-Suspension hineingelegt, und man
ließ eine Chromatographie fünf Minuten lang ihren Verlauf
nehmen, und zwar im wesentlichen wie in der veröffentlichten
Anmeldung EP 0 357 011 A2 beschrieben. Der Streifen wurde
getrocknet und ist in Fig. 17 gezeigt. Die Anwesenheit eines
Farbflecks an dem Ort des Aufbringens der Fluorescein-Antiserums
wies auf die Anwesenheit eines spezifischen LCR®-Produkts hin.
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Fig. 17 zeigt Prüfmengenstreifen von verschiedenen Personen,
die, wie folgt, zu verschiedenen Zeiten nach der Sammlung auf
Filtern aufbereitet wurden: Streifen C ist gereinigte plazentare
DNS. Streifen 1-5 sind Prüfmengen von fünf verschiedenen
Personen, die aus Filtern aufbereitet wurden, und zwar 47 Tage
nach der Sammlung (Streifen 1), 45 Tage nach der Sammlung
(Streifen 2) und einen Tag nach der Sammlung (3 Personen,
Streifen 3, 4 und 5). Streifen B ist eine Blindmuster für
Kontrollzwecke, ohne hinzugefügte DNS.
Beispiel 5: LCR®-Amplifikation und Detektion des β-Globin-
Gens
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A. Amplifikation: LCR®-Amplifikation wurde unter Anwendung
der sogenannten "Double gap"-Strategie, wie von Backman, et al.
in EP-A-0 439 182 (1991) beschrieben, durchgeführt. Vier Sonden
(Seq.-Id.-Nr. 6, 7, 8 und 9) wurden unter Anwendung von auf dem
Fachgebiet bekannten Standardtechniken synthetisiert und mit
Biotin- oder Fluoresceinhaptenen markiert. Die Ausrichtung
dieser Sonden mit dem β-Globin-Gen (Seq.-Id.-Nr. 10) ist in Fig.
16 gezeigt.
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LCR®-Amplifikation wurde wie in Beispiel 4A durchgeführt,
außer daß nur dTTP benötigt wird, um die Lücke in diesen Sonden
zu füllen; und 10-ul-Zellenprüfmengen, die sowohl mit Wasser- als
auch mit KOH-Extraktionen aufbereitet worden waren, wurden
verwendet (siehe Beispiel 3A und 3B).
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B. Detektion durch Immunchromatographie:
Immunchromatographie-Streifen werden wie in Beispiel 4B
vorbereitet. Die Detektion amplifizierter Produkte wurde wie
oben beschrieben durchgeführt, außer daß das folgende Konjugat
verwendet wurde.
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Antiserum gegen Biotin wurde mit Polystyrol gleichmäßig
gefärbten blauen Latex-Teilchen (Molecular Probes, Inc., Eugene,
OR) konjugiert. Teilchen (Durchmesser 306 nm) wurden in 1/40 in
Wasser verdünnt, um 5 ml mit 0,05% Feststoffen zu ergeben, und
50 ul Biotin-Antiserum mit einer Konzentration von 1 mg/ml wurde
hinzugefügt. Die Suspension wurde 5 Minuten lang gemischt. 50 ul
5%iges Kasein in 0,1 M Tris, pH 7,8, wurde hinzugefügt und 15
Minuten lang gemischt. Die Lösung wurde in eine 1,7-ml-
Mikrozentrifuge umgefüllt und 10 Minuten lang bei 16 10.000
U/min zentrifugiert. Der Flüssigkeitsüberstand wurde entfernt.
Ein Pellet aus der ursprünglichen 1 ml Lösung wurde mit 980 ml
Wasser von HPLC-Qualität resuspendiert und die gesamten 5 ml
wurden vereinigt.
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Daten von diesem Beispiel sind in Fig. 18 gezeigt, wobei die
folgende Aufschriften verwendet wurden: Streifen C ist
gereinigte plazentare DNS (50 ng); Streifen 1 bis 3 stammen von
Filtern, die durch Wasserextraktion gemäß Beispiel 3A
aufbereitet wurden; Streifen 4 und 5 stammen von Filtern, die
durch KOH-Extraktion gemäß Beispiel 3B aufbereitet wurden, wobei
reine plazentare DNA (50 ng) beigemischt wurde.
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Aus diesen und anderen Versuchen (Daten nicht gezeigt) ist
festgestellt worden, daß herkömmliche KOH-Extraktion bei Blunt-
LCR angewandt werden kann, aber für Gap-LCR nicht geeignet ist
(man beachte das Fehlen eines Signals in Streifen 4 und 5 von
Fig. 18). Anscheinend bewirkt das KOH-Extraktionsprotokoll, daß
Inhibitoren von Amplitaq®-DNS-Polymerase mit extrahiert werden.
Im Falle von Gap-LCR wird das alternative Wasser-
Extraktionsprotokoll bevorzugt.
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Auch festgestellt wird, daß bei der Gewinnung lebensfähiger
Zellen Leitungswasser besser zu sein scheint als Scope®-
Mundspülungsmittel. Erfahrungen mit Scope® haben gezeigt, daß
das Filter komplett auseinanderfiel, vielleicht auf Grund des
Alkoholgehalts dieses im Handel erhältlichen Produkts.
SEQUENZLISTE
(1) Allgemeine Information
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(i) Anmelder: Gordon, Julian
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Stimpson, Donald I.
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Hsieh, Wang-Ting
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(ii) Titel der Erfindung: VORRICHTUNG UND VERFAHREN ZUR
SAMMLUNG VON ZELLEN AUS EINER FLÜSSIGEN PROBE
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(iii) Anzahl von Sequenzen: 10
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(iv) Korrespondenzadresse:
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(A) Adressat: Abbott Laboratories
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(B) Straße: 100 Abbott Park Road
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(C) Stadt: Abbott Park
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(D) Staat: Illinois
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(E) Land: USA
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(F) Postleitzahl: 60064-3500
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(v) Computerlesbare Form:
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(A) Mediumtyp: Floppy disk
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(B) Computer: IBM PC kompatibel
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(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
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(D) Programm: WordPerfect
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(vii) Daten der früheren Anmeldung:
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(A) Anmeldenummer: US 08/158,233
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(B) Anmeldetag: 24. November, 1993
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(C) Klassifizierung:
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(viii) Angaben zum Anwalt:
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(A) Name: Brainard, Thomas D.
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(B) Registrierungsnummer: 32,459
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(C) Aktenzeichen/Aktennummer: 5472.PC.01
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(ix) Telekommunikationsinformation:
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(A) Telefon: 708-937-4884
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(B) Telefax: 708-938-2623
(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 1:
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(i) Sequenzeigenschaften:
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(A) Länge: 22 Basenpaare
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(B) Typ: Nukleinsäure
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(C) Strängigkeit: einzeln
-
(D) Topologie: linear
-
(ii) Molekültyp: DNA (synthetisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 1:
(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 2:
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(i) Sequenzeigenschaften:
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(A) Länge: 21 Basenpaare
-
(B) Typ: Nukleinsäure
-
(C) Strängigkeit: einzeln
-
(D) Topologie: linear
-
(ii) Molekültyp: DNA (synthetisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 2:
(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 3:
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(i) Sequenzeigenschaften:
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(A) Länge: 23 Basenpaare
-
(B) Typ: Nukleinsäure
-
(C) Strängigkeit: einzeln
-
(D) Topologie: linear
-
(ii) Molekültyp: DNA (synthetisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 3:
(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 4:
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(i) Sequenzeigenschaften:
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(A) Länge: 28 Basenpaare
-
(B) Typ: Nukleinsäure
-
(C) Strängigkeit: einzeln
-
(D) Topologie: linear
-
(ii) Molekültyp: DNA (synthetisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 4:
(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 5:
-
(i) Sequenzeigenschaften:
-
(A) Länge: 68 Basenpaare
-
(B) Typ: Nukleinsäure
-
(C) Strängigkeit: einzeln
-
(D) Topologie: linear
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(ii) Molekültyp: genomische DNA
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 5:
(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 6:
-
(i) Sequenzeigenschaften:
-
(A) Länge: 24 Basenpaare
-
(B) Typ: Nukleinsäure
-
(C) Strängigkeit: einzeln
-
(D) Topologie: linear
-
(ii) Molekültyp: DNA (synthetisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 6:
(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 7:
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(i) Sequenzeigenschaften:
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(A) Länge: 23 Basenpaare
-
(B) Typ: Nukleinsäure
-
(C) Strängigkeit: einzeln
-
(D) Topologie: linear
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(ii) Molekültyp: DNA (synthetisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 7:
(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 8:
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(i) Sequenzeigenschaften:
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(A) Länge: 23 Basenpaare
-
(B) Typ: Nukleinsäure
-
(C) Strängigkeit: einzeln
-
(D) Topologie: linear
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(ii) Molekültyp: DNA (synthetisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 8:
(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 9:
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(i) Sequenzeigenschaften:
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(A) Länge: 24 Basenpaare
-
(B) Typ: Nukleinsäure
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(C) Strängigkeit: einzeln
-
(D) Topologie: linear
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(ii) Molekültyp: DNA (synthetisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 9:
(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 10:
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(i) Sequenzeigenschaften:
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(A) Länge: 47 Basenpaare
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(B) Typ: Nukleinsäure
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(C) Strängigkeit: einzeln
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(D) Topologie: linear
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(ii) Molekültyp: DNA (synthetisch)
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(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 10: