DE69422753T2

DE69422753T2 - Säulenpackung für Flüssigkeitschromatographie

Info

Publication number: DE69422753T2
Application number: DE69422753T
Authority: DE
Inventors: Keisuke Hisada; Naoki Koga; Hisashi Matsuda; Akinori Shigematsu; Akira Tomizawa
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1993-07-19
Filing date: 1994-07-18
Publication date: 2000-09-21
Anticipated expiration: 2014-07-19
Also published as: DE69422753D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Erfindungsgebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie und Verfahren zur Trennung von Materialien unter Verwendung dieser Säulenpackungen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie, die poröse keramische Körner mit einer hydrophilen Oberfläche enthalten, die durch Calcinieren eines kristallinen Tonminerals mit einer faserigen Struktur hergestellt werden, und ein Verfahren zur Trennung von Materialien unter Verwendung dieser Säulenpackungen.

2. Stand der Technik

Flüssigkeitschromatographie ist eine Chromatographie, bei der als mobile Phase Flüssigkeiten verwendet werden. Es wurden verschiedene Typen der Flüssigkeitschromatographie zur Trennung [von Materialien] entwickelt.
Je nach Trennungsprinzip wird die Flüssigkeitschromatographie eingeteilt in Ionenaustauschchromatographie, Verteilungs-Chromatographie, Adsorptionschromatographie, Gelpermeationschromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen. Abhängig von der Art des Betriebs wird sie weiterhin in Abwärtsfluß-Verfahren, Aufwärtsfluß-Verfahren, Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie oder dergleichen eingeteilt.
Unter diesen Verfahren weist die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ein hohes Trennvermögen auf, und die Durchflußrate ist sehr hoch, so daß [die HPLC] in den letzten Jahren eine starke Verbreitung erfahren hat. Bei der HPLC werden im wesentlichen gleichmäßige und extrem feine runde Körner als stationäre Phase (die nachstehend als "Säulenpackungen" bezeichnet wird) verwendet.
Als herkömmliche Säulenpackungen für die HPLC wurden neben Kieselgel, modifizierten Kieselgelen, bei denen das Kieselgel mit einer Octadecylgruppe oder einer Aminogruppe oder dergleichen modifiziert ist, Ionenaustauschharze, die synthetische Polymere, wie Polystyrol und Polyvinyl, enthalten, und Säulenpackungen, die natürliche Polymere oder dergleichen enthalten, verwendet.
Kieselgel wurde als Säulenpackung zur Trennung von lipidverwandten Materialien bei der Adsorptionschromatographie verwendet, wobei das ausgezeichnete Adsorptionsvermögen der Silanolgruppen, die in großer Anzahl auf den inneren Oberflächen der Poren vorhanden sind, ausgenutzt wird. Kieselgel ist jedoch leicht in Wasser löslich und widersteht Eluentien mit hohem pH-Wert kaum. Daher kann es zur Trennung von Proben unter Verwendung von diesen Eluentien nicht eingesetzt werden.
Andererseits wurden als herkömmliche anorganische Säulenpackungen aktiver Porzellanton (Kaolin) und synthetischer Zeolith zur Trennung durch Adsorption oder dergleichen verwendet. Diese weisen jedoch kein genügendes Trennvermögen als Säulenpackungen für die Chromatographie auf und konnten für die HPLC nicht verwendet werden.
Zusätzlich weisen die kürzlich entwickelten Säulenpackungen für die Chromatographie, die als Rohmaterial Hydroxyapatit verwenden, eine gute mechanische Stärke und niedrige Löslichkeit in Eluentien auf und sind daher als Säulenpackungen brauchbar. Sie absorbieren jedoch keine ungeladenen Materialien, wie Lipide, obwohl sie Materialien mit geladenen funktionellen Gruppen, wie Proteine, absorbieren. Sie sind daher zur Trennung von lipidverwandten Materialien nicht geeignet.
Die US-A-2,968,633 offenbart eine absorbierende poröse Masse, die bei der Trennung von Bestandteilen flüssiger organischer Gemische brauchbar ist und die stochastisch (zufällig) orientierte Teilchen eines Minerals, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Attapulgit und Sepiolith, enthält, wobei die Substanz einen einheitlichen Porendurchmesser zwischen etwa 10 bis 15 mm hat. Diese Masse liegt nicht in gekörnter Form vor und weist keine hydrophile Oberfläche auf.
Unter diesen Umständen besteht ein Bedürfnis, Säulenpackungen zu entwickeln, die gegenüber Eluentien mit einer hohen Polarität und einem hohen pH-Wert sehr widerstandsfähig sind, und die lipidverwandte Materialien mit hoher Wirksamkeit trennen können.
Andererseits haben in letzter Zeit Verfahren, die Keramiken verwenden, große Fortschritte gemacht, und es wurden Keramiken entwickelt, die verschiedene Funktionen aufweisen.
Beispielsweise offenbart die ungeprüfte Japanische Offenlegungsschrift Hei-3-8752 ein Verfahren zur Herstellung poröser Keramiken, indem ein Tonmineralien mit faseriger Kristallstruktur, wie Sepiolith, enthaltendes Rohmaterial calciniert wird.
Zusätzlich offenbart die ungeprüfte Japanische Offenlegungsschrift Hei-4-183393 ein Verfahren zur Fixierung von Enzymen in solchen porösen Körnern.
Die Verwendung von porösen Keramiken als Säulenpackungen für die Chromatographie war jedoch bisher unbekannt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Unter diesen Umständen ist es ein erfindungsgemäßes Ziel, Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie bereitzustellen, die gegenüber Eluentien mit hoher Polarität und/oder hohem pH-Wert sehr stabil sind und die zur Trennung lipidverwandter Materialien verwendet werden können.
Ein anderes erfindungsgemäßes Ziel ist es, Verfahren zur Trennung von Lipiden unter Verwendung der Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie zu liefern.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Ziel ist es, Verfahren zur Trennung von Vitaminen unter Verwendung der Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie zu liefern.
Es wurde nun gefunden, daß diese erfindungsgemäßen Ziele erreicht werden können, wenn poröse keramische Körner mit einer hydrophilen Oberfläche, die durch Calcinieren eines kristallinen Tonminerals mit einer faserigen Struktur hergestellt werden, als Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie verwendet werden; die keramischen Körner sind gegenüber Eluentien mit einer hohen Polarität und/oder einem hohen pH-Wert sehr stabil und sind in der Lage, lipidverwandte Materialien zu trennen, die bisher nur unter Schwierigkeiten getrennt werden konnten.
Erfindungsgemäß werden Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie bereitgestellt, enthaltend poröse keramische Körner, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die porösen keramischen Körner hydrophile Oberflächen und einen mittleren Porendurchmes ser im Bereich zwischen 0,001 um und 0,1 um aufweisen und daß die porösen keramischen Körner nach den [folgenden] Schritten hergestellt werden:
(a) Calcinieren von Körnern eines kristallinen Tonminerals mit einer faserigen Struktur und einer Korngröße im Bereich zwischen 1 und 100 um;
(b) Behandeln der Körner mit einer Säure, um die Oberfläche der Körner hydrophil zu machen; und
(c) Zweites Calcinieren der Körner, um eine Abnahme des Porenvolumens zu vermeiden, wonach die erhaltenen porösen keramischen Körner einen SiO&sub2;-Gehalt von 60% oder mehr aufweisen.
Vorzugsweise stellt die faserige Struktur eine faserige kristalline Struktur dar, die: entlang der Fasern parallelepipede intrakristalline Tunnel enthält.
Vorzugsweise ist das kristalline Tonmineral Sepiolith oder Attapulgit.
Vorzugsweise beträgt cler MgO-Gehalt der porösen keramischen Körner 30% oder weniger und der SiO&sub2;-Gehalt der porösen keramischen Körner beträgt 60% oder mehr.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Trennung von Lipiden, wie Phospholipiden, bereitgestellt, welches die [folgenden] Schritte umfaßt: Einfüllen der vorstehend beschriebenen Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie in eine Säule; Injizieren einer Lipide enthaltenden Probe; und Elution der Säule, um die in der Probe enthaltenen Lipide zu trennen und zu eluieren.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Trennung von Vitaminen, wie fettlöslichen Vitaminen, bereitgestellt, welches die [folgenden] Schritte umfaßt:
Einfüllen der vorstehend beschriebenen Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie in eine Säule; Injizieren einer Vitamine enthaltenden Probe; und Elution der Säule, um die in der Probe enthaltenen Vitamine zu trennen und zu eluieren.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt ein Röntgenbeugungsmuster von Sepiolith nach der ersten Calcinierung. "A" entspricht einem Crystobalit-Peak, "B" entspricht einem Quartz-Peak, und "C" entspricht Enstatit-Peaks.
Fig. 2 zeigt ein Röntgenbeugungsmuster von mit Säure behandeltem Sepiolith. "B" entspricht einem Quartz-Peak und ein breiter Peak, der zwischen 15 und 30º erscheint, entspricht einem Peak von nichtkristallinem SiO&sub2;.
Fig. 3 zeigt ein Röntgenbeugungsmuster von Sepiolith nach der zweiten Calcinierung. "B" entspricht einem Quartz-Peak und ein breiter Peak, der zwischen 15 und 30º erscheint, entspricht einem Peak von nichtkristallinem SiO&sub2;.
Fig. 4 zeigt ein Chromatogramm von Phosphatidylcholin (PC) und Sphingomyelin (SPM) unter Verwendung der erfindungsgemäßen Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie.
Fig. 5 zeigt die Schwankungen der Retentionszeit bei einer kontinuierlichen Verwendung von HPLC-Säulen mit Kieselgel (SC) bzw. den erfindungsgemäßen Säulenpackungen. "o" zeigt die Retentionszeit von Sphingomyelin bei Verwendung der erfindungsgemäßen Säulenpackung, " " die von Phosphatidylcholin bei Verwendung der erfindungsgemäßen Säulenpackung, "·" zeigt die von Sphingomyelin unter Verwendung einer Kieselgelsäule bzw. "x" die von Phosphytidylcholin unter Verwendung einer Kieselgelsäule.
Fig. 6 zeigt ein Chromatogramm von Vitamin K&sub1; und Vitamin D&sub3; unter Verwendung der erfindungsgemäßen Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG

Die erfindungsgemäß als Rohmaterialien verwendeten kristallinen Tonminerale mit faseriger Struktur umfassen Sepiolith, Attapulgit und Palygorskit.
Sepiolith is ein Tonmineral mit der chemischen Formel Mg&sub8;Si&sub1;&sub2;O&sub3;&sub0;(OH&sub2;)&sub4; · 6 bis 8 H&sub2;O. Unter den Tonmineralen weist Sepiolith eine faserige kristalline Struktur auf, die von der von Mineralien, wie Kaolinit und Montmorillonit, die eine Schichtstruktur haben, verschieden ist. Die Kristalle enthalten parallelepipede intrakristalline Tunnel einheitlicher Größe entlang der Fasern, und deren Querschnitt beträgt etwa 1,35 · 0,67 nm². Aggregate von Sepiolith haben ein großes Porenvolumen mit maximalen Porengrößen von 0,001 gut und 0,02 um. Sie werden auf vielen Gebieten eingesetzt, beispielsweise als Entfärbungsmittel, wasserabsorbierende Mittel, geruchsabsorbierende Mittel und ölabsorbierende Mittel.
Attapulgit ist ein kristallines Tonmineral mit einer faserigen kristallinen Struktur, die, wie Sepiolith, parallelepipede intrakristalline Tunnel entlang der Fasern enthält, und hat die chemische Formel Mg&sub5;Si&sub8;O&sub2;&sub0;(OH)&sub2;(OH&sub2;)&sub4; · 4 H&sub2;O. Es wird auf vielen Gebieten verwendet, beispielsweise als Adsorptionsmittel und Aufschlämmungen für Bohrzwecke. Attapulgit wird auch als Palygorskit bezeichnet.
Verschiedene Tonmineralien, wie SiO&sub2; und MgO als Hauptkomponenten enthaltender Talk, und SiO&sub2; als Hauptkomponente enthaltender Kaolinit und Montmorillonit, zusätzlich zu dem vorstehenden kristallinen Tonmineral mit faseriger Kristallstruktur, das parallelepipede intrakristalline Tunnel entlang der Fasern auf weist, können als Rohmaterial für die erfindungsgemäßen Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie können beispielsweise nach einem nachstehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Die Säulenpackungen können durch die [folgenden] Schritte hergestellt werden: Zerkleinern des vorstehend beschriebenen Rohmaterials und anschließende Körnung (Granulierung), wie z. B. Walzkörnung (rolling granulation), um runde Körner einer vorbestimmten Korngröße zu erhalten, Durchführen der ersten Calcinierung, umfassend eine Calcinierung bei einer Temperatur von 100 bis 1.200ºC, Behandeln der Körner durch Eintauchen in eine Mineralsäure, wie Salzsäure oder Schwefelsäure, um Alkalioxide zu entfernen, Durchführen der zweiten Calcinierung, umfassend eine Calcinierung bei einer Temperatur von 100 bis 1.200ºC, und anschließende Einteilung der Körner verschiedener Korngrößen, beispielsweise durch Levitation, Luftaufbereitung und Sieben, um eine vorbestimmte Korngröße zu erhalten.
Das vorstehende Verfahren zur Herstellung von Säulenpackungen wird nun anhand eines Beispiels im Detail beschrieben, wobei Sepiolith als Rohmaterial verwendet wird.
Nach dem herkömmlichen Zerkleinern des keramischen Rohmaterials wird es zunächst gekörnt. Die Körnung wird vorzugsweise ausgeführt, um das Rohmaterial in runder Form zu erhalten.
Das Körnungsverfahren kann unter Zusatz von Wasser als Extrusionskörnung des roher. Tonminerals, enthaltend pulverförmigen Sepiolith, als Walzkörnung, umfassend die Dispersionskörnung des pulverförmigen Sepioliths und einer kleinen Menge Wasser in einem Mixer, und als Sprühtrocknung durchgeführt werden. Für eine Körnung in runder Form wird die Walzkörnung bevorzugt. Zusätzlich wird Sprühtrocknen bevorzugt, um Körner kleiner Größen zu erhalten.
Beim Durchführen der Sprühtrocknung wird zunächst eine Aufschlämmung hergestellt, bei der das Rohsepiolith-Pulver in Wasser oder einem organischen Lösungsmittel dispergiert ist. Zu dieser Zeit ist die Aufschlämmung so weit als möglich entflockt. Viele Verfahren zur Durchführung des Sprühtrocknens sind bekannt, aber hier ist es wichtig, ein Verfahren zu verwenden, bei dem die Aufschlämmung in Form feiner Tröpfchen gesprüht wird. Jedes bekannte Verfahren, wie ein Verfahren mit einer rotierenden Scheibe, ein Verfahren, bei dem die Aufschlämmung unter Druck aus einer Düse versprüht wird oder ein Verfahren, bei dem zwei Flüssigkeiten versprühende Düsen eingesetzt werden, kann erfindungsgemäß verwendet werden. Der Durchmesser der Körner kann durch Auswahl eines bestimmten Verfahrens oder Systems kontrolliert werden.
Der Korndurchmesser des durch Körnung erhaltenen Rohmaterials liegt im Bereich von 1 bis 100 um. Ein Korndurchmesser von weniger als 1 um ist nicht wünschenswert, da sich leicht Klumpen (Verstopfungen) bilden und bei der Verwendung als HPLC-Säulenpackungen ein hoher Druck erforderlich ist, obwohl theoretisch die Anzahl der Platten erhöht werden kann, wenn der Oberflächenbereich pro Mengeneinheit der Säulenpackungen erhöht wird, d. h. wenn die Korngröße verkleinert wird, um den Oberflächenkontakt mit den Proben zu erhöhen. Andererseits verringert sich die Trennungseffizienz, wenn die Korngröße mehr als 100 um beträgt, was nicht wünschenswert ist.
Um den so hergestellten Körnern Stabilität zu verleihen, kann der Aufschlämmung zunächst ein organisches Bindemittel, wie Cellulose, und ein anorganisches Bindemittel, wie Wasserglas, zugesetzt werden.
Anschließend werden die hergestellten Körner der ersten Calcinierung unterzogen. Die erste Calcinierung wird durchgeführt, um eine Veränderung der Form der Körner während des Eintauchens in Säurelösung bei dem nächsten Säurebehandlungs-Schritt zu vermeiden. Die erste Calcinierungstemperatur liegt vorzugsweise im Be reich von 100 bis 1.200ºC. Wenn die Calcinierungstemperatur unterhalb von 100ºC liegt, tritt leicht eine Veränderung der Form auf. Wenn die Calcinierungstemperatur mehr als 1.200ºC beträgt, ist die Entfernung von auf die Säurebehandlung zurückzuführenden Verunreinigungen erschwert, und [diese Temperatur] ist daher nicht erwünscht.
Durch das Calcinieren wird aus dem Sepiolith zunächst Metasepiolith, wobei das adsorbierte Wasser und das Kristallwasser entfernt werden. Wenn er weiter bei einer höheren Temperatur thermisch behandelt wird, wird er zu einem Kristall, wie beispielsweise Enstatit, Quartz, oder Crystobalit. Das Röntgenbeugungsmuster ist in Fig. 1 dargestellt.
Anschließend werden die in dem Sepiolith enthaltenen Alkalimetalloxide oder Erdalkali-Metalloxide durch Säurebehandlung entfernt.
Das Sepiolith-Rohmaterial enthält üblicherweise viele Verunreinigungen und enthält neben der Hauptkomponente SiO&sub2; auch nach der Reinigung MgO, Al&sub2;O&sub3;, Fe&sub2;O&sub3;, CaO, K&sub2;O, Na&sub2;O oder dgl., obwohl die Mengen sehr klein sind. Diese Verunreinigungen werden vorzugsweise so weit als möglich entfernt. Glücklicherweise sind fast alle Verunreinigungen Alkalimetalloxide und MgO oder Erdalkali-Metalloxide und in Säure löslich, so daß sie durch eine Tauchbehandlung mit Säurelösung entfernt werden können.
Als ein Verfahren zur Entfernung von Verunreinigungen durch Säurebehandlung ist in der ungeprüften Japanischen Offenlegungsschrift Sho 4-183393 ein Verfahren offenbart, bei dem andere Komponenten als die Hauptkomponente SiO&sub2; eluiert werden, indem die vorläufig bei 800ºC calcinierten Sepiolith-Keramiken 24 Stunden in Salzsäure mit einem pH-Wert von 2 getaucht werden. Bei der vorliegenden Erfindung kann so eine Säurebehandlung ebenfalls durchgeführt werden.
Fig. 2 zeigt das Röntgenbeugungsmuster von Sepiolith, in dem nichtkristallines SiO&sub2; gebildet wurde, indem das in dem Kristall enthaltene MgO entfernt wird, wenn ein Zeolith mit dem in Fig. 1 dargestellten Röntgenbeugungsmuster nach der ersten Calcinierung mit Säure behandelt wird.
Das nichtkristalline SiO&sub2; kann gebildet werden, indem MgO aus den Sepiolith-, Metasepiolith- oder Enstatit-Kristallen entfernt wird, um die Kristallstruktur zu zerstören.
Die Säurelösung kann mineralische Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure enthalten.
Je niedriger der pH-Wert und je höher die Konzentration der Säurelösung sind, desto schneller können die Alkalimetalloxide und die Erdalkali-Metalloxide, wie MgO, entfernt werden. Obwohl die Leistung der Säulenpackungen von ihrer Zusammensetzung abhängt, kann die Zusammensetzung der fertigen Säulenpackungen durch die Säurebehandlung eingestellt werden. Der SiO&sub2;-Anteil wird vorzugsweise auf 60 bis 100% eingestellt.
Zusätzlich werden durch die Entfernung von MgO an den Stellen, aus denen das MgO eluiert wurde, neue Poren geschaffen. Die Porengröße beträgt etwa 0,1 um oder weniger. Die durch die Bildung neuer Poren aufgrund der Entfernung von etwa 25% MgO erhöhte spezifische Oberfläche beträgt etwa 100 m² oder mehr pro Gramm Säulenpackung, und daher ist die Bildung neuer Poren ein Faktor, der zur Leistungssteigerung der Säulenpackungen führt. In Bezug auf die Eigenschaften als die stationäre Phase der HPLC bleibt aber ein bestimmter Anteil MgO vorzugsweise erhalten, und es wird nicht das gesamte MgO entfernt. Der bestimmte bevorzugte Anteil von in den porösen Keramiken enthaltenem MgO beträgt 30% oder weniger.
Die bei der vorliegenden Erfindung durch das Entfernen von MgO mittels einer Säurebehandlung gebildeten Poren können eine gleichmäßige Form und eine gleichmäßige Porengröße aufweisen, während bei den herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Keramiken sich die Porenbildung in Abhängigkeit von den Calcinierungsbedingungen ändert und Keramiken mit einer gleichmäßigen Porengröße nicht erhalten werden können.
Nach der Behandlung mit einer Säurelösung wird eine weitere Calcinierung durchgeführt, um eine hohe mechanische Stabilität zu ergeben.
Die zweite Calcinierungstemperatur muß so eingestellt werden, daß eine Abnahme des Porenvolumens vermieden wird, und liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 100 bis 1.200ºC, und insbesondere im Bereich von 800 bis 1.100ºC. Wenn die Calcinierungstemperatur weniger als 100ºC beträgt, ist die mechanische Stabilität der Säulenpackungen vermindert. Wenn die Calcinierungstemperatur mehr als 1.200ºC beträgt, nimmt das Porenvolumen ab, was nicht bevorzugt ist.
Nach der Durchführung der zweiten Calcinierung nimmt das Sintern und die Menge an nichtkristalliner SiO&sub2;, die kristallisiert, zu. Das Röntgenbeugungsmuster in Fig. 3 zeigt diese Veränderungen.
Die erfindungsgemäßen Säulenpackungen enthalten als Hauptkomponente nichtkristallines SiO&sub2; und kristallines SiO&sub2;. Das nichtkristalline SiO&sub2; hat eine hohe Oberflächenenergie und kann leicht Wasser binden, um Silanolgruppen zu bilden, die hydrophile Gruppen darstellen. Die hydrophilen Gruppen erfüllen die wichtigen Funktionen der erfindungsgemäßen Säulenpackungen.
Die (das) endgültige Porengröße und -volumen der Säulenpackungen werden durch die Calcinierungsbedingungen nach der Körnung (Granulierung), die Behandlungsbedingungen in der Säurelösung und die Calcinierungsbedingungen nach der Behandlung mit der Säurelösung eingestellt. Das Einstellen der Bedingungen ist wichtig, da die Eigenschaften der Säulenpackungen von der Porenverteilung abhängen.
Im besonderen ist der mittlere Porendurchmesser der erfindungsgemäßen Säulenpackungen wichtig. Wenn der mittlere Porendurchmesser mehr als 0,1 um beträgt, vermindert sich das Trennungsverhältnis, weshalb dies nicht bevorzugt ist. Wenn die Porengröße weniger als 0,001 tun beträgt, verstopfen die Poren, wodurch eine Streuung der Trenn-Meßwerte auftritt, weshalb dies nicht bevorzugt ist. Entsprechend liegt der mittlere Porendurchmesser der erfindungsgemäßen Säulenpackungen im Bereich von 0,001 um bis 0,1 tun.
Obwohl mit den vorstehenden Verfahren Säulenpackungen hergestellt werden können, kann, falls eine gleichmäßige Korngröße nicht erhalten wird, eine vorbestimmte gleichmäßige Korngröße durch Levitation, eine Luftaufbereitung oder Sieben erhalten werden.
Die Säulenpackungen mit gleichmäßiger Korngröße können, wenn sie in eine Säule eingefüllt werden, als Säule zur Trennung verwendet werden.
Die Säulenpackungen können in eine Säule eingefüllt werden und können wie herkömmliche Säulenpackungen verwendet werden, um eine Flüssigkeitschromatographie durchzuführen.
Die erfindungsgemäßen Säulenpackungen können zur Analyse von Proteinen, Enzymen, Nukleinsäuren, Glycosiden, Vitaminen, Phospholipiden, Glycolipiden, Triglyceriden und Fettsäuren verwendet werden. Im besonderen zeigen die erfindungsgemäßen Säulenpackungen eine ausgezeichnete Wirkung bei der Trennung von fettlöslichen Vitaminen, Phospholipiden, Glycosiden, Triglyceriden und Fettsäuren.
Bei der Trennung verwendete Eluentien können herkömmliche Lösungen wie eine Acetonitril/Phosphatpufferlösung oder Hexan/Ethanol umfassen.
Die erfindungsgemäßen Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie können polare Materialien, die mit einer herkömmlichen HPLC nicht wirksam getrennt werden konnten, unter Verwendung eines Eluens mit hoher Polarität in kurzer Zeit trennen. Die Säulenpackungen sind daher als Säulenpackungen für die präparative Chromatographie und die analytische Chromatographie brauchbar.
Zusätzlich haben die erfindungsgemäßen Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie eine hohe mechanische Stabilität und sind druckresistent und gegenüber Eluentien mit einem hohen pH- Wert und/oder einer hohen Polarität unempfindlich, so daß ihre Trennungseigenschaften auch nach einer Benutzung über lange Zeit nicht verändert werden.

AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die vorliegende Erfindung wird im Detail durch die nachstehenden Beispiele beschrieben, die nicht beschränkend sind.

Beispiel 1

Rollkörnungsverfahren

1,5 l Wasser wurden zu 3 kg Sepiolithkörnern mit einer Korngröße von 325 USS-Mesh (0,044 mm) oder weniger zugegeben. Das Gemisch wurde durch Walzkörnung (rolling granulation) mit einem Mixer zu runden Körnern mit einer Korngröße von 50 um granuliert. Nach dem Calcinieren der runden Körner über 4 Stunden bei 900ºC wurden sie 96 Stunden in 3 N Salzsäure getaucht, um Alkalioxide zu entfernen. Nach dem weiteren Calcinieren über 4 Stunden bei 1.020ºC wurden 2,5 l runde poröse Keramiken mit 45 bis 53 um durch Siebtrennung (screening) erhalten. Die Zusammensetzung der Keramikmaterialien wurde durch Fluoreszenz-Röntgenstrahlenanalyse bestimmt. Die Zusammensetzung war: SiO&sub2; 97,31%, MgO 0,39%, Fe&sub2;O&sub3; 0,23%, Al&sub2;O&sub3; 1,39%, CaO 0,08%, K&sub2;O 0,60% und Spuren von Na&sub2;O.
Die Porenverteilung der Säulenpackungen wurde weiter durch ein Quecksilberpenetrationsverfahren bestimmmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. TABELLE 1
(2) 1,5 l Wasser wurden zu 3 kg Sepiolithkörnern mit einer Korngröße von 325 USS-Mesh (0,044 mm) oder weniger zugegeben. Das Gemisch wurde durch Walzkörnung (rolling granulation) mit einem Mixer zu runden Körnern mit einer Korngröße von 50 um granuliert. Nach dem Calcinieren der runden Körner über 4 Stunden bei 900ºC wurden sie 0,25 Stunden in 3 N Salzsäure getaucht, um Alkalioxide zu entfernen. Nach dem weiteren Calcinieren über 4 Stunden bei 1.020ºC wurden 2,5 l runde poröse Keramikmaterialien mit 45 bis 53 um [Größe] durch Siebtrennung erhalten.
Die Zusammensetzung der Keramikmaterialien wurde durch Fluoreszenz-Röntgenstrahlenanalyse bestimmt. Die Zusammensetzung war: SiO&sub2; 65,10%, MgO 28,12%, Fe&sub2;O&sub3; 1,42%, Al&sub2;O&sub3; 2,75%, CaO 1,83%, K&sub2;O 0,67% und Na&sub2;O 0,11%.
Die Porenverteilung der Säulenpackungen wurde weiter durch ein Quecksilberpenetrationsverfahren bestimmmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. TABELLE 2

Beispiel 2

Sprühtrocknungsverfahren

(1) 5 l Wasser wurden zu 2 kg Sepiolithkörnern mit einer Korngröße von 325 USS-Mesh (0,044 mm) oder weniger zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten mit einem Homogenisator gerührt, um eine Dispersion zu bilden. Dann wurden 40 g Ammoniumcarbonat als Entflockungsmittel zugegeben. 1,4 kg granulierte runde Körner [mit einer Größe] von 50 um wurden unter den nachstehenden Bedingungen erhalten: Scheibendrehzahl 8.000 U/min. Zugaberate der Aufschlämmung 50 cc/min. Heißlufttemperatur 200ºC und Abgastemperatur 110ºC. Nach dem Calcinieren der runden Körner bei einer Calcinierungstemperatur von 900ºC über 4 Stunden wurden die Körner 96 Stunden in 3 N Salzsäure getaucht, um Alkalioxide zu entfernen. Nach dem weiteren Calcinieren über 4 Stunden bei 1.020ºC wurden 1,4 kg runde poröse Keramikmaterialien mit 50 um [Größe] erhalten.
(2) 5 l Wasser wurden zu 250 g Sepiolithkörnern mit einer Korngröße von 325 USS-Mesh (0,044 mm) oder weniger zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten mit einem Homogenisator gerührt, um eine Dispersion zu bilden. Dann wurden 5 g Ammoniumcarbonat als Entflockungsmittel zugegeben. 150 g granulierte runde Körner [mit einer Größe] von 5 um wurden unter den nachstehenden Bedingungen erhalten: Scheibendrehzahl 15.000 U/min. Zugaberate der Aufschlämmung 50 cc/min, Heißlufttemperatur 200ºC und Abgastemperatur 110ºC. Nach dem Calcinieren der runden Körner bei einer Calcinierungstemperatur von 900ºC über 4 Stunden wurden die Körner 96 Stunden in 3 N Salzsäure getaucht, um Alkalioxide zu entfernen. Nach dem weiteren Calcinieren über 4 Stunden bei 1.020ºC wurden 150 g runde poröse Keramikmaterialien mit 5 um [Größe] erhalten.

Beispiel 3

Die in Beispiel 1(2) hergestellten runden Keramikmaterialien wurden in einer Methanol/Glycerin-Lösung (1 : 1) dispergiert und die Aufschlämmung in eine Säule mit einem Innendurchmesser von 3 mm und einer Länge von 300 mm gefüllt. Ein Eluentiengemisch, umfassend 1 Gewichtsteil 10 mM phosphorierte Pufferlösung (pH 2,6), enthaltend 100 mM Natriumperchlorat, und 9 Gewichtsteile Acetonitril, wurden mit einer Flußrate von 1 ml/min durch die Säule geleitet, um diese ausreichend zu äquilibrieren. 5 ul einer Probe, enthaltend 10 mg Phosphatidylcholin (PC) und 50 mg Sphingomyelin (SPM), gelöst in 60 ml Ethanol, wurden in die Säule injiziert, und die aus der Säule eluierten Phospholipide wurden mit einem UV-Detektor bei 205 nm bestimmt. Die Säulentemperatur betrug 45ºC. Die Ergebnisse der Bestimmung sind in Fig. 4 dargestellt. Wie in Fig. 4 gezeigt, wurden PC und SPM zufriedenstellend getrennt und nach 18,9 Minuten bzw. 28,5 Minuten eluiert.

Beispiel 4

Ein Eluentiengemisch, umfassend 14 Gewichtsteile 10 mM Phosphorpufferlösung (pH 2,6), enthaltend 100 mM Natriumperchlorat, und 86 Gewichtsteile Acetonitril wurden durch die in Beispiel 2 verwendete Säule mit einer Flußrate von 1 ml/min geleitet, um die Säule ausreichend zu äquilibrieren. 5 ul einer Probe, enthaltend 10 mg Phosphatidylcholin (PC) und 50 mg Sphingomyelin (SPM), gelöst in 60 ml Ethanol, wurde in die Säule injiziert, und die aus der Säule eluierten Phospholipide wurden mit einem UV-Detektor bei 205 nm bestimmt. Nachdem alle Phospholipide eluiert waren, wurde das Injizieren der Probe in die Säule wiederholt, und die Veränderungen der Retentionszeiten jedes der Phospholipide bestimmt. Als Vergleichsbeispiel wurde eine Säule mit einem im Handel erhältlichen Kieselgel befüllt, die Proben in gleicher Weise wiederholt injiziert, und die Veränderungen der Retentionszeiten der Phospholipide wurden beobachtet. Die Retentionszeiten der Phospholipide in jeder der Säulen sind in Fig. 5 aufgetragen. Die mit Keramikmaterialien befüllte Säule zeigte keine Veränderungen der Retentionszeiten der Phospholipide nach 1.400 Stunden, während die Kieselgel-Säule einen eindeutigen Anstieg der Retentionszeit mit der Durchlaufzeit des Eluens zeigte.

Beispiel 5

Die in Beispiel 1(2) hergestellten runden porösen Keramikmaterialien wurden in einer Methanol/Glycerin-Lösung (1 : 1) dispergiert und die Aufschlämmung in eine Säule mit einem Innendurchmesser von 3 mm und einer Länge von 300 mm gefüllt. Ein Eluens aus Hexan/Ethanol (99,5/0,5) wurde mit einer Flußrate von 1 ml/min durch die Säule geleitet, um die Säule ausreichend zu äquilibrieren. 10 ul einer Probe, enthaltend 100 mg Vitamin K1 und 100 mg Vitamin D3, gelöst in 1 ml Hexan, wurde in die Säule injiziert, und die aus der Säule eluierten Vitamine wurden mit einem UV-Detektor bei 245 nm bestimmt. Die Säulentemperatur betrug 20ºC. Die Ergebnisse der Bestimmung sind in Fig. 6 dargestellt. Wie in Fig. 6 gezeigt, wurden Vitamin K&sub1; und Vitamin D&sub3; zufriedenstellend getrennt und nach 6,6 Minuten bzw. 13,8 Minuten eluiert.
Wie vorstehend beschrieben, sind die erfindungsgemäßen Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie gegenüber Eluentien mit einem hohen pH-Wert und Eluentien mit hoher Polarität stabil, die Trenneigenschaften sind auch nach langer Betriebsdauer nicht verändert, und Proben können mit hoher Wirksamkeit getrennt werden.
Die erfindungsgemäßen Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie können lipidverwandte Materialien, die nicht mit guter Wirksamkeit getrennt werden konnten, trennen, und sie sind insbesondere zur Analyse von Phospholipiden und fettlöslichen Vitaminen geeignet.

Claims

1. Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie, enthaltend poröse keramische Körner, dadurch gekennzeichnet, daß die porösen keramischen Körner hydrophile Oberflächen und einen mittleren Porendurchmesser im Bereich zwischen 0,001 um und 0,1 um aufweisen und daß die porösen keramischen Körner nach den [folgenden] Schritten hergestellt werden:

(a) Calcinieren von Körnern eines kristallinen Tonminerals mit einer faserigen Struktur und einer Korngröße im Bereich zwischen 1 und 100 um;

(b) Behandeln der Körner mit einer Säure, um die Oberfläche der Körner hydrophil zu machen; und

(c) Zweites Calcinieren der Körner, um eine Abnahme des Porenvolumens zu vermeiden, wonach die erhaltenen porösen keramischen Körner einen SiO&sub2;-Gehalt von 60% oder mehr aufweisen.

2. Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie nach Anspruch 1, worin die faserige Struktur eine faserige Kristallstruktur darstellt, die entlang der Fasern parallelepipedische intrakristalline Tunnel enthält.

3. Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie nach Anspruch 1 oder 2, worin das kristalline Tonmineral Sepiolith oder Attapulgit darstellt.

4. Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der MgO-Gehalt der porösen keramischen Körner 30% oder weniger beträgt.

5. Verfahren zur Trennung von Lipiden, welches die [folgenden] Schritte umfaßt:

Einfüllen der Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in eine Säule;

Injizieren einer Lipide enthaltenden Probe; und

Elution der Säule, um die in der Probe enthaltenen Lipide zu trennen und zu eluieren.

6. Verfahren zur Trennung von Lipiden nach Anspruch 5, wobei die Lipide Phospholipide sind.

7. Verfahren zur Trennung von Vitaminen, welches die [folgenden] Schritte umfaßt:

Einfüllen der Säulenpackungen für die Flüssigkeitschromatographie nach einem der Ansprüche 1 bis 4 eine Säule;

Injizieren einer Vitamine enthaltenden Probe; und

Elution der Säule, um die in der Probe enthaltenen Vitamine zu trennen und zu eluieren.

8. Verfahren zur Trennung von Vitaminen nach Anspruch 7, wobei die Vitamine fettlösliche Vitamine sind.