DE69328672T2 - Verwendung von aspergillus niger catalase-r zur wasserstoffperoxid-neutralisierung - Google Patents
Verwendung von aspergillus niger catalase-r zur wasserstoffperoxid-neutralisierungInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft die Anwendung eines Katalase-Enzyms von Aspergillus niger für die Neutralisierung von Wasserstoffperoxid in Lösung. Es wurde entdeckt, daß A. niger zwei Katalasen produziert, die als Katalase-A und Katalase-R bezeichnet werden. Bei Vergleich mit Katalase-A und Katalase aus Rinderleber zeigt Katalase-R überlegene Eigenschaften für biotechnologische Anwendungen, Darüber hinaus wurde gezeigt, daß das Katalase-R-Enzym aus A. niger ungefähr viermal so wirksam wie Katalase aus Rinderleber in Anwendungen, die die Neutralisierung von konzentrierten Wasserstoffperoxidlösungen erfordern, ist.
- Katalasen [Wasserstoffperoxid: Wasserstoffperoxidoxidoreduktasen (EC 1.11.1.6)] sind Enzyme, die die Umwandlung von Wasserstoffperoxid (H&sub2;O&sub2;) zu Sauerstoff (O&sub2;) und Wasser (H&sub2;O) gemäß der folgenden Gleichung katalysieren.
- Diese ubiquitären Enzyme sind aus einer Vielzahl von tierischen Geweben, Pflanzen und Mikroorganismen gereinigt worden (Chance und Maehly, 1955, Methods Enzymol. 2: 764-791; Jones und Wilson, 1978, in H. Sigel (Hrsg.), Metal Ions in Biological Systems, Band 7, Marcel Dekker Inc., New York). Nahezu alle Formen des Enzyms, die charakterisiert worden sind, bestehen aus vier Polypeptiduntereinheiten, die jeweils eine relative Molekülmasse von 50000 bis 60000 aufweisen und eine aus Protohämin gebildete prosthetische Gruppe pro Untereinheit enthalten (Wasserman und Hultin, 1981, Arch. Biochem. Biophys. 212: 385-392; Hartig und Ruis, 1986, Eur. J. Biochem. 160: 487-490).
- Katalase aus Rinderleber ist die am intensivsten untersuchte Spezies dieses Enzyms gewesen [Schonbaum und Chance, 1976, in The Enzywes (P. D. Boyer, Hrsg.), 3. Auflage, Band 13, S. 363-408, Academic Press, New York]. Die vollständige Aminosäuresequenz und die dreidimensionale Struktur von Katalase aus Rinderleber sind bekannt (Schroeder et al., 1982, Arch. Biochem. Biophys. 214: 397-412; Murthy et al., 1981, J. Mol. Biol. 152: 465-499).
- Obwohl sie aus biochemischer und biophysikalischer Hinsicht weniger gut untersucht sind, haben Katalasen aus filamentösen Pilzen mehrere Eigenschaften, die sie von ihren Gegenstücken aus Säugetieren unterscheiden. Obwohl sie eine ähnliche Anzahl von Untereinheiten und einen ähnlichen Hämgehalt aufweisen, sind pilzliche Katalasen wesentlich größere Moleküle als jene aus anderen Organismen, wobei sie relative Molekülmassen einer Untereinheit, die von 80000 bis 97000 reichen, aufweisen (Vainshtein et al., 1986, J. Mol. Biol. 188: 63-72; Jacob und Orme-Johnson, 1979, Biochem. 18: 2967-2975; Jones et al., 1987, Biochim. Biophys. Acta 913: 395-398). Noch wichtiger ist, daß Katalasen aus Pilzen, wie aus Aspergillus niger, stabiler als Katalase aus Rinderleber gegenüber einer Proteolyse und einer Inaktivierung durch Glutaraldehyd, SDS sind und eine geringere Affinität für Katalaseinhibitoren, wie Cyanid, Azid und Fluorid, aufweisen (Wasserman und Hultin, 1981, Arch. Biochem. Biophys. 212: 385-392). Zusätzlich ist Katalase aus A. niger beträchtlich stabiler als Katalase aus Rinderleber, wenn sie Extrembedingungen von pH, Wasserstoffperoxid und Temperatur ausgesetzt wird (Scott und Hammer, 1960, Enzymologia 22: 229-237). Obwohl pilzliche Katalasen Stabilitätsvorteile bieten, haben die entsprechenden Enzyme aus Säugetieren, wie beispielsweise Katalase aus Rinderleber, im allgemeinen eine höhere katalytische Aktivität (Gruft et al., 1978; Can. J. Biochem. 56: 916-919). Traditionell ist Katalase aus Rinderle ber das bevorzugte Enzym für diagnostische Zwecke und für Arzneimittel-verwandte Anwendungen (z. B. Reinigung von Kontaktlinsen/Desinfektion/H&sub2;O&sub2;-Neutralisierung) gewesen. Jedoch haben unlängst festgestellte Ausbrüche einer Slow-Virus-Erkrankung, die als BSE ("bovine spongiform encephalopathy"; spongiforme Rinder-Enzephalopathie) in europäischen Rinderherden und die Angst, daß diese Erkrankung auf den Menschen übertragen werden könnte [Dealler und Lacey, 1991, Nutr. Health (Bicester) 7: 117-134; Dealler und Lacey, 1990, Food Microbiol. 7: 253-280] ein Interesse daran geweckt, Alternativen zu Katalase aus Rinderleber für diese Anwendungen zu finden. Da darüber hinaus Enzymstabilität ein bedeutender Faktor bei der biotechnologischen Nutzung von Enzymen darstellt, gibt es ein beträchtliches Interesse an der Verwendung von Katalase aus A. niger in Anwendungen, die die Neutralisierung von hohen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid umfassen, und für Arzneimittelverwandte Anwendungen, in denen die Verwendung von Katalase aus Rinderleber ein Gesundheitsrisiko darstellen könnte.
- Obwohl es mehrere veröffentlichte Berichte gibt, die die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften von Katalase aus A. niger beschreiben, wurde bislang noch nicht offenbart, daß in diesem Organismus tatsächlich zwei Katalaseenzyme anwesend sind. Unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken haben wir Gene (catA und catR), die zwei unterschiedliche Katalaseenzyme (Katalase-A und Katalase-R) aus A. niger kodieren, isoliert (Genencor International, Inc., nicht veröffentlicht). Das catA-Gen aus A. niger, das durch Kreuzhybridisierung mit dem CTA1-Gen aus Hefe (Saccharomyces cerevisiae) kloniert worden ist, kodiert ein Katalaseenzym, das primär während eines Wachstums auf Fettsäuren induziert wird und vermutlich peroxisomal ist. Katalase-A aus A. niger ist weniger stabil (d. h. sie hat eine kürzere Halbwertszeit bei Lagerung), wird durch hohe Konzentrationen von Wasserstoffperoxid schneller inaktiviert und ist weniger aktiv als Katalase-R bei niedrigem pH. Das catR-Gen aus A. niger kodiert ein lösliches zytoplasmatisches Enzym (Katalase-R), von dem wir entdeckt haben, daß es die Hauptaktivität in kommerziellen Katalasezubereitungen darstellt. Im Gegensatz zu Katalase-A ist dieses Enzym über einen breiten pH-Bereich stabil, hat eine ausgedehnte Lagerungsstabilität und ist gegenüber einer Deaktivierung bei hohen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid resistent. Zusätzlich haben wir entdeckt, daß Katalase-R wirksamer als Katalase aus Rinderleber für eine Neutralisierung von konzentrierten (z. B. dreiprozentigen) Wasserstoffperoxidlösungen ist.
- Es ist entdeckt worden, daß das A. niger-Genom zwei Katalasegene, die als catA und catR bezeichnet werden, enthält. Zusätzlich wurde entdeckt, daß die catA- und catR-Genprodukte (Katalase-A bzw. Katalase-R) zwei unterschiedliche Katalaseenzyme sind, die jeweils ihre eigenen charakteristischen Eigenschaften aufweisen. Die Erfindung offenbart, daß Katalase-R Eigenschaften aufweist, die sie zu einem überlegenen Enzym für zahlreiche biotechnologische Anwendungen, die die Neutralisierung von Wasserstoffperoxidlösungen umfassen, machen. Zusätzlich umfaßt die Erfindung die Entdeckung, daß Katalase-R Eigenschaften bei der Entfernung von Wasserstoffperoxid zeigt, die der Katalase aus Rinderleber überlegen sind.
- Dementsprechend betrifft die Erfindung ein Katalase-R- Enzym, das die in Fig. 5A-C angegebene Aminosäuresequenz oder allelische Varianten davon umfaßt. Zusätzlich betrifft die Erfindung ein DNA-Molekül, das das vorstehend erwähnte Katalase- R-Enzym kodiert. Schließlich ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Neutralisierung von Wasserstoffperoxid in einer Lösung, welches umfaßt, die Lösung mit einer wirksamen Menge des Katalase-R-Enzyms zu behandeln. Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Reinigen und Desinfizieren von Kontaktlinsen, welches umfaßt, die Linse mit einer Wasserstoffperoxidlösung, die eine zur Desinfektion der Linse aus reichende Konzentration aufweist, zu behandeln und das restliche Wasserstoffperoxid in der Lösung zu zersetzen, indem die Lösung einer Menge des Katalase-R-Enzyms ausgesetzt wird, die wirksam ist, um das restliche Wasserstoffperoxid zu zersetzen.
- Fig. 1 zeigt einen Vergleich von Katalase-A- und Katalase-R-Aktivitäten in verdünnter Wasserstoffperoxidlösung (100 ppm).
- Fig. 2 zeigt einen Vergleich von Katalase-A- und Katalase-R-Aktivitäten in konzentrierter Wasserstoffperoxidlösung (16,5 g/l).
- Fig. 3 veranschaulicht einen Vergleich von enzymatischen Aktivitäten von Katalase-A und Katalase-R bei unterschiedlichen pH-Werten.
- Fig. 4 zeigt Restriktionskarten der catA- und catR-Gene von A. niger, die Katalase-A bzw. Katalase-R kodieren.
- Fig. 5 zeigt die Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des catR-Gens von A. niger. Introns werden durch gestrichelte Linien bezeichnet.
- Fig. 6 zeigt einen Vergleich der Wirksamkeit von Katalase-R- und Rinderleber-Katalase-Tabletten (die jeweils 1 mg Enzym enthalten) bei der Neutralisierung einer 3%-igen Lösung von Wasserstoffperoxid. Die spezifischen Aktivitäten waren für die zwei Enzymzubereitungen vergleichbar (6541 U/mg für Katalase aus Rinderleber und 7344 U/mg für Katalase-R aus A. niger).
- Ein Vergleich der biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften von Katalase-A und Katalase-R wird nachfolgend beschrieben. Zusätzlich wird ein Vergleich von Katalase-R und Katalase aus Rinderleber erläutert. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird verstehen, daß verschiedene Veränderungen bei den folgenden Beispielen vorgenommen werden könnten. Dementsprechend sollen die Beispiele nicht beschränkend sein.
- Zur Messung von biochemischen Parametern, wie Enzymaktivität, Wasserstoffperoxidkonzentrationen, pH-Aktivitätsprofil und Enzymstabilität, verwendete Techniken sind herkömmliche Techniken, die in den folgenden Beispielen beschrieben werden.
- Katalase-R wurde aus einer kommerziell erhältlichen Zubereitung von A. niger-Katalase (Fermcolase 1000, Genencor International, Inc.) unter Verwendung von Ionenaustauschchromatographie an TrisAcryl Q-Harz (IBF Biotechnics, Inc.) gereinigt. Zuerst wurde die kommerzielle Enzymzubereitung an einer PD-10-Säule (Pharmacia-LKB), die in 10 mM Tris-HCl bei pH 8 äquilibriert worden war, entsalzt. Das Enzym wurde auf eine 2,5 cm · 5,5 cm TrisAcryl Q-Säule, die zuerst mit 100 ml 100 mM Tris-HCl, pH 8, dann mit 200 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8, bei einer Fließrate von 6,0 ml/min äquilibriert worden war, aufgetragen. Ungebundene Proteine wurden durch Waschen der Säule mit 10 mM Tris-HCl eluiert. Die verbleibenden Proteine wurden mit einem Gradienten von ansteigendem NaCl (0 bis 0,5 M in 10 mM Tris-HCl, pH 8) eluiert. Die Proteinfraktion, die das höchste A&sub4;&sub1;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0;-Verhältnis aufwies, enthielt gereinigte Katalase. Eine SDS-PAGE-Analyse dieser Proteinfraktion zeigte eine einzelne Bande, die mit einer apparenten relativen Molekülmasse von ungefähr 80000 wanderte.
- Katalase-A aus A. niger wurde aus Myzelextrakten von Zellen, die zwei Tage in Medium, das 1% Glucose als Kohlenstoffquelle enthielt, gezüchtet worden waren, gereinigt. Die Myzele wurden in flüssigem Stickstoff schockgefrostet und in einer elektrischen Kaffeemühle zu einem feinen Pulver gemahlen. Das gefrorene Pulver wurde in 10 ml 100 mM Natriumformiatpuffer, pH 7, suspendiert und eine Stunde auf Eis gehalten. Die unlöslichen Zellrückstände wurden durch Zentrifugation entfernt und der Überstand wurde durch Ultrafiltration (Amicon) konzentriert. Der konzentrierte Extrakt wurde dann einer Chromatographie an Sephacryl 5-100 unterworfen und die Fraktionen mit Katalaseaktivität wurden erneut einer Chromatographie an einer Ionenaustauschsäule, wie oben beschrieben, unterworfen. Zwei Peaks, ein größerer und ein kleinerer, die Katalaseaktivität enthielten, wurden durch SDS-PAGE analysiert. Die in größerer Menge vorliegende Katalasefraktion lieferte eine vorherrschende Bande mit einer relativen Molekülmasse von 80000 und es wurde nachfolgend gezeigt, daß es sich dabei um Katalase-R handelte, Der in geringerer Menge vorliegende Bestandteil, Katalase-A, lieferte eine Bande mit einer relativen Molekülmasse von 46000.
- Tabelle 1 zeigt einen Vergleich der biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften von Katalase-A und Katalase-R aus A. niger. Tabelle 1
- Die bei der Klonierung der catA- und catR-Gene von A. niger verwendeten Techniken sind herkömmliche Techniken, die in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben sind.
- Aus gereinigter Katalase-R wurde durch Verdau des Proteins mit Bromcyan eine Reihe von proteolytischen Fragmenten erzeugt. Diese Peptidfragmente wurden einer Aminosäuresequenzanalyse unterworfen. Die Aminosäuresequenzinformation wurde eingesetzt, um synthetische DNA-Sonden für eine Identifizierung von catR-spezifischen cDNA-Sequenzen in einer λgt11- Bibliothek zu gestalten. Kurz zusammengefaßt, wurde das Peptidfragment Met-Phe-Trp-Asn-Ser-Leu-Ile-Pro-Ala-Glu-Gln-Gln- Met verwendet, um einen Pool von drei synthetischen Oligonukleotiden mit den folgenden Sequenzen zu gestalten:
- 5' ATG TTC TGG AAC AGC CTG ATC CCC GCC GAG CAG ATG 3'
- 5' ATG TTC TGG AAC TCC CTG ATC CCC GCC GAG CAG ATG 3'
- 5' ATG TTC TGG AAC AGC TTG ATC CCC GCC GAG CAG ATG 3'
- Dieses Peptid wurde gewählt, da die Aminosäuren minimal degenerierte Codonauswahlmöglichkeiten liefern. Die Unterschiede zwischen den drei synthetischen Oligonukleotiden repräsentieren alternative Codonauswahlen, wo es keine starke Präferenz in dem bekannten Codonnutzungsmuster für A. niger gab. Diese Position dieses proteolytischen Fragments entspricht dem in Fig. 2 gezeigten Peptid 3. Ein Klon, der ein partielles cDNA-Fragment enthielt, wurde durch Hybridisierung mit der synthetischen DNA-Sonde positiv identifiziert und eine Nukleotidsequenzanalyse dieses Klons bestätigte, daß es Katalase-R kodierte. Dieses klonierte cDNA-Segment wurde verwendet, um eine Genbank von genomischer A. niger-DNA mittels Hybridisierung zu durchmustern. Nachfolgend wurde das vollständige catR-Gen einschließlich stromaufwärts und stromabwärts liegenden Transkriptionskontrollelementen als ein 9,0 kb- HindIII-XhoI-Restriktionsfragment zusammengestellt. Die Nu kleotidsequenz des kodierenden Bereichs von catR wurde bestimmt und ist in Fig. 5 angegeben.
- Das catA-Gen von A. niger wurde durch Kreuzhybridisierung unter Verwendung des CTA1-Gens von S. cerevisiae als Sonde kloniert. Die Katalasegene aus Hefe sind bereits früher isoliert und ihre Sequenzen veröffentlicht worden (Cohen et al., 1988, Eur. J. Biochem. 176: 159-163; Hartig und Ruiz, 1986, Eur. J. Biochem. 160: 487-490). Ein Fragment des CTA1-Gens aus Hefe wurde unter Verwendung von PCR (Perkin Elmer-Cetus) amplifiziert und in pUC18 kloniert. Eine Sequenzanalyse dieses Klons bestätigte, daß es das peroxisomale Katalasegen der Hefe war. Der Klon wurde dann verwendet, um Southern-Blots von genomischer A. niger-FS-1-DNA zu screenen, und es wurde festgestellt, daß er mit einer einzelnen EcoRI-Bande von 3,2 kb hybridisierte. Die Sonde wurde dann verwendet, um eine λEMBL- Bibliothek von genomischer FS-1-DNA zu screenen, was zu der Identifizierung von mehreren positiven Klonen, die jeweils das bereits früher identifizierte 3,2 kb-EcoRI-Restriktionsfragment enthielten, führte. Einer dieser λEMBL-Klone (λEMBL3-1) wurde mit BamHI verdaut und ein 9 kb-Fragment wurde in pUC18 subkloniert. Eine Restriktionskarte dieses Subklons ist in Fig. 4 angegeben. Eine DNA-Sequenzanalyse eines Abschnitts dieses Fragments, der mit dem CTA1-Gen aus Hefe hybridisierte, zeigte, daß der Klon eine Katalase kodierte, die sich von Katalase-R unterschied. Auf der Basis von dessen Homologie zu dem CTA1-Gen aus Hefe wurde ihm die Bezeichnung catA gegeben. Eine Cotransformation von A. niger-FS-1 wurde unter Verwendung des pUC18-catA-Plasmids und eines Plasmids, das ein Benomylresistenz verleihendes β-Tubulingen enthielt, vorgenommen. Benomyl-resistente Kolonien wurden hinsichtlich einer erhöhten Anzahl von integrierten catA-Genkopien durch Southern-Blotting gescreent. Jene Transformanten, die mehr als eine catA- Genkopie zeigten, wurden in Schüttelkolbenkulturen ausgewer tet. Eine Transformante, die als 208 bezeichnet wurde, zeigte ungefähr eine Verdopplung der gesamten zellulären Katalaseaktivität.
- Die Leistungseigenschaften von gereinigter Katalase-R und gereinigter Katalase aus Rinderleber (Boehringer Mannheim) wurden in den folgenden Assays verglichen.
- (a) Verschiedene Mengen von jedem lyophilisierten Enzympulver wurden zu 10 ml einer 3%-igen Wasserstoffperoxidlösung, wie in Tabelle 2 gezeigt, zugesetzt. Die spezifischen Aktivitäten der zwei Enzymzubereitungen waren vergleichbar (6541 U/mg für Katalase aus Rinderleber und 7344 U/mg für Katalase-R aus A. niger). Nach 3 Minuten wurde restliches Wasserstoffperoxid spektrophotometrisch (Scott und Hammer, 1960, Enzymologia 22: 194- 200) gemessen. Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, daß bezogen auf die benötigte Menge von Katalase aus Rinderleber ein Viertel der Menge von Katalase-R benötigt wird, um 3%-iges Wasserstoffperoxid zu neutralisieren. Beispielsweise sind 0,1 mg Katalase-R hinsichtlich der Leistungseigenschaften gleich zu 0,5 mg von Katalase aus Rinderleber.
- Tabelle 2 offenbart einen Vergleich der Wirksamkeit von Katalase-R und Katalase aus Rinderleber bei der Neutralisierung einer 3%-igen Lösung von Wasserstoffperoxid in einer dreiminütigen Reaktion. Die spezifischen Aktivitäten der zwei Enzymzubereitungen waren vergleichbar (6541 U/mg für Katalase aus Rinderleber und 7344 U/mg für Katalase-R aus A. niger). Tabelle 2
- (b) Tabletten, die 1 mg Katalase aus Rinderleber enthielten, wurden in einem Oxysept 2-Kit (Allergan) erworben. Tabletten, die 1 mg Katalase-R aus A. niger enthielten, wurden unter Verwendung von Sorbitol als Träger hergestellt. Ein Vergleich der Wirksamkeit von jeder dieser Tabletten wurde in einem Leistungseigenschaftenassay, der identisch zu jenem, der vorstehend beschrieben wurde, war, vorgenommen. Fig. 6 zeigt, daß A. niger-Katalase-R-Tabletten 3%-iges Wasserstoffperoxid auf weniger als 1 ppm in 2 Minuten reduzieren, wohingegen Tabletten, die Katalase aus Rinderleber enthalten, 4 bis 5 Minuten benötigen.
Claims (7)
1. Katalase-R-Enzym, umfassend die in Fig. 5A-C angegebene
Aminosäuresequenz oder allelische Varianten davon.
2. DNA-Molekül, das für das Katalase-R-Enzym gemäß Anspruch
1 codiert.
3. DNA-Molekül nach Anspruch 2, wobei die DNA-Sequenz die
in Figur FA-C angegebene Nukleotid-Sequenz aufweist oder
allelische Varianten davon.
4. Verfahren zur Neutralisierung von Wasserstoffperoxid in
einer Lösung, umfassend die Behandlung dieser Lösung mit
einer wirksamen Menge eines Katalase-R-Enzyms nach
Anspruch 1.
5. Verfahren zur Reinigung und Desinfizierung einer
Kontaktlinse, umfassend das Behandeln der Kontaktlinse mit
einer Wasserstoffperoxid-Lösung mit einer ausreichenden
Stärke, um die Linse zu desinfizieren, und Zersetzung
des restlichen Wasserstoffperoxids in der Lösung
dadurch, daß man die Lösung einer Menge des Katalase-R-
Enzyms nach Anspruch 1 aussetzt, die wirksam das
restliche Wasserstoffperoxid zersetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Katalase-R mit
einem Träger hergestellt wurde.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Träger Sorbitol
ist.
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