JP3408535B2 - 過酸化水素を中和するための黒色アスペルギルスカタラーゼ−ｒの使用 - Google Patents
過酸化水素を中和するための黒色アスペルギルスカタラーゼ−ｒの使用Info
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- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は溶液中の過酸化水素を中和するために黒色ア
スペルギルス カタラーゼ酵素を用いることに関するも
のである。黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）
がカタラーゼ−Ａおよびカタラーゼ−Ｒと称する２種類
のカタラーゼを産生することを発見した。カタラーゼ−
Ａおよびウシ肝カタラーゼと比較すると、カタラーゼ−
Ｒは生物工学的用途で優れた成績を示す。さらに、黒色
アスペルギルス カタラーゼ−Ｒ酵素は、濃縮過酸化水
素溶液の中和を必要とする用途において、ウシ肝カタラ
ーゼの約４倍も効果的であることが示されている。
スペルギルス カタラーゼ酵素を用いることに関するも
のである。黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）
がカタラーゼ−Ａおよびカタラーゼ−Ｒと称する２種類
のカタラーゼを産生することを発見した。カタラーゼ−
Ａおよびウシ肝カタラーゼと比較すると、カタラーゼ−
Ｒは生物工学的用途で優れた成績を示す。さらに、黒色
アスペルギルス カタラーゼ−Ｒ酵素は、濃縮過酸化水
素溶液の中和を必要とする用途において、ウシ肝カタラ
ーゼの約４倍も効果的であることが示されている。
発明の背景
カタラーゼ［過酸化水素：過酸化水素オキシドレダク
ターゼ（EC 1.11.1.6）］は、以下の化学式にしたがっ
て過酸化水素（H2O2）が酸素（O2）および水（H2O）へ
転化するのを触媒する酵素である： これらの汎存酵素は様々な動物組織、植物および微生物
から精製されてきた（チャンスおよびメーリー1955Meth
ods Enzymol.2:764−791;ジョーンズおよびウィルソン1
978、H.シンゲル（編集者）、生物学系における金属イ
オン、第７巻、マーセル デッカー社、ニューヨー
ク）。特徴付けられているほとんど全ての形態の酵素
は、４つのポリペプチドサブユニットからなり、各々の
サブユニットは50,000から60,000までの範囲の分子量を
有し、サブユニット当たり１つのプロトヘミン補欠分子
族を有している（ワッサーマンおよびハルチン1981Arc
h.Biochem.Biophys.212:385−392;ハーティグおよびル
イス1986Eur.J.Biochem.160;487−490）。ウシ肝カタラ
ーゼはこの種の酵素でもっとも広く研究されたものであ
る［ションバウムおよびチャンス1976酵素（P.D.ボイヤ
ー、編集者）第３版、第13巻、363−408頁、アカデミッ
クプレス、ニューヨーク］。ウシ肝カタラーゼの完全な
アミノ酸配列および三次元構造は公知である（シュレダ
ー等、1982Arch.Biochem.Biophys.214:397−412;マーシ
ー等、1981J.Mol.Biol.152:465−499）。
ターゼ（EC 1.11.1.6）］は、以下の化学式にしたがっ
て過酸化水素（H2O2）が酸素（O2）および水（H2O）へ
転化するのを触媒する酵素である： これらの汎存酵素は様々な動物組織、植物および微生物
から精製されてきた（チャンスおよびメーリー1955Meth
ods Enzymol.2:764−791;ジョーンズおよびウィルソン1
978、H.シンゲル（編集者）、生物学系における金属イ
オン、第７巻、マーセル デッカー社、ニューヨー
ク）。特徴付けられているほとんど全ての形態の酵素
は、４つのポリペプチドサブユニットからなり、各々の
サブユニットは50,000から60,000までの範囲の分子量を
有し、サブユニット当たり１つのプロトヘミン補欠分子
族を有している（ワッサーマンおよびハルチン1981Arc
h.Biochem.Biophys.212:385−392;ハーティグおよびル
イス1986Eur.J.Biochem.160;487−490）。ウシ肝カタラ
ーゼはこの種の酵素でもっとも広く研究されたものであ
る［ションバウムおよびチャンス1976酵素（P.D.ボイヤ
ー、編集者）第３版、第13巻、363−408頁、アカデミッ
クプレス、ニューヨーク］。ウシ肝カタラーゼの完全な
アミノ酸配列および三次元構造は公知である（シュレダ
ー等、1982Arch.Biochem.Biophys.214:397−412;マーシ
ー等、1981J.Mol.Biol.152:465−499）。
生化学的見地および生物理的見地からはよく研究され
ていないけれども、糸状菌類からのカタラーゼには、そ
れらを哺乳類からのカタラーゼと区別するいくつかの特
徴がある。菌類カタラーゼ（fungal catalase）は、他
の微生物から得たカタラーゼと比較して、サブユニット
数およびヘム含有量（heme content）においては類似し
ているが、分子が相当大きく、80,000から97,000までの
範囲におよぶサブユニット分子量を有する（バンシュタ
イン等、1986J.Mol.Biol.188:63−72;ジャコブおよびオ
ーム−ジョンソン1979Biochem.18:2967−2975;ジョーン
ズ等、1987Biochim.Biophys.Acta913:395−398）。より
重要なことには、黒色アスペルギルスのような菌類から
のカタラーゼは、SDS、グルタルアルデヒドによる不活
化並びにそしてタンパク質分解に対して、ウシ肝カタラ
ーゼよりも安定であり、シアン化物、アジドおよびフッ
化物のようなカタラーゼ阻害因子に対する親和性が小さ
い（ワッサーマンおよびハルチン1981Arch.Biochem.Bio
phys.212:385−392）。さらに、黒色アスペルギルスカ
タラーゼは、極端なpH、過酸化水素および温度にさらし
た場合にウシ肝カタラーゼより著しく安定である（スコ
ットおよびハマー1960Enzymologia 22:229−237）。菌
類カタラーゼには安定性という利点があるが、菌類カタ
ラーゼに対応するウシ肝カタラーゼのような哺乳類酵素
には一般的により高い触媒活性がある（グラフト等、19
78;Can.J.Biochem.56:916−919）。従来より、ウシ肝カ
タラーゼは診断を目的とする用途および製薬関連用途に
は好ましい酵素であった（例えば、コンタクトレンズの
洗浄／消毒/H2O2中和）。しかしながら、ヨーロッパの
ウシの群にBSE（ウシ海綿状エンセファロパシー）とし
て知られている遅発ウイルス病が最近発生したこと、お
よびこの病気が人間に広がるかもしれないという恐れ
［ディーラーおよびラシー1991Nutr.Health（バイセス
ター）7:117−134;ディーラーおよびラシー1990Food Mi
crobiol.7:253−280］から、これらの用途でウシ肝カタ
ラーゼの代替物となるべきものを発見しようとする試み
がなされている。さらに、酵素の安定性は、酵素を生物
工学的に利用しようとする上で重要な要因となるので、
高濃度過酸化水素の中和を必要とする用途およびウシ肝
カタラーゼを使用することが健康まを該する恐れがある
製薬関連用途に黒色アスペルギルスカタラーゼを使用す
ることに大きな関心が集まっている。
ていないけれども、糸状菌類からのカタラーゼには、そ
れらを哺乳類からのカタラーゼと区別するいくつかの特
徴がある。菌類カタラーゼ（fungal catalase）は、他
の微生物から得たカタラーゼと比較して、サブユニット
数およびヘム含有量（heme content）においては類似し
ているが、分子が相当大きく、80,000から97,000までの
範囲におよぶサブユニット分子量を有する（バンシュタ
イン等、1986J.Mol.Biol.188:63−72;ジャコブおよびオ
ーム−ジョンソン1979Biochem.18:2967−2975;ジョーン
ズ等、1987Biochim.Biophys.Acta913:395−398）。より
重要なことには、黒色アスペルギルスのような菌類から
のカタラーゼは、SDS、グルタルアルデヒドによる不活
化並びにそしてタンパク質分解に対して、ウシ肝カタラ
ーゼよりも安定であり、シアン化物、アジドおよびフッ
化物のようなカタラーゼ阻害因子に対する親和性が小さ
い（ワッサーマンおよびハルチン1981Arch.Biochem.Bio
phys.212:385−392）。さらに、黒色アスペルギルスカ
タラーゼは、極端なpH、過酸化水素および温度にさらし
た場合にウシ肝カタラーゼより著しく安定である（スコ
ットおよびハマー1960Enzymologia 22:229−237）。菌
類カタラーゼには安定性という利点があるが、菌類カタ
ラーゼに対応するウシ肝カタラーゼのような哺乳類酵素
には一般的により高い触媒活性がある（グラフト等、19
78;Can.J.Biochem.56:916−919）。従来より、ウシ肝カ
タラーゼは診断を目的とする用途および製薬関連用途に
は好ましい酵素であった（例えば、コンタクトレンズの
洗浄／消毒/H2O2中和）。しかしながら、ヨーロッパの
ウシの群にBSE（ウシ海綿状エンセファロパシー）とし
て知られている遅発ウイルス病が最近発生したこと、お
よびこの病気が人間に広がるかもしれないという恐れ
［ディーラーおよびラシー1991Nutr.Health（バイセス
ター）7:117−134;ディーラーおよびラシー1990Food Mi
crobiol.7:253−280］から、これらの用途でウシ肝カタ
ラーゼの代替物となるべきものを発見しようとする試み
がなされている。さらに、酵素の安定性は、酵素を生物
工学的に利用しようとする上で重要な要因となるので、
高濃度過酸化水素の中和を必要とする用途およびウシ肝
カタラーゼを使用することが健康まを該する恐れがある
製薬関連用途に黒色アスペルギルスカタラーゼを使用す
ることに大きな関心が集まっている。
黒色アスペルギルスカタラーゼの生化学的特性および
生物理的特性を記載した多くの報告書が出されている
が、黒色アスペルギルスには実際は２種類のカタラーゼ
酵素が存在することはこれまで開示されていなかった。
標準的な分子生物学技術を用いて、黒色アスペルギルス
（ジェネンカー インターナショナル社、非公表）か
ら、２つの異なるカタラーゼ酵素（カタラーゼ−Ａおよ
びカタラーゼ−Ｒ）をコード化する遺伝子（catAおよび
catR）を単離した。酵母（サッカロミセス属セレビシア
エ（cerevisiae））CTA1遺伝子に対する交雑（cross−h
ybridization）によりクローニングされた黒色アスペル
ギルスcatA遺伝子は、主に脂肪酸上でＫ成長中に誘発さ
れ、おそらくはペルオキシソーム中にあるカタラーゼ酵
素をコード化する。黒色アスペルギルスカタラーゼ−Ａ
はそれほど安定ではなく（すなわち、貯蔵においてより
短い半減期を有する）、高濃度の過酸化水素により急速
に不活化され、小さいpH値の元でカタラーゼ−Ｒよりも
活性が小さい弱い。黒色アスペルギルスcatR遺伝子は、
商業的なカタラーゼ調製において主要な役割を果たすこ
とが分った溶性細胞質酵素（カタラーゼ−Ｒ）をコード
化する。カタラーゼ−Ａとは著しく違って、この酵素は
広いpH範囲に亘って安定であり、たな寿命が長く、高濃
度過酸化水素中における非活性化に耐性を有している。
さらに、カタラーゼ−Ｒは、濃縮（例えば、３パーセン
ト）過酸化水素溶液の中和に関してウシ肝カタラーゼよ
りも効果的である。
生物理的特性を記載した多くの報告書が出されている
が、黒色アスペルギルスには実際は２種類のカタラーゼ
酵素が存在することはこれまで開示されていなかった。
標準的な分子生物学技術を用いて、黒色アスペルギルス
（ジェネンカー インターナショナル社、非公表）か
ら、２つの異なるカタラーゼ酵素（カタラーゼ−Ａおよ
びカタラーゼ−Ｒ）をコード化する遺伝子（catAおよび
catR）を単離した。酵母（サッカロミセス属セレビシア
エ（cerevisiae））CTA1遺伝子に対する交雑（cross−h
ybridization）によりクローニングされた黒色アスペル
ギルスcatA遺伝子は、主に脂肪酸上でＫ成長中に誘発さ
れ、おそらくはペルオキシソーム中にあるカタラーゼ酵
素をコード化する。黒色アスペルギルスカタラーゼ−Ａ
はそれほど安定ではなく（すなわち、貯蔵においてより
短い半減期を有する）、高濃度の過酸化水素により急速
に不活化され、小さいpH値の元でカタラーゼ−Ｒよりも
活性が小さい弱い。黒色アスペルギルスcatR遺伝子は、
商業的なカタラーゼ調製において主要な役割を果たすこ
とが分った溶性細胞質酵素（カタラーゼ−Ｒ）をコード
化する。カタラーゼ−Ａとは著しく違って、この酵素は
広いpH範囲に亘って安定であり、たな寿命が長く、高濃
度過酸化水素中における非活性化に耐性を有している。
さらに、カタラーゼ−Ｒは、濃縮（例えば、３パーセン
ト）過酸化水素溶液の中和に関してウシ肝カタラーゼよ
りも効果的である。
発明の概要
黒色アスペルギルスゲノムがcatAおよびcatRと称する
２種類のカタラーゼ遺伝子を含有していることを発見し
た。さらに、catAおよびcatR遺伝子産物（それぞれ、カ
タラーゼ−Ａおよびカタラーゼ−Ｒ）は、２つの異なる
カタラーゼ酵素であり、各々はそれぞれ特色のある特性
を有していることを発見した。本発明は、カタラーゼ−
Ｒが、過酸化水素溶液の中和を必要とする多くの生物工
学的用途に対して有用で優れた酵素となるべき特性を有
していることを開示する。さらに、本発明は、カタラー
ゼ−Ｒが、過酸化水素の除去に際してウシ肝カタラーゼ
より優れた成績を示すという発見に基づく。
２種類のカタラーゼ遺伝子を含有していることを発見し
た。さらに、catAおよびcatR遺伝子産物（それぞれ、カ
タラーゼ−Ａおよびカタラーゼ−Ｒ）は、２つの異なる
カタラーゼ酵素であり、各々はそれぞれ特色のある特性
を有していることを発見した。本発明は、カタラーゼ−
Ｒが、過酸化水素溶液の中和を必要とする多くの生物工
学的用途に対して有用で優れた酵素となるべき特性を有
していることを開示する。さらに、本発明は、カタラー
ゼ−Ｒが、過酸化水素の除去に際してウシ肝カタラーゼ
より優れた成績を示すという発見に基づく。
図面
第１図は、希釈した過酸化水素溶液（100ppm）中のカ
タラーゼ−Ａおよびカタラーゼ−Ｒの活性を比較したグ
ラフである。
タラーゼ−Ａおよびカタラーゼ−Ｒの活性を比較したグ
ラフである。
第２図は、濃縮した過酸化水素溶液（16.5g/L）中の
カタラーゼ−ＡおよびカタラーゼＲの活性を比較したグ
ラフである。
カタラーゼ−ＡおよびカタラーゼＲの活性を比較したグ
ラフである。
第３図は、異なるpH値でのカタラーゼ−Ａおよびカタ
ラーゼ−Ｒの酵素活性を比較したグラフである。
ラーゼ−Ｒの酵素活性を比較したグラフである。
第４図は、それぞれカタラーゼ−Ａおよびカタラーゼ
−Ｒをコード化する黒色アスペルギルスcatAおよびcatR
遺伝子の制限マップである。
−Ｒをコード化する黒色アスペルギルスcatAおよびcatR
遺伝子の制限マップである。
第５図は、黒色アスペルギルスcatR遺伝子のヌクレオ
チド配列および推測したアミノ酸配列を示している。イ
ントロンはダッシュラインにより示す。
チド配列および推測したアミノ酸配列を示している。イ
ントロンはダッシュラインにより示す。
第６図は、３％の過酸化水素溶液を中和する際のカタ
ラーゼ−Ｒおよびウシ肝カタラーゼのタブレット（各々
が1mgの酵素を含有している）の効果を比較したグラフ
である。２つの酵素標品の特異的な活性は同等であった
（ウシ肝カタラーゼについては6541U/mgであり、黒色ア
スペルギルスカタラーゼ−Ｒについては7344U/mgであ
る）。
ラーゼ−Ｒおよびウシ肝カタラーゼのタブレット（各々
が1mgの酵素を含有している）の効果を比較したグラフ
である。２つの酵素標品の特異的な活性は同等であった
（ウシ肝カタラーゼについては6541U/mgであり、黒色ア
スペルギルスカタラーゼ−Ｒについては7344U/mgであ
る）。
実施例
カタラーゼ−Ａとカタラーゼ−Ｒの生化学的特性およ
び生物理学的特性の比較について以下に記載する。さら
に、カタラーゼ−Ｒとウシ肝カタラーゼの酵素の性能の
比較についても概説する。当業者にとって、以下の実施
例を様々に変更できることは理解されよう。したがっ
て、実施例は制限を意図するものではない。
び生物理学的特性の比較について以下に記載する。さら
に、カタラーゼ−Ｒとウシ肝カタラーゼの酵素の性能の
比較についても概説する。当業者にとって、以下の実施
例を様々に変更できることは理解されよう。したがっ
て、実施例は制限を意図するものではない。
1. カタラーゼ−Ａとカタラーゼ−Ｒの生化学的特性お
よび生物理学的特性の比較 酵素活性、過酸化水素濃度、pH活性プロファイル、お
よび酵素安定性のような生化学パラメータを測定するの
に用いた技術は、以下の実施例に記載されるような従来
の技術である。
よび生物理学的特性の比較 酵素活性、過酸化水素濃度、pH活性プロファイル、お
よび酵素安定性のような生化学パラメータを測定するの
に用いた技術は、以下の実施例に記載されるような従来
の技術である。
黒色アスペルギルスカタラーゼ−Ｒの精製
トリスアクリルＱ樹脂（IBFバイオテクニクス社）を
用いたイオン交換クロマトグラフィーを利用して、カタ
ラーゼ−Ｒを黒色アスペルギルスカタラーゼの市販の標
品（ファームコラーゼ1000、ジェネンカー インターナ
ショナル社）から精製した。最初に、10mMのトリス−HC
l中においてpH8で平衡にしたPD−10カラム（ファーマシ
ア−LKB）を用いて、市販の酵素標品を脱塩させた。最
初に100mMのトリス−HClを用いてpH8に平衡させ、次い
で6.0ml/分の流速で200mlの10mMのトリス−HClを用いて
pH8に平衡にした2.5cm×5.5cmトリスアクリルＱカラム
上に酵素を装填した。そのカラムを10mMのトリス−HCl
で洗浄することにより、結合していないタンパク質を溶
出させた。NaClの濃度を増大させて（pH8にて10mMのト
リス−HCl中でゼロから0.5Mまで）生じた勾配により、
残りのタンパク質を溶出させた。最高のA410/A280比を
有するタンパク質画分は精製されたカタラーゼを含有し
ていた。このタンパク質画分のSDS−PAGE分析により、
約80,000の見掛けの分子量を示す１つのバンドが現れ
た。
用いたイオン交換クロマトグラフィーを利用して、カタ
ラーゼ−Ｒを黒色アスペルギルスカタラーゼの市販の標
品（ファームコラーゼ1000、ジェネンカー インターナ
ショナル社）から精製した。最初に、10mMのトリス−HC
l中においてpH8で平衡にしたPD−10カラム（ファーマシ
ア−LKB）を用いて、市販の酵素標品を脱塩させた。最
初に100mMのトリス−HClを用いてpH8に平衡させ、次い
で6.0ml/分の流速で200mlの10mMのトリス−HClを用いて
pH8に平衡にした2.5cm×5.5cmトリスアクリルＱカラム
上に酵素を装填した。そのカラムを10mMのトリス−HCl
で洗浄することにより、結合していないタンパク質を溶
出させた。NaClの濃度を増大させて（pH8にて10mMのト
リス−HCl中でゼロから0.5Mまで）生じた勾配により、
残りのタンパク質を溶出させた。最高のA410/A280比を
有するタンパク質画分は精製されたカタラーゼを含有し
ていた。このタンパク質画分のSDS−PAGE分析により、
約80,000の見掛けの分子量を示す１つのバンドが現れ
た。
黒色アスペルギルスカタラーゼ−Ａの精製
炭素源として１％のグルコースを含有した媒質中で２
日間成長させた細胞の菌糸抽出物から黒色アスペルギル
スカタラーゼ−Ａを精製した。菌糸は液体窒素中で急速
冷凍し、電気コーヒー粉砕機中で微細な粉末となるまで
粉砕した。冷凍粉末をpH7で10mlの100mMの蟻酸ナトリウ
ム緩衝液中に懸濁させ、氷上で１時間保持した。不溶性
デブリ（debris）を遠心分離により除去し、上澄み液を
限外濾過（アミコン）により濃縮した。次いでセファク
リルＳ−100を用いて濃縮抽出物についてクロマトグラ
フを行ない、上述したようにイオン交換カラムを用いて
カタラーゼ活性を示す分画について再度クロマトグラフ
を行なった。カタラーゼ活性を示す２つのピーク（一方
が大きく、他方が小さい）をSDS−PAGEにより分析し
た。大きいカタラーゼ分画からは、80,000の分子量を示
す主要バンドが得られ、その後カララーゼ−Ｒであるこ
とが分った。カタラーゼ−Ａである微量成分の分画から
は、46,000の分子量を示すバンドが得られた。
日間成長させた細胞の菌糸抽出物から黒色アスペルギル
スカタラーゼ−Ａを精製した。菌糸は液体窒素中で急速
冷凍し、電気コーヒー粉砕機中で微細な粉末となるまで
粉砕した。冷凍粉末をpH7で10mlの100mMの蟻酸ナトリウ
ム緩衝液中に懸濁させ、氷上で１時間保持した。不溶性
デブリ（debris）を遠心分離により除去し、上澄み液を
限外濾過（アミコン）により濃縮した。次いでセファク
リルＳ−100を用いて濃縮抽出物についてクロマトグラ
フを行ない、上述したようにイオン交換カラムを用いて
カタラーゼ活性を示す分画について再度クロマトグラフ
を行なった。カタラーゼ活性を示す２つのピーク（一方
が大きく、他方が小さい）をSDS−PAGEにより分析し
た。大きいカタラーゼ分画からは、80,000の分子量を示
す主要バンドが得られ、その後カララーゼ−Ｒであるこ
とが分った。カタラーゼ−Ａである微量成分の分画から
は、46,000の分子量を示すバンドが得られた。
表１は、黒色アスペルギルスカタラーゼ−Ａおよびカ
タラーゼ−Ｒの生化学特性と生物理特性を比較したもの
を示している。
タラーゼ−Ｒの生化学特性と生物理特性を比較したもの
を示している。
2. 黒色アスペルギルスのcatA遺伝子およびcatR遺伝子
のクローニング 黒色アスペルギルスのcatA遺伝子およびcatR遺伝子を
クローニングするのに用いた技術は、サムブルック等の
分子クローニング、研究所手引き（1989、コールド ス
プリング ハーバー プレス、コールド スプリング
ハーバー、ニューヨーク）に記載されている従来の技術
である。
のクローニング 黒色アスペルギルスのcatA遺伝子およびcatR遺伝子を
クローニングするのに用いた技術は、サムブルック等の
分子クローニング、研究所手引き（1989、コールド ス
プリング ハーバー プレス、コールド スプリング
ハーバー、ニューヨーク）に記載されている従来の技術
である。
黒色アスペルギルスのcatR遺伝子のクローニング
臭化シアンを用いてタンパク質を切断することによ
り、一連のタンパク質分解断片を、精製したカタラーゼ
−Ｒから生成した。これらのペプチド断片についてアミ
ノ酸配列分析を行なった。アミノ酸配列情報を用いて、
λgt11ライブラリーにおけるcatR特異的cDNA配列を同定
するための合成DNAプローブを設計した。手短に言う
と、ペプチド断片Met−Phe−Trp−Asn−Ser−Leu−Ile
−Pro−Ala−Glu−Gln−Gln−Metを用いて、下記の配
列： を有する３つの合成オリゴヌクレオチドのプールを設計
した。
り、一連のタンパク質分解断片を、精製したカタラーゼ
−Ｒから生成した。これらのペプチド断片についてアミ
ノ酸配列分析を行なった。アミノ酸配列情報を用いて、
λgt11ライブラリーにおけるcatR特異的cDNA配列を同定
するための合成DNAプローブを設計した。手短に言う
と、ペプチド断片Met−Phe−Trp−Asn−Ser−Leu−Ile
−Pro−Ala−Glu−Gln−Gln−Metを用いて、下記の配
列： を有する３つの合成オリゴヌクレオチドのプールを設計
した。
そのアミノ酸からは最小限の変性コドンしか選択され
ないので、このペプチドを選択した。黒色アスペルギル
スの既知のコドン使用パターンにおいて強い偏りがなか
った場合には、３つの合成オリゴヌクレオチドにおける
差異なよりコドンの選択が二者択一的であることを意味
する。このタンパク質分解断片のこの位置は、第２図に
示したペプチド３に対応する。部分的なcDNA断片を含有
するクローンは、合成DNAプローブによる雑種形成によ
り明確に同定され、このクローンについてヌクレオチド
配列分析を行なって、このクローンがカタラーゼ−Ｒを
コード化したことを明らかにした。このクローニングし
たcDNA断片を用いて、黒色アスペルギルスゲノムDNAの
ライブラリーをプローブした。続いて、全縁（entire）
catR遺伝子およびその上流と下流の転写調節要素を、9.
0kbのHind III−Xho I制限断片として組み立てた。catR
暗号領域のヌクレオチド配列を決定し、第５図に示す。
ないので、このペプチドを選択した。黒色アスペルギル
スの既知のコドン使用パターンにおいて強い偏りがなか
った場合には、３つの合成オリゴヌクレオチドにおける
差異なよりコドンの選択が二者択一的であることを意味
する。このタンパク質分解断片のこの位置は、第２図に
示したペプチド３に対応する。部分的なcDNA断片を含有
するクローンは、合成DNAプローブによる雑種形成によ
り明確に同定され、このクローンについてヌクレオチド
配列分析を行なって、このクローンがカタラーゼ−Ｒを
コード化したことを明らかにした。このクローニングし
たcDNA断片を用いて、黒色アスペルギルスゲノムDNAの
ライブラリーをプローブした。続いて、全縁（entire）
catR遺伝子およびその上流と下流の転写調節要素を、9.
0kbのHind III−Xho I制限断片として組み立てた。catR
暗号領域のヌクレオチド配列を決定し、第５図に示す。
黒色アスペルギルスcatA遺伝子のクローニング
プローブとしてサッカロミセス属セレビシアエCTA1遺
伝子を用いた交差雑種形成により黒色アスペルギルスca
tA遺伝子をクローニングした。酵母カタラーゼ遺伝子を
前もって単離し、それらの配列を公表した（コヘン等、
1988Eur.J.Biochem.176:159−163;ハーティングおよび
ルイズ1986、Eur.J.Biochem.160:480−490）。PCR（パ
ーキン エルマー−セタス）を用いて酵母CTA1遺伝子の
断片を増幅し、pUC18中にクローニングした。このクロ
ーンについて配列分析を行なうことにより、このクロー
ンは酵母ペルオキシソーム中にある（peroxisomal）カ
タラーゼ遺伝子であることが明らかとなった。次いでこ
のクローンを用いて、黒色アスペルギルスFS−１ゲノム
DNAのサザンブロットをスクリーニングし、3.2kbの１つ
のEcoR Iバンドまで雑種形成することが分った。次いで
このプローブを用いてFS−１ゲノムDNAのλEMBLライブ
ラリーをスクリーニングして、いくつかの陽性クローン
を同定することができた。各々のクローンは前もって同
定した3.2kbのEcoR I制限断片を含有している。これら
のλEMBLクローンのうちの１つ（λEMBL3−１）をBamH
Iで断片し、9kbの断片をpUC18中にサブクローニングし
た。このサブクローンの制限酵素切断地図を第４図に示
す。酵母CTA1遺伝子を用いて雑種形成したこの断片の一
部のDNA配列分析により、そのクローンはカタラーゼ−
Ｒとは異なるカタラーゼをコード化することが示され
た。酵母CTA1遺伝子との相同性を基準として、そのカタ
ラーゼをcatAと称した。pUC18−catAプラスミドとベノ
ミル耐性（benomyl−resistance）を付与するβ−チュ
ーブリン遺伝子を含有するプラスミドとを用いて、黒色
アスペルギルスFS−１の同時形質転換（co−transforma
tion）を行なった。サザンブロッテッイングにより増加
した集積catA遺伝子コピーについて、ベノミル耐性コロ
ニーをスクリーニングした。２つ以上のcatA遺伝子コピ
ーを示すそれらの形質転換体を、振とうフラスコ培養中
で評価した。208と称する１つの形質転換体は、全細胞
カタラーゼ活性がほぼ倍になったことを示した。
伝子を用いた交差雑種形成により黒色アスペルギルスca
tA遺伝子をクローニングした。酵母カタラーゼ遺伝子を
前もって単離し、それらの配列を公表した（コヘン等、
1988Eur.J.Biochem.176:159−163;ハーティングおよび
ルイズ1986、Eur.J.Biochem.160:480−490）。PCR（パ
ーキン エルマー−セタス）を用いて酵母CTA1遺伝子の
断片を増幅し、pUC18中にクローニングした。このクロ
ーンについて配列分析を行なうことにより、このクロー
ンは酵母ペルオキシソーム中にある（peroxisomal）カ
タラーゼ遺伝子であることが明らかとなった。次いでこ
のクローンを用いて、黒色アスペルギルスFS−１ゲノム
DNAのサザンブロットをスクリーニングし、3.2kbの１つ
のEcoR Iバンドまで雑種形成することが分った。次いで
このプローブを用いてFS−１ゲノムDNAのλEMBLライブ
ラリーをスクリーニングして、いくつかの陽性クローン
を同定することができた。各々のクローンは前もって同
定した3.2kbのEcoR I制限断片を含有している。これら
のλEMBLクローンのうちの１つ（λEMBL3−１）をBamH
Iで断片し、9kbの断片をpUC18中にサブクローニングし
た。このサブクローンの制限酵素切断地図を第４図に示
す。酵母CTA1遺伝子を用いて雑種形成したこの断片の一
部のDNA配列分析により、そのクローンはカタラーゼ−
Ｒとは異なるカタラーゼをコード化することが示され
た。酵母CTA1遺伝子との相同性を基準として、そのカタ
ラーゼをcatAと称した。pUC18−catAプラスミドとベノ
ミル耐性（benomyl−resistance）を付与するβ−チュ
ーブリン遺伝子を含有するプラスミドとを用いて、黒色
アスペルギルスFS−１の同時形質転換（co−transforma
tion）を行なった。サザンブロッテッイングにより増加
した集積catA遺伝子コピーについて、ベノミル耐性コロ
ニーをスクリーニングした。２つ以上のcatA遺伝子コピ
ーを示すそれらの形質転換体を、振とうフラスコ培養中
で評価した。208と称する１つの形質転換体は、全細胞
カタラーゼ活性がほぼ倍になったことを示した。
3. 黒色アスペルギルスカタラーゼ−Ｒおよびウシ肝カ
タラーゼの性能比較 以下の検定において、精製したカタラーゼ−Ｒおよび
精製したウシ肝カタラーゼ（ベーリンガーマンハイム）
の成績を比較した： （ａ） 表２に示したように、様々な量の凍結乾燥した
酵素粉末各々を10mlの３％過酸化水素溶液に加えた。２
つの酵素標品の特異的な活性は同等であった（ウシ肝カ
タラーゼについては6541U/mgであり、黒色アスペルギル
スカタラーゼ−Ｒについては7344U/mgであった）。３分
後、残留する過酸化水素を分光光度分析により測定した
（スコットおよびハマー1960Enzymogia 22:194−20
0）。表２の結果は、３％の過酸化水素を中和するに
は、ウシ肝カタラーゼの必要量と比較して、四分の一の
量のカタラーゼ−Ｒが必要であることを示している。例
えば、0.1mgのカタラーゼ−Ｒは、成績においては0.5mg
のウシ肝カタラーゼと同等である。
タラーゼの性能比較 以下の検定において、精製したカタラーゼ−Ｒおよび
精製したウシ肝カタラーゼ（ベーリンガーマンハイム）
の成績を比較した： （ａ） 表２に示したように、様々な量の凍結乾燥した
酵素粉末各々を10mlの３％過酸化水素溶液に加えた。２
つの酵素標品の特異的な活性は同等であった（ウシ肝カ
タラーゼについては6541U/mgであり、黒色アスペルギル
スカタラーゼ−Ｒについては7344U/mgであった）。３分
後、残留する過酸化水素を分光光度分析により測定した
（スコットおよびハマー1960Enzymogia 22:194−20
0）。表２の結果は、３％の過酸化水素を中和するに
は、ウシ肝カタラーゼの必要量と比較して、四分の一の
量のカタラーゼ−Ｒが必要であることを示している。例
えば、0.1mgのカタラーゼ−Ｒは、成績においては0.5mg
のウシ肝カタラーゼと同等である。
表２は、３分間の反応における過酸化水素の３％の溶
液を中和するカタラーゼ−Ｒとウシ肝カタラーゼの効果
の比較を示している。２つの酵素標品の特異的活性は同
等であった（ウシ肝カタラーゼについては6541U/mgであ
り、黒色アスペルギルスカタラーゼ−Ｒについては7344
U/mgであった）。
液を中和するカタラーゼ−Ｒとウシ肝カタラーゼの効果
の比較を示している。２つの酵素標品の特異的活性は同
等であった（ウシ肝カタラーゼについては6541U/mgであ
り、黒色アスペルギルスカタラーゼ−Ｒについては7344
U/mgであった）。
（ｂ） オキシセプト２キット（アラーガン）中の、1m
gのウシ肝カタラーゼを含有するタブレットを購入し
た。キャリアとしてソルビトールを用いて、1mgの黒色
アスペルギルスカタラーゼ−Ｒを含有するタブレットを
調製した。上述した検定と同等な成績検定においてこれ
らのタブレットの各々の効果を比較した。第６図は、黒
色アスペルギルスカタラーゼ−Ｒのタブレットは２分以
内で３％の過酸化水素を1ppm未満に減少させたが、一方
でウシ肝カタラーゼを含有するタブレットでは３％の過
酸化水素を1ppm未満に減少させるのに４分から５分要し
た。
gのウシ肝カタラーゼを含有するタブレットを購入し
た。キャリアとしてソルビトールを用いて、1mgの黒色
アスペルギルスカタラーゼ−Ｒを含有するタブレットを
調製した。上述した検定と同等な成績検定においてこれ
らのタブレットの各々の効果を比較した。第６図は、黒
色アスペルギルスカタラーゼ−Ｒのタブレットは２分以
内で３％の過酸化水素を1ppm未満に減少させたが、一方
でウシ肝カタラーゼを含有するタブレットでは３％の過
酸化水素を1ppm未満に減少させるのに４分から５分要し
た。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 フォーラー，ティモシー
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94061 レッドウッド シティ ハル
アヴェニュー 1738
(72)発明者 ヴァハ−ヴァヘ，ペッカ
フィンランド国 カントヴィーク
02460 ソケリリンネ 22
(56)参考文献 特開 平３−161091（ＪＰ，Ａ)
特開 昭60−68858（ＪＰ，Ａ)
特開 昭62−63916（ＪＰ，Ａ)
特開 昭63−199799（ＪＰ，Ａ)
特開 平５−317388（ＪＰ，Ａ)
特開 平６−102474（ＪＰ，Ａ)
特公 平２−28849（ＪＰ，Ｂ２)
特公 平１−60806（ＪＰ，Ｂ２)
国際公開92／17571（ＷＯ，Ａ１)
米国特許4585488（ＵＳ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A61L 2/18
A01N 59/00
C11D 7/18
C11D 7/46
G02C 13/00
Claims (6)
- 【請求項１】コンタクトレンズを洗浄し消毒する方法で
あって、 コンタクトレンズを消毒するのに十分な強さを有する過
酸化水素の溶液で該コンタクトレンズを処理し、 黒色アスペルギルスから得た効果的な量のカタラーゼ−
Ｒ酵素に前記溶液をさらして残留する過酸化水素を分解
する、 各工程からなり、 前記残留する過酸化水素を分解するのに必要なカタラー
ゼの量と時間が少ないことを特徴とする方法。 - 【請求項２】前記カタラーゼ−Ｒがキャリアとともに調
製されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方
法。 - 【請求項３】前記キャリアがソルビトールであることを
特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項４】溶液中の過酸化水素を中和する方法であっ
て、 アスペルギルスからの効果的な量のカタラーゼ−Ｒ酵素
で前記溶液を処理することからなり、 前記溶液を中和するのに必要な酵素の量と時間が少ない
ことを特徴とする方法。 - 【請求項５】前記カタラーゼ−Ｒ酵素が、配列認識番号
２のアミノ酸配列またはその対立変種からなることを特
徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項６】前記カタラーゼ−Ｒ酵素が、配列認識番号
２のアミノ酸配列またはその対立変種からなることを特
徴とする請求の範囲第４項記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US84599092A | 1992-03-04 | 1992-03-04 | |
| US845,990 | 1992-03-04 | ||
| PCT/US1993/002018 WO1993017721A1 (en) | 1992-03-04 | 1993-03-04 | Use of aspergillus niger catalase-r for hydrogen peroxide neutralization |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07505619A JPH07505619A (ja) | 1995-06-22 |
| JP3408535B2 true JP3408535B2 (ja) | 2003-05-19 |
Family
ID=25296625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51592393A Expired - Lifetime JP3408535B2 (ja) | 1992-03-04 | 1993-03-04 | 過酸化水素を中和するための黒色アスペルギルスカタラーゼ−ｒの使用 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP3408535B2 (ja) |
| AT (2) | ATE192934T1 (ja) |
| CA (1) | CA2131162A1 (ja) |
| DE (2) | DE69328672T2 (ja) |
| DK (2) | DK0629134T3 (ja) |
| ES (2) | ES2263246T3 (ja) |
| FI (1) | FI113010B (ja) |
| WO (1) | WO1993017721A1 (ja) |
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| US5646025A (en) * | 1995-05-05 | 1997-07-08 | Novo Nordisk A/S | Scytalidium catalase gene |
| US5919698A (en) * | 1995-09-25 | 1999-07-06 | Novo Nordisk A/S | Disinfection and cleaner of contact lenses |
| AU698356B2 (en) * | 1995-09-25 | 1998-10-29 | Novo Nordisk A/S | Disinfection and cleaning of contact lenses |
| EP0853533A1 (en) * | 1995-10-06 | 1998-07-22 | Novo Nordisk A/S | Bleaching and sterilization of cork articles |
| US5897833A (en) * | 1996-09-30 | 1999-04-27 | Allergan | Systems and methods for disinfecting contact lenses |
| US6022721A (en) * | 1997-01-03 | 2000-02-08 | Development Center For Biotechnology | Catalase, the gene thereof and composition comprising the same, and process for preparing catalase using genetic engineering technology |
| US6022732A (en) * | 1997-04-09 | 2000-02-08 | Allergan | Hydrogen peroxide destroying compositions and methods of using same |
| SG148934A1 (en) † | 2007-06-11 | 2009-01-29 | Novozymes As | A process for combined biopolishing and bleach clean-up |
| WO2009026697A1 (en) * | 2007-08-28 | 2009-03-05 | University Of Manitoba | A method of reducing a vasodilatory response using a guanylate cyclase pathway inhibitor or an h2o2 reducing agent |
| CN102782209A (zh) | 2009-08-27 | 2012-11-14 | 丹尼斯科美国公司 | 组合的纺织品磨蚀和颜色修饰 |
| US8753513B2 (en) | 2010-11-09 | 2014-06-17 | International Business Machines Corporation | Ammonia-peroxide wastewater treatment system |
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| TR201909592T4 (tr) | 2012-08-16 | 2019-07-22 | Novozymes As | Tekstili endoglukanazla işlemden geçirmek için usul. |
| WO2014086659A2 (en) | 2012-12-06 | 2014-06-12 | Ahmedabad Textile Industry's Research Association | Method for enzymatical preparation of textiles |
| US9487759B2 (en) * | 2013-02-26 | 2016-11-08 | Avent, Inc. | Preparation of stabilized catalase enzymes using polyvinyl alcohol |
| WO2014143773A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Lubrizol Advanced Materials, Inc. | Itaconic acid polymers |
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-
1993
- 1993-03-04 CA CA002131162A patent/CA2131162A1/en not_active Abandoned
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- 1993-03-04 WO PCT/US1993/002018 patent/WO1993017721A1/en active IP Right Grant
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- 1993-03-04 AT AT99119007T patent/ATE325867T1/de not_active IP Right Cessation
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1994
- 1994-09-02 FI FI944050A patent/FI113010B/fi not_active IP Right Cessation
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