DE69322573T2 - Zellkultureinsatz - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum In-Vitro-Züchten von Zellen oder Gewebekulturen und umfaßt insbesondere einen neuartigen und verbesserten Zellkultureinsatz zum Stützen von Gewebekulturen in einem Fluidmedium, welches das Gewebekulturwachstum fördernde Nährstoffe enthält.
• Zellkultureinsätze bestehen aus einem Kunststoffmaterial und sind mit einer Membran an der Unterseite versehen, so daß eine freie Diffusion und ein freier Transport von Ionen und Makromolekülen möglich ist. Durch Verwenden einer frei hängenden mikroporösen Membran können beispielsweise zwei Zelltypen gezüchtet werden, und zwar jeweils eine auf jeder Seite der Membran in der selben Aufnahme. Ohne Aufhängen wären die Zellen auf der Unterseite der Membran Beschädigungen ausgesetzt. Die mikroporöse Membran ermöglicht den freien Durchgang von Makromolekülen, Proteinen und Ionen. Infolgedessen können die Wechselwirkungen der beiden Zelltypen ohne wirklichen physischen Kontakt zwischen den beiden Zeilpopulationen im gestützten Zustand des Einsatzes untersucht werden.
• Herkömmliche Zellkultureinsätze und -vorrichtungen sind in US-A-4 871 674 und US- A-5 026 649 beschrieben. US-A-4 871 674 offenbart einen Zellkultureinsatz mit an einem oberen Umfangsrandbereich vorgesehenen unterbrochenen vorstehenden Teilen zum Aufhängen des Zellkultureinsatzes. US-A-5 026 649 offenbart einen Zellkultureinsatz, der einen über den gesamten oberen Umfangsbereich vorgesehenen vorstehenden Teil zum Aufhängen der Kulturzelle und Öffnungen in den Seitenwänden zum Gasaustausch und zum Pipetieren von Proben aufweist.
• Beim Gebrauch dieser Zellkultureinsätze können Gase nicht ausreichend ausgetauscht werden, da die Fläche zwischen der Seitenwand des Einsatzes und der Kulturplatte zu klein ist. Wie des weiteren in US-A-5 026 649 beschrieben, können Teile des Zellkultureinsatzes möglicherweise kontaminiert werden, da in den Seitenwänden des Zellkultureinsatzes Öffnungen vorgesehen sind.
• Die vorliegende Erfindung betrifft einen Zellkultureinsatz mit einem oberen Bereich, einem unteren Bereich und Seitenwänden, die sich vom oberen Bereich zum unteren Bereich erstrecken. Der untere Bereich weist eine Bodenfläche auf, an der eine flache poröse und durchlässige Membran, eine Glasdeckplatte oder dergleichen angebracht sein kann. Der obere Bereich weist eine Oberseite auf, die wenigstens einen sich nach außen erstreckenden Flansch hat, der den Einsatz in der Öffnung des Zellkulturbehälters stützt. Die Seitenwände sind vorzugsweise unter Bildung einer geometrischen Form zueinander angeordnet, beispielsweise eines Dreiecks, eines Rechtecks, eines Quadrats, eines Sechsecks, eines Achtecks und dergleichen. Der Zellkultureinsatz kann in verschiedenen Größen und verschiedenen geometrischen Konfigurationen ausgebildet sein, so daß er mit verschiedenen Größen und geometrisch unterschiedlich geformten Gewebekulturgefäßen verwendet werden kann.
• Vorzugsweise weist der Zellkultureinsatz vier Seitenwandbereiche, die vom oberen Bereich zum unteren Bereich verjüngt ausgebildet sind und relativ zueinander zur Bildung einer geometrischen Konfiguration mit vier Ecken angeordnet sind. Die Ecken schaffen Einrichtungen zum Selbstzentrieren des Zellkultureinsatzes, wenn dieser zur Verwendung in dem Gewebekulturgefäß angeordnet ist, wobei dieses eine Aufnahme mit kreisförmiger geometrischer Ausbildung aufweist. Die Ecken begrenzen die Bewegung der Seitenwände in die Nähe der Aufnahme des Gewebekulturgefäßes, in dem der Einsatz angeordnet ist, um die Kapillarwirkung des Fluids in der Wand zu minimieren. Ferner kann eine Pipette zwischen den Seitenwänden des Zellkultureinsatzes und der Aufnahme des Gewebekulturgefäßes eingeführt werden. Die Pipette kann ohne Störung oder Entfernen des Zellkultureinsatzes aus der Aufnahme eingeführt werden, um den Boden der Aufnahme des Gewebekulturgefäßes zu erreichen und ein Medium einzuleiten oder von unterhalb der Membran und um die Außenfläche des Zellkultureinsatzes herum ohne Kontaminierung der Oberseite der Membran zu entfernen.
• Die Außenabmessungen des Bereichs des Zellkultureinsatzes in der Aufnahme sind ausreichend kleiner als der Innendurchmesser der Aufnahme, um das Anordnen einer Pipette oder einer ähnlichen Vorrichtung zwischen den Wänden zum Einfüllen oder Ansaugen von Fluid zu ermöglichen.
• Vorzugsweise sind wenigstens zwei sich nach außen erstreckende Flansche an der oberen Endfläche des Zellkultureinsatzes vorgesehen. Diese Flansche können entlang der oberen Endfläche des Zellkultureinsatzes in horizontaler Ausrichtung verteilt angeordnet sein, so daß die Flansche, wenn der Zellkultureinsatz in einem Gewebekulturgefäß angeordnet ist, auf der Oberseite des Gewebekulturgefäßes aufliegen können.
• Die Flansche ermöglichen das Abstützen des Zellkultureinsatzes im Gewebekulturgefäß, derart, daß ein Spalt zwischen dem Boden der Membran und dem Boden des Gewebekulturgefäßes besteht. Der Spalt schafft eine kontrollierte Druckhöhe und eine ebensolche Diffusion des Fluids in dem Gewebekulturgefäß, so daß Zellen auf den Flächen in geeigneter Weise gezüchtet werden können. Der Flansch kann ferner einen Gasaustauschbereich bilden.
• Der Zellkultureinsatz kann ferner Füße an der Bodenfläche aufweisen. Die Füße schaffen einen Zwischenraum zwischen der Membran und dem Aufnahmeboden des Gewebekultureinsatzes für den Fall, daß der sich nach außen erstreckende Flansch nicht mit dem Gewebekulturgefäß kompatibel ist und den Zellkultureinsatz nicht stützen kann. Ferner können die Füße den Zellkultureinsatz stützen, wenn dieser auf einer Fläche abgestellt wird.
• Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Zellkultureinsatzes ist die Selbstzentriereinrichtung. Die Seitenwände des Zellkultureinsatzes sind daran gehindert, sich nahe an die Seitenwand der Aufnahme des Gewebekulturgefäßes zu bewegen, in dem es angeordnet ist, so daß die Kapillarwirkung des Fluids in der Aufnahme minimiert ist.
• Fig. 1 ist eine perspektivische Explosionsdarstellung eines herkömmlichen Gewebekulturgefäßes und des bevorzugten erfindungsgemäßen Zellkultureinsatzes.
• Fig. 2 ist eine perspektivische Explosionsdarstellung des bevorzugten erfindungsgemäßen Zellkultureinsatzes ohne Membran.
• Fig. 3 ist eine Draufsicht auf Fig. 2.
• Fig. 4 ist eine Draufsicht auf Fig. 1 zur Darstellung des in der Aufnahme eines zellkulturgefäßes gestützten Zellkultureinsatzes.
• Fig. 5 ist ein Querschnitt entlang der Linie 5-5 der Fig. 4, welcher das Selbstzentrierungsmerkmal des Zellkultureinsatzes darstellt und bei dem eine Pipettenspitze in den Zwischenraum zwischen der Seitenwand des zellkultureinsatzes und der Aufnahme des Gewebekulturgefäßes eingeführt werden kann.
• Fig. 6, 7, 8, 9, 10, 11 und 12 sind vergrößerte perspektivische Ansichten alternativer Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Zellkultureinsatzes ohne Membran.
• Die Vorrichtung zum Züchten von Gewebekulturen gemäß Fig. 1 weist ein Gewebekulturgefäß oder -behälter 10 und einen Zellkultureinsatz 40 auf. Zwar ist lediglich ein Gewebekulturbehälter mit sechs Aufnahmen dargestellt, jedoch sei darauf hingewiesen, daß der Gewebekulturbehälter einen, acht, vierundzwanzig oder eine andere Zahl von Aufnahmen aufweisen kann, die nach dem jeweiligen Verwendungszweck der Vorrichtung gewählt ist.
• Der Kulturbehälter 10 weist eine Basis 11 mit einer Anzahl von Aufnahmen 14 auf, die jeweils eine Seitenwand 20 haben, welche am unteren Ende durch eine Wand 18 geschlossen und am oberen Ende 19 offen ist. Die Basis 11 ist üblicherweise transparent und kann beispielsweise aus Polyvinylchlorid geformt sein.
• Zwar sind in den vorhergehenden Absätzen die Einzelheiten des dargestellten Kulturbehälters beschrieben, jedoch sei darauf hingewiesen, daß der Behälter selbst nicht Teil der vorliegenden Erfindung ist, und daß der erfindungsgemäße Zellkultureinsatz in andere Kulturbehälter passend bemessen sein kann und mit diesen verwendet werden kann.
• Die Fig. 2 und 3 zeigen ferner den erfindungsgemäßen Zellkultureinsatz 40, der eine Körperwand 42 mit einer äußeren Wandfläche 44 und einer inneren Wandfläche 46 aufweist. Die Körperwand 42 erstreckt sich unter Verjüngung von einem oberen Bereich 48 zu einem unteren Bereich 50, wobei der Außenumfang des oberen Bereichs 48 größer als der Außenumfang des unteren Bereichs 50 ist.
• Die Seitenwände sind an Ecken 51 miteinander verbunden. Die Ecken bewirken ein Selbstzentrieren des Zellkultureinsatzes in der Aufnahme, um die Außenfläche der Seitenwände im wesentlichen darin einzuschränken, sich nahe an die Seitenwände der Aufnahme zu bewegen, so daß die Kapillarwirkung des Fluids in der Aufnahme minimiert ist, und um eine wesentliche Bewegung des Einsatzes in der Aufnahme zum leichteren Einführen einer Pipette zu ermöglichen.
• Der obere Bereich 48 weist eine Oberseite 52 auf, die einen sich nach außen erstreckenden Flansch 54 trägt. Der Flansch 54 bildet eine geeignete Angriffsfläche zum einfachen Entfernen und Anordnen des Zellkultureinsatzes aus bzw. in dem Kulturbehälter, und er stützt den Einsatz, wenn dieser in der Aufnahme eines Kulturbehälters angeordnet ist.
• Der untere Bereich 50 weist eine Bodenfläche 56 auf, an der eine mikroporöse Membran 58 haftend angebracht werden kann. Die Membran kann aus jedem geeigneten Material bestehen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf perforierte inerte Folie, hydriertes Gel oder eine geschichtete Kombination.
• Wie in den Fig. 2, 3 und 4 dargestellt, sind, wenn mehr als ein sich nach außen erstreckender Flansch 54 verwendet wird, diese voneinander beabstandet, um das Einführen von Sonden oder Pipetten während des Kultivierungsvorgangs zu ermöglichen. Die Konfiguration des Flanschs 54 kann derart ausgebildet sein, daß sie den meisten Situationen gerecht wird. Wie dargestellt, kann der Flansch 54 mit einer Öffnung zum Einführen einer Pipette oder einer Sonde in den Raum zwischen der Außenwand des Einsatzes und der Aufnahme ausgebildet sein. Die Ausbildung des Flansches kann das aseptische Einsetzen und Entfernen des Zellkultureinsatzes in die oder aus der Aufnahme des Kulturbehälters mit einer Pinzette oder einer Zange erleichtern und Luftzirkulation ermöglichen, um die Kammerbildung zu minimieren sowie den Zellkultureinsatz zu stützen, wenn dieser in der Aufnahme eines Kulturbehälters eingesetzt ist.
• Es ist höchst erwünscht, daß zwischen der Membran an der Bodenfläche des Einsatzes und der Aufnahme des Kulturbehälters ein Zwischenraum bestehen bleibt, so daß Zellen auf beiden Seiten der Membran gezüchtet werden können. Zu diesem Zweck kann der erfindungsgemäße Zellkultureinsatz ferner Füße 61 an der Bodenfläche des Zellkultureinsatzes aufweisen. Die Füße 61 können zum Stützen des Zellkultureinsatzes in einer bestimmten Kulturbehälterausbildung verwendet werden, wenn keine vorstehenden Flansche vorhanden sind oder diese nicht mit der bestimmten Kulturbehälterausbildung kompatibel sind. Die Füße 61 können ferner eine adäquate Stützfunktion für den Zellkultureinsatz bieten, wenn dieser auf einer ebenen Fläche angeordnet ist.
• Fig. 5 zeigt den in dem Gewebekulturbehälter 10 durch die Flansche 54 gestützten Zellkultureinsatz und die Stelle, an der die Pipettenspitze 64 in den Zwischenraum zwischen der äußeren Wandfläche 44 des Zellkultureinsatzes und der Seitenwand 20 der Aufnahme 14 des Kulturbehälters eingeführt werden kann.
• Es sei darauf hingewiesen, daß aufgrund der durch die Ecken 51 bewirkten Selbstzentrierung, der Zellkultureinsatz 40 in die Aufnahme 14 eingesetzt und ausreichend von der Seitenwand 20 der Aufnahme 14 beabstandet ist, so daß die Kapillarwirkung von Lösungen oder Medien minimiert wird, so daß diese sich nicht im Zwischenraum 62 an der Außenfläche 44 hinaufbewegen und in den Zellkultureinsatz gelangen oder aus der Aufnahme 14 austreten können. Zwar ist es üblich, die Membran im Abstand über der Bodenwand 18 der Aufnahme des Kulturbehälters anzuordnen, und da der Flansch 54 den Zellkultureinsatz stützt, kann die Funktion des Zellkultureinsatzes gegebenenfalls in einer Aufnahme mit einer Tiefe verwendet werden, die größer ist als vorgesehen, um mehr Lösung oder Medium unter der Membran vorsehen zu können oder um zusätzlichen Raum zwischen der Membran und der Bodenwand 18 zu bieten.
• Die Fig. 6-12 zeigen weitere Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung, die sämtlich ein Selbstzentrieren des Zellkultureinsatzes ermöglichen, wenn dieser in der Aufnahme des Kulturbehälters angeordnet ist, um so die Kapillarwirkung in der Aufnahme zu minimieren. Die Fig. 6-12 weisen zahlreiche Bestandteile auf, die im wesentlichen identisch mit den Bestandteilen der Fig. 1-5 sind. Dementsprechend sind gleiche Teile, die gleiche Funktionen haben, mit den gleichen Bezugszeichen versehen wie die Teile in den Fig. 1-5, mit der Ausnahme das diese ähnlichen Teile in den Fig. 6-12 mit dem Suffix "a" identifiziert werden.
• Fig. 6 zeigt einen Zellkultureinsatz 70, bei dem sich die Seitenwände von einem oberen Bereich 48a zu einem unteren Bereich 50a erstrecken und der Außenumfang des oberen Bereichs 48a im wesentlichen gleich dem Außenumfang des unteren Bereichs 50a ist.
• Die Seitenwände sind miteinander an Ecken 51a verbunden. Die Ecken 51a verjüngen sich vom oberen Bereich 48a zum unteren Bereich 50a. Der obere Bereich des Zelleinsatzes bewirkt an den Ecken eine Selbstzentrierung des Einsatzes in einer Aufnahme, um die Außenfläche der Seitenwände im wesentlichen daran zu hindern, sich nahe an die Aufnahmeseitenwände zu bewegen, und um eine erhebliche Bewegung des Zell kultureinsatzes in der Aufnahme zum leichteren Einführen einer Pipette in die Aufnahme zu ermöglichen.
• Fig. 7 zeigt ein anderes Ausführungsbeispiel der Erfindung, bei dem der Zellkultureinsatz 80 Seitenwände 42a aufweist, die sich von einem oberen Bereich 42a zu einem Übergangsbereich 82 und weiter zu einem unteren Bereich 50a erstrecken. Der Außenumfang des unteren Bereichs 50a ist kleiner als der Außenumfang des Übergangsbereichs 82, dessen Außenumfang größer als derjenige des oberen Bereichs 48a ist. Die Ecken 51a verjüngen sich vom Übergangsbereich 82 zum oberen Bereich 48a und vom Übergangsbereich 82 zum unteren Bereich 50a. Am Übergangsbereich des Zellkultureinsatzes bewirken die Ecken eine Selbstzentrierung des Einsatzes in einem Behälter, um die Außenfläche der Seitenwände daran zu hindern, sich nahe an die Aufnahmeseitenwände zu bewegen, und um eine wesentliche Bewegung des Zellkultureinsatzes in der Aufnahme zum leichteren Einführen einer Pipette in die Aufnahme zu ermöglichen.
• Fig. 8 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung, bei dem der Zellkultureinsatz 90 mit Seitenwänden 42a versehen ist, die sich vom oberen Bereich 48a zu einem Übergangsbereich 84 erstrecken und zu einem unteren Bereich 50a verlaufen. Der Außenumfang des unteren Bereichs 50a ist kleiner als der Außenumfangsbereich des Übergangsbereichs 84, der größer ist als der Außenumfang des oberen Bereichs 48a. Die Ecken 51a verjüngen sich vom Übergangsbereich 84 zum oberen Bereich 48a und vom Übergangsbereich 84 zum unteren Bereich 50a.
• Der obere Bereich 48a weist die Oberseite 52a auf, die bevorzugterweise einen viereckigen Querschnitt hat. Der untere Bereich 50a weist die Bodenfläche 50a auf, die vorzugsweise einen kreisförmigen Querschnitt aufweist.
• Ein alternatives Ausführungsbeispiel der Fig. 8 ist in Fig. 9 dargestellt, wobei die Oberseite 52a vorzugsweise einen kreisförmigen Querschnitt und die Bodenfläche 50a vorzugsweise einen viereckigen Querschnitt aufweist.
• Fig. 10-12 zeigen ferner ein alternatives Ausführungsbeispiel des Zellkultureinsatzes, wobei die Seitenwände 42a verschiedene geometrische Konfigurationen bilden können. Fig. 12 zeigt ferner, daß die Seitenwände sich von dem oberen Bereich 48a zum unteren Bereich 50a verjüngend erstrecken.
• Dem Fachmann ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Zelleinsätze aus einfachen Formteilen gebildet sein können, die aus einer Vielzahl verschiedener Materialien einschließlich beispielsweise Polyethylen, Polystyrol, Polyethylenterephthalat und Polypropylen. Dem Fachmann ist weiter ersichtlich, daß Materialien gewählt werden sollten, die einen geringen Elastizitätsgrad haben, um ein einfaches Einführen der erfindungsgemäßen Einsätze in mehrere Aufnahmen aufweisende Platten und ein einfaches Verwenden zu nachfolgenden Untersuchung der entwickelten gezüchteten Zellen zu ermöglichen. Eine derartige Elastizität ermöglicht ferner eine vereinfachte haftende Anbringung der Membran an der Bodenfläche des Zellkultureinsatzes.

Claims (9)

1. Zellkultureinsatz (40, 70, 80, 90) mit:

einer hohlen Kammer mit einem oberen Bereich (48, 48a), einem unteren Bereich (50, 50a) und einer Seitenwand (42, 42a), wobei der obere Bereich (48, 48a) eine Oberseite (52, 52a) und der untere Bereich (50, 50a) eine Bodenfläche (56, 50a) aufweist, die Seitenwand (42, 42a) eine Innenfläche (46) und eine Außenfläche (44) aufweist, die sich vom oberen Bereich (48, 48a) zum unteren Bereich (50, 50a) erstrecken, und wobei sich ein vorstehender Flansch (54, 54a) vom oberen Bereich (48, 48a) radial nach außen erstreckt und eine poröse Membran (58) an der Bodenfläche (56, 56a) angebracht ist,

dadurch gekennzeichnet, daß

wenigstens drei Seitenwände (42, 42a) in bezug zueinander derart angeordnet sind, daß sie wenigstens drei Verbindungsbereiche (51, 51a) bilden, und daß sich der vorstehende Flansch (54, 54a) über wenigstens eine Seitenwand (42, 42a) hinaus erstreckt.

2. Einsatz nach Anspruch 1, ferner mit einer sich von der Bodenfläche (56) aus erstreckenden Einrichtung (61) zum Stützen des Einsätze.

3. Einsatz nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Außenumfang des oberen Bereichs (48, 48a) und der Außenumfang des unteren Bereichs (50, 50a) im wesentlichen gleich sind.

4. Einsatz nach einem der Ansprüche 1-3, bei dem die Seitenwände (42, 42a) ein Viereck bilden.

5. Einsatz nach einem der Ansprüche 1-4, bei dem die Oberseite (52, 52a) und die Bodenfläche (56, 56a) viereckig sind.

6. Einsatz nach einem der Ansprüche 1-3, bei dem die Oberseite (52a) kreisförmig oder oval und die Bodenfläche (56a) viereckig ist.

7. Einsatz nach einem der Ansprüche 1-3, bei dem die Oberseite (52a) viereckig und die Bodenfläche (56a) kreisförmig oder oval ist.

8. Einsatz nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Umfang des oberen Bereichs (48, 48a) größer als der Umfang des unteren Bereichs (50, 50a) ist.

9. Einsatz nach Anspruch 8, bei dem die Seitenwände (40, 40a) von der Oberseite (52, 52a) zum unteren Bereich (50, 50a) zulaufen.