DE69320779T2 - Diagnostisches Schnellverfahren für aerobe Bakterien in einem biologischen Medium - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen Diagnose von aeroben Bakterien, die in einem biologischen Milieu, insbesondere im Blut, vorhanden sind.
• Trotz der Antibiotika bleiben die Septhämien eine Haupttodesursache. In den letzten Jahren ist vorgeschlagen worden, die Septhämien und gramnegative septische Schocks durch monoklonale anti-endotoxine Antikörper zu behandeln. Diese Behandlungen sind jedoch teuer, weshalb es logisch ist, sie nur für Krankheiten vorzuschreiben, die Gegenstand einer gramnegativen Septhämie sind. Der Nachweis der Existenz von gramnegativen Bakterien im Blut gelingt nur über zwei mögliche Wege: Dosieren des Endotoxins oder Aufzeigen der gramnegativen Bakterien.
• Es hat sich indessen gezeigt, daß die für diesen letzteren Weg verwendeten Diagnoseverfahren wegen der Notwendigkeit, die anti-endotoxinen Antikörper im Hinblick auf ihre Wirksamkeit schnell zu verabreichen, stark verspätete Antworten liefern. So ermöglichen die herkömmlichen Verfahren, die Züchtungen verwenden, keine Diagnose in weniger als 12 Stunden.
• Es sind insbesondere Diagnoseverfahren beschrieben worden, die Auflösungsoperationen (Lysis) und Zentrifugierungsoperationen des abgenommenen Blutes vor der Züchtung der Abnahme verwenden (siehe z. B. G. Dorn u. a., J. Clinical Microbiology, 1976, 3 : 258-263 und N. Henry u. a., J. Clinical Microbiology, 1983, 17 : 864-869). Die Diagnose durchläuft jedoch stets eine Züchtung mit einer Inkubationszeit von mindestens 18 Stunden.
• Außerdem sind Verfahren beschrieben worden, die eine Erfassung des bakteriellen Wachstums durch Strahlungsmessung umfassen. Die Erfassung kann jedoch nur in mindestens 12 Stunden erfolgen.
• Die vorliegende Erfindung zielt auf die Schaffung eines Verfahrens zur schnellen Diagnose, d. h. innerhalb von höchstens 5 Stunden, von aeroben Bakterien, die in einem biologischen Milieu und insbesondere im Blut vorhanden sind, selbst bei sehr geringen Konzentrationen (0,1 bis 10 UFC/ml).
• Die vorliegende Erfindung hat somit ein Verfahren zur schnellen Diagnose von aeroben Bakterien, die in einem biologischen Milieu vorhanden sind, zum Gegenstand, wobei das Verfahren nacheinander enthält:
• a) eine schnelle Züchtung (maximal 4 Stunden) in Aerobiose einer Probe des biologischen Milieus unter Umrühren,
• b) eine schnelle Zentrifugierung, um die Bakterien im Zentrifügenrückstand zurückzugewinnen,
• c) das Schleudern des vorher erhaltenen Rückstands auf einen Träger mittels Zentrifugierung,
• d) die Entwicklung der Bakterien auf dem Träger.
• Die vorliegende Erfindung hat insbesondere ein Verfahren zur Diagnose von im Blut vorhandenen aeroben Bakterien zum Gegenstand, das nacheinander enthält:
• a) eine Züchtung in Aerobiose einer Blutprobe unter Umrühren während 2 bis 4 Stunden,
• b) eine Trennung der Erythrozyten durch langsame Zentrifugierung und eine Rückgewinnung des Serums,
• c) eine Auflösung der Leukozyten im Serum,
• d) eine schnelle Zentrifugierung des so erhaltenen Milieus, um die Bakterien im Zentrifugenrückstand zurückzugewinnen,
• e) das Schleudern des obenerhaltenen Rückstands auf einen Träger mittels Zentrifugierung,
• f) die Entwicklung der Bakterien auf dem Träger.
• Der erste Schritt des Verfahrens gemäß der Erfindung ist eine Züchtung einer Probe, beispielsweise von 8-10 ml Blut unter starkem Umrühren, zweckmäßig unter sehr starkem Umrühren in Gegenwart von Sauerstoff, z. B. in Gegenwart von Luft. Das Umrühren kann mit Geschwindigkeiten in der Größenordnung von 100 bis 400 Umdrehungen pro Minute, z. B. 250 Umdrehungen pro Minute, erfolgen. Dieser Schritt steht im Gegensatz zu allem, was bisher empfohlen worden ist. Im allgemeinen ist nämlich das Umrühren nicht vorhanden oder schwach oder von sehr kurzer Dauer, um die Ablagerung der Erythrozyten zu ermöglichen. In der vorliegenden Erfindung wird die Züchtung unter Umrühren im allgemeinen während einer Dauer von 2 bis 4 Stunden ausgeführt, wobei diese Dauer um so kürzer sein kann, je höher die Konzentration der Bakterien ist.
• Bei Fehlen eines solchen Umrührens ist der erfaßbare Schwellenwert von Bakterien viel höher, wobei sich die Verzögerung bis zum Erhaltung der Ergebnisse verdoppelt. Somit ist es bei Fehlen des Umrührens und bei Verwendung derselben aufeinanderfolgenden Schritte erst nach einer achtstündigen Züchtung möglich, Konzentrationen von mindestens 102 UFC von Escherichia coli/ml im Blut nachzuzweisen, während bei Ausführung der Züchtung unter Umrühren während 4 Stunden Konzentrationen von Escherichia coli von nur 0,1 UFC/ml nachgewiesen werden können.
• Der Schritt der Trennung der Erythrozyten durch langsame Zentrifugierung kann insbesondere mit 200-300 g während einer Dauer in der Größenordnung von 15 Minuten erfolgen.
• Der Schritt der Auflösung (Lysis) der Leukozyten kann, wie von N. Henry (oben zitiert) beschrieben, unter Verwendung des in den Isolator-Röhren enthaltenden Produkts oder unter Verwendung jeglichen anderen die Auflösung ermöglichenden Produkts wie etwa Saponin (Endkonzentration von 0,2%) erfolgen. Hierzu wird das die Auflösung ermöglichende Produkt direkt zum Serum hinzugefügt, wobei die Gesamtheit beispielsweise mit Hilfe eines Vortexes während 1 Minute innig vermischt wird.
• Der Schritt des schnellen Zentrifugierens des Milieus, das der Auflösung unterworfen worden ist, wird ausgeführt, um die Bakterien zu konzentrieren. Diese Zentrifugierung kann mit 4000-5000 g während 10 Minuten ausgeführt werden.
• Der Schritt des Schleuderns des vorher erhaltenen Rückstands auf einen Träger mittels Zentrifugierung kann insbesondere unter Verwendung eines sogenannten Cytospin-Geräts (siehe insbesondere C. Shanholtzer u. a., J. Clinical Microbiology, 16, 6, 1052, 1982) oder unter Verwendung jedes anderen Zentrifugierungsprinzips ausgeführt werden. Dieses Gerät ermöglicht, die im Rückstand enthaltenen Bakterien auf eine kleine Oberfläche eines Glasplättchens, d. h. auf einen Kreis mit einem Durchmesser von ungefähr 4 mm, zu schleudern und zu konzentrieren, so daß eine Entwicklung der Bakterien auf dem Träger möglich ist. Diese Entwicklung kann im allgemeinen durch Gram-Färbung erfolgen.
• Das Verfahren gemäß der Erfindung ist unter Verwendung von drei aeroben Bakterienstämmen, die bei den nosokomialen Infektionen angetroffen werden, entwickelt worden: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa und Acinetobaceter baumanii.
• Diese Bakterien sind während 18 Stunden in Aerobiose auf Gelose gezüchtet worden. Die Kolonien sind entnommen und in 2 ml sterilen destillierten Wassers verdünnt worden, wobei Bakterienkonzentrationen von 5 · 10&sup6; bis 5 · 10&sup8; UFC/ml erhalten worden sind. Blutproben von 10 ml sind mit 0,1 ml in Verdünnungen von 10&supmin;&sup5; und 10&supmin;&sup6; für jede Spezies geimpft worden, wobei die Bakteriendichte in den Proben 0,05 bis 5 UFC/ml betrug.
• Die Blutproben (10 ml) sind in Blutkulturflaschen übertragen worden, die 20 ml Nährlösung (Hemoline Performance BioMérieux S. A.) mit 0,025 % Natrium-Polyanetholsulfonat enthalten, und unter Umrühren (250 Umdrehungen pro Minute (Rotatest, Bioblock) während 4 Stunden bei 37ºC inkubiert worden.
• Anschließend ist jede Kultur einer Zentrifugierung mit 250 g während 15 Minuten bei 20ºC unterworfen worden. Das Serum ist entnommen worden, wobei zur Ausführung der Auflösung der Leukozyten zur Endkonzentration von 0,2% der Isolator-Komplex (Dupont) oder Saponin hinzugefügt worden ist. Die Mischung ist mit dem Vortex während 1 Minute umgerührt worden und dann mit 4500 g während 10 Minuten zentrifugiert worden. Nach der Entfernung des Serums ist der Rückstand als Ganzes einer Zentrifugierung mit 192 g während 10 Minuten in einer Cytozentrifuge (Cytospin 2, Shandon) unterworfen worden, um auf einem Glasplättchen ein Quetschpräparat mit einem Durchmesser von 4 mm zu erhalten. Die Gram-Färbung ist auf dieser Probe ausgeführt und im Tauchmikroskop untersucht worden.
• Es konnte das Vorhandensein in einer Blutprobe von E. coli mit der Konzentration von 0,1 UIFC/ml, von P. aeruginosa mit der Konzentration von 0,3 UFC/ml und von A. baumanii mit der Konzentration von 1,5 UFC/ml erfaßt werden.
• Außerdem führt das Verfahren bei Fehlen eines Antibiotikums in den Blutproben zum Nachweis der Morphologie der Bakterien und ermöglicht somit eine diagnostische Orientierung hinsichtlich der Art. So sind E. coli in Form des dicken Stäbchenbakteriums, P. aeruginosa in Form des dünnen und langgestreckten Stäbchenbakteriums und A. baumanii in Form des Kugelbakteriums erkennbar. Dies ist ein zusätzlicher Vorteil des Verfahrens, weil dies dem Kliniker ermöglicht, die antibiotische Behandlung präziser zu wählen.
• Schließlich ist es im Erythrozytenrückstand, der mit Hilfe der langsamen Zentrifugierung separiert wird, möglich, am gleichen Tag ein Antibiogramm auszuführen, woraus sich ein deutlicher Zeitgewinn ergibt.
• Es ist anzumerken, daß das Verfahren nicht nur auf die Diagnose von Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter und Escherichia coli, sondern auch auf andere Enterobakterien wie etwa Klepstella pneumoniae, andere gramnegative Bakterien und hiervon Haemophilus influenzae, das ein Wachstumsfaktoren erfordernder Keim ist, gramnegative Kokken wie etwa Neisseiria meningitidis und schließlich grampositive Kokken wie etwa Staphylococcus aureus, Enterococcus und β-haemolytische Streptokokken anwendbar ist.
• Die Anwendung des Verfahrens auf das Blut, das von 39 Patienten abgenommen worden ist, die als klinisch septhämisch oder mit septischem Schock angesehen wurden, hat die Berechnung der Empfindlichkeit und der Spezifität des Verfahrens in bezug auf herkömmliche Blutkulturen (Anaerobia-Hämolin- Fläschchen von BioMèrieux, Marcy l'Etoile) und auf den Isolator (Merck) ermöglicht. Für diese zwei Verfahren sind die direkte Züchtung oder die Verpflanzung auf Schokoladenagar, das in einer CO&sub2;-Atmosphäre (5%) inkubiert wurde, sowie auf Blutagar, das in Aerobiose inkubiert wurde, ausgeführt worden.
• Die Tabelle 1 gibt eine Liste der Bakterienarten, die isoliert worden sind, ferner die anfängliche Blutkonzentration, die durch die Züchtung des Isolators eingeschätzt wurde, sowie die morphologischen und Gram-Färbungs-Ergebnisse, die durch das schnelle Diagnoseverfahren gemäß der Erfindung erhalten werden, an. TABELLE 1
• Es ist anzumerken, daß für den Fall 38 die herkömmlichen Blutkulturen in Aerobiose, jedoch ohne Isolator, die Isolierung eines Stamms von Bakteroides fragiles (anaerobes Bakterium) ermöglicht haben. Das schnelle Diagnoseverfahren hat mit dem Vorhandensein von gramnegativen Bakterien geantwortet. Mit diesem letzteren Verfahren hat die Züchtung, die in Aerobiose erfolgt ist, normalerweise nicht die Vervielfachung des Stamms ermöglichen können. Dies setzte selbstverständlich voraus, daß die Anfangskonzentration von Baktero les fragiles im Blut des Patienten groß war und ausreichte, damit der einfache Schritt der Konzentration der Bakterien ermöglichte, sie durch Gram- Färbung nachzuweisen.
• Außerdem ist in fünf Fällen, deren Blutkulturen in den herkömmlichen Verfahren negativ blieben, das schnelle Diagnoseverfahren positiv gewesen. In vier Fällen sind gramnegative Bakterien nachgewiesen worden, während im letzten seltene grampositive Kokken in Anhäufung vorhanden waren. Für einen der Fälle mit gramnegativen Bakterien ist anzumerken, daß die Bakterien sehr polymorph und in sehr großer Menge vorhanden waren, während in den anderen Fällen die Menge der Bakterien wie im Fall der grampositiven Kokken gering war.
• Das schnelle Verfahren hat außerdem ermöglicht, im Blut von Kranken das Vorhandensein von Bakterien, die in bezug auf die Morphologie (nicht länglich verformte Bakterien) und in bezug auf die Gram-Färbung (Körnigkeit, inhomogene Färbung, grampositiv und gramnegativ) anomal sind, nachzuweisen. Diese "anomalen" Bakterien sind einerseits züchtbar und andererseits auch im Blut von gesunden Personen vorhanden. Im Unterschied zu gesunden Personen ist die Menge dieser "anomalen" Bakterien bei den Personen, von denen angenommen wird, daß sie klinisch septihämisch sind und/oder unter septischem Schock stehen, manchmal größer.
• Sämtliche dieser letzteren Resultate zeigen, daß das schnelle Diagnoseverfahren kraft seines Schrittes der Konzentration der Bakterien durch die Zentrifugierung nicht nur lebende, sondern auch nicht lebende Bakterien erfassen kann.
• Das Verfahren gemäß der Erfindung und schneller Züchtung unter Umrühren ist auf andere Typen von Entnahmen als das Blut erweiterbar gewesen. Dieses Verfahren ist nämlich ebenso leistungsfähig für den Nachweis von Bakterien in der Zerebrospinalflüssigkeit (ZSF). Die ersten Erfahrungen, die in vitro ausgeführt wurden, zeigen, daß eine Kultur von 1 ml ZSF in 10 ml Nährlösung (Hämolin) durch das schnelle Verfahren positiv erfaßt wird, wenn die ZSF in vitro mit 10 UFC/ml von S. aureus, S. epidermidis, E. coli, K. pneumoniea, P. aeruginosa, Listeria monocytogenes oder Streptokokken kontaminiert worden ist.
• Um jedoch dieses Verfahren auf ZSF anzuwenden, müssen einige Modifikationen vorgenommen werden:
• - es findet keine langsame Zentrifugierung statt, weil in der ZSF keine roten Blutkörperchen vorhanden sind,
• - die Auflösung ist nicht ausgeführt worden, da die Auflösung der Leukozyten in großer Menge in der ZSF das Grundrauschen bei der Gram-Färbung erhöht.

Claims (6)

1. Verfahren zur schnellen Diagnose von aeroben Bakterien, die in einen biologischen Milieu vorhanden sind, wobei das Verfahren nacheinander enthält:

a) eine schnelle Züchtung in Aerobiose einer Probe des biologischen Milieus unter Umrühren während 2 bis 4 Stunden,

b) eine schnelle Zentrifugierung, um die Bakterien im Zentrifugenrückstand zurückzugewinnen,

c) das Schleudern des vorher erhaltenen Rückstands auf einen Träger mittels Zentrifugierung,

d) die Entwicklung der Bakterien auf dem Träger.

2. Verfahren zur schnellen Diagnose von im Blut vorhandenen aeroben Bakterien, wobei das Verfahren nacheinander enthält:

a) eine Züchtung in Aerobiose einer Blutprobe unter Umrühren während 2 bis 4 Stunden,

b) eine Trennung der Erythrozyten durch langsame Zentrifugierung und eine Rückgewinnung des Serums,

c) eine Auflösung der Leukozyten im Serum,

d) eine schnelle Zentrifugierung des so erhaltenen Milieus, um die Bakterien im Zentrifugenrückstand zurückzugewinnen,

e) das Schleudern des obenerhaltenen Rückstands auf einen Träger mittels Zentrifugierung,

f) die Entwicklung der Bakterien auf dem Träger.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in dem die Züchtung unter Umrühren während 2 bis 4 Stunden bei 250 Umdrehungen pro Minute ausgeführt wird.

4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die langsame Zentrifugierung mit 200-300 g erfolgt.

5. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, bei dem die schnelle Zentrifugierung mit 4000-5000 g erfolgt.

6. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, bei dem die Entwicklung eine Gram-Färbung ist.