DE69229706T2 - Verfahren zur Kultur von Mikroorganismen des Genus Helicobacter, Campylobacter und Arcobacter unter Verwendung von Cyclodextrinen oder Methylcellulose oder deren Gemischen enthaltenden Kulturmedien - Google Patents
Verfahren zur Kultur von Mikroorganismen des Genus Helicobacter, Campylobacter und Arcobacter unter Verwendung von Cyclodextrinen oder Methylcellulose oder deren Gemischen enthaltenden KulturmedienInfo
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Description
- Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Helicobacter, Campylobacter und Acrobacter unter Verwendung von Cyclodextrine oder Methylcellulose oder deren Gemische enthaltenden Kulturmedien.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen der Gattungen Helicobacter, Campylobacter und Arcobacter, wobei Kulturmedien verwendet werden, welche Cyclodextrin und gegebenenfalls Methylcellulose umfassen.
- Die Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Helicobacter, Campylobacter und Arcobacter im industriellen Maßstab sowohl für die Produktion der Mikroorganismen als auch wegen der Bedeutung der Produkte, welche während der Fermentationskultur produziert werden können, ist zunehmend von Bedeutung. Die Erzeugung billiger Medien, welche für die primäre Isolierung von Mikroorganismen, die zu den vorstehend erwähnten Gattungen gehören, geeignet sind, wäre nützlich im Hinblick auf die Wichtigkeit dieser Mikroorganismen, z. B. wird Helicobacter pylori als das auslösende Mittel der Typ B-Gastritis angesehen, wahrscheinlich nach der Zahnkaries die in der Welt am zweitmeisten verbreitete chronische Infektion, und als Co- Wirkstoff bei Ulcus pepticum. Es ist deshalb offensichtlich, daß eine tiefgehendere Kenntnis der physiologischen und pathologischen Eigenschaften besagter Mikroorganismen von außerordentlicher Wichtigkeit sein sollte, ein Wissen, welches zur Zeit aufgrund der Schwierigkeiten bei der Züchtung sehr gering ist. Die Züchtung von H. pylori wird gewöhnlich durchgeführt, indem man dem Kulturmedium Blut oder ein Derivat davon (Serum, rote Blutkörperchen, usw.), Eigelb in Konzentrationen im Bereich zwischen 5% und 20%, zugibt. Solche Zusätze können im industriellen Maßstab offensichtlich wegen der daraus folgenden Nachteile für die Reinigung der Kulturprodukte nicht eingesetzt werden, Nachteile, welche darüber hinaus hohe Kosten für die Industrie beinhalten. Es ist deshalb von außerordentlichem Interesse ein Kulturmedium zu erhalten, worin Blut und dessen Derivate gänzlich oder teilweise durch Produkte ersetzt werden, welche die vorstehend erwähnten Nachteile nicht haben, ohne die Ausbeute der Kultur zu mindern.
- Es ist überraschenderweise entdeckt worden, daß Kulturmedien, worin Blut und seine Derivate zumindest teilweise durch Cyclodextrine und, gegebenenfalls Methylcellulose ersetzt werden, es erlauben die Mikroorganismen der Gattungen Helicobacter, Campylobacter und Arcobacter auf ähnliche Weise und mit einer Ausbeute, zu züchten, die sogar über derjenigen liegt, die mit den herkömmlichen Medien erhalten wird (z. B. Buck and Smith, J. Clin. Micorbiol 25: 597-599). Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb ein Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen der Gattungen Helicobacter, Campylobacter, und Arcobacter, mit dem Ziel Zellschichten der gleichen Mikroorganismen und/oder spezifische Proteine von pharmazeutischem Interesse, die von den selbigen produziert werden, herzustellen und betrifft die Herstellung billiger Kulturmedien, welche für die primäre Isolierung von Mikroorganismen, die zu den vorstehend erwähnten Gattungen gehören, geeignet sind. Dies wird erreicht, indem ein Kulturmedium bereitgestellt wird, welches ein Cyclodextrin umfaßt.
- Gemäß einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft das Züchtungsverfahren die Züchtung von Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter lari, Campylobacter jejuni subsp. doylei, "Campylobacter upsaliensis", Campylobacter hyointestinalis, "Campylobacter fetus subsp. fetus", "Campylobacter fetus subsp. venerealis", "Arcobacter nitrofigilis", "Arcobacter cryaerophilus". Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Züchtung von Helicobacter pylori und die Herstellung eines etwa 130 kD- Proteins, welches mit der cytotoxischen und vacuolisierenden Aktivität assoziiert ist, sowie das Protein, welches Urease- Aktivität zeigt und welches vom gleichen Mikroorganismus synthetisiert wird.
- Gemäß einer noch spezifischeren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung fehlen. Blut und/oder Derivate davon gänzlich in dem Kulturmedium. Die Züchtung wird mit Medien durchgeführt, entweder fest oder flüssig, welche Cyclodextrine umfassen und gegebenenfalls Methylcellulose (welches zuvor für die Züchtung von Bordetella verwendet wurde siehe EP-A- 0239504). Im einzelnen werden Cyclodextrine, ausgewählt aus α- Cyclodextrin, β-Cyclodextrin und γ-Cyclodextrin, gegebenenfalls methyliert, verwendet. Gemäß einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung wird Dimethyl-O-β-cyclodextrin verwendet. Die Züchtungstemperatur kann von 30ºC bis 42ºC variieren, wird aber vorzugsweise bei 37ºC erhalten. Die Kulturmedien werden gerührt und unter mikroaerophilen Bedingungen in Anwesenheit von CO&sub2; und gegebenenfalls H&sub2; gehalten. Das 130kD-Cytotoxin kann durch Zentrifugation des Kulturmediums nach dem hierin offenbarten Verfahren aus der Biomasse extrahiert werden:
- Nach Waschen mit Phosphatpuffer, pH 7,4 (PBS) wird die Zellschicht mit einer 6M Guanidinium-HCl-PBS-Lösung bei Raumtemperatur unter Rühren behandelt. Nach Zentrifugation wird der Überstand gegen PBS dialysiert und stellt eine Fraktion dar, welche mit dem. 130 kD-Cytotoxin angereichert ist. Urease kann aus der gleichen Biomasse gemäß dem nachstehend berichteten Verfahren gereinigt werden:
- Der Rückstand aus bakteriellen Zellen wird in 0,25 M Glycin- HCl, pH 3, 5mM EDTA resuspendiert und 16 Stunden bei 37ºC inkubiert. Der nach Zentrifugation (12000 Upm, 5ºC für 30 Minuten in einer Beckman-Zentrifuge, ausgestattet mit einem JA 20-Rotor) erhaltene Überstand wird zu zwei Volumen absolutem Aceton gegeben und auf -20ºC gekühlt. Nachdem der Protein- Rückstand für 5 Stunden bei besagter Temperatur aufbewahrt wurde, wurde er durch Zentrifugation wie bereits beschrieben gesammelt und schließlich resuspendiert und gegen PBS dialysiert. Das erfindungsgemäße Verfahren hat nicht nur die Züchtung der vorstehend genannten Mikroorganismen und die Gewinnung der von ihnen hergestellten Proteine vereinfacht, sondern hat auch das Studium der biochemischen und physiologischen Merkmale (z. B. Motilität), wie auch der Chemosensitivität und der Pathogenität von H. pylori vereinfacht.
- H. pylori wird auf Petrischalen gezüchtet, welche 20 ml agarisiertes Kulturmedium Columbia Difco, modifiziert durch Zugabe von 1 g/l Dimethyl-O-β-cyclodextrin, enthalten. Die beimpften Platten werden in einer mikroaerophilen Atmosphäre bei hoher Luftfeuchtigkeit (etwa 95%) bei 37ºC 72 bis 96 Stunden inkubiert. Wenn die Zellschicht auf den Platten klar erkennbar ist, wird das Verfahren mit der Suspension der Bakterien in Brucella-Medien unter Verwendung eines Bausches aus steriler Baumwolle fortgeführt, bis eine optische Dichte erreicht ist, die äquivalent zu 9 McFarland ist. 5 ml dieser Suspension werden in einen 2000 ml-konischen Kolben überimpft, der 500 ml Brucella-Difco-Medium enthält, welches durch Zugabe von 1 g/l Dimethyl-O-β-cyclodextrin, 2,5 mg/l FeCl&sub2;, 2,5 mg/l Amphotericin B, 10 ml/l Trimethoprin, 5 mg/l Vancomycin und 5 U/ml Polymixin B modifiziert wurde. Weitere 5 ml werden in einen konischen Kolben der gleichen Größe wie vorstehend überimpft, welcher das gleiche Medium enthielt, wobei jedoch Cyclodextrin durch 50 g/l fötales Serum ersetzt wird. Die konischen Kolben werden 72 Stunden in einem Rotationsinkubator bei 200 Upm und 37ºC in mikroaerophiler Atmosphäre (N&sub2; 75%, CO&sub2; 10%, H&sub2; 10% und O&sub2; 5%) inkubiert. Nach besagter Inkubationszeit wird die optische Dichte bei 590 nm gemessen und eine Subkultivierung auf Columbia-Agar/Blut sowie eine Gram-Färbung durchgeführt, um die Reinheit der gleichen Kultur zu bestätigen. Die optische Dichte in dem konischen Kolben mit Cyclodextrin beträgt 7,8 und in dem mit fötalem Serum 4,8. Die Menge an feuchter Zellschicht, die nach Zentrifugation gewonnen wird, beträgt 8 g aus dem konischen Kolben mit Cyclodextrin und 5 g aus dem mit fötalem Serum. Zwei Proben, jeweils 5 g Zellschicht, gesammelt aus den Kulturen, welche wie vorstehend berichtet hergestellt wurden, entweder mit Cyclodextrin (CD) oder fötalem Serum (FS) wurden wie folgt behandelt:
- Nach Waschen mit 100 ml PBS wurden sie zentrifugiert (Beckman- Zentrifuge, ausgestattet mit einem JA 20-Rotor, 5000 Upm, 30 Minuten bei 4ºC). Die Zellschicht wurde mit 25 ml 6M Guanidinium-HCl-PBS-Lösung behandelt und 60 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Dann wurden die Suspensionen, wie vorstehend, zentrifugiert und die Überstände (20 ml für jede Probe) wurden 16 Stunden bei 4ºC gegen PBS dialysiert. Nach der Dialyse wurde eine weitere Zentrifugation durchgeführt, um unlösliches Material zu entfernen. Die Überstände stellen die Fraktionen dar, in welchen das Protein von etwa 130 kD angereichert ist, welches mit dem vacuolisierenden Toxin assoziiert ist.
- Wie in Fig. 1 gezeigt, sind die Mengen an dem Protein mit etwa 130 kD, die aus den beiden Zellschichten erhalten wurden, vergleichbar, jedoch mit einem Überschuß aus der Kultur, die unter Verwendung von Cyclodextrin erhalten wurde, von welcher eine größere Menge der Zellschicht gewonnen wurde.
- Die Flüssigkulturen von H-pylori, die wie in Beispiel 1 berichtet erhalten wurden, wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 25 ml 0,25 M Gylcin-HCl, 5mM EDTA, pH 3 resuspendiert und 16 Stunden ohne Schütteln bei 37ºC inkubiert. Diese Bakteriensuspension wurde durch Zugabe von 10 N NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt und nachfolgend bei 12000 Upm 30 Minuten bei 5ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde schnell in Eis/Wasser und 2 Volumen Aceton, vorgekühlt bei -20º, gekühlt. Die Suspension wurde 5 Stunden bei -20ºC gehalten und nachfolgend bei 12000 Upm zentrifugiert. Die gewonnenen Rückstände wurden in 5 ml PBS resuspendiert und gegen PBS 16 Stunden bei 4ºC dialysiert. Die resultierenden Proben stellen Fraktionen dar, in denen Urease angereichert ist (Fig. 2). Der Vergleich der Banden zeigt, daß die beiden Banden der Urease-Hauptuntereinheiten (66 und 29 kD) in beiden Proben nahezu gleich sind.
- 8 Stämme von H. pylori (CCUG 717874 und weitere sieben Stämme, welche aus gastrischen Biopsien isoliert wurden) wurden auf ihre Fähigkeit auf Columbia-Agar und auf Müller-Hinton-Agar zu wachsen, welcher entweder 1 g/l Dimethyl-O-β-cyclodextrin oder alternativ und als Vergleichswert, 50 g/l defibriniertes Pferdeblut enthält, getestet. Diese Kulturmedien wurden weiterhin in ihrer selektiven Form, die sie nach Zugabe von einer der beiden hierin nachfolgend berichteten chemotherapeutischen Gemischen erhalten haben, getestet:
- Gemisch A: 5 mg/l Vancomycin, 10 mg/l Trimethoprin, 5 mg/l Amphotericin B, 5 U/ml Polymixin.
- Gemisch B: wie Gemisch A, jedoch wird Polymixin durch 6 mg/l Cefsulodin ersetzt.
- Die Stämme, welche in Wilkins-Chalgren-Medium mit 20% Glycerol bei -80ºC gehalten wurden, wurden aufgetaut, auf Petrischalen mit Columbia-Agar, welcher 5% defibriniertes Pferdeblut enthält, überimpft und 72 Stunden bei 37ºC unter mikroaerophilen Bedingungen inkubiert. Dann wurde die Bakterienschicht jedes Stammes bis zu einer optischen Dichte von etwa 6 McFarland in Brucella-Medium suspendiert. 10 ul bakterielle Suspension wurde auf jede Platte überimpft und mit dem Verfahren der Isolierung ausgestrichen. Die Platten wurden wie vorstehend inkubiert und nach 5 bis 7 Tagen betrachtet. Die. Kolonien, welche sich auf dem Medium entwickelten, welches Cyclodextrin enthielt, mit oder ohne Antibiotikum, wurden etwa 2 mm groß, traten hervor, waren undurchsichtig, regelmäßig geschnitten und von butterartiger Konsistenz. Die Merkmale besagter Kolonien unterschieden sich nicht von denjenigen auf Medium, welches Blut enthielt.
- Die Kolonien auf Medium mit entweder Cyclodextrin oder Blut zeigten in den nachfolgenden Tests die gleichen Ergebnisse, die der jeweiligen Art eigen sind: Gram-negative Färbung; positiv für Oxidase, Katalase und Urease; Reduktion von Nitrat zu Nitrit; negativ für Hippurat-Hydrolyse; positiv für Leucinaryl-Amidase, Gammaglutamyl-Transpeptidase, saure Phosphatase und Indoxylacetat.
- Sensitivitätstests von H. pylori für Chemotherapeutika wurden mit Columbia-Agar, der Dimethyl-o-β-cyclodextrin enthielt, durchgeführt. Die acht Stämme, die in Beispiel 3 beschrieben sind, wurden getestet.
- Die Chemotherapeutika, die nach dem Kirby-Bauer-Verfahren getestet wurden, waren die folgenden: Ampicillin (10 ug- Flachtablette), Erythromycin (15 ug-Flachtablette), Clindamycin (2 ug-Flachtablette), Metronidazol (100 ug- Tabletten), Kolloidales Wismutsubcitrat (De Nol) (100 ug-Flachtabletten) Metronidazol wurde auch mit dem Verfahren getestet, das als E- Test bezeichnet wird (AB Biodisk Solna Schweden).
- Die. Tests wurden auf Columbia-Agar mit entweder 0.1% Cyclodextrin oder 5% defibriniertem Pferdeblut durchgeführt. 80 ml des vorstehend erwähnten festen Kulturmediums wurden in 150 mm-Petri-Schalen gegeben. Die Stämme wurden in Brucella- Medium zu einer optischen Dichte von 4 Mc Farland suspendiert und nachfolgend mit einem sterilen Baumwollbausch auf den Platten verteilt. Nachdem die Scheiben und Streifen plaziert worden waren, wurden die Platten 3-5 Tage in mikroaerophiler Atmosphäre, bei hoher Luftfeuchtigkeit und 37ºC gehalten. Nach dieser Zeit werden die Hemmhöfe der verschiedenen Chemotherapeutika und die minimale hemmende Konzentration ("minimum inhibiting concentration", MIC) von Metromidazol auf den Platten, welche Medium mit Cyclodextrin enthielten, mit denjenigen mit defibriniertem Pferdeblut verglichen. Die Höfe erwiesen sich als überlappend.
- Unter Verwendung der acht Stämme, die in Beispiel 3 offenbart sind, wurden Beweglichkeitstests auf Soft-Agar durchgeführt. Der Soft-Agar wurde hergestellt, indem vor der Sterilisation 5 g DIFCO-Agar pro Liter Brucella-Medium zugegeben wurden. Die zu vergleichenden Medien waren die, die jeweils entweder 0,1% Cyclodextrin oder 10% Hitze-inaktiviertes fötales Kälberserum enthielten.
- Die Überimpfung wurde durchgeführt, indem man den Ring, der die Bakterienschicht enthielt, welche von einer Agar-Platte, die 0,1% Cyclodextrin enthielt, entnommen worden war, etwa 2 mm eingetaucht wurde. Nach Überimpfung wurden die Platten unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 4, inkubiert und nach 5 Tagen betrachtet. Von den acht getesteten Stämmen zeigten 6 Diffusion ins Innere des Agar beider Medien, was Beweglichkeit anzeigt, wohingegen die beiden anderen keinerlei Diffusion in beiden Medien zeigten.
- Proben von 10 Patienten, die sich einer diagnostischen Gastroskopie auf Dyspepsie unterzogen hatten, wurden getestet. Von jedem Patienten wurden 5 Biopsieproben aus der Magenhöhle gesammelt: eine für den histologischen Test; eine für die Züchtung auf Columbia-Agar, welcher 0,1% Dimethyl-o-β- cyclodextrin, 5 mg/l Vancomycin, 10 mg/l Trimethoprim, 6 mg/l Cefsulodin, 5000 U/l Polymixin und 5 mg/l Amphotericin B enthielt; eine für die Züchtung auf Columbia-Agar, welcher 5% defibriniertes Blut und das vorstehend beschriebene Gemisch von Chemotherapeutika enthielt; eine für den bakterioskopischen Test nach Färbung der Biopsie-Ausstriche auf Objektträgern mit Acridin-Orange; eine für die Bestimmung der Urease-Aktivität.
- Die Platten wurden in einer mikroaerophilen Atmosphäre bei 37ºC inkubiert und nach 48 h und täglich während 7 Tagen getestet.
- Die vermuteten Kolonien wurden als H. pylori identifiziert, indem man das Verfahren, welches in Beispiel 3 offenbart ist, verwendete.
- H. pylori wurde in 5 Fällen isoliert: in drei Fällen auf beiden Medien, in einem Fall nur auf Cyclodextrin-Medium und in einem weiteren Fall nur auf Blut-Medium. Die H. pylori- Kolonien auf Columbia-Agar mit Cyclodextrin waren bereits nach 48 h gut sichtbar; am fünften Tag waren die Größen der Kolonien ähnlich denjenigen, die sich auf Columbia-Agar mit Blut entwickelten. Die Selektivität beider Medien betreffend H. pylori begleitender Bakterien in der gleichen Biopsieprobe erwies sich für beide Medien als gleich. Diese Experimente bestätigen, daß Medium mit Cyclodextrin für die primäre Isolierung von H. pylori aus gastrischen Biopsien geeignet ist.
- Die Fig. 1 und 2 zeigen die Ergebnisse der Elektrophorese, die mit den Zellschichten aus Beispiel 1 bzw. Beispiel 2 erhalten wurde (Bahn CD in jeder Figur), im Vergleich mit den Zellschichten, die mit traditionellem Medium erhalten wurden (die Bahnen SF). Bahn C in beiden Figuren gibt die Standards zur Bestimmung des Molekulargewichts an. Die Elektrophorese wurde nach dem Verfahren von Laemmli U. K., unter Verwendung einer Mini-Protean 2 BioradR-Elektrophorese-Einheit, in einem 7% SDS-PAGE-Minigel bei 200 V für 45 min durchgeführt. Die Protein-Banden wurden mit CoomassieR R-250 gefärbt.
Claims (9)
1. Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen der Gattungen
Helicobacter, Campylobacter und Arcobacter, wobei das
Kulturmedium ein Cyclodextrin umfaßt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Cyclodextrin
gegebenenfalls methyliertes α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin
oder γ-Cyclodextrin ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Cyclodextrin
Dimethyl-O-β-cyclodextrin ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das
Kulturmedium ferner Methylcellulose umfaßt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei
Fermentationstechniken verwendet werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei feste
Medien verwendet werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der
gezüchtete Mikroorganismus Helicobacter pylori ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der
gezüchtete Mikroorganismus Campylobacter jejuni,
Campylobacter coli, Campylobacter lari, Campylobacter jejuni
subsp. doylei, Campylobacter upsaliensis, Campylobacter
hyointestinalis, Campylobacter fetus subsp. fetus oder
Campylobacter fetus subsp. venerealis ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der
gezüchtete Mikroorganismus Arcobacter nitrofigilis oder
Arcobacter cryaerophilus ist.
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