HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Bereich der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Sequenzanalyse des C-terminalen Fragments eines Peptids, wobei
Fragmente ausgehend vom Carboxylterminus (im folgenden als C-
Terminus bezeichnet) eines Proteins oder Peptids abgespalten und
gesammelt und nachfolgend einer Aminosäuresequenzanalyse
unterzogen werden.
Diskussion des Standes der Technik
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Konventionelle Verfahren zur C-terminalen Peptidanalyse
umfassen das Hydrazinolyseverfahren und das
Carboxypeptidaseverfahren. Das Carboxypeptidaseverfahren, welches auf der Wirkung
verschiedener Arten von Carboxypeptidasen zum
aufeinanderfolgenden Spalten von Peptidbindungen ausgehend vom Carboxylterminus
des Polypeptids beruht, weist einige Nachteile, wie komplexe
Arbeitsvorgänge, das Erfordernis eines relativ großen
Probenvolumens und unzuverlässige Sequenzierungsergebnisse, auf.
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Als modifiziertes Verfahren, welches diese Nachteile nicht
aufweist, offenbart die Japanische Patentoffenlegung Nr. 235600
/1989 ein Verfahren, in dem ein Peptid mit einem Lys-C
spezifischen Spaltenzym gespalten, jedes entstandene Fragment an einen
festen Träger mit einer funktionellen Gruppe, die mit der α-
Aminogruppe und -Aminogruppe des Fragments zur Bildung einer
kovalenten Bindung reagieren kann, gebunden, dann die
Peptidbindung zwischen dem α-aminoterminalen Aminosäurerest jedes
Fragments und dem benachbarten Aminosäurerest durch Säurebehandlung
gespalten und ein C-terminales Peptid in einer freien Form
gesammelt wird. Die gleiche Veröffentlichung offenbart außerdem,
daß das so erhaltene C-terminale Peptid durch verschiedene
Aminosäuresequenzanalyseverfahren für eine Aminosäuresequenzanalyse
verwendet werden kann.
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Jedoch bestehen, wenn dieses Verfahren zur Fragmentsammlung
verwendet wird, immer noch einige Probleme bei der Analyse der
Aminosäuresequenz. Im besonderen ist bekannt, daß hydrophobe
Peptide mit relativ kurzer Kette, die aus nicht mehr als etwa 10
Aminosäuren besteht, im besonderen Peptide mit einer hydrophoben
Aminosäure am C-Terminus, schwierig mit Polybren oder anderen
mehrwertigen Ionenträgern, die in der
Gasphasenproteinsequenzierungsvorrichtung verwendet werden, abzufangen sind, und aus
diesem Grund leicht ein Auswaschen der Probe stattfindet, was
die Beendigung der Aminosäuresequenzanalyse behindert.
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Außerdem gab es keine Peptidfragmentsammelvorrichtung.
Konventionelle Sammelvorrichtungen sind wie beispielhaft in
Fig. 3 dargestellt aufgebaut. Im einzelnen werden die
Reagenzien 31 und 32 zu einer Probe, die sich in einem Reaktor (Säule)
R befindet, gegeben, um Spaltung oder Abbau der Probe in dem
Reaktor durchzuführen, und die gespaltene (abgebaute) Probe wird
an eine Wiedergewinnungsflasche 12 oder
Abfallflüssigkeitsflasche 13 abgegeben, die jeweils stromabwärts des Reaktors R
angeordnet sind.
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In diesem Fall wird der Wechsel zwischen der
Wiedergewinnungsflasche 12 und der Abfallflüssigkeitsflasche 13 durch die
Betätigung des Ventils V erreicht. In Fig. 3 stellen V&sub1; ein
Zweiwegventil (Durchgangsventil) und V&sub2; und V&sub3; jeweils ein
Dreiwegventil dar. Die Reagenzien 31 und 32 werden durch den Druck
eines inerten Gases zugeführt. In den oben dargestellten
konventionellen Sammelvorrichtungen wird die Abgabe der Probe durch
die Betätigung eines Ventils erreicht; aus diesem Grund kann es
zu Kontamination kommen, wenn ein Totvolumen in einem Ventil
vorliegt.
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Wenn außerdem ein Reagens oder eine Probe verwendet wird,
welche nach dem Trocknen ausfällt, wie Hanstoff, ist es nicht
wünschenswert, diese durch Ventile zu leiten, da sie in den
Ventilen ausfallen. Ein derartig begrenzender Faktor macht es
unmöglich, eine Peptidspaltungsreaktion durchzuführen und die
Peptidfragmente unter Verwendung von derartigen konventionellen
Sammelvorrichtungen zu sammeln.
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Außerdem kann, wenn der Reaktor mit einem Packungsmaterial
gefüllt ist, das Packungsmaterial stromabwärts ausfließen und
die Ventile beschädigen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, die obigen
Probleme zu lösen und ein Verfahren zur Analyse C-terminaler
Peptidfragmente zur Verfügung zu stellen, welches vollständige
und effiziente Analyse der Aminosäuresequenz bis zum C-Terminus
des Peptids ermöglicht.
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Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Sequenzanalyse C-terminaler Peptidfragmente, welches das
Spalten eines Peptids mit einem Lys-C spezifischen Spaltenzym,
das Umsetzen jedes entstandenen Fragments mit einem festen
Träger, welcher eine funktionelle Gruppe aufweist, die mit der α-
Aminogruppe jedes Fragments und der -Aminogruppe von Lys
reagieren kann, um mit diesen eine kovalente Bindung zu bilden, das
Spalten der Peptidbindung zwischen dem α-Aminosäurerest jedes
Fragments und dem benachbarten Aminosäurerest durch
Säurebehandlung, das Sammeln eines freien carboxylterminalen (C-terminalen)
Fragments, welches keine -Aminogruppe aufweist, und das
Analysieren der Aminosäuresequenz umfaßt. Die vorliegende Erfindung
ist dadurch gekennzeichnet, daß das Sammeln der Fragmente in den
obigen Stufen auf einer allylamingruppenderivatisierten
Polymermembran oder auf einem allylamingruppenderivatisierten
Glasfaserfilterpapier durchgeführt wird, das gesammelte C-terminale
Fragment als solches auf der Polymermembran oder dem
Glasfaserfilterpapier unter Verwendung von wasserlöslichem Carbodiimid
immobilisiert wird und das erhaltene immobilisierte Produkt
direkt Aminosäuresequenzanalyse unterworfen wird.
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Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Peptide, welche
reich an hydrophoben Gruppen in ihrem C-Terminus und deshalb
schwer mit mehrwertigen Ionenträgern, wie Polybren, die
gewöhn
lich in Gasphasensequenzierungsvorrichtungen verwendet werden,
aufzufangen sind, vollständig bis zu ihrem C-Terminus analysiert
werden. Außerdem kann Aminosäuresequenzanalyse durchgeführt
werden, auch wenn die Menge an C-terminalen Fragmenten sehr
gering ist (nicht mehr als 10 pmol). Des weiteren sind die Risiken
der Kontamination und des Verlustes an Material sehr gering, da
das Sammeln und die Immobilisierung der Fragmente in der
gleichen Flasche durchgeführt werden können.
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Außerdem erfordert die Vorrichtung zum Sammeln des
Peptidfragments (im folgenden als Sammelvorrichtung bezeichnet),
welche bevorzugt in der vorliegenden Erfindung verwendet wird,
keine Ventilbetätigung, weshalb kein Totvolumen stromabwärts der
Reaktorsäule auftritt. Demgemäß ist diese Sammelvorrichtung für
das erfindungsgemäße Verfahren geeignet, da es derartige
Probleme, wie Kontamination, nicht aufweist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden
Zeichnungen, welche ausschließlich der Veranschaulichung dienen
und somit die vorliegende Erfindung nicht einschränken, besser
verständlich, wobei:
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Fig. 1 eine schematische Darstellung des chemischen
Verfahrens zur Trennung der C-terminalen Peptidfragmente der
vorliegenden Erfindung ist.
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Fig. 2 ist eine schematische Darstellung der in der
vorliegenden Erfindung verwendeten Vorrichtung.
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Fig. 3 ist eine schematische Darstellung einer
konventionellen Sammelvorrichtung.
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Fig. 4 ist ein schematisches Diagramm einer Vorrichtung
zum Sammeln und Immobilisieren C-terminaler Fragmente in der
vorliegenden Erfindung.
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Die Bezugsziffern in den Fig. 2 bis 4 bezeichnen
folgende Elemente:
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Die Elemente 2 und 3 sind Dreiwegventile, die Elemente 1,
4, 5, 6 und 7 Zweiwegventile, das Element 8 eine Reaktionssäule,
das Element 9 eine Verteilleitung, die Elemente 10 und 11
Reagensreservoirs, die Elemente 12 und 12'
Wiedergewinnungsflaschen, die Elemente 13 und 13' Flaschen für Abfallflüssigkeit, das
Element 21 ein Reaktionsgefäß, das Element 23 ein Fließweg für
die Reaktionsmischung, das Element 24 eine N&sub2;-Abführleitung, das
Element 25 eine Membran, das Element 31 das Reagens 1, das
Element 32 das Reagens 2, das Element a (a1, a2, a3 und a4)
Gaszuführleitungen, das Element b (b1 und b2) Reagenszuführleitungen,
das Element c ein Reagenszuführfließweg, das Element d ein
Abflußweg für die Reaktionsmischung, das Element e ein
Wiedergewinnungsfließweg, das Element f ein Fließweg für
Abfallflüssigkeit, das Element g (g1 und g2) Ausströmleitungen das Element R
ein Reaktor, das Element V&sub1; ein Zweiwegventil und die Elemente V,
V&sub2; und V&sub3; Dreiwegventile.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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In der vorliegenden Erfindung ist das Lys-C-spezifische
Spaltenzym als ein Enzym definiert, welches spezifisch
Peptidbindungen an der C-terminalen Seite von Lys-Resten in dem Peptid
spaltet. Zu derartigen Enzymen gehören API (Achromobacter
lyticus-Protease I) und Endoproteinase Lys-C (Handelsbezeichnung,
hergestellt von Boehringer Mannheim), sie sind jedoch nicht
darauf beschränkt, so lang sie die oben beschriebene Wirkung
aufweisen.
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Bei der funktionellen Gruppe, die mit der Aminogruppe zur
Bildung einer kovalenten Bindung reagieren kann, handelt es sich
in der vorliegenden Erfindung beispielsweise um die Imidgruppe,
die Aldehydgruppe, die Cyanogruppe, die Acetylgruppe, die
Succinylgruppe, die Maleylgruppe und die Isothiocyanatgruppe, wobei
die Isothiocyanatgruppe hinsichtlich ihrer spezifischen
Reaktivität mit der Aminogruppe und der spezifischen Spaltung nach der
Bindung bevorzugt ist. Der feste Träger, welcher eine derartige
funktionelle Gruppe aufweist, ist ein fester Träger aus einem
Material, wie porösem Glas, Kieselsäuregel oder Polystyrol,
wobei beispielhaft DITC-Polystyrol genannt wird.
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Obwohl die in der vorliegenden Erfindung zur
Säurebehandlung verwendete Säure nicht begrenzt ist, ist Trifluoressigsäure
(TFA) aufgrund ihrer hohen Flüchtigkeit, hohen Reaktivität und
des geringen Auftretens von Nebenreaktionen bevorzugt.
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Das chemische Verfahren zur Trennung der C-terminalen
Peptidfragmente in der vorliegenden Erfindung ist in Fig. 1
dargestellt.
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In der vorliegenden Erfindung dient als Beispiel für die
Polymermembran, welche mit der Aminogruppe derivatisiert ist,
eine Allylaminmembran PVDF (Polyvinylidendifluorid) (Sequeleon-
AATM, hergestellt von MilliGen). Der mit der Aminogruppe
derivatisierte Glasfaserträger als Material für das
Glasfaserfilterpapier ist beispielsweise Aminopropylglas oder Aminophenylglas.
Die Größe der Polymermembran, beispielsweise bevorzugt 8 bis 10
mm Durchmesser, ist nicht begrenzt, so lang die Polymermembran
als solche in der Wiedergewinnungsflasche zum Sammeln der
Fraktionen befestigt und als solche in der Reaktionskammerpatrone
der Sequenzierungsvorrichtung untergebracht werden kann.
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Im folgenden wird die Peptidfragmentsammelvorrichtung,
welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann,
detailliert beschrieben.
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Als Reaktor, der in der Peptidfragmentsammelvorrichtung
verwendet wird, dient beispielsweise ein Reaktor, welcher einen
festen Träger enthält, an den der Aminoterminus des Peptids
gebunden wurde. Jedoch ist dieser nicht hierauf beschränkt;
verschiedene Reaktoren, wie
Flüssigchromatographie-Trennungssäulen und Peptidsynthesereaktionssäulen, können zu diesem Zweck
verwendet werden.
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Eine Anzahl von Flaschen, die stromabwärts des Reaktors
angeordnet sind, können sowohl für wiedergewonnene Flüssigkeit
als auch für Abfallflüssigkeit verwendet werden. Es ist außerdem
möglich, den Typ zu verwenden, in dem Wiedergewinnungsflaschen,
die auf einer Drehscheibe angeordnet sind, der Reihe nach
gedreht werden.
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Die Zweigleitung kann von jeglichem Typ sein, so lange sie
den Fluß des Fluids von dem Reaktor zu dem Fließweg jeder
Flasche trennen kann; es handelt sich beispielsweise um eine
Verteilleitung.
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Die Druckanlegungsmittel dienen dem Anlegen eines Drucks
ausgehend von dem Stromabwärtsbereich der Zweigleitung auf den
Fließweg jeder der Flaschen, um den Druck in dem Fließweg höher
als den Druck des Fluids, das aus dem Reaktor ausfließt, zu
halten; es handelt sich beispielsweise um einen Zylinder mit
inertem Gas, der mit einer Steuerung ausgestattet ist. Der Druck
kann auf einen oder mehreren Fließwege, durch die das Fluid
nicht fließen soll, d. h., die Fließwege, die zu den Flaschen
führen, in denen das Fluid nicht gesammelt werden soll, angelegt
werden.
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Wie oben dargelegt, ermöglicht die Verwendung einer
derartigen Peptidfragmentsammelvorrichtung, durch Anlegen eines
Gasdrucks in der entgegengesetzten Richtung zu dem Fluß, auf den
Fließweg, durch den das Fluid nicht fließen soll, das Fluid nur
zu einem ausgewählten Fließweg/Fließwegen fließen zu lassen.
BEISPIELE
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Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand der
folgenden Arbeitsbeispiele, auf die die vorliegende Erfindung
jedoch nicht beschränkt ist, detaillierter beschrieben.
Beispiel 1
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Fig. 2 ist eine schematische Darstellung einer
Peptidfragmentsammelvorrichtung, in der die Bezugsziffer 8 eine
Reaktionssäule (einen Reaktor) darstellt. Die Reaktionssäule ist mit
einem festen Träger, der eine funktionelle Gruppe aufweist
(beispielsweise einem porösen Glas, in welches die
Isothiocyanatgruppe eingeführt wurde), die an Aminosäurereste gebunden ist,
die mit einem Enzym (beispielsweise Lysylendopeptidase)
behandelt wurden, gepackt.
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Stromaufwärts der Reaktionssäule 8 sind die
Reagensreservoirs 10 und 11 angeordnet. Im Falle einer Sammelvorrichtung für
C-terminale Peptidfragmente enthalten die Reagensreservoirs 10
und 11 ein Detergens bzw. ein Spaltungsagens (beispielsweise
Trifluoressigsäure). Diese Reagensreservoirs 10 und 11 sind fest
verschlossene Flaschen, die jeweils zwei Leitungen (a1 und b1/
a2 und b2), eine für die Gaszuführung (a1, a2) und die andere
für die Zuführung von Reagens (b1, b2) aufweisen. Die
Reagenszuführleitungen b1 und b2 sind über die Dreiwegventile 2 und 3 mit
einem Reagensfließweg c verbunden.
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Die Gaszufuhrleitungen a1 und a2 sind mit einer Leitung a
von einer (nicht gezeigten) inerten Gasquelle verbunden. Die
Leitung a ist mit einem Reagenszufuhrfließweg c über ein
Zweiwegventil 1 verbunden, um das direkte Anlegen von Gasdruck auf
die Reaktionssäule 8 zu ermöglichen.
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Stromabwärts der Reaktionssäule 8 ist eine Verteilleitung
9 angeordnet, mit der ein Reaktionsmischungsabführfließweg d,
ein Wiedergewinnungsfließweg e und ein
Abfallflüssigkeitsfließweg f separat verbunden sind.
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Ein Ende des Wiedergewinnungsfließweges e und ein Ende des
Abfallflüssigkeitsfließweges f sind in einer
Wiedergewinnungsflasche 12' vom geschlossenen Typ bzw. einer
Abfallflüssigkeitsflasche 13' vom geschlossenen Typ untergebracht. In der
Wiedergewinnungsflasche 12' und der Abfallsflüssigkeitsflasche 13'
sind Gaszufuhrleitungen a3 und a4 bzw. Ausströmleitungen g2 und
g1 untergebracht. Die Gaszufuhrleitungen a3 und a4 sind auf die
gleiche Weise wie oben über Zweiwegventile 4 und 5 mit einer
Leitung a von einer (nicht gezeigten) inerten Gasquelle
verbunden. In Fig. 2 bezeichnen die Bezugsziffern 6 und 7 ein
Zwei
wegventil.
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Mit dieser Anordnung wird die Abfallflüssigkeit
folgendermaßen abgeführt:
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Stufe 1: Zum Schicken der abzuführenden Flüssigkeit von der
Reaktionssäule 8 zu der Abfallflüssigkeitsflasche 13' werden die
Ventile 4 und 6 geöffnet und die Ventile 5 und 7 geschlossen.
Das Gas von der inerten Gasquelle passiert das Zweiwegventil 4
und tritt in die Gaszufuhrleitung a3 und anschließend in die
Wiedergewinnungsflasche 12' ein, wonach es den
Wiedergewinnungsfließweg e, die Verteilleitung 9 und dann den
Abfallflüssigkeitsfließweg f passiert und in die Abfallflüssigkeitsflasche
13' eintritt. Das Gas, welches in die Abfallflüssigkeisflasche
13' eintritt, wird durch die Ausströmleitung g1 und das
Zweiwegventil 6 abgeführt.
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Stufe 2: Wenn das Dreiwegventil 2 unter den obigen
Bedingunen geöffnet (in Fig. 2 durch eine gepunktete Linie
angezeigt) und das Dreiwegventil 3 geschlossen ist (in Fig. 2 durch
eine durchgehende Linie angezeigt), wird die Flüssigkeit in dem
Reagensreservoir 10 durch die Reagenszufuhrleitung b1 und
anschließend den Reagenszufuhrfließweg c durch den Druck auf der
Oberfläche der Reaktionssäule 8 zugeführt, wonach sie durch den
Reaktionsmischungsabführfließweg d die Verteilleitung 9
erreicht. Da die Verteilleitung 9 von der Wiedergewinnungsflasche
12' unter Druck steht, tritt die gesamte Flüssigkeit, die die
Verteilleitung erreicht, in die Abfallflüssigkeitsflasche 13'
ein.
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Stufe 3: Nach Stufe 2 wird das Dreiwegventil 2 geschlossen
und das Zweiwegventil 1 geöffnet. Die Zufuhr der Flüssigkeit in
dem Reagensreservoir 10 wird gestoppt, der Gasdruck von der
inerten Gasquelle wird direkt an die Reaktionssäule 8 angelegt,
und die gesamte Flüssigkeit von der Reaktionssäule 8 tritt in
die Abfallflüssigkeitsflasche 13' ein.
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Als nächstes wird die Flüssigkeit folgendermaßen
wiedergewonnen:
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Stufe 4: Zunächst werden die Ventile 5 und 7 geöffnet und
die Ventile 4 und 6 geschlossen. Das Gas von der inerten
Gasquelle passiert das Zweiwegventil 5 und tritt in die
Gaszufuhrleitung a4 und abschließend in die Abfallflüssigkeitsflasche 13'
ein, wonach sie über den Abfallsflüssigkeitsfließweg f die
Verteilleitung 9 und dann den Wiedergewinnungsfließweg e passiert
und in die Wiedergewinnungsflasche 12' eintritt. Das Gas,
welches in die Wiedergewinnungsflasche 12' eintritt, wird durch die
Ausströmleitung g2 und das Zweiwegventil 7 abgeführt.
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Stufe 5: Wenn das Dreiwegventil 3 unter den obigen
Bedingungen geöffnet ist, wird die Flüssigkeit in dem
Reagensreservoir 11 durch die Reagenszufuhrleitung b2 und anschließend den
Reagenszufuhrfließweg c durch den Druck auf der Oberfläche der
Reaktionssäule 8 zugeführt, wonach sie die Verteilleitung 9
durch den Rekationsmischungsabführfließweg d erreicht. Da die
Verteilleitung 9 unter Druck von der Wiedergewinnungsflasche 13'
steht, tritt die gesamte Flüssigkeit, die die Verteilleitung 9
erreicht, in die Wiedergewinnungsflasche 12' ein.
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Stufe 6: Nach Stufe 5 werden die Dreiwegventile 2 und 3
geschlossen und das Zweiwegventil 1 geöffnet. Die Zufuhr der
Flüssigkeit in dem Reagensreservoir 11 wird gestoppt, der
Gasdruck von der inerten Gasquelle direkt an die Reaktionssäule 8
angelegt, und die gesamte Flüssigkeit von der Rekationssäule 8
tritt in die Wiedergewinnungsflasche 12' ein.
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Mit dem oben beschriebenen Aufbau werden die Flüssigkeiten
in den Reagensreservoirs 10 und 11 direkt der Reaktionssäule
über den Fließweg c zugeführt. Alternativ können zwischen dem
Dreiwegventil 3 und der Reaktionssäule 8 ein Meßröhrchen und ein
Flüssigkeitssensor angeordnet sein, um eine Probeentnahme mit
konstantem Volumen zu ermöglichen.
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Mit der Peptidfragmentsammelvorrichtung gemäß Fig. 2 ist
es möglich, ein Fließwegsystem zur Verfügung zu stellen, in dem
kein Totvolumen stromabwärts der Reaktionssäule vorliegt, da das
Fluid ohne Verwendung eines Ventils abgegeben werden kann.
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Des weiteren begrenzt die vorliegende Erfindung nicht die
zu verwendenden Reagenzien, und es ist außerdem möglich, ein
Fließwegesystem zur Verfügung zu stellen, welches
versehentliches Auslaufens von Packungsmaterial aus der Reaktionssäule
aushalten kann.
Beispiel 2
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Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren zur
Analyse von C-terminalen Peptidfragmenten mit Bezug auf Fig. 4
beschrieben.
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Fig. 4 ist ein schematisches Diagramm einer Vorrichtung
zum Sammeln und Immobilisieren C-terminaler Fragmente in der
vorliegenden Erfindung.
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Zunächst wurde das gewünschte Peptid bei einer
Reaktionstemperatur von 37ºC mit einem Lys-C spezifischen Spaltenzym
gespalten, wonach die entstandenen Fragmente mit einem festen
Träger, welcher eine funktionelle Gruppe aufweist, die mit der
α-Aminogruppe und der -Aminogruppe von Lys reagieren kann und
mit diesen eine kovalente Bindung bildet (beispielsweise DITC-
Polystyrol), umgesetzt. Die Kupplungsreaktion zwischen dem
festen Träger und den Peptidfragmenten, die aus der Spaltung durch
die obige Enzymbehandlung resultierten, wurde bei einer
Reaktionstemperatur von 48ºC bis 50ºC für etwa 1 Stunde
durchgeführt. Diese Reaktion wird bevorzugt in der Reaktionssäule 8
durchgeführt, welche in einem Reaktionsgefäß 21 angeordnet ist,
welches mit einer Heizvorrichtung ausgestattet ist, um optimale
Reaktionsbedingungen zu schaffen. Nach Beendigung der
Kupplungsreaktion wurde der feste Träger gewaschen und einer
Säurebehandlung unterzogen. Die Säurebehandlung wurde mit
Trifluoressigsäure (TFA) in einer Stickstoffatmosphäre bei einer
Reaktionstemperatur von 30ºC bis 50ºC, bevorzugt bei 48ºC, für 15
Minuten durchgeführt.
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Nach Beendigung der Reaktion wurde die TFA durch Trocknen
entfernt. Als nächstes wurde die Reaktionsmischung in der
zylin
drischen Wiedergewinnungsflasche 12', welche eine Polymermembran
25 (oder ein Glasfaserfilterpapier) in ihrem unteren Bereich
aufwies, wiedergewonnen, wobei die Membrangröße zu der
Reaktorgröße der Sequenzierungsvorrichtung der Analysevorrichtung, die
für die nachfolgende Aminosäuresequenzanalyse verwendet wurde,
paßte. Während die Rekationsmischung durch einen
Rekationsmischungsfließweg 23 zu der Wiedergewinnungsflasche 12' geschickt
wurde, wurde die Wiedergewinnungsflasche 12' mit N&sub2;-Gas aus einer
N&sub2;-Ausblasleitung 24 versetzt, wodurch die Reaktionslösung
(wiedergewonnene Lösung), in der ausschließlich die C-terminalen
Peptidfragmente gelöst worden waren, bis zur Trockenheit
eingedampft wurden. Das Material für die Wiedergewinnungsflasche 12'
war Polypropylen oder ein anderes Material, welches keine
unspezifische Adsorption verursacht.
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In den obigen Verfahren kann die Sammelvorrichtung für C-
terminale Peptidfragmente von Beispiel 1 verwendet werden.
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Während die Membran 25 in der Wiedergewinnungsflasche 12'
belassen wurde, wurde 30- bis 50%iges Acetonitril (nicht mehr
als 30 ul) zu der Wiedergewinnungsflasche 12' gegeben. Die
Wiedergewinnungsflasche 12' wurde in einen Heizblock gestellt und
bei 55ºC erwärmt. Nachdem die Temperatur der
Wiedergewinnungsflasche 12' auf Raumtemperatur abgesunken war, wurden 15 ul
einer Reagenslösung [0,1 M 4-Morpholinethansulfonsäure (MES), pH
5,0, 15% Acetonitril, 10 mg/ml wasserlösliches Carbodiimid
(EDC)] zugegeben. Die Wiedergewinnungsflasche wurde für 20
Minuten stehen gelassen und dann die Membran 25 herausgenommen, mit
Acetonitril gewaschen und getrocknet. Danach wurde sie der
Sequenzierungsvorrichtung zugeführt.
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Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können die Risiken der
Kontamination minimiert werden, da die Aminosäuresequenzanalyse
durch direktes Plazieren der Polymermembran oder des
Glasfaserfilterpapiers, auf welchen die C-terminalen Fragmente durch das
oben beschriebene Verfahren immobilisiert wurden, in den Reaktor
einer Aminosäuresequenzanalysevorrichtung (beispielsweise einer
Gasphasensequenzierungsvorrichtung) eingeleitet wird.
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Obwohl die vorliegende Erfindung auf diese Weise
beschrieben wurde, ist es offensichtlich, daß sie auf verschiedene Weise
variiert werden kann. Derartige Variationen sind nicht als eine
Abweichung von den Modifikationen, die für einen Fachmann auf
dem Gebiet offensichtlich sind, zu betrachten und befinden sich
im Bereich der folgenden Ansprüche.