DE69227493T2

DE69227493T2 - Verwendung eines Mittels zur Verformung von Hepatozyten-Sphäroiden und Verfahren zur Züchtung von Hepatozyten für Sphäroid-Bildung

Info

Publication number: DE69227493T2
Application number: DE69227493T
Authority: DE
Inventors: Koji Nagoya-Shi Aichi 468 Kimata; Norio Okayama-Shi Okayama 700 Koide; Toshikazu Moriyama-Ku Nagoya-Shi Aichi 463 Yada
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1991-08-30
Filing date: 1992-08-28
Publication date: 1999-05-06
Anticipated expiration: 2012-08-29
Also published as: DE69227493D1; FI923874A; NO923376D0; EP0529659B1; ATE173012T1; EP0529659A2; AU2138592A; CA2077175A1; JP3199405B2; EP0529659A3; US5624839A; FI923874A0; AU654376B2; JPH05236951A; NO923376L; KR100191363B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Mittels zur Ausbildung von Hepatocytenspheroiden, die als künstliche Leberfunktionsmittel dienen, und ein kovalent an Lipid-gebundenes Glycosaminglycan umfassen, und ein Verfahren zur Bildung der Spheroide, das die Kultivierung von Hepatocyaten in einem Gefäß in Gegenwart eines Mittels als Kultursubstrat umfaßt.

Hintergrund der Erfindung

Die Leber ist ein wichtiges Organ, das am Metabolismus teilnimmt, und die Leberfunktion hat ihren Ursprung aus Hepatocyten, die ca. 70% der Leber einnehmen. Eine solche Funktion wird nicht nur durch die Hepatocyten bewirkt, sondern durch ihre Wechselwirkungen mit nicht-parenchym- Zellen und extrazellurar Matrix, und durch die Konstruktion von auf diesen Wechselwirkungen basierendem Gewebe. Mit anderen Worten werden die biologischen Aktivitäten der Leber im lebenden Körper durch die Bildung von Spheroiden bewirkt, in denen Hepatocyten aneinander haften.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldungen der vorliegenden Anmeldung haben Untersuchungen zum Verfahren zur Kultivierung von Hepatocyten zur Bildung von Spheroiden unternommen, die ihre Funktion erhalten, und entdeckt, daß Substanzen, die zur Rekonstitution des Morphologiegewebes von Hepatocyten dazu fähig sind, die Funktion der Leber auf hohem Niveau zu halten. Auf der Basis dieser Erkenntnis sind die Erfinder erfolgreich gewesen, in dem sie Spheroide von Hepatocyten ausgebildet haben, die ihre Funktionen mit einem hohen Niveau exprimieren auf während eines langen Zeitraums aufrechterhalten, in dem sie die Hepatocyten in Gegenwart der vorstehend beschriebenen Substanz kultiviert haben, und in dem sie die Gewebekonstruktion bis zu einem gewissen Grad reproduziert haben.
D. h., wie in Fig. 1 dargestellt, werden Hepatocyten von erwachsenen Rattenlebern durch eine Kollagenease-Leber- Perfusionsmethode isoliert, in einer Kulturschale, die mit Proteoglycan(en) von Leberretikulinfasern beschichtet sind, inokuliert und dann statisch in serumfreiem Hormondefiniertem Medium (HDM), das mit notwendigen Hormonen, wie z. B. EGF (epidermer Wachstumsfaktor), Insulin und dergleichen ergänzt sind, inokuliert, und die auf dem beschichteten Substrat anhaftenden inokulierten Hepatocyten formen während der einzigen Stufe der Kultivierung Monoschichten, und, wenn die Kultivierung fortschreitet, ordnen sich die Monoschichten so an, um mehrschichtige Inseln zu bilden, und die mehrschichtigen Inseln schrumpfen um spherische Zellkluster zu bilden, die nachfolgend von der Oberfläche der Schale entfernt werden, um in flüssigem Medium schwimmende Spheroide zu bilden (Cell Struct. Funct. 13 (1988) 179; Biochem. Biophys. Res. Commun. 161 (1989) 385).
Es wurde nun gefunden, daß die Glycan-Einheit des vorstehend beschriebenen Proteoglycans mit Retikulin-Ursprung aus Dermatansulfat, Heparansulfat und anderen unbekannten Zuckern besteht. Wenn die Kulturgefäß jedoch mit Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Heparansulfat oder anderen anhaftenden Substraten, wie z. B. aus Rattenleber extrahierten Collagen oder Fibrinectinfraktionen oder einem Glycoprotein, beschichtet werden, breiten sich Hepatocyten in den Schalen aus, bleiben aber im Zustand von Monoschichten und bilden keine Spheroide.
Wenn die Hepatocyten in einer positiv geladenen Polystyrol- Kunststoffschale kultiviert werden, bilden sie schwimmende Spheroide, die ähnlich denen sind, wenn sie in einer Proteoglycan-beschichteten Kulturschale kultiviert werden. Es wird angenommen, daß ein solches Phänomen auftritt, weil Hepatocyten Proteoglycane abscheiden, wenn sie in solchen Kunststoffschalen inokuliert werden, und die sekretierten Proteoglycane an der Oberfläche der Schale anhaften (Exp. Cell Res. 186 (1990) 227; JP-A-1-277486 (der Ausdruck "JP-A", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine "ungeprüfte veröffentlichte Japanische Patentanmeldung")).
Wenn die Kultivierung in Gegenwart eines Proteoglycans als Kultursubstrat durchgeführt wird, bilden die Hepatocyten schwimmende Spheroide, die sogar während einer relativ langen Kultivierungsperiode stabil sind. Es wurde berichtet, daß die Hepatocyten-Spheoriden eine Leber-spezifische Differenzierungsfunktion mit einem hohen Niveau aufrechterhalten können, weil sie dazu fähig sind, Albumin mit hohem Grad konstant während eines langen Zeitraums im Vergleich mit Monoschichten von Hepatocyten abzugeben, und die Hepatocyten-Spheroiden möglicherweise eine Gewebsrekonstruktion zeigen, die ziemlich ähnlich ist der in vivo-Struktur, weil sie kaum eine Aktivität in der Zellproliferation zeigen, zumindest wenn sie durch ³H- Thymidin-Einbau und einen nuklearen Labeling-Index (J. Clin. Electron Microscopy 21 (1988) 5) untersucht werden.
Da die Proteoglycane jedoch aus Retikulinfasern mit hoher Ausbeute nicht leicht herstellbar sind, wurden große Anstrengungen darauf gerichtet, die Entwicklung einer Kultursubstanz als Substitut für die Proteoglycane voranzutreiben, die die Spheroidbildung von Hepatocyten wirksam induzieren können und wirksam sind für die kontinuierliche Expression einer Hepatocytendifferenzierungsfunktion. Zusätzlich ist es erforderlich, Hepatocyten in vitro während eines längeren Zeitraums zu kultivieren, die ihre in vivo-Funktion zur Entwicklung biologischer künstlicher Leberfunktionshilfsmittel beizubehalten.

Zusammenfassung der Erfindung

Eine Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung ist es, die Verwendung eines Mittels zur Bildung von Hepatocyten- Spheroiden bereitzustellen, die ein an ein Glucosaminoglycan kovalent gebundenes Lipid umfassen. Wirksame Mittel zur Verwendung der vorliegenden Erfindung sind solche, die Spheroide induzieren, die die Hepatocyten- Differenzierungsfunktion exprimieren und aufrechterhalten. Diese Wirkungen sind gegenüber denen, die unter Verwendung von Proteoglycanen aus Retikulinfiebern erhalten wurden, beträchtlich besser.
Die vorliegende Erfindung stellt somit die Verwendung von Glucosaminoglycanen bereit, an die ein Lipid kovalent gebunden ist, zur Herstellung eines Mittels zur Bildung von Hepatocyten-Spheroiden. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Ausbildung von Spheroiden von Hepatocyten bereit, das umfaßt die Kultivierung von Hepatocyten mit einem Lipid-gebundenen Glucosaminoglycan das die Kultivierung von Hepatocyten mit einem Lipid-gebundenen Glucosaminoglycan in einem Kultursubstrat umfaßt und die so hergestellten Hepatocyten-Spheroiden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt drei Anordnungsmoden von Hepatocyten, in denen A, B und C Monoschichten, Multischichten, Inselähnliche Spheroide bzw. Spheroide zeigt.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, die die Adhäsionsrate von BHK-21-Zellen gegenüber Kulturschalen, die mit Fibronectin und verschiedenen Phosphorlipid-gebundenen Glucosaminoglycanen beschichtet ist, und in denen - - eine Linie für eine CS-PPEADP-beschichtete Schale, - - für eine DS-PPEADP-beschichtete Schale, - - für eine CH-PPEADP- beschichtete Schale, - - für eine HA-PPEADP-beschichtete Schale und - - für eine HS-PPEADP-beschichtete Schale ist.
Fig. 3 ist ein Diagramm, das die sekretorische Albuminproduktionsfähigkeit für Hepatocyten-Spheroiden zeigt, die unter Verwendung von mit CS-PPEADP und dergleichen beschichteten Kulturschalen erhalten wurden, worin - - eine Linie für eine CS-PPEADP-beschichtete Schale, - O - für eine unbeschichtete positiv geladene Polystyrolkunststoffschale ist und - - für eine Collagenbeschichtete Schale ist.
Das Hepatocyten-Spheroiden bildende Mittel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Glycosaminoglycan (in einigen Fällen nachfolgend als "GAG" bezeichnet), an das ein Lipid, kovalent gebunden ist. Vorzugsweise ist eine kovalente Bindung zwischen einem Lipid und einem GAG eine CONH-Bindung, eine Esterbindung oder eine CH&sub2;NH-Bindung, die zwischen einer Carboxylgruppe einschließlich Lacton, einer Formylgruppe, einer Hydroxylgruppe oder einer primären Aminogruppe von GAG und einer primären Aminogruppe, einer Carboxylgruppe oder einer Formylgruppe eines Lipids vorhanden ist. Eine besonders bevorzugte kovalente Bindung ist (1) eine CONH-Bindung zwischen einer Carboxylgruppe einschließlich einem Lacton eines Glycosaminoglycans, dessen reduzierendes Terminal gespalten ist und einer primären Aminogruppe eines Lipids, (2) eine CONH-Bindung zwischen einer Carboxylgruppe und einer Uronsäureeinheit eines Glycosaminoglycans und einer primären Aminogruppe eines Lipids oder (3) einer CH&sub2;NH-Bindung zwischen einer Formylgruppe eines Glycosaminoglycans, dessen reduzierendes Terminal gespalten ist und einer primären Aminogruppe eines Lipids.
Eine primäre Aminogruppe, eine Carboxylgruppe, eine Formylgruppe oder eine Hydroxylgruppe, die in den obigen Bindungen teilnehmen, können inherent eine GAG oder ein Lipid enthalten, oder können durch chemische Behandlung des GAG oder Lipids gebildet werden, oder vorher in die GAG oder das Lipid durch eine Reaktion mit einer Spacer-Verbindung eingeführt werden, die die obige funktionelle Gruppe als terminale Gruppe besitzt.
Die folgenden Beispiele zeigen typische Beispiele für die Beziehung zwischen der Lipid-gebundenen GAG und seinen Materialkomponenten.
(1) GAG oder Derivate davon
(A)
(lactoniertes GAG)
(B)
(Aldehyd-GAG)
(C)
(Uronsäureinheit)
(D) GAG NH&sub2; (Aminogruppe-eingeführtes GAG)
(E) GAG-OH (gemeinsame Zuckereinheit)
In den vorstehenden Formeln ist GAG ein Glycosaminoglycan und NH&sub2; bedeutet eine eingeführte Aminogruppe.
(2) Lipide oder Derivate davon
(i) Lipid-NH&sub2;
(Aminogruppe-enthaltendes Phosphorlipid)
(ii) Lipid NH&sub2;
(Aminogruppe-eingeführtes Lipid)
(iii) Lipid COOH
(Carboxylgruppe-eingeführtes Lipid)
(iv)
(Aldehyd-Lipid)
In den obigen Formeln bedeutet COOH eine eingeführte Carboxylgruppe.
(3) Lipid-gebundenes GAG
(a) (A)+(i) → GAG-CONH-Lipid
(b) (A)+(ii) → GAG-CONH Lipid
(c) (B)+(i) → GAG-CH&sub2;NH-Lipid
(d) (B)+(ii) → GAG-CH&sub2;NH Lipid
(e) (C)+(i) →
(f) (C)+(ii) →
(g) (D)+(iii) → GAG HNCO Lipid
(h) (D)+(iv) → GAG HNCH&sub2;-Lipid
(i) (E)+(iii) → GAG-O-CO Lipid
Das Lipid-gebundene Glycosaminoglycan zur erfindungsgemäßen Verwendung kann als Salz verwendet werden, vorzugsweise mit als Erdalkalimetallsalz, wie z. B. Natrium und Kalium, als Erdalkalisalz, wie z. B. Calcium und Magnesium, und als Amin, wie z. B. Trialkylamin, und als organische Base, wie z. B. Pyridin.
Die folgenden sind Beispiele für Lipid-gebundene Glycosaminoglycane zur erfindungsgemäßen Verwendung.
1. Lipid-gebundenes Glycosaminoglycan, dargestellt durch die folgende Formel:
worin P¹ ein Lipid mit einem primären Aminogruppe ist, GAG ein Glycosaminoglycan-Rest ist und;
(1) GAG an 4-Stellung steht, R³ an 3-Stellung steht, R² eine COOH-Gruppe und R³ eine OH-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycoaminoglycan-Rest einer Hyaluronsäure, Chondroitin, Chondroitinsulfat A, C oder E, Dermatansulfat, Heparin oder Heparansulfat, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Glucoronsäureeinheit, oder wenn GAG ein Glycosaminoglycanrest von Dermatansulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Iduronsäureeinheit,
(2) GAG ist an 4-Stellung positioniert, R³ ist an 3-Stellung positioniert, R² ist eine COOH-Gruppe und R³ ist eine OSO&sub3;H- Gruppe, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Chondroitinsulfat K oder Chondroitinpolysulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Glucoronsäureeinheit;
(3) GAG ist an 3-Stellung positioniert, R³ ist an 4-Stellung positioniert, R² ist eine CH&sub2;OH-Gruppe und R³ ist eine OH- Gruppe, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Keratansulfat ist ausschließlich einer reduzierenden terminalen Galactoseeinheit, und
(4) GAG ist an 3-Stellung positioniert, R³ ist an 4-Stellung positioniert, R² ist eine CH&sub2;OSO&sub3;H-Gruppe und R³ ist eine OH- Gruppe, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Keratanpolysulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Galactoseeinheit.
2. Ein Lipid-gebundenes Glycosaminoglycan der folgenden Formel:
worin P¹ ein Lipid mit einer primären Aminogruppe ist, GAG ein Glycosaminoglycan-Rest und;
(1) R¹ eine NHCOCH&sub3;-Gruppe und R³ eine OH-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest einer Hyaluronsäure oder Chondroitin ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamineinheit,
(2) R¹ ist eine NHCOCH&sub3;-Gruppe und R³ ist eine OH-Gruppe, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Chondroitinsulfat A oder K ist, Chondroitinpolysulfat oder Dermatansulfat, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamineinheit, und
(3) jeder der Reste R¹ und R³ eine OH-Gruppe ist, wenn GAG eine Glycosaminoglycan-Rest von Keratansulfat oder Keratanpolysulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Galactoseeinheit.
3. Lipid-gebundenes Glycosaminoglycan dargestellt durch die folgende Formel:
worin P¹ ein Lipid mit einer primären Aminogruppe und GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Keratansulfat oder Keratanpolysulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Galactoseeinheit.
4. Ein Lipid-gebundenes Glycosaminoglycan dargestellt durch die folgende Formel:
worin P¹ ein Lipid ist mit einer primären Aminogruppe, GAG ein Glycosaminoglycan-Rest und;
(1) GAG an 4-Stellung positioniert ist, R³ an 3-Stellung positioniert ist, R¹ eine OH-Gruppe ist, R² eine COOH-Gruppe und R³ eine OH-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan- Rest einer Hyaluronsäure, Chondroitin, Chondroitinsulfat A, C oder E, Dermatansulfat, Heparin oder Heparansulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Glucoronsäureeinheit, oder wenn GAG ein Glycosaminoglycan- Rest von Dermatansulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Iduronsäureeinheit,
(2) GAG an 4-Stellung positioniert ist, R³ an 3-Stellung positioniert ist, R¹ eine OSO&sub3;-Gruppe ist, R² eine COOH-Gruppe und R³ eine OH-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan- Rest von Chondroitinsulfat D ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Glucoronsäureeinheit, oder wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Heparin oder Heparansulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Iduronsäureeinheit,
(3) GAG ist an 4-Stellung lokalisiert, R³ ist an 3-Stellung lokalisiert, R¹ ist eine OH-Gruppe, R² ist eine COOH-Gruppe und R³ ist eine OSO&sub3;H-Gruppe, wenn GAG ein Glycosaminoglycan- Rest von Chondroitinsulfat K, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Glucoronsäureeinheit ist,
(4) GAG ist an 4-Stellung lokalisiert, R³ ist an 3-Stellung lokalisiert, und mindestens einer der Reste R¹ und R³ ist ein OSO&sub3;H-Gruppe, während die andere eine OH-Gruppe ist, R² ist eine COOH-Gruppe, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Chondroitinpolysulfat, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Glucoronsäureeinheit ist,
(5) GAG ist an 3-Stellung lokalisiert, R³ ist an 4-Stellung lokalisiert, jeder der Reste R¹ und R³ ist eine OH-Gruppe und R² ist CH&sub2;OH-Gruppe, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Keratansulfat ausschließlich einer reduzierenden terminalen Galactoseeinheit ist.
(6) GAG ist an 3-Stellung lokalisiert, R³ ist an 4-Stellung lokalisiert, jeder der Reste R¹ und R³ ist eine OH-Gruppe und R² ist eine CH&sub2;OSO&sub3;H-Gruppe, GAG eine Glycosaminoglycan- Rest von Keratanpolysulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Galactoseeinheit,
(7) GAG ist an 3-Stellung lokalisiert, R³ ist an 4-Stellung lokalisiert, R¹ ist eine NHCOCH&sub3;-Gruppe, R² ist eine CH&sub2;OH- Gruppe und R³ ist eine OH-Gruppe, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest einer Hyaluronsäure oder Chondroitin ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamineinheit,
(8) GAG ist an 3-Stellung lokalisiert, R³ ist an 4-Stellung lokalisiert, R¹ ist eine NHCOCH&sub3;-Gruppe, R² ist eine CH&sub2;OH- Gruppe und R³ ist eine OSO&sub3;H-Gruppe, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Chondroitinsulfat A oder K ist oder Dermatansulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamineinheit,
(9) GAG ist an 3-Stellung lokalisiert, R³ ist an 4-Stellung lokalisiert, R¹ ist eine NHCOCH&sub3;-Gruppe, R² ist eine CH&sub2;OSO&sub3;H- Gruppe und R³ ist eine OH-Gruppe, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Chondroitinsulfat C oder D, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamineinheit ist,
(10) GAG ist an 3-Stellung lokalisiert, R³ ist an 4-Stellung lokalisiert, R¹ ist eine NHCOCH&sub3;-Gruppe, R² ist eine CH&sub2;OSO&sub3;H- Gruppe und R³ ist ein OSO&sub3;H-Gruppe, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Chondroitinsulfat E, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamineinheit ist,
(11) GAG ist an 3-Stellung lokalisiert, R³ ist an 4-Stellung lokalisiert, R¹ ist eine NHCOCH&sub3;-Gruppe, R² ist eine CH&sub2;OH- Gruppe und R³ ist eine OSO&sub3;H-Gruppe, oder R² ist eine CH&sub2;OSO&sub3;H-Gruppe und R³ ist eine OH-Gruppe oder eine OSO3H- Gruppe, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Chondroitinpolysulfat ist, ausschließlich einer, reduzierenden terminalen Hexosamineinheit,
(12) GAG ist an 4-Stellung lokalisiert, R³ ist an 3-Stellung lokalisiert, R¹ ist eine NHSO&sub3;H-Gruppe, R² ist eine CH&sub2;OSO&sub3;H- Gruppe und R³ ist eine OH-Gruppe wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Heparin ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamingruppe,
(13) GAG ist an 4-Stellung lokalisiert, R³ ist an 3-Stellung lokalisiert, R¹ ist eine NHCOCH&sub3;-Gruppe oder eine NHSO&sub3;H- Gruppe, R² ist eine CH&sub2;OH-Gruppe, wenn R³ eine OSO&sub3;H-Gruppe ist, oder R² ist eine CH&sub2;OSO&sub3;H-Gruppe, wenn R³ eine OH-Gruppe oder eine OSO&sub3;H-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan- Rest von Heparansulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamineinheit,
(14) GAG ist an 4-Stellung lokalisiert, R³ ist an 3-Stellung lokalisiert, R¹ ist eine NHCOCH&sub3;-Gruppe, R² ist eine CH&sub2;OSO&sub3;H- Gruppe und R³ ist eine OH-Gruppe, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Keratansulfat oder Keratanpolysulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamingruppe.
5. Lipid-gebundenes Glycosaminoglycan dargestellt durch die folgende Formel:
worin P² ein Lipid ist, GAG, R² und R³ sind die in der vorgehenden Formel (I) definierten Reste, m ist eine ganze Zahl von 1 bis 8, und k ist eine ganze Zahl von 1 bis 10, und
6. Ein Lipid-gebundenes Glycosaminoglycan, dargestellt durch die folgende Formel:
worin GAG, R¹ und R³ die in der vorstehenden Formel (II) definierte Bedeutung besitzt, und m, k und P² die in der vorstehenden Formel (V) angegebene Bedeutung besitzen.
7. Lipid-gebundenes Glycosaminoglycan dargestellt durch die folgende Formel:
worin GAG, R¹, R² und R³ die in der vorstehenden Formel (IV) angegebene Bedeutung besitzen, und m, k und P² die in der vorstehenden Formel (V) angegebene Bedeutung besitzen.
8. Lipid-gebundenes Glycosaminoglycan dargestellt durch die folgenden Formel:
worin P¹ ein Lipid ist mit einer primären Aminogruppe, GAG ein Glycosaminoglycan-Rest, n ist eine ganze Zahl von nicht mehr als der Zahl der Carboxylgruppen, die im Glycosaminoglycan enthalten sind, A bedeuten Hexosamin oder Hexaosaminsulfat, abhängig von dem Glycosaminoglycan und;
(1) jeder der Reste R¹ und R³ ist eine OH-Gruppe, wenn GAG eine Glycosaminoglycankette von Hyaluronsäure, Chondroitin, Chondroitinsulfat A, C oder E oder Dermatansulfat ist,
(2) R¹ ist eine OSO&sub3;H-Gruppe und R³ ist eine OH-Gruppe, wenn GAG eine Glycosaminoglycankette von Chondroitinsulfat D ist,
(3) R¹ ist eine OH-Gruppe und R³ ist eine OSO&sub3;H-Gruppe, wenn GAG eine Glycosaminoglycankette von Chondroitinsulfat K ist,
(4) mindestens einer der Reste R¹ und R³ ist eine OSO&sub3;H- Gruppe, während der andere eine OH-Gruppe ist, wenn GAG eine Glycosaminoglycankette von Chondroitinpolysulfat ist, und
(5) R¹ ist eine OH-Gruppe oder eine OSO&sub3;H-Gruppe und R³ ist eine OH-Gruppe, wenn GAG eine Glycosaminoglycankette von Heparin oder Heparansulfat ist.
Spezifische Beispiele von Glycosaminoglycan umfassen Hyaluronsäure, Chondroitin, Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat C, Chondroitinsulfat D, Chondroitinsulfat E, Chondroitinsulfat K, Chondroitinpolysulfat, Dermatansulfat (Chondroitinsulfat B), Heparin, Heparansulfat, Keratansulfat und Keratanpolysulfat.
Bevorzugte Molekulargewichte der Glycosaminoglycane liegen im Bereich von 1000 bis 1000000.
Bei der Herstellung der vorstehend erwähnten Lipid-gebundenen Glycosaminoglycane der Formeln (V), (VI) oder (VII) kann ein Glycosaminoglycan, in das eine primäre Aminogruppe eingeführt ist, als Ausgangsmaterial durch Spalten des reduzierenden Terminals des Glycosaminglycans unter Bildung eines Lactons oder Aldehyds und Umsetzen des resultierenden Glycosaminoglycans mit Alkylendiamin, dargestellt durch die Formel NH&sub2;-(CH&sub2;)m-NH&sub2; dargestellt werden. Alternativ kann auch ein Glycosaminoglycan, in das eine primäre Aminogruppe eingeführt wurde, hergestellt werden durch Verwendung einer Aminosäure mit zwei Aminogruppen, wie z. B. Lysin, anstelle von Alkylendiamin. Solche Alkylendiamine oder Aminosäuren können mit einer Carboxylgruppe einer Uronsäureeinheit eines Glycosaminoglycans reagieren.
Das Lipid mit einer mit P¹ in den folgenden Formeln (I), (II), (III), (IV) und (VIII) dargestellten Aminogruppe ist ein Phosphorlipid, wie z. B. Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylthreonin und Plasmalogene, dargestellt durch die Formel:
worin jeder der Reste R&sup4; und R&sup5; Wasserstoff ist, -CH=CHR&sup6; oder -COR&sup7; (wobei jeder der Reste R&sup6; und R&sup7; eine C&sub6;&submin;&sub2;&sub4;-Alkylgruppe ist) unter der Voraussetzung; daß R&sup4; und R&sup5; nicht gleichzeitig Wasserstoff sind, und Y -CH&sub2;CH&sub2;NH-,
oder
Besonders bevorzugt sind Verbindungen, in denen beide Reste R&sup4; und R&sup5; -COR&sup7;-Gruppe sind, wie z. B. Palmitoyl (Hexadecanoyl) oder Stearoyl (Octadecanoyl), oder in denen R&sup4; eine -CH=CHR&sup6;- Gruppe ist und R&sup5; -COR&sup7;-Gruppe ist.
Das durch P² dargestellte Lipid der vorstehenden Formel (V), (VI) und (VII) ist eine Verbindung dargestellt durch die Formel:
worin R&sup8; und R&sup9; jeweils Wasserstoff bedeuten, eine C&sub6;&submin;- Alkylgruppe, -CH=CHR&sup6; oder -COR&sup7;, worin R&sup6; und R&sup7; die gleiche Bedeutung wie vorstehend beschrieben besitzen, mit der Maßgabe, daß R&sup8; und R&sup9; nicht gleichzeitig Wasserstoff sind, R¹&sup0; ist eine C&sub6;&submin;&sub2;&sub4;-Alkylgruppe, -CH=CHR&sup6; oder -COR&sup7;, worin R&sup6; und R&sup7; die gleiche Bedeutung wie vorstehend besitzen, und W - CH&sub2;CH&sub2;N&spplus;(CH&sub3;)&sub3; sind, oder ein Inositrest. Insbesondere bevorzugt sind einfache Lipide, dargestellt durch die Formel (X) oder (XI), worin beide Reste R&sup8; und R&sup9; -COR&sup7;-Gruppen sind, wie z. B. Palmitoyl (Hexadecanoyl) oder Stearoyl (Octadecanoyl), oder in denen R&sup5; Wasserstoff und R&sup9; eine - COR&sup7;-Gruppe ist, oder ein Phosphorlipid, dargestellt durch die Formel (XII) oder (XIII) worin R¹&sup0; eine -COR&sup7;-Gruppe ist.
Ein Lipid, in das eine Carboxylgruppe eingeführt ist, stellt die Formel dar HOOC-(CH&sub2;)k-CO-P², worin P² ein Lipid mit einer Hydroxylgruppe ist, k besitzt die in Formel (V) angegebene Bedeutung, verwendet zur Herstellung eines Lipid-gebundenen Glycosaminoglycans, dargestellt durch die folgenden Formel (V), (VI) oder (VII), kann hergestellt werden durch Umsetzen eines Lipids mit einer Hydroxylgruppe mit einer Dicarbonsäure dargestellt durch die Formel HOOC-(CH&sub2;)k-COOH.
Das vorstehend beschriebene Aldehydlipid ((2)-(iv)) kann z. B. hergestellt werden, indem man eine Hydroxylgruppe eines Glycerinaldehyds acyliert oder verethert.
Die Verfahren zur Herstellung von Lipid-gebundenen Glycosaminoglycanen der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend detailliert beschrieben.

Begrenzte Oxidation des reduzierenden Terminals

In diesem Verfahren wird der reduzierende Terminal Uronsäure, Galactose oder die Hexosamineinheit eines Glycosaminoglycans reduziert und partiell oxidiert, um das reduzierende Terminal zu spalten und um eine Aldehydgruppe zu bilden (eine Formylgruppe), und die so gebildete Aldehydgruppe wird einer reduktiven Alkylierungsreaktion unterworfen mit einer primären Aminogruppe eines Lipids unterworfen, um ein Lipidgebundenes Glycosaminoglycan zu erhalten. Das Reaktionsschema dieses Verfahrens ist das nachfolgend beschriebene.
(A) Für den Fall, daß Glucoronsäure oder Iduronsäure in einem reduzierenden Terminal der Reaktion unterworfen wird:
worin R³ die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt und P¹ ein Lipid mit einer primären Aminogruppe ist.
Für den Fall, daß als Ausgangsmaterial Hyaluronsäure, Chondroitin, Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat C, Chondroitinsulfat E, Chondroitinsulfat K, Chondroitinpolysulfat, Dermatansulfat, Heparin oder Heparansulfat verwendet wird, dargestellt durch die Formel (1) mit D-Glucoronsäure oder L-Iduronsäure als reduzierenden Terminal, worin eine OH-Gruppe an die 2-Stellung des Kohlenstoffatoms gebunden ist, wird ein Lipid-gebundenes Glycosaminoglycan mit der Formel (I)-a gemäß dem vorstehenden Reaktionsschema hergestellt.
(B) Für den Fall, daß Glucosamin oder Galactosamin in einem reduzierenden Terminal einer Reaktion unterworfen wird, gilt die Gleichung:
worin R³ die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt und P¹ ein Lipid mit einer primären Aminogruppe ist.
Für den Fall, daß als Ausgangsmaterial Hyaluronsäure, Chondroitin, Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat K, Chondroitinpolysulfat oder Dermatansulfat verwendet wird, dargestellt durch die Formel (4) mit Glucosamin oder Galactosaminals reduzierenden Terminal, worin eine OH-Gruppe an die 6-Stelle des Kohlenstoffatoms gebunden ist, wird ein Lipid-gebundenes Glycosaminoglycan der Formel (II)-a gemäß dem vorstehenden Reaktionsschema dargestellt.
(C) Es wird der Fall gezeigt, daß Galactose in einem reduzierenden Terminal der Reaktion unterworfen wird:
worin P¹ ein Lipid mit einer primären Aminogruppe ist.
Für den Fall der Verwendung von Keratansulfat und Keratanpolysulfat, dargestellt durch die Formel (7), mit Galactose als reduzierendes Terminal, als Ausgangsmaterial, wird ein Lipid-gebundenes Glycosaminoglycan der Formel (I)-b, (II)-b oder (III) gemäß dem vorstehen angegebenen Reaktionsschema hergestellt.
In den vorstehenden Verfahren (A), (B) und (C) werden die durch die Formel (1), (4) oder (7) dargestellten reduzierenden terminalen Zuckereinheiten in den Glycosaminoglycanen zuerst einer reduktiven Spaltung unterworfen, um die entsprechenden Verbindungen (2), (5) oder (8) zu erhalten.
Als Reduktionsmittel zur Verwendung in der Reduktionsreaktion wird ein Alkalisalz eines Borhydrids (Boran), wie z. B. Natriumborhydrid, Natriumcyanborhydrid oder dergleichen verwendet.
Als Lösungsmittel für die Verwendung der obigen Reaktion kann Wasser oder eine 0,05 M Boratpuffer (pH = 8,3) verwendet werden.
Die Reduktionsreaktion kann bei einer Temperatur von 10 bis 30ºC, und vorzugsweise von 15 bis 25ºC durchgeführt werden.
Die Menge an Reduktionsmittel, obwohl sie abhängig von der Art variieren kann, erreicht von 5 bis 50 Äquivalenten, und vorzugsweise von 25 bis 30 Äquivalenten, pro Mol Verbindung (1), (4) oder (7).
Die so erhaltenen Verbindungen der Formel (2), (5) oder (8) werden dann einer partiellen Oxidation unter Bildung von Aldehydverbindungen der Formel (3), (6), (9), (10) oder (11) unterworfen.
Als Oxidationsmittel zur Verwendung in der Oxidationreaktion ist ein Alkalisalz einer Periodsäure, wie z. B. Natriumperiodat, Kaliumperiodat oder dergleichen verwendbar.
Die Menge des Oxidationsmittel liegt im Bereich von 1 bis 10 Äquivalenten, und vorzugsweise von 3 bis 6 Äquivalenten, pro Mol der Verbindungen (2), (5) oder (8). Die Oxidationsreaktion kann bei einer Temperatur von 0 bis 10ºC, und vorzugsweise von 0 bis 4ºC durchgeführt werden.
Jede der so gebildeten Aldehydverbindungen (3), (6), (9), (10) und (11) kann mit einer primären Aminogruppe eines Lipids gemäß einer bekannten reduktiven Alkylierung umgesetzt werden. So kann das Lipid-gebundene Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung durch die Formel (I), (II) oder (III) erhalten werden.
Beispiele für die in der obigen Reaktion verwendeten Lipide umfassen Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylthreonin, Ethanolaminplasmalogen, Serinplasmalogen und dergleichen.
Die reduktive Alkylierungsreaktion zur Herstellung der durch die Formel (I), (II) oder (III) dargestellten Verbindungen können durch wirksames und gleichmäßiges Mischen der Aldehydverbindungen (3), (6), (9), (10) oder (11) und eines in Chloroform gelösten Lipids oder dergleichen in einem Lösungsmittel, wie z. B. Wasser, 0,05 M Phosphatpuffer (pH = 7,0), oder Dimethylformamid und Stehenlassen der Mischung um bei einer Temperatur von 15 bis 60ºC zu reagieren, und gleichzeitig danach die Reduktionsreaktion unter Verwendung eines Reduktionsmittels, wie z. B. Natriumcyanoborhydrid oder dergleichen durchzuführen.

Lactonisierung des reduzierenden Terminals

In diesem Verfahren wird das reduzierende Terminal Uronsäure, Galactose oder die Hexosamineinheit eines Glucosaminoglyans einer Oxidation unterworfen, um das reduzierende Terminal zu spalten und das gespaltene Produkt wird lactonisiert und mit einer primären Aminogruppe eines Lipids lactonisiert, um ein Lipid-gebundenes Glycosamin zu erhalten. Dieses Reaktionsschema wird nachfolgend angegeben.
worin jeder der Reste R¹, R² und R³ die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen, P¹ ein Lipid mit einer primären Aminogruppe ist, und A ein Kation ist, wie z. B. ein Alkalimetall oder ein Amin.
Gemäß diesem Verfahren wird das durch die Formel (12) dargestellte Glycosaminoglycan zuerst einer Oxidation zur Spaltung seines reduzierenden Terminals unterworfen, wodurch eine Carboxylverbindung der Formel (13) erhalten wird.
Verwendbar als Ausgangsmaterialien sind die in der obigen Formel (12) angegebenen Verbindungen einschließlich Hyaluronsäure, Chondroitin, Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat C, Chondroitinsulfat D, Chondroitinsulfat E, Chondroitinsulfat K, Chondroitinpolysulfat, Dermatansulfat, Heparin, Heparansulfat, Keratansulfat oder Keratanpolysulfat.
Als in der Oxidationsreaktion verwendetes Oxidationsmittel können Jod, Brom oder dergleichen verwendet werden.
Die Menge des Oxidationsmittels liegt im Bereich von 2 bis 20 Äquivalenten, und vorzugsweise von 5 bis 15 Äquivalenten, pro Mol der Verbindung der Formel (12).
Als Lösungsmittel für die Oxidationsreaktion kann Wasser oder eine 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH = 7,0) verwendet werden.
Die Oxidationsreaktion kann bei einer Temperatur von 0 bis 40ºC, und vorzugsweise von 15 bis 20ºC, durchgeführt werden.
Die so erhaltene Verbindung der Formel (13) wird dann einer Säurebehandlung unterworfen, um eine Lactonverbindung der durch die Formel (14) dargestellten Formel zu erhalten.
Die Säurebehandlung wird durchgeführt, indem man einen starken sauren Kationenaustauscher, wie z. B. Dowex 50 (Handelsname, Dow Chemical Co.), Amberlite IR 120 (Handelsname, Rohm & Haas Co; Organo Co., Ltd) oder dergleichen und/oder eine Säure, die eine anorganische Säure, wie z. B. Salzsäure, Schwefelsäure oder dergleichen einschließt, verwendet, oder ein organisches Säureanhydrid, wie z. B. Essigsäureanhydrid, Citronensäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid oder dergleichen.
Die so gebildete Lactonverbindung der Formel (14) wird dann mit einem Lipid mit einer primären Aminogruppe umgesetzt, um ein Lipid-gebundenes Glycosaminoglycan der Formel (IV) herzustellen.
Die gleichen Lipidverbindungen, die vorstehend in dem limitierenden reduzierenden thermischen Oxidationsverfahren beschrieben wurden, können bei dieser Reaktionsschritt verwendet werden.
Die Reaktion der Lactonverbindung der Formel (14) mit einem Lipid zur Herstellung der durch die Formel (4) dargestellten Verbindung kann bewirkt werden, indem man die Lactonverbindung der Formel (14) in einem Lösungsmittel, wie z. B. Wasser, 0,05 M Phosphatpuffer (pH = 7,0) oder Dimethylformamid löst und die Lösung mit einem in Chloroform oder einem ähnlichen Substanz gleichförmig gelösten Lipid mischt und die Mischung bei einer Temperatur von 5 bis 80ºC, und vorzugsweise von 30 bis 60ºC reagieren läßt.

Aminierung des reduzierenden Terminals

In diesem Verfahren wird jede der Aldehydverbindungen, die durch die Formel (3), (6), (9) und (10), oder die Lactonverbindung der Formel (14), mit einer Alkylendiaminverbindung umsetzengelassen, um ein Glycosaminoglycanderivat mit einer primären Aminogruppe in seinem reduzierenden Terminal zu erhalten. Das so erhaltene Glycosaminoglycan-Derivat mit einer primären Aminogruppe wird dann mit einem Lipidderivat mit einer Carboxylgruppe so umgesetzt, daß die primäre Aminogruppe und die Carboxylgruppe zusammen gebunden werden. Auf diese Weise wird ein Lipid gebundenes Glycosaminoglycan hergestellt. Das Reaktionsschema dieses Verfahrens wird nachfolgend angegeben.
worin jeder der Reste R¹, R² und R³ die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen und P² ein Lipid ist.
Ein Glycosaminoglycan-Derivat mit einer primären Aminogruppe in seinem reduzierenden Terminal, wie durch die vorstehenden Formel (15) oder (16) dargestellt, wird erhalten, indem man jede der Verbindungen (3), (6), (9) und (10) mit einer Alkylendiaminverbindung in Gegenwart eines reduzierenden Mittels gemäß einer reduktiven Alkylierungsreaktion umsetzt.
Das durch die obige Formel (17) dargestellte Glycosaminoglycanderivat wird erhalten, indem man die Verbindung (14) mit einer Alkylendiaminverbindung nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren umsetzt.
Eine in diesem Verfahren brauchbare Alkylendiaminverbindung kann aus Verbindungen ausgewählt werden, die dargestellt werden durch die Formel
NH&sub2;-(CH&sub2;)m-NH&sub2;
worin m eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist.
Als Reduktionsmittel kann Natriumcyanborhydrid oder ein ähnliches verwendet werden.
Die Menge des im Reaktionssystem verwendeten Reduktionsmittels liegt im Bereich von 10 bis 100 Mol pro Mol Glycosaminoglycan.
Als Reaktionslösungsmittel kann Wasser oder ein 0,05 M Phosphatpuffer verwendet werden.
Die Reaktion kann bei einer Temperatur von 0 bis 60ºC, und vorzugsweise von 4 bis 25ºC durchgeführt werden.
Ein Lipidderivat mit einer Carboxylgruppe kann erhalten werden, indem man eine Lipidverbindung mit einer Hydroxylgruppe in ihrer Glycerinstruktur mit einer Dicarbonsäure oder einem aktiven Derivat davon (z. B. einem Säureanhydrid, Halogenid) umsetzt.
Beispiele für die in dieser Reaktion zu verwendende Lipidverbindung umfassen Monoacylglycerin, Diacylglycerin, Lysophosphatidylcholin, Lysophosphatidylinositol, Etherlipide mit einer Hydroxygruppe, Etherphospholipide mit einer Hydroxygruppe und dergleichen.
Verwendbare Dicarbonsäuren oder als ihre aktive Derivate sind Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Terephthalsäure oder ihre Säurenanhydride oder Halogenide (z. B. Chlorid).
Verwendbares Kondensationsmittel sind 1-Ethyl-3- (dimethylaminopropyl)carbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid oder dergleichen.
Chloroform, Acetanilid, Dimethylformamid oder dergleichen, können als Lösungsmittel verwendet werdne.
Die Reaktionstemperatur kann im Bereich von 1 bis 60ºC liegen, wenn eine Dicarbonsäure in Gegenwart eines Kondensationsmittels verwendet wird, oder im Bereich von 20 bis 80ºC, wenn ein aktives Derivat der Dicarbonsäure, wie z. B. Dicarbonsäureanhydrid, verwendet wird.
Die Umsetzung eines Glycosaminoglycanderivats mit einer primären Aminogruppe in ihrem reduzierenden Terminal mit einem Lipidderivat mit einer Carboxylgruppe kann durchgeführt werden, indem man zuerst die Carboxylgruppe im Lipidderivat gemäß allgemein bekannter Methoden auf dem Gebiet der Peptidchemie aktiviert, und dann die so aktivierte Verbindung mit dem Glycosaminoglycanderivat (Nobuo Izumiya, Michinori Waki et al., Pepuchido Gosei no Kiso to Jikken (Basic and Experimental Peptide Synthesis), 1985, herausgegeben von Maruzen) umsetzen läßt.
Die Aktivierung der Carboxylgruppe im Lipidderivat kann erzielt werden, indem man die Carboxylgruppe in einem aktiven Ester überführt durch Umsetzung des Lipidderivates mit N- Hydroxysuccinimid, p-Nitrophenol, N-Hydroxybenzotriazol, N- Hydroxypiperidin, 2,4,5-Trichlorphenol oder dergleichen in Gegenwart eines Kondensationsmittels.
Brauchbare Reaktionslösungsmittel sind Chloroform, Acetonitril, Dimethylformamid oder dergleichen, oder eine Mischung davon. Brauchbares Kondensationsmittel sind 1-Ethyl- 3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid und dergleichen.
Die Umsetzung kann bei einer Temperatur von 0 bis 60ºC durchgeführt werden.
Das so erhaltene Lipidderivat, in dem die Carboxylgruppe aktiviert wurde, wird dann mit dem Glycosaminoglycanderivat (15), (16) oder (17) mit einer primären Aminogruppe umgesetzt, um das Lipid-gebundene Glycosaminoglycan (V), (VI) und (VII) zu erhalten. Das bei dieser Umsetzung verwendete Lösungsmittel ist Chloroform, Acetonitril, Dimethylformamid oder eine Mischung davon. Die Reaktionstemperatur liegt im Bereich von 0 bis 60ºC.

Anwendung eines Kondensationsmittels

Jede Verbindung aus Glycosaminoglycanen, ausschließlich Keratansulfat und Keratanpolysulfat, enthalten D- Glucoronsäure oder L-Iduronsäure als Uronsäureeinheit, und jede dieser Säuren besitzt eine Carboxylgruppe, die an sein C-5-Atom gebunden ist.
In diesem Verfahren wird ein Lipid-gebundenes Glycosaminoglycan hergestellt, indem man die Uronsäurecarboxylgruppe mit einer primären Aminogruppe eines Lipids in Gegenwart eines Kondensationsmittels reagieren läßt.
Das Reaktionsschema dieses Verfahrens wird nachfolgend angegeben.
worin jeder der Reste R¹, R³, A, n und P¹ die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen.
Verbindungen der Formel (18), die als Ausgangsmaterial verwendet werden können, werden ausgewählt aus Hyaluronsäure, Chondroitin, Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat C, Chondroitinsulfat D, Chondroitinsulfat E, Chondroitinsulfat K, Chondroitinpolysulfat, Dermatansulfat, Heparin und Heparansulfat. Irgendeine der in der vorstehenden Veranschaulichung des begrenzten reduzierenden terminalen Oxidationsverfahrens kann als Lipid verwendet werden.
Beispiele für das Kondensationsmittel umfassen Diethylcarbodiimid, Diisopropylcarbodiimid, Methylpropylcarbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid, Hexamethylencarbodiimid, Heptamethylencarbodiimid, 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, 1-Cyclohexyl-3-(2- morpholinoethyl)carbodiimid-meso-p-toluolsulfonat, 1-t-Butyl- 3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, Diphenylcarbodiimid, 4,4'Dinitrodiphenylcarbodiimide, Di-p-tolylcarbodiimid, Bis- (trimethylsilyl)carbodiimid und dergleichen.
Das Kondensationsmittel kann in einer Menge von 10 bis 100 Mol pro Mol eines Lipids verwendet werden.
Die Umsetzung kann bei einer Temperatur von 4 bis 60ºC, und vorzugsweise von 15 bis 25ºC, in einem Lösungsmittel, wie z. B. Dimethylformamid, Chloroform oder einer Mischung davon, durchgeführt werden.

Aktivierung des Glycosaminoglycans

In diesem Verfahren wird ähnlich zu dem vorstehenden Fall, bei dem ein Verfahren unter Anwendung eines Kondensationsmittels verwendet wurde, das Lipid-gebundene Glycosaminoglycan (VIII) durch Aktivierung der Carboxylgruppe der Uronsäure und nachfolgendes Binden der aktivierten Carboxylgruppe an einer primären Aminogruppe im Lipid durchgeführt.
Die gleichen Glycosaminoglycan-Verbindungen und Lipidverbindungen, wie sie in dem vorstehenden Verfahren unter Verwendung eines Kondensationsmittels beschrieben wurden, können in diesem Verfahren verwendet werden.
Die Aktivierung einer Carboxylgruppe in der Uronsäureeinheit einer Glycosaminoglycanverbindung kann durch allgemein bekannter Mittel auf dem Gebiet der Peptidchemie erreicht werden, z. B. durch Überführung der Carboxylgruppe in einem aktivierten Ester durch Umsetzung der Glycosaminoglycanverbindung mit N-Hydroxysuccinimid, p- Nitrophenol, N-Hydroxybenzotriazol, N-Hydroxypiperidin, 2,4,5-Trichlorphenol oder dergleichen in Gegenwart eines Kondensationsmittels.
Die Carboxylgruppe der Uronsäureeinheit kann einer Umsetzung in Form eines Aminsalzes unterworfen werden, wie z. B. eines Tri(n-butyl)aminsalzes, Triethylaminsalzes, eines Salzes einer organischen Base, wie z. B. eines Pyridinsalzes oder Alkalimetallsalzes, wie z. B. eines Natriumsalzes oder Kaliumsalzes.
Als Reaktionslösungsmittel können Dimethylformamid, Pyridin, Dimethylsulfoxid oder dergleichen verwendet werden.
Verwendbares Kondensationsmittel sind 1-Ethyl-3- (dimethylaminopropyl)carbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid oder dergleichen.
Die Reaktion kann bei einer Temperatur von 0 bis 60ºC, und vorzugsweise von 4 bis 20ºC durchgeführt werden.
Indem man das so Carboxylgruppe-aktivierte Glycosaminoglycan mit einem Lipid umsetzen läßt, wird das Lipid-gebundene Glycosaminoglycan der Formel (VIII) erhalten.
Diese Umsetzung kann durchgeführt werden, indem man das aktivierte Glycosaminoglycan mit einem Lipid bei einer Temperatur von 0 bis 90ºC, und vorzugsweise von 25 bis 60ºC, in einem Lösungsmittel, wie z. B. Dimethylformamid, Chloroform oder einer Mischung davon, umsetzt.
Der Gehalt an Lipidanteilen in den Lipid-gebundenen Glycosaminoglycanen der durch die Formeln (I) bis (VIII) dargestellten Verbindungen der vorliegenden Erfindung können von 0,005 bis 50%, und vorzugsweise von 2 bis 10% variieren.
Die durch die vorstehend genannten verschiedenen Verfahren erhaltenen Trennungen und Reinigungen der Lipid-gebundenen Glycosaminoglycane können z. B. auf folgende Weise durchgeführt werden. Die endgültige Reaktionslösung jedes Verfahrens wird mit Methanol gemischt, das mit Natriumacetat gesättigt ist, und der resultierende Niederschlag wird abfiltriert, um ungesetztes Lipid zu entfernen. Der so abgetrennte Niederschlag wird einer hydrophoben Chromatographie unterworfen und der Träger mit einer wässerigen Lösung eines Salzes, wie z. B. Ammoniumacetat, Ammoniumchlorid, Natriumchlorid oder dergleichen gewaschen, um unumgesetztes Glycosaminoglycan zu entfernen. Danach wird das absorbierte Lipid-gebundene Glycosaminoglycan mit 10 bis 50% methanolischer Lösung eluiert.
Die Herstellungsbeispiele der vorstehend beschriebenen Lipid- gebundenen Glycosaminoglycane werden in WO 92/01720 oder EP- A-493622 beschrieben.
Irgendeine Art eines vorstehend genannten Lipid-gebundenen Glycosaminoglycans kann als Hepatocyt-Spheroid-bildendes Mittel verwendet werden. Ein Lipid-gebundenes Glycosaminoglycan, das durch die Formel (IV) dargestellt wird, ist besonders bevorzugt. Insbesondere bevorzugt ist eine Verbindung, in der Phosphatidylethanolamin kovalent an Chondroitinsulfat C bindet, dessen reduzierender Terminal abgespalten wurde.
Spheroide von Hepatocyten können erhalten werden, indem man Hepatocyten auf normalem Weg unter Verwendung des Hepatocyten-Spheroid-formenden Mittels (ein Lipid-gebundenes GAG) als Kultursubstrat verwendet, das z. B. auf der Oberfläche eines Kulturgefäß, auf dem Hepatocyten aufgegeben werden, aufgeschichtet ist.
Bevorzugt als Kulturgefäß ist die vorstehend genannte positiv geladene Polystyrolkunststoffschale (cf. JP-A-1-296982), wie z. B. Primaria 3801 oder 3802 (Handelsname, Becton Dickinson & Co.). Eine Lösung, die Lipid-gebundenes Glycosaminoglycan enthält, wird als Kultursubstrat auf die Oberfläche der Kulturschale aufgeschichtet. Die Beschichtung des Lipidgebundenen Glycosaminoglycans wird z. B. so durchgeführt, indem man eine im Gleichgewicht befindliche Salzlösung, wie z. B. Hank's-Lösung, die das Lipid-gebundene Glycosaminoglycan in einer Konzentration im Bereich von 10 ug/ml bis 10 mg/ml enthält, zur Kulturschale zugibt und diese bei 0ºC bis Raumtemperatur 1 bis 10 Stunden stehen läßt. Dann werden die isolierten Hepatocyten (1 · 10&sup4; bis 1 · 10&sup6; Zellen/ml) einer mit Substrat beschichteten Kulturschale inokuliert und in einem Serumfreien Hormon-definierten Medium (Williams #E- Medium oder dergleichen), das z. B. 10 ug Insulin, 0,1 uM CuSO&sub4;.5H&sub2;O, 3 nM H&sub2;SeO&sub3;, 50 pM ZnSO&sub4;.7H&sub2;O, 50 ng/ml EGF (epidermal growth factor), 50 ug/ml Linolsäure, 100 U/ml Penicillin G, 100 U/ml Streptomycin und 1 ug/ml Fungizon, bei ca. 37ºC unter einer Atmosphäre von 100% Feuchtigkeit, 5% CO&sub2; und 95% Luft, kultiviert. Die Kultivierung wird während eines Zeitraums von 6 Stunden bis zu mehreren Tagen durchgeführt, wobei man gelegentlich das Medium durch frisches ersetzt. Die Hepatocyten bilden am Anfang der Kultivierung Monoschichten, und wenn die Kultivierung fortschreitet, aggregieren sich die Monoschichten allmählich zur Bildung von Hemispheroiden oder mehrschichtigen Inseln, und die mehrschichtigen Inseln aggregieren weiter unter Bildung von spherischen Zellklustern, die nachfolgend von der Oberfläche der Schale unter Bildung der fließenden Spheroide im flüssigen Medium abgetrennt werden. Jede der so gebildeten Spheroide kann einen Durchmesser von 50 bis 150 um, und vorzugsweise von 70 bis 120 um besitzen, und kann aus einer Gesamtzahl von 50 bis 300 Zellen, und vorzugsweise von 70 bis 250 Zellen bestehen.
Die schwimmenden (schwebenden) Spheroide können aus der Kultur durch Zentrifugieren der Kultur bei 50 X G während 1 Minute, Entfernen des Überstandes durch Absaugen und Sammeln des Rückstandes erhalten werden.
Es wird angenommen, daß die Spheroidbildung auftritt, weil eine Adhäsion der Hepatocyten an das Kultursubstrat in Gegenwart eines Lipid-gebundenen Glycosaminoglycans verhindert wird, und die Spheroid-bildende Aktivität hat eine wechselseitige Beziehung zur Adhäsion-inhibierenden Wirkung des Lipid-gebundenen Glycosaminoglycans, das die Adhäsion von Babyhamster-Nierenzellen (BHK-Zellen) und dergleichen an ein Fibronectin-Substrat inhibiert.
Die Spheroidbildung kann mit niedriger Konzentration eines Lipid-gebundenen Glycosaminoglycans bewirkt werden, das eine hohe-Adhäsions-Inhibierungswirksamkeit besitzt. Vorzugsweise können solche Lipid-gebundenen Glycosaminoglycane eine Zelladhäsionsinhibierungswirksamkeit von 400 ug/ml oder darunter als 50%-ige Inhibierungskonzentration (IC&sub5;&sub0;) besitzen, wenn sie gemäß einem in folgenden Beispielen beschriebenen Verfahren gemessen werden.
Die Spheroide können nicht unter Verwendung von Glycosaminoglycan allein gebildet werden. Es ist vollständig unerwartet, daß die Spheroidbildung bewirkt werden kann unter Verwendung eines Lipid-gebundenen Glycosaminoglycans als Kultursubstrat innerhalb einer beträchtlich kürzeren Zeit im Vergleich mit dem Fall der Verwendung von positiv geladenem Polystyrolkunststoffschalen allein, oder von bekannten Proteoglycanen. Ein solches Auffinden ermöglicht eine praktische Kultivierung der Hepatocyten.
Es wurde bestätigt, daß die Spheroiden der so erhaltenen Hepatocyten mit hohem Gehalt Albumin sekretieren können und leberspezifische differenzierende Funktionen aufrechterhalten können. Zusätzlich wurde gefunden, daß aufgrund des ³H- Thymidineinbaus das Wachstum der Zellen dieser Spheroide schwer zu unterdrücken war, was anzeigt, daß die Spheroidbildung unterschiedlich ist von einer krebsähnlichen Proliferation.
Erfindungsgemäß können deshalb flotierfähige (schwimmfähige) Spheroide von Hepatocyten, die leberspezifische Funktionen beibehalten, und Spheroidkörper während eines verlängerten Zeitraums wirksam erhalten werden können. Da, ungleich zu Proteoglycanen, ein erfindungsgemäß Lipid-gebundenes Glycosaminoglycan, von dem angenommen wird, daß es als künstliche extrazellulare Matrix leicht synthetisiert werden kann, ist es zur Entwicklung einer künstlichen Leberfunktionshilfe geeignet.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegenden Erfindung weiter veranschaulichen. Es ist jedoch verständlich, daß die Beispiele nur zum Zwecke einer Veranschaulichung gegeben werden, ohne den Rahmen der Erfindung auf irgendeine Weise zu beschränken.

Bezugsbeispiel

Herstellung von Phosphorlipid-gebundenem Glycosaminoglycan durch Lactonisierung von reduzierenden Terminals

(1) Herstellung von reduzierendem Terminal-oxidierten Glycosaminoglycan

1) Herstellung von reduzierender Terminal-oxidierter Hyaluronsäure

500 mg Hyaluronsäure (HA1; MW, 10000; von Hahnenkamm) wurden in 10 ml Wasser gelöst, und die Lösung wurde mit 5 ml methanolischer Lösung von 0,1 M Jod gemischt und bei Raumtemperatur 6 Stunden lang inkubiert, um die Reaktion zu bewirken. Zur resultierenden Reaktionsmischung wurden ca. 5 ml 0,1 M Natriumhydroxid zugegeben, um freies Jod zu entfärben. Kaliumacetat-gesättigtes Ethanol wurde zur resultierenden Lösung zugegeben, um einen Niederschlag auszubilden, und der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, sorgfältig mit Ethanol gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Auf diese Weise wurden 423 mg Kaliumsalz der reduzierenden Terminal-oxidierten Hyaluronsäure (Ansatznummer 400) erhalten. Durch Überprüfung mittels Somogyi-Nelson-Methode wurde kein reduzierender Zucker im Produkt bestimmt.

2) Herstellung von reduzierender Terminal-lactonisierter Hyaluronsäure

400 mg des Ansatzes Nr. 400 der reduzierenden Terminaloxidierten Hyaluronsäure wurden in 10 ml Wasser gelöst, und die Lösung wurde durch 50 ml einer Säule eines stark sauren Ionenaustauscherharzes (Dowex 50(H&spplus;)) während einer Stunde hindurchgeleitet. Auf diese Weise wurde eine Lösung, die 390 mg reduzierende Terminal-lactonisierte Hyaluronsäure enthielt, erhalten. Durch Somogyi-Nelson-Methode wurde in der Lösung kein reduzierender Zucker bestimmt.
Die so erhaltene Lösung wurde mit Tri-n-butylamin neutralisiert und nachfolgend lyophilisiert, um 400 mg Tri-n- butylaminsalz der reduzierenden Terminal-lactonisierten Hyaluronsäure (Ansatz Nr. 500) zu erhalten.

3) Herstellung anderer reduzierender Terminal-lactonisierter Glycosaminoglycane

Die Reduzierung des Terminal-oxidierten Glycosaminoglycans wurde gemäß dem vorstehenden Verfahren 1) unter den in Tabelle 1 angegebenen Bedingungen durchgeführt, wobei jedes der folgenden Ausgangsmaterialien verwendet wurde: Chondroitin (CH; MW, 15000), Chondroitinsulfat C (CS (S1); MW, 10000: CS (S3); MW, 30000: und CS (S6); MW, 60000), Dermatansulfat (DS; MW, 15000), Heparin (Hep; MW, 15000) und Heparansulfat (HS; MW, 15000). Die so erhaltenen Proben wurden dem obigen Verfahren 2) unter den in Tabelle 2 angegebenen Bedingungen unterworfen und die reduzierenden Terminal-lactonisierten Glycosaminoglycane erhalten. Tabelle 1
* Somogyi-Nelson: Vorhandensein (+) oder Abwesenheit (-) des durch Somogyi-Nelson-Methode bestimmten reduzierenden Zuckers. Tabelle 2
* Somogyi-Nelson: Vorhandensein (+) oder Abwesenheit (-) des durch Somogyi-Nelson-Methode bestimmten reduzierenden Zuckers.
(2) Herstellung von L-(α-Phosphatidyl)ethanolamin-dipalmitoyl (PPEADP)-gebundenem Glycosaminoglycan
1) Herstellung von L-(α-Phosphatidyl)ethanolamin-dipalmitoyl- gebundener Hyaluronsäure
n: durchschnittlich 25
400 mg des Ansatzes Nr. 500 der reduzierenden Terminallactonisierten Hyaluronsäure wurden in 200 ml Dimethylformamid gelöst und 27,6 mg PPEADP, gelöst in Chloroform, zugegeben. Die resultierende Mischung wurde bei 70ºC während 2 Stunden umsetzengelassen. Nach Entfernen des Chloroforms aus der Reaktionsmischung durch Destillation wurde überschüssiges Volumen an wässeriger Natriumacetatlösung zum Rückstand zugegeben, um das Reaktionsprodukt ins Natriumsalz überzuführen. Mit Natriumacetat-gesättigtes Ethanol wurden dazu gegeben, um einen Niederschlag auszubilden, und das so gebildete Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt. Der Niederschlag wurde in 0,3 M Ammoniumacetatlösung gelöst und auf eine hydrophobe Chromatographiesäule (400 ml TSK-Gel Phenyl Toyopearl 650 M, Tosoh Corporation) zur Adsorption aufgebracht. Die Lösung wurde sorgfältig mit 0,3 M Ammoniumchloridlösung gewaschen und die Elution wurde mit 30% wässeriger Methanollösung durchgeführt. Das interessierende Reaktionsprodukt wurde in der 30%-igen- Methanol-eluierten Fraktion gefunden, während unumgesetzte Hyaluronsäure in der nicht-adsorbierten Fraktion unter Waschlösung gefunden wurde. Die mit 30%-Methanol eluierte Fraktion wurde unter vermindertem Druck reduziert, durch Dialyse entsalzt und dann lyophilisiert und 36 mg des gewünschten Produktes (Ansatz Nr. 600) erhalten.
Phosphorgehalt: 0,30%
PPEADP-Gehalt: 6,44%
Hyaluronsäuregehalt: 82,37%

(2) Herstellung eines anderen L-(α-Phosphatidyl)ethanolamindipalmitoyl-gebundenen Glycosaminoglycans

Die in Tabelle 3 angegebenen PPEADP-gebundenen Glycosaminoglycane wurden aus der reduzierenden Terminallactonisierten Glycosaminoglycanen der Tabelle 2 und aus PPEADP gemäß dem vorstehend angegebenen Verfahren (1)-2) unter den in Tabelle 3 angegebenen Bedingungen hergestellt. Die Ergebnisse der Analysen des so erhaltenen Produktes sind in Tabelle 4 angegeben. Tabelle 3 Tabelle 4

Beispiel 1

(1) Aufschichten von Phosphorlipid-gebundenen Glycosaminoglycanen auf Kulturschalen

Jede der fünf in Tabelle 5 angegebenen verschiedenen Typen von Phosphorlipid-gebundenen Glycosaminoglycanen wurden in Hank's Lösung (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 71 (1949) 196) auf verschiedenen Endkonzentrationen im Bereich von 1 bis 100 ug/ml gelöst, und 2 ml Portionen jeder der resultierenden Lösungen in eine Polystyrol-Kunststoffschale gegeben (Primaria 3802, 60 mm Durchmesser, erhältlich von Becton Dickinson & Co.), und die Schalen wurden ca. 10 Stunden bei 4ºC stehen gelassen, um das Phosphorlipid-gebundene Glycosaminoglycane aufzuschichten.

(2) Isolierung und Kultivierung der erwachsenen Rattenhepatocyten

Primäre Kulturen von erwachsenen Rattenhepatocyten wurden gemäß dem Verfahren von Seglen et al. (In Methods in Cell Biology, D. M. Prescott, Ed. Vol. XIII (1976), Seiten 29-83, Academic Press, New York) durchgeführt, um kultivierte Hepatocyten zu erhalten. Jede der Sprague-Dawley-Ratten (sieben Woche alt, mit einem Gewicht von 150 bis 200 g) wurden durch intraperitoneale Injektion von 10 mg (200 ul- Anteile für 50 mg/ml-Lösung) von Nembutal (Handelsname, Abbot Labs; Pentobarbiturat) anästhesiert. Jede der so anästhesierten Ratten wurde einer Laparotomie unterworfen, um eine Katheter-verbundene Röhre in die Portalader einzuführen, und die Preperfusionslösung in die Vene mit einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/min einzuführen. Nach Unterbindung der unteren Hohlvene wurde die Preperfusion 2 bis 3 Minuten durch den Schlauch der oberen Hohlvene durchgeführt. Nach Beendigung der Preperfusion wurde die Perperfusionslösung durch eine 0,05%-ige Kollagenase- Perfusionslösung, die bei 37ºC gehalten wurde, ersetzt und die Kollagenaseperfusion wurde 7 bis 10 Minuten lang durchgeführt. Danach wurde die Leber entnommen, in ein Gefäß mit einer kalten Zellwaschlösung (Hanks'e Lösung) gegeben, und unter Kühlung mit einem Eisbad unter Verwendung eines Messers in feine Schnitte geschnitten, um die Zellen zu erhalten.
Die so erhaltene Zellsuspension wurde eine Minute lang bei 50 · G zentrifugiert und der resultierende Überstand durch sorgfältiges Absaugen entfernt. Die im zentrifugen Rohr in Form von Pellets verbleibenden Zellen wurden in Williams #E- Medium suspendiert und 1 Minute lang bei 50 · G zentrifugiert. Durch zweimaliger Wiederholung der letzteren Zentrifugationsstufe wurden Hepatocyten von nicht-Parenchym- Zellen (Endothelialzellen, Kupffer-Zellen und Fettspeicherzellen (Ito-Zellen)) abgetrennt.
Nach Zählen der Zellzahl und Messen der Lebensfähigkeit (durch einen Farbstoff-Exclusionstest unter Verwendung von 0,6% Trypanblau) wurden die so isolierten Hepatocyten auf eine Dichte von 3 · 10&sup5; Zellen/ml mit Enat's HDM-Medium, modifiziert mit Koide et al. (Shinji, T., Koide, N. und Tsuji T., Cell Struct. Funct. 13 (1988) 179-188) (Williams #E- Medium, enthaltend 10 ug Insulin, 0,1 uM CuSO&sub4;.5H&sub2;O, 3 nM H&sub2;SeO&sub3;, 50 pM ZnSO&sub4;.7H&sub2;O, 50 ng/ml EGF (epidermal growth factor, Takara Shuzo Co., Ltd.), 50 ug/ml Linolsäure, 100 U/ml Penicillin G, 100 U/ml Streptomycin und 1 ug/ml Fungizon). Die PPEADP-gebundene Glycosaminglycan-beschichtete Polystyrolkunststoffschale (Falcon 3802, 60 mm Durchmesser), wie in (1) hergestellt, wurde zweimal mit Hanks' Lösung gewaschen und mit 4 ml Anteilen der so hergestellten Zellsuspension inokuliert. Die Zellen wurden bei 37ºC unter einer Atmosphäre von 100% Feuchtigkeit, 5% CO&sub2; und 95% Luft kultiviert. Die Hälfte des Volumens des Mediums wurde nach 6 Stunden, 1 Tag und 3 Tagen der Kultivierung mit frischem Medium ersetzt. Am ersten und zweiten Tag wurden mikroskopische Beobachtungen und Photographien durchgeführt.

(3) Ergebnisse

Es wurde eine beträchtliche Steigerung der Bildung von Spheroiden in einer Schale beobachtet, die mit einer Konzentration von 10 ug/ml CS(S3)-PPEADP (Ansatz Nr. 602-2; nachfolgend als "CS-PPEADP" bezeichnet) beobachtet. Bei einer Konzentration von 10 ug/ml wurden nach einem Tag Kultivierung mehrschichtige inselförmige Hemispheroide beobachtet, und der Großteil von ihnen ging in flotierende (schwimmende) Spheroide zwei Tage nach der Kultivierung über. Die Spheroidbildung wurde nicht beobachtet, wenn eine nur mit CS(S3) beschichtete Schale oder PPEADP allein verwendet wurde, und die Wirkung von CS-PPEADP erhöhte sich nicht, wenn seine Konzentration auf 100 ug/ml erhöht wurde. In einer Kontrollschale (nicht beschichtet) wurden 2 bis 3 zusätzliche Tage erforderlich, und es wurden nur wenige vollständig flotierende Spheroide beobachtet. Das Ergebnis der Spheroidbildung in den mit verschiedenen PPEADP-gebundenen Glycosaminoglycanen ist in der Tabelle 5 angegeben.

Tabelle 5

Ansatz-Nr. (10 ug/ml) Grad der Spheroidbildung
602-2 +++
604 +
606 +
600 +
601 +
Kontrolle (unbehandelte Schale) +
Anmerkung: +++: sehr gut, ++: gut, +: Kontrollniveau, -: inhibiert
Die Kulturschalen, die vorher mit Fibronectin beschichtet worden waren, wurden außerdem mit jeder der Verbindungen der Tabelle 5 beschichtet, um zu prüfen, ob diese Verbindungen die Adhäsion von Babyhamsternierenzellen (BHK 21-Zellen) gegenüber Fibronectin-Substrat inhibieren.
Die Fig. 2 zeigt die Konzentrationskurven, die Adhäsionsinhibierende Wirkungen verschiedener PPEADP-gebundener Glycosaminoglycane anzeigen. Wie in den Figuren gezeigt, zeigt CS-PPEADP die höchste inhibierende Wirkung, gefolgt von DS-PPEADP, HS-PPEADP, HA-PPEADP und CH-PPEADP, in dieser Reihenfolge. Der aus diesen Kurven berechnete Wert IC&sub5;&sub0; ist in Tabelle 6 angegeben.

Tabelle 6

Ansatz-Nr. IC&sub5;&sub0; zur Adhäsionsinhibierung (ug/ml)

602-2 0,77
604 1,49
606 4,9
600 17,2
601 80,8
Die obigen Ergebnisse legen es nahe, daß die Hepatocyt- Spheroid-bildende Aktivität der erfindungsgemäßen Mittel mit ihrer Adhäsions-inhibierenden Aktivität gegenüber Fibronectinsubstraten zusammenhängt.

Beispiel 2

Unter Verwendung von CS-PPEADP-gebildeten Spheroiden, einer positiv geladenen Kunststoffschale oder Kollagen als Kultursubstrat wurde für die leberspezifische Funktion und Proliferation geprüft.

(1) Primärkultur erwachsener Rattenhepatocyten

Die Hepatocyten wurden auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 beschrieben isoliert und auf eine Dichte von 3 · 10&sup5; Zellen/ml eingestellt.

(2) Beschichtung der Kultursubstrate

Eine 1 ml-Portion von Hank'sche Lösung, die 10 ug/ml CS- PPEADP enthielt, wurde in ein Polystyrol-Kunststoffglas (Primaria 3801, 35 mm Durchmesser, Becton Dickinson & Co.) gegossen, und ein 1 ml Teil von 0,02 N Essigsäurelösung, die 0,03% Kollagen (Cell Matrix IC, Koken Co " Ltd.) in ein Polystyrol-Kunststoffglas (Falcon 3001, 35 mm Durchmesser, Becton Dickinson & Co.) gegeben. Jede der resultierenden Schalen wurde ca. 10 Stunden lang bei 4ºC stehengelassen, um das Kultursubstrat aufzuschichten. Die so aufgeschichteten Schalen wurden zweimal mit Williams-Medium gewaschen.

(3) Messung der Proliferationspotenz - Messung der DNA- Replikationsaktivität unter Verwendung von ³H-Thymidin -

Die vorstehend in (1) erwähnten isolierten Hepatocyten wurden in den in (2) hergestellten Schalen inokuliert und in einer Inokulum-Größe einer 1,5 ml-Suspension pro Schale inokuliert und auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 kultiviert. Das Medium wurde 24 Stunden vor dem Markierungsexperiment mit frischem Medium ersetzt. Nach 24 Stunden wurden 1 uCi (3,7 · 10&sup4; Bq) von ³H-Thymidin zu Medium zugegeben und die Zellen wurden ferner bei 37ºC 24 Stunden lang kultiviert. Nach Kultivierung in Gegenwart von ³H-Thymidin wurde das Medium entfernt und die Zellen mit eiskaltem Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Danach wurden 1 ml gekühlter 10%-iger Trichloressigsäure (TCA) zu den gewaschenen Zellen gegeben, um sie zu fixieren. Nach einer Stunde Lagerung in einem Kühlschrank wurde TCA durch Absaugen entfernt, und die resultierenden Zellen wurden mit 1 ml 1N NaOH-Lösung gemischt, und bei 37ºC eine Stunde lang inkubiert, um die Hepatocyten vollständig zu lysen. Ein 100 ul-Anteil des so erhaltenen Zelllysats wurde zur Verwendung für die DNA- Messung aufgehoben, und der Rest wurde in ein kleines Teströhrchen übertragen. Ein 0,3 ml-Anteil der 100% TCA wurde zu dem Lysat-enthaltenden Teströhrchen gegeben, und die Mischung wurde 10 Minuten eisgekühlt und dann einer Zentrifugation bei 10000 UpM während 20 Minuten unterworfen. Nach Entfernen des Überstandes wurde der resultierende Niederschlag mit 0,5 ml 10% TCA gemischt, und die Mischung 15 Minuten in einem siedenden Wasserbad erhitzt, abgekühlt und dann bei 10000 UpM 20 Minuten lang zentrifugiert. Ein 0,3 ml-Anteil der resultierenden Überstandes wurde in ein Scintillationsgefäß gegeben und mit 3 ml eines Scintillators gemischt, um die Radioaktivität von Tritium (³H) unter Verwendung eines flüssigen Scintillationszählers zu messen.

(4) Messung der Albumin-Sekretion als Index der leberspezifischen Funktionen

Die Menge an sekretiertem Albumin wurde durch Enzymimmunoassay (EIA) unter Verwendung einer Sandwichtechnik und Verwendung von Polystyrolperlen gemessen.
Anti-Ratten-Albuminantikörper-IgG-Fraktion (erhältlich von Cappel) wurde mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer/0,15 M NaCl-Lösung auf eine Endkonzentration von 10 ug/ml verdünnt. Zu einem 1 ml-Anteil der so hergestellten Körperlösung wurden vier Polystyrolperlen (1/4"φ, Pierce), gegeben, und dann 2 Stunden unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur entgast. Nach Stehenlassen über Nacht bei 4ºC wurden die resultierenden Perlen dreimal mit PBS gewaschen und zu einer Lösung zugegeben, die 50 mM Phosphatpuffer (pH = 7,4), 0,15 M NaCl, 0,1% Gelatine und 0,02% Natriumacetat enthielt. Die so hergestellten Anti-Rattenalbumin-Antikörper-gebundenen Perlen wurden bei 4ºC (konserviert für 2 bis 3 Monate) gelagert.
Ein 100 ul-Anteil der drei Proben (eine 5 ul-Probe des 1,5 ml Kulturüberstands der unter bestimmten Bedingungen 24 Stunden lang inkubierten Hepatocytenkultur wurde mit dem vorstehend erwähnten Phosphatpuffer verdünnt, oder es wurde eine Standard-Ratten-Albuminlösung mit 500 ul des vorstehenden Phosphatpuffers gemischt. Nach Zugabe von Anti-Ratten- Albumin-Antikörper-gebundenen Perlen wurde die so hergestellte Mischung bei Raumtemperatur 4 Stunden lang unter Rühren inkubiert. Die Perle wurde dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 Lösung (jeweils 5 Minuten) gewaschen und zu 500 ul einer Lösung von mit Peroxidase-markierten Anti-Ratten- Albumin-Antikörper IgG (erhältlich von Cappel) zugefügt, die mit 0,1% Gelatine-enthaltendem PBS/0,05% Tween 20 Lösung um einen Faktor von 1 · 10&sup4; verdünnt wurde. Nach Inkubation über Nacht bei 4ºC unter schwachem Rühren wurde die so behandelte Perle dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 Lösung (jeweils 5 Minuten) gewaschen, einmal mit PBS 5 Minuten gewaschen, und dann zu 1 ml einer chromogenen Reagenslösung gegeben, die durch Lösen von 50 mg o-Phenylendiamin und 10 ul 30% H2O2 in 100 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) hergestellt wurde. Nach 30 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 ml 1,3 N Schwefelsäure beendet. Die entwickelte Farbe wurde auf der Basis des spektralen Absorptionsbasis bei 492 nm gemessen.

(5) Quantitative Bestimmung der DNA

Ein 80 ul-Anteil jeder Probe, gelöst in 1 N NaOH-Lösung, wurde mit Essigsäure neutralisiert und einer Ethanolfällung unterworfen. Der resultierende Niederschlag wurde in 100 ul 1 N NH&sub4;OH-Lösung gelöst und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Zu der getrockneten Probe wurden 100 ul Diaminobenzosäure (DABA)-Reagenzlösung (0,4 g DABA. 2HCl, gelöst in 1 ml destilliertem Wasser; 10 bis 20 mg Norit A (Handelsname, Aktivkohle, aktivierte Säure, gewaschen mit HCl, Pulver, Nacalai Tesque) als Entfärbungsmittel verwendet, wenn die Lösung eine dunkelbraune Farbe zeigte), und danach sorgfältig gerührt. Die so hergestellte Probe wurde mit Parafilm versiegelt und 30 Minuten in einem Wasserbad von 60ºC inkubiert. Nach Abkühlen wurde die so behandelte Probe sorgfältig mit 2 ml 0,6 N HClO&sub4; gemischt, und die Mischung bei 10000 UpM 5 Minuten lang zentrifugiert. Dann wurde das spektrale Absorptionsmaß des resultierenden Überstandes bei einer Excitationswellenlänge von 415 nm und einer Emissionswellenlänge von 515 nm unter Verwendung von Fluorophotometers gemessen.

(6) Ergebnisse

In den CS-PPEADP-beschichteten Schalen begannen sich die Zellen 1 Tag nach der Kultivierung zu sammeln und den meisten von ihnen bildeten am zweiten Tag floating (schwimmende) Spheroide. Die nach einem Tag Kultivierung gesammelten Zellen schienen aufgrund der rohen Oberfläche der gesammelten Schicht einfach aneinander zu haften. Vom zweiten Tag an schritt die Organisation der Spheroide voran und ihre Oberflächen wurden glatt. In den positiv geladenen Kunststoffschalen, die nicht beschichtet waren, begann die Spheroidbildung einen halben Tag bis zu einem Tag später als im Falle der mit CS-PPEADP-beschichteten Schalen. Mehrschichtige inselähnliche Hemispheroide begannen allmählich zu floatieren, erforderten aber nahezu einen Tag länger um vollständig zu floating (schwimmen). In der mit Kollagen beschichten Schale begannen die Zellen aneinander zu haften und verbreiteten sich 6 Stunden nach der Kultivierung nach einem Tag unter Bildung feiner dünner Monoschichten. Mit fortschreitender Kultivierung begannen die Zellen zu proliferieren und die Zelldichte erhöhte sich, aber die Zellschichten begannen am vierten Tag zu schrumpfen, und zählten sich am fünften Tag klar vom Umfang der Schale ab, um eine kleine floatierende Membran zu bilden.
Die Messung und Einbau von ³H-Thymidin während der Kultivierung zeigt die Tabelle 7. Tabelle 7
Aus der vorstehenden Tabelle ist es ersichtlich, daß die Proliferation der Zellen in dem Fall sehr stark unterdrückt wird, wenn CS-PPEADP-beschichtete Schalen verwendet werden, gefolgt von unbeschichteten Schalen, und den Kollagenbeschichteten Schalen, in dieser Reihenfolge. Für den Fall von Kollagenbeschichteten Schalen zeigte der Einbau von ³H- Thymidin einen scharfen Abfall am fünften Tag, was von der Erhöhung der Zelldichte aufgrund der Schrumpfung der Monoschichten und der nachfolgenden Bildung der dreidimensionalen Struktur herzurühren schien.
Im Hinblick auf die Messungen des sekretieren Albumins als Index der leberspezifischen Funktionen konnten 20 bis 1000 ng/ml Rattenalbumin quantitativ unter den gewählten Bedingungen bestimmt werden. Die Ergebnisse der Messungen der Menge an in 24 Stunden sekretiertem Albumin pro DNA unter jeder Kulturbedingung sind in Fig. 3 angegeben. Wenn CS- PPEADP als Kultursubstrat verwendet wurde, wurde die Bildung von Spheroiden in einem frühen Zustand der Kultivierung beobachtet, und die Tendenz der Leberfunktion war bedeutend größer als die, die beobachtet wurde unter Verwendung von nicht-beschichteten positiv geladenen Plastikschalen. Unter der Annahme, daß die Ergebnisse des in Tabelle 7 gezeigten 3H-Thymidin-Einbaus und der Beobachtung der Zellmorphologie scheint der frühe Zustand der Bildung von Spheroiden der Hauptgrund zur Aufrechterhaltung einer solchen Leberfunktion zu sein. Wenn Kollagen als Kultursubstrat verwendet wurde, fiel die spezifische Leberfunktion bereits zu einem frühen Zustand der Kultivierung ab.
Es wird deshalb angenommen, daß Hepatocyten-Spheroide, die unter Verwendung von erfindungsgemäßen Spheroid-bildenden Mitteln gebildet werden, eine gute leberspezifische Funktion von Hepatocyten aufrechterhalten können.
Obwohl die Erfindung detailliert unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen davon beschrieben wurde, ist es für einen Fachmann auf diesem Gebiet ersichtlich, daß verschiedene Veränderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne sich vom Rahmen und Geist der Erfindung zu entfernen.

Claims

1. Verwendung von Glycosaminoglycan, an das ein Lipid kovalent gebunden ist, zur Herstellung eines Mittels zur Bildung von Hepatocyten-Spheroiden.

2. Verwendung des Mittels nach Anspruch 1, wobei ein reduzierendes Ende des Glycosaminoglycans gespalten ist.

3. Verwendung des Mittels nach Anspruch 2, wobei ein Glycosaminoglycan kovalent an ein Lipid über eine Carboxylgruppe, die ein Lacton enthält, eine Formylgruppe oder eine primäre Aminogruppe, die an einem gespaltenen reduzierenden Ende eines Glycosaminoglycans gebildet ist, oder über diese in ein Glycosaminoglycan eingeführte Spacerverbindungsgruppe gebunden ist.

4. Verwendung eines Mittel nach Anspruch 2, wobei ein Lipid kovalent an ein Glycosaminoglycan, dessen reduzierendes Ende gespalten ist, über eine primäre Aminogruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Formylgruppe des Lipids oder über diese in ein Lipid eingeführte Spacerverbindungsgruppe gebunden ist.

5. Verwendung des Mittels nach Anspruch 1, wobei die kovalente Bindung zwischen einem Lipid und einem Glycosaminoglycan ausgewählt ist aus:

(1) einer CONH-Bindung zwischen einer Carboxylgruppe, die ein Lacton enthält, an einem gespaltenen reduzierenden Ende eines Glycosaminoglycans und einer primären Aminogruppe eines Lipids;

(2) einer CONH-Bindung zwischen einer Carboxylgruppe einer Uronsäureeinheit eines Glycosaminoglycans und einer primären Aminogruppe eines Lipids; oder

(3) einer CH&sub2;NH-Bindung zwischen einer Formylgruppe an einem gespaltenen reduzierenden Ende eines Glycosaminoglycans und einer primären Aminogruppe eines Lipids.

6. Verwendung des Mittels nach Anspruch 1, wobei das Glycosaminoglycan, an das ein Lipid über eine kovalente Bindung gebunden ist, dargestellt wird durch die folgende Formel:

worin P¹ ein Lipid mit einer primären Aminogruppe ist und GAG ein Glycosaminoglycanrest ist, ausschließlich eines gespaltenen reduzierenden Endes, und;

(1) GAG sich in 4-Stellung befindet, R³ sich in 3- Stellung befindet, R¹ eine OH-Gruppe ist, R² eine COOH- Gruppe ist und R³ eine OH-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Hyaluronsäure, Chondroitin, Chondroitinsulfat A, C oder E, Dermatansulfat, Heparin oder Heparansulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Glucoronsäureeinheit, oder wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Dermatansulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Iduronsäureeinheit,

(2) GAG sich in 4-Stellung befindet, R³ sich in 3- Stellung befindet, R¹ eine OSO&sub3;-Gruppe ist, R² eine COOH- Gruppe ist und R³ eine OH-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Chondroitinsulfat D ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Glucoronsäureeinheit, oder wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Heparin oder Heparansulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Iduronsäureeinheit,

(3) GAG sich in 4-Stellung befindet, R³ sich in 3- Stellung befindet, R¹ eine OH-Gruppe ist, R² eine COOH- Gruppe ist und R³ eine OSO&sub3;H-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Chondroltinsulfat K ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Glucoronsäureeinheit,

(4) GAG sich in 4-Stellung befindet, R³ sich in 3- Stellung befindet, mindestens einer der Reste R¹ und R³ eine OSO&sub3;H-Gruppe ist, während der andere eine OH-Gruppe ist, und R² eine COOH-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Chondroitinpolysulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Glucoronsäureeinheit,

(5) GAG sich in 3-Stellung befindet, R³ sich in 4- Stellung befindet, jeder der Reste R¹ und R³ eine OH- Gruppe ist und R² eine CH&sub2;OH-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Keratansulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Galactoseeinheit,

(6) GAG sich in 3-Stellung befindet, R³ sich in 4- Stellung befindet, jeder der Reste R¹ und R³ eine OH- Gruppe ist und R² eine CH&sub2;OSO&sub3;H-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Keratanpolysulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Galactoseeinheit,

(7) GAG sich in 3-Stellung befindet, R³ sich in 4- Stellung befindet, R¹ eine NHCOCH&sub3;-Gruppe ist, R² eine CH&sub2;OH-Gruppe ist und R³ eine OH-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Hyaluronsäure oder Chondroitin ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamineinheit,

(8) GAG sich in 3-Stellung befindet, R³ sich in 4- Stellung befindet, R¹ eine NHCOCH&sub3;-Gruppe ist, R² eine CH&sub2;OH-Gruppe ist und R³ eine OSO&sub3;H-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Chondroitinsulfat A oder K oder Dermatansulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamineinheit,

(9) GAG sich in 3-Stellung befindet, R³ sich in 4- Stellung befindet, R¹ eine NHCOCH&sub3;-Gruppe ist, R² eine CH&sub2;OSO&sub3;H-Gruppe ist und R³ eine OH-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Chondroitinsulfat C oder D ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamineinheit,

(10) GAG sich in 3-Stellung befindet, R³ sich in 4- Stellung befindet, R¹ eine NHCOCH&sub3;-Gruppe ist, R² eine CH&sub2;OSO&sub3;H-Gruppe ist und R³ eine OSO&sub3;H-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Chondroitinsulfat E ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamineinheit,

(11) GAG sich in 3-Stellung befindet, R³ sich in 4- Stellung befindet, R¹ eine NHCOCH&sub3;-Gruppe ist, R² eine CH&sub2;OH-Gruppe ist und R³ eine OSO&sub3;H-Gruppe ist, oder R² eine CH&sub2;OSO&sub3;H-Gruppe ist und R³ eine OH-Gruppe oder eine OSO&sub3;H-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Chondroitinpolysulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamineinheit,

(12) GAG sich in 4-Stellung befindet, R³ sich in 3- Stellung befindet, R¹ eine NHSO&sub3;H-Gruppe ist, R² eine CH&sub2;OSO&sub3;H-Gruppe ist und R³ eine OH-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Heparin ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamingruppe,

(13) GAG sich in 4-Stellung befindet, R³ sich in 3- Stellung befindet, R¹ eine NHCOCH&sub3;-Gruppe oder eine NHSO&sub3;H-Gruppe ist, R² eine CH&sub2;OH-Gruppe ist, wenn R³ eine OSO&sub3;H-Gruppe ist, oder R² eine CH&sub2;OSO&sub3;H-Gruppe ist, wenn R³ eine OH-Gruppe oder eine OSO&sub3;H-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Heparansulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamineinheit,

(14) GAG sich in 4-Stellung befindet, R³ sich in 3- Stellung befindet, R¹ eine NHCOCH&sub3;-Gruppe ist, R² eine CH&sub2;OSO&sub3;H-Gruppe ist und R³ eine OH-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Keratansulfat oder Keratanpolysulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamineinheit.

7. Verwendung des Mittels nach Anspruch 1, wobei das Lipid Phosphatidylethanolamin ist und das Glycosaminoglycan Chondroitinsulfat C ist, dessen reduzierendes Ende gespalten ist.

8. Verwendung des Mittels nach Anspruch 1, wobei das Glycosaminoglycan, an das ein Lipid gebunden ist, erhältlich ist durch Oxidieren eines reduzierenden Endes eines Glycosaminoglycans, um das reduzierende Ende zu spalten, Lactonisieren des gespaltenen Produktes und Umsetzen der resultierenden Lactonverbindung mit einer primären Aminogruppe eines Lipids.

9. Verfahren zur Bildung von Spheroiden von Hepatocyten, wobei man Hepatocyten mit einem Lipid-gebundenen Glycosaminoglycan als Kultursubstrat kultiviert.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei ein reduzierendes Ende des Glycosaminoglycans gespalten ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Glycosaminoglycan an das Lipid kovalent über eine Carboxylgruppe, die ein Lacton enthält, eine Formylgruppe oder eine primäre Aminogruppe, die an einem gespaltenen reduzierenden Ende eines Glycosaminoglycans gebildet ist, oder über diese in ein Glycosaminoglycan eingeführte Spacerverbindungsgruppe gebunden wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Lipid kovalent an das Glycosaminoglycan, dessen reduzierendes Ende gespalten ist, über eine primäre Aminogruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Formylgruppe des Lipids oder über diese in ein Lipid eingeführte Spacerverbindungsgruppe gebunden wird.

13. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die kovalente Bindung zwischen dem Lipid und dem Glycosaminoglycan ausgewählt ist aus:

14. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Glycosaminoglycan, an das das Lipid über eine kovalente Bindung gebunden ist, dargestellt wird durch die folgende Formel:

(3) GAG sich in 4-Stellung befindet, R³ sich in 3- Stellung befindet, R¹ eine OH-Gruppe ist, R² eine COOH- Gruppe ist und R³ eine OSO&sub3;H-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Chondroitinsulfat K ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Glucoronsäureeinheit,

(12) GAG sich in 4-Stellung befindet, R³ sich in 3- Stellung befindet, R¹ eine NHSO&sub3;H-Gruppe ist, R² eine CH&sub2;CSO&sub3;H-Gruppe ist und R³ eine OH-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Heparin ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamingruppe,

(13) GAG sich in 4-Stellung befindet, R³ sich in 3- Stellung befindet, R¹ eine NHCOCH&sub3;-Gruppe oder eine NHSO&sub3;H-Gruppe ist, R² eine CH&sub2;OH-Gruppe ist, wenn R² eine OSO&sub3;H-Gruppe ist, oder R² eine CH&sub2;OSO&sub3;H-Gruppe ist, wenn R³ eine OH-Gruppe oder eine OSO&sub3;H-Gruppe ist, wenn GAG ein Glycosaminoglycan-Rest von Heparansulfat ist, ausschließlich einer reduzierenden terminalen Hexosamineinheit,

15. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Lipid Phosphatidylethanolamin ist und das Glycosaminoglycan Chondroitinsulfat C ist, dessen reduzierendes Ende gespalten ist.

16. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Glycosaminoglycan, an das das Lipid gebunden ist, erhältlich ist durch Oxidieren eines reduzierenden Endes eines Glycosaminoglycans, um das reduzierende Ende zu spalten, Lactonisieren des gespaltenen Produktes und Umsetzen der resultierenden Lactonverbindung mit einer primären Aminogruppe eines Lipids.