-
Die vorliegende Erfindung betrifft eine ebene
Chromatographie-Vorrichtung zur Erzeugung eines
verminderten Drucks als erzwungenen Fluß.
-
Die Dünnschicht-Chromatographie (DC), die auch als ebene
Chromatographie bezeichnet wird, ist ein Trennverfahren
durch differentielle Wanderung zwischen einer stationären
Phase und einer mobilen Phase.
-
Die ersten DCs wurden auf Kieselgelplatten durchgeführt,
deren Korngrößenverteilung im Bereich von 15 µm lag und
deren Dicke etwa 1 mm betrug.
-
Die Trennung der chromatographierten Produkte kann
verbessert werden, wenn man den Durchmesser der Körner
und/oder die Dicke der Platte vermindert. So werden
sogenannte HPTLC (High Performance Thin Layer
Chromatography)-Platten erhalten. Diese Verbesserung ist
mit einem größeren Nachteil verbunden, nämlich mit der
Erhöhung der Zeit, die benötigt wird, um eine Höhe, die
einer gegebenen theoretischen Platte äquivalent ist, und
aus diesem Grund eine Verminderung des Durchmessers der
Körnchen zu erreichen. Um diesem Nachteil abzuhelfen, wur
den mehrere Lösungen vorgeschlagen:
-
a. Erzwungene Durchleitung des Eluenten und Erhöhen
seiner Geschwindigkeit über die Platte unter Verwendung
von Pumpen. Die europäische Patentanmeldung Nr. 0 060 709
beschreibt ein Verfahren dieses Typs, in dem das
Lösungsmittel durch Überdruck beschleunigt wird.
-
Diese Lösung besitzt insbesondere die folgenden Nachteile:
-
Der Adsorbant auf den Platten ist nicht hermetisch
von der Membran bedeckt, was zu einer Begrenzung der
Wanderung des Lösungsmittels führt.
-
Das Lösungsmittel kann über der Schicht des
Adsorbanten wandern, d. h. zwischen der Membran und dem
Adsorbanten und nicht im Adsorbanten.
-
b. Um den Nachteilen dieses Verfahrens und insbesondere
den begrenzten Wanderungsentfernungen abzuhelfen, hat ein
ungarisches Team ein neues ebenes
Flüssigchromatographieverfahren mit der Bezeichnung OPTLC (Overpressured Thin
Layer Chromatography) entwickelt, das insbesondere in den
folgenden Artikeln: E. TYHAK et al. (J. Chromat., 1979,
174, 75-81; J. Chromat., 1981, 211, 45-51; J. Chromat.,
1989, 471, 375-387); H.F. HAUCK et al. (J. Chromat., 1983,
262, 113-120); E. TYHAK (J. Pharm. Biomed. Anal., 1987, 5,
3, 191-203); Z. WITKIEWICZ et al. (J. Chromat., 1986, 373,
111-140) und den folgenden französischen
Patentanmeldungen:
Nr. 2 483 248, Nr. 2 495 779, Nr. 2 575 810 und
Nr. 2 580 406 beschrieben ist. Das Hauptmerkmal dieses
Verfahrens liegt in der Tatsache, daß die
Adsorbantenschicht der Platte vollständig mit einer flexiblen Membran
bedeckt ist, an die ein Druck angelegt ist, und die mobile
Phase in die Dünnschicht unter Druck mit Hilfe einer Pumpe
eingeleitet wird.
-
Eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens ist
insbesondere wie folgt in der Patentanmeldung 2 483 248
oder der Patentanmeldung 2 580 406 beschrieben: Eine DC-
Platte, die auf einen Glas- oder Kunststoffträger gegeben
ist und einen unteren und einen oberen Teil umfaßt, wird
vollständig an ihrem oberen Teil mit einer
Kunststoffmembran (Druckmembran) bedeckt, die der Oberfläche gut
angepaßt ist, weil ein Gasdruck in dem von der Membran und
dem oberen Teil des Blockträgers der Vorrichtung
begrenzenten Raum angelegt wird.
-
Der Gaseintritt und das Druckmeßgerät (beispielsweise
Manometer) in Kombination mit einer Spritze zum Einbringen
des Lösungsmittels und ein Eingang zum Einbringen der
Probe unter Druck befinden sich am oberen Teil des
Blockträgers. In dieser Vorrichtung muß der externe Druck
auf die Membran immer über dem auf den Eluenten
(Lösungsmittel) ausgeübten Druck liegen und führt so zu einem
Überdruck. Der obere Teil und der untere Teil des
Blockträgers sind mit Clips blockiert.
-
Diese Vorrichtung und das sich daraus ergebende Verfahren
besitzen zahlreiche Vorteile und erlauben insbesondere die
Optimierung der Trennbedingungen, indem die Eluenten-
Abgabe eingestellt wird. Jedoch besitzt OPTLC trotzdem
eine ganze Reihe von Nachteilen:
-
- Die Notwendigkeit der Herstellung von
Chromatographieplatten vor ihrer Verwendung, um 4 dichte
Verbindungsstellen zu erzeugen;
-
- Das Vorhandensein einer Dampfphase an der
adsorbierenden Schicht während der Entwicklung; in der Tat
besitzt eine derartige Dampfphase den Nachteil, die
Selektivität (Trennkraft) der mobilen Phase insbesondere
im Falle von Lösungsmittelgemischen zu modifizieren, den
Weg der gelösten Substanzen (Rf) von 20 auf 40% zu
vermindern, den maximalen Rf-Wert, ab dem keine Trennung
möglich ist, auf Werte zwischen 0,6 und 0,8 zu vermindern
(Bildung einer virtuellen Front) und auch eine Entmischung
der mobilen Phase und die Modifikation der Zusammensetzung
der zuletzt genannten herbeizuführen;
-
- Die Notwendigkeit insbesondere von zwei Druckpumpen,
einer Pumpe für den Eluenten und einer Pumpe, um die
Platte über Vermittlung der Druckmembran, die hermetisch
an der Platte haftet, unter Druck zu setzen.
-
c. Andere Methoden wurden auch verwendet, insbesondere
diejenige, die in der deutschen Patentanmeldung Nr.
2412524 beschrieben ist, bezieht sich auf ein
Trennverfahren
eines Gemisches durch DC, in der die Bewegung
des Lösungsmittels durch die Adsorbantenschicht mittels
Kapillarkräften erfolgt.
-
Der vorliegenden Erfindung liegt folglich die Aufgabe
zugrunde, eine Vorrichtung der ebenen Chromatographie mit
erzwungenem Fluß bereitzustellen, die besser den
Notwendigkeiten der Praxis entspricht als die
Überdruckvorrichtungen, die bis jetzt verwendet wurden, die
insbesondere den Vorteil besitzt, keine vorherige
Herstellung der Chromatographieplatten (fest oder flexibel)
zu benötigen, und die nicht mit der Entwicklung einer
Dampfphase verbunden ist und die besonders einfach
anzuwenden ist.
-
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung
der ebenen Chromatographie zur Entwicklung mit erzwungenem
Fluß des Typs umfassend eine Entwicklungskammer enthaltend
mindestens eine Chromatographieplatte, die mit einer
geeigneten Adsorbantenschicht bedeckt ist, und Mittel zur
Bedeckung der Platte, wobei die Vorrichtung dadurch
gekennzeichnet ist, daß sie weiterhin Mittel zur Erzeugung
eines verminderten Drucks in der Kammer und an der
Adsorbantenschicht umfaßt, die mit einem Mittel zur
Regulierung eines abnehmenden Druckgradienten verbunden
sind, und daß die Mittel zur Bedeckung der Platte schräg
der Platten hermetisch sind und aus einer Membran
bestehen, die hydrophob und für die Fließmittel
undurchlässig ist
-
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Vorrichtung
ist das Mittel zur Anlegung eines verminderten Drucks
insbesondere eine Vakuumpumpe.
-
Das Mittel zur Regulierung eines abnehmenden
Druckgradienten kann eine geeignete Verschlußvorrichtung sein
und ist ohne Beschränkung eine Mikrometerschraube, die an
einen stufenweise regulierbaren Motor gekoppelt ist.
-
Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der
Vorrichtung besteht die Membran aus einem geschlossenzelligen
Polyethylenschaum.
-
Die Polymermembran besitzt entweder die gleiche Dimension
wie die Chromatographieplatte oder ist geringfügig kleiner
als diese.
-
Diese Vorrichtung erzeugt überraschenderweise einen
homogenen verminderten Druck an der Entwicklungskammer und
folglich an der adsorbierenden Schicht und ergibt so eine
gute Aufbringung der Polymermembran auf den
Chromatographieträger.
-
Diese Vorrichtung besitzt eine Reihe von Vorteilen im
Vergleich mit der OPTLC, abgesehen von ihrer einfachen
Durchführung:
-
- Das in der Entwicklungskammer, insbesondere mit Hilfe
einer einzigen Pumpe, erzeugte Vakuum erlaubt
gleichzeitig:
-
das homogene Aufbringen der polymeren Membran auf der
Chromatographieplatte,
-
das Wandern der mobilen Phase durch "Traktion" mit
einer konstanten Geschwindigkeit und nicht unter Druck,
wie dies im Falle von Überdrucksystemen der Fall ist, was
den Vorteil besitzt, daß die Empfindlichkeit der
Chromatographievorrichtung zunimmt und die Wanderungszeit
vermindert wird (Erhalt von Ergebnissen in einer deutlich
kürzeren Zeit als bei den Vorrichtungen aus dem Stand der
Technik) und
-
die Möglichkeit der Verwendung jeder beliebigen
handelsüblichen Chromatographieplatte.
-
Die Gesamtheit der für die erfindungsgemäße Vorrichtung
charakteristischen Eigenschaften erlaubt außerdem:
-
- das Vermeiden der Entwicklung einer Dampfphase auf
der Platte und
-
- das Entgasen der Platte.
-
Eine derartige Vorrichtung erlaubt durch Vermeiden der
Entwicklung einer Dampfphase eine Entwicklung entsprechend
einer linearen Charakteristik und bietet deutlich
verbesserte Trennleistungen, wie die Anwendung der Formel
Z = kt zeigt, worin Z die Wanderungsentfernung, k eine
Konstante und t die Wanderungszeit bedeutet.
-
Die nun erhaltenen Vorteile sind:
-
- Verlängerung der Trennstrecke und
-
- Möglichkeit der Optimierung der Traktion durch
Regulierung bei konstanter Temperatur des abnehmenden,
aber homogenen Druckgradienten an der adsorbierenden
Schicht vom Typ ΔP = f(t).
-
Der lineare Variationsmodus ΔP = a(t)+b entspricht einer
besseren Progression der mobilen Phase und somit einer
besseren Trennung. Die Wanderungsgeschwindigkeit hängt von
der Variation des angelegten Drucks (Gradient) ab und wird
daher nur durch die Dichte und die Viskosität der mobilen
Phase und die Temperatur der Entwicklungskammer
beeinflußt.
-
Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der
Vorrichtung kann sie mehrere, durch eine geeignete Membran
getrennte Chromatographiekammern umfassen, was eine
gleichzeitige Analyse von mehreren Parametern und/oder die
Trennung einer großen Anzahl von gelösten Stoffen in einer
einzigen Entwicklung erlaubt.
-
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur
Detektion und/oder zur Bestimmung mittels ebener
Chromatographie in einer chromatographischen
Entwicklungskammer, die mindestens eine geeignete
Chromatographieplatte, die mit einer geeigneten Adsorbantenschicht
bedeckt ist, enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die
Wanderung der mobilen Phase durch die stationäre Phase
durch Zugkräfte durch Anlegen eines homogenen verminderten
Drucks in der die Chromatographieplatte bedeckenden
Adsorbantenschicht, die mit einer hydrophoben und für
Fließmittel undurchlässigen Membran bedeckt ist, in der
Entwicklungskammer erfolgt, umfassend die folgenden
Stufen:
-
(a) Erzeugung einer graduellen Verminderung des Drucks in
der Entwicklungskammer und in der Adsorbantenschicht durch
Anlegen eines abnehmenden Druckgradienten,
-
(b) Durchführung der Wanderung einer mobilen Phase durch
eine stationäre Phase unter den Bedingungen der Stufe (a)
und
-
(c) Nachweis und Entwicklung der gewanderten Stoffe.
-
Abgesehen von den vorstehenden Vorrichtungen umfaßt die
Erfindung auch andere Vorrichtungen, die aus der folgenden
Beschreibung hervorgehen.
-
Die Erfindung wird anhand der folgenden
Beschreibungsergänzung besser verstanden, die sich auf
Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens und
eine ausführliche Beschreibung der erfindungsgemäßen
Vorrichtung bezieht. Dabei wird auf die beigefügten
Figuren Bezug genommen, in denen:
-
- die Figur 1 eine perspektivische Ansicht einer
bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung mit einer Platte zeigt;
-
- die Figur 2 einen Transversalschnitt der
Ausführungsform der Figur 1 zeigt;
-
- die Figur 3 eine Ansicht zeigt, die das Funktionieren
der erfindungsgemäßen Vorrichtung zeigt;
-
- die Figur 4 eine Kurve zeigt, die den Einfluß des
Drucks auf die von dem Lösungsmittel zurückgelegte
Entfernung zeigt;
-
- die Figur 5 eine andere Ansicht zeigt, die das
Funktionieren der erfindungsgemäßen Vorrichtung zeigt,
umfassend ein Mittel zur Regulierung des abnehmenden
Druckgradienten.
-
Es ist jedoch zu verstehen, daß diese Figuren und
entsprechenden Beschreibungsteile nur der Erläuterung des
Gegenstands der Erfindung dienen und in keiner Weise eine
Beschränkung davon darstellen.
-
Zuerst wird auf die Figuren 1 bis 4 Bezug genommen, die
eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung
zeigen.
-
Die Figur 1 zeigt eine perspektivische Ansicht einer
bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung,
umfassend eine chromatographische
Entwicklungskammer 10, die in der dargestellten Ausführung durch die
Wände 11 und 12 begrenzt ist; die untere Wand (Wand 12)
ist vorteilhafterweise mit einer Klammer 13 assoziiert,
die den Erhalt einer Entwicklungskammer mit größerer oder
kleinerer Dimension entsprechend den Bedürfnissen erlaubt.
Die Entwicklungskammer 10 ist mit Mitteln zur Erzeugung
eines verminderten Drucks, die nicht dargestellt sind, im
Bereich der Öffnung 14 assoziiert.
-
Die Entwicklungskammer 10 enthält in der dargestellten
Ausführung eine Chromatographieplatte 20, die mit einer
für die auszuführende Dünnschicht-Chromatographie
geeigneten adsorbierenden Schicht und einer Polymermembran 30
bedeckt ist, die sich hermetisch und homogen an die
adsorbierende Schicht anschließt, wenn ein verminderter
Druck angelegt wird.
-
Die Wände 11 und 12 sind durch jedes geeignete Mittel
fixiert.
-
Die Chromatographieplatten 20 sind bevorzugt und nicht
beschränkend Glasplatten, die zuvor mit einem Kieselgel
("KIESELGEL" G60 F254, MERCK) beschichtet wurden.
-
Die Polymermembran 30 ist bevorzugt, aber nicht
beschränkend, eine hydrophobe, geschlossenzellige
Polyethylenmembran, ("RECTICEL", FRANCE; Ausmaße 180 x 200 x 3
mm), die einen leichten Druck auf die Oberfläche der
Chromatographieplatte 20 ergibt; so findet der einzige
Passageweg für das Lösungsmittel während der
Chromatographie im Inneren der adsorbierenden Schicht statt.
-
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser
Polyethylenmembran sind wie folgt:
Tabelle I
-
Die nachstehende Tabelle II führt das Verhalten dieser
Membran gegenüber üblicherweise in der DC verwendeten
Lösungsmitteln näher aus.
Tabelle II
Tabelle II (Fortsetzung)
-
Die Figur 2 zeigt einen transversalen Schnitt der
Ausführungsform der Figur 1 in geschlossener Position.
-
Die Figur 3 zeigt eine perspekttvische Ansicht der
Ausführungsform der Figur 1. Das Funktionieren der
Vorrichtungen, das in Figur 3 dargestellt ist, ist wie
folgt:
-
Nach Aufbringen der zu analysierenden Proben auf die
adsorbierende Schicht der Chromatographieplatte 20 wird
diese in die Entwicklungskammer 10 so eingebracht, daß
sich der Teil, der die aufgebrachten Proben enthält,
gegenüber (Seite A der erfindungsgemäßen Vorrichtung) der
Austrittsöffnung 14 (Seite B der erfindungsgemäßen
Vorrichtung) befindet, dann wird die Seite A der
erfindungsgemäßen Vorrichtung, hermetisch mit Hilfe von
Verschlußmitteln 15 verschlossen, in ein Behältnis 50, das
die mobile Phase 51 (geeignetes Lösungsmittel) enthält,
eingetaucht, und die Entwicklungskammer wird über die
Öffnung 14 mit einer Vakuumpumpe verbunden.
-
Diese Vorrichtung ermöglicht das Anlegen eines homogen
verminderten Drucks an die Entwicklungskammer und ganz
besonders an die adsorbierende Schicht und erlaubt die
Durchführung einer DC mit vermindertem Druck, die auch als
Vacuum Planar Chromatography (VPC) oder Vakuum-
Chromatographie (VC) bezeichnet wird.
-
Es wird auch auf Figur 5 Bezug genommen, die eine
Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung zeigt,
umfassend ein Mittel zur Regulierung des abnehmenden
Druckgradienten; die Vorrichtung der Figur 5 umfaßt eine
Entwicklungskammer 10, wie in Figur 3 beschrieben, in
Profilansicht, die in der dargestellten Ausführungsform
mit Mitteln zur Anlegung eines verminderten Drucks an die
Öffnung 14 verbunden ist. Diese Mittel zur Anlegung eines
verminderten Drucks umfassen eine Vakuumquelle, die durch
die Vakuumpumpe 42 dargestellt ist, die mit der
Vorrichtung 10 über das Verbindungsstück 44 verbunden ist;
diese Vakuumquelle ist auch mit einem Mittel zur
Regulierung des abnehmenden Druckgradienten verbunden, das
in dieser Ausführung durch eine Mikrometerschraube 40 in
Kopplung an einen stufenweise regulierbaren Motor 41
dargestellt ist, das die Regulierung des Luft-Abschlusses
43, der auf der Strecke des Verbindungsstück 44 angebracht
ist, erlaubt.
-
Der Motor 41 ist vorteilhafterweise programmierbar, sowohl
bezüglich der Geschwindigkeit des Verschlusses der
Vakuumleitung (Verbindungsstück 44 und Luftzufuhr 43) als
auch bezüglich der Selektion der Variation der
Verschlußgeschwindigkeit (linear oder exponentiell).
Beispiel 1: Einfluß des verminderten Drucks auf die
Chromatographie.
-
Die Entfernungen, die von einem Lösungsmittel (Methanol)
zu verschiedenen Zeitpunkten der Wanderung zurückgelegt
werden, werden gemessen (Z). Diese Entfernungen sind in
der Figur 4 als Funktion der Zeit dargestellt. Die Kurve
(5 mm Hg) umfaßt zwei Teile: Erhalt eines Drucks von 5 mm
Hg in 3 Minuten, anschließend Aufrechterhaltung einer
konstanten Depression bei 5 mm Hg durch Anhalten des
Depressionsgradienten. Es ist festzustellen, daß der
lineare Depressionsgradient einer linearen Variation der
zurückgelegten Entfernung als Funktion der Zeit
entspricht. Ausgehend von konstanten Drücken schreitet die
Entfernung nicht mehr kontrolliert fort. Diese
Feststellungen können auch bezüglich der Kurve (1 mm Hg)
getroffen werden. Man kann sehen, daß die Geschwindigkeit
der mobilen Phase in der Entwicklungskammer bei
vermindertem Druck eine Funktion des Drucks (P) ist und daß
diese Beziehung nicht linear ist. Nur eine progressive
Verminderung des Drucks ΔP erlaubt den Erhalt einer
linearen Beziehung, wenn ΔP = f(t). Die Vorrichtung mit
vermindertem Druck erlaubt somit die progressive
Verminderung von P im Verlauf der Analyse, um die
Linearität der Gleichung Z = kt zu gewährleisten.
Beispiel 2: Bestimmung von Natriumpyruvat mit einer
erfindungsgemäßen Vorrichtung.
-
5 Flecken von 5 µl einer Natriumpyruvatlösung zu 1 g/l
werden auf eine Kieselgel-TLC-Platte ohne Fluoreszenz
(Merck, Darmstadt, BRD) mit den Maßen 200 x 200 mm
aufgebracht.
-
Die Platte wird in eine erfindungsgemäße Vorrichtung wie
vorstehend beschrieben gegeben.
-
Die mobile Phase besteht aus:
-
Die Wanderung wird unter einer geringen Depression,
entsprechend 1 mm Hg Enddepression, erhalten durch einen
Gradienten von 0 bis 1 mm Hg, über 30 Minuten
durchgeführt.
-
Die Entwicklung wird mit Hilfe des in der europäischen
Patentanmeldung Nr. 909107753.4 beschriebenen Verfahrens
durch Derivatbildung unter Druck mit einer
Bromkresolpurpurlösung durchgeführt:
-
Parallel dazu wird eine DC-Wanderung unter den gleichen
Arbeitsbedingungen durchgeführt.
-
In den zwei Fällen erscheint eine Entmischungszone, aber
mit einer deutlich geringeren Breite, wenn die
Chromatographie mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung
durchgeführt wird; außerdem liegen die Natriumpyruvatflecken
über der Entmischungszone für die DC im Gegensatz zur mit
der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführten
Chromatographie.
-
Die Rf-Werte der Flecken betragen in beiden Fällen 0,85.
Beispiel 3: Parameter: Wanderunsgeschwindigkeit.
-
Es wird eine Natriumpyruvatbestimmung mit Hilfe der
erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt (vergleiche
Beispiel 2); die Wanderungsdauer beträgt 30 Minuten (± 1
Minute).
-
Für die Entwicklungen, die unter den gleichen
Arbeitsbedingungen, aber mit einer klassischen DC-
Vorrichtung durchgeführt werden, dauert die Wanderung 50
Minuten (± 2 Minuten).
-
Aus den vorstehenden Ausführungen folgt, daß die Erfindung
in keiner Weise auf diejenigen der Ausführungsformen und
Anwendungsformen, die soeben ausführlicher beschrieben
wurden, beschränkt ist; sie umfaßt im Gegensatz dazu alle
Varianten, die einem Fachmann auf dem Gebiet einfallen
können, ohne vom Umfang und Schutzbereich der vorliegenden
Erfindung abzuweichen.