DE69131409T2

DE69131409T2 - Ueberbrückte und nicht-überbrückte heterocyclische Spiroverbindungen

Info

Publication number: DE69131409T2
Application number: DE69131409T
Authority: DE
Inventors: Abraham Fisher; Yishai Karton; Haim Meshulam; Yoffi Segall; Ezra Shirin
Original assignee: Israel Institute for Biological Research
Current assignee: Israel Institute for Biological Research
Priority date: 1990-04-10
Filing date: 1991-04-09
Publication date: 2000-02-03
Anticipated expiration: 2011-04-10
Also published as: EP0452101A3; AU636047B2; IL97726A; ES2137926T3; JP3266624B2; EP0452101B1; ATE181920T1; CA2039826A1; CA2039826C; DE69131409D1; JPH06293761A; AU8124191A; EP0452101A2

Description

Die Erfindung betrifft 4- und 5-spiro(1,3-Oxazoline und 1,3-Thiazoline), worin der Ring, der mit Oxazolin oder Thiazolin spiroverknüpft ist, ein gesättigter heterozyklischer Ring mit oder ohne Brücke ist, der ein Stickstoffatom enthält, und pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Spiroverbindungen enthalten. Diese Verbindungen eignen sich potentiell zur Behandlung von Erkrankungen des Zentral- und peripheren Nervensystems, wobei diese Spiroverbindungen oder pharmazeutische Zusammensetzungen verwendet werden.
Neue Spiro-Chinuclidin-Verbindungen, worin die Oxathiolanringe spiroartig an Chinuclidinringe gebunden sind, sind bspw. beschrieben in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0205247, veröffentlicht am 17. Dezember 1986 und in den US-Patenten Nr. 4 855 290 (ausgegeben am 8. August 1989), 4 981 858 (ausgegeben am 1. Januar 1991), 4 900 830 (ausgegeben am 13. Februar 1990) und 4 876 260 (ausgegeben am 24. Oktober 1989). Diese neuen Verbindungen wirken auf das Zentralnervensystem. Die biologische Aktivität der Verbindung 2-Methylspiro(1,3-Oxathiolan-5',3)chinuclidin, die - je nachdem ob sich die 2-Methylgruppe auf der gleichen Seite des Oxothiolanrings wie das Chinuclidin-Ring- Stickstoffatom (cis) oder auf der anderen Seite davon (trans) befindet - als geometrische cis- und trans-Isomere vorkommt, wurde besonders eingehend untersucht. Vorklinische Tests haben ergeben, dass die cis-Verbindung (Code- Nr. AF102B) für die Bekämpfung der senilen Demenz des Alzheimer-Typs (SDAT) besonders erfolgversprechend ist. Es ist ebenfalls von Interesse, dass sich die cis- bzw. trans-Isomere optisch auflösen lassen. Die biologische Aktivität der optischen Isomere wurde ebenfalls in vielen Fällen untersucht.
Die Hauptaufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung neuer 4- und 5-Spiro-1,3-oxazolin und -1,3-thiazolin- Verbindungen, die sich von den vorstehend genannten Spirooxathiolan-/Chinuclidin-Verbindung unterscheiden. Weitere Aufgaben der Erfindung, und insbesondere solche, die die Bereitstellung geeigneter Zusammensetzungen und die Behandlung von Erkrankungen betreffen, werden aus der nachstehenden Beschreibung ersichtlich.
Die Erfindung stellt neue Verbindungen bereit, die den schematischen Strukturformeln (I) und (II) entsprechen:
einschließlich ihrer Enantiomere, Racemate und Säureadditions- und quartären Salze, wobei in Formel (I) Q -CH&sub2;CH&sub2;- ist, das an die Stellungen 1',4' oder 1',5' des sechsgliedrigen Rings gebunden ist, und in Formel (II) Q zwei Wasserstoffatome, (CH&sub2;)m oder C(CH&sub3;)&sub2;, ist, worin m 1, 2 oder 3 ist und n und p jeweils unabhängig voneinander 0, 1, 2 oder 3 ist, mit der Maßgabe, dass n + p = 1-3 ist, R&sub0; Wasserstoff, Methyl oder Hydroxyl ist,
der Rest
gleich
oder
R ausgewählt ist aus Wasserstoff, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, C&sub2;&submin;&sub6;-Alkenyl, C&sub2;&submin;&sub6;-Alkinyl, C&sub3;&submin;&sub7;-Cycloalkyl, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, substituiert mit 1 bis 6 Halogenatomen, Hydroxy, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxy, C&sub1;&submin;&sub6;- Alkylthio, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxy-C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl, Carboxy-C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl, (C&sub1;&submin;&sub6;- Alkoxy)carbonyl-C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl, Amino-C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl, Mono-(C&sub1;&submin;&sub6;- alkyl) amino-C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl, Di-(C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl) amino-C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl, 2- Oxopyrrolidin-1-yl-methyl, Aryl und C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, substituiert mit ein oder zwei Arylgruppen, wobei R zusätzlich ausgewählt ist aus NH&sub2;, NH-C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl und N(C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl)&sub2;, wenn R Teil von Formel (I) ist;
R' unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, aus der R ausgewählt ist, wenn R Teil der Formel (I) ist; C&sub1;&submin;&sub6;- Alkanoyl und Arylcarbonyl; und wobei Aryl steht für ein unsubstituiertes Phenyl oder ein Phenyl, substituiert mit 1 bis 3 Substituenten, ausgewählt aus Halogen, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxy und CF&sub3;, mit den Maßgaben (i), (ii) und (iii), nämlich:
(i) in Formel II, ist Q zwei Wasserstoffatome, n = p = 1, Rº Wasserstoff und R Phenyl, dann ist R' kein tert.-Butyl;
(ii) in Formel (II), ist Q zwei Wasserstoffatome, n = p = 1, Rº Wasserstoff und R p-Chlorphenyl und R' tert.-Butyl, dann ist der
Rest
weder
noch
(iii) in Formel II, ist Q zwei Wasserstoffatome, n = p = 1, Rº Wasserstoff, R 3,5-Dichlorphenyl, und R' tert-Butyl, dann ist der
Rest
was anderes als
Die erfindungsgemäßen Spiroverbindungen können gegenüber den vorstehend genannten optische Isomerie aufweisen. Optische Isomerie liegt insbesondere vor, wenn R und/oder R' asymmetrisch sind, und/oder der Spiroring, der nur ein einziges Stickstoffatom als Ring-Heteroatom enthält, hinsichtlich der Spiroverknüpfung asymmetrisch ist.
Viele der wie vorstehend definierten Verbindungen der Formeln (I) und (II) sind neu. Die Definitionen der Verbindungen der Formeln (I) und (II) enthalten eine Reihe von Maßgaben, damit der Schutz bestimmter Verbindungen des Standes der Technik ausgeschlossen wird. Bspw. offenbart US-A-3 629 276 u. a. eine Verbindung der Formel:
Dies ist die Verbindung der Formel (II), worin Q zwei Wasserstoffatome ist, n = p = 1, Rº Wasserstoff ist, R NH&sub2; ist und R' Methyl ist, und der Rest
ist
Sie gehört zu einer Reihe von Verbindungen, die von Harnden und Rasmussen (J. Med. Chem. 1970, 13: 305-308) auf ZNS-Aktivität untersucht wurden, jedoch nicht zu den fünf Verbindungen gehört, die als die wirksamsten aus der Reihe ausgewählt wurden. Bezüglich der Aktivität wird keine Information gegeben.
Die Verbindungen der Formel (II), worin Q zwei Wasserstoffatome ist, n = p = 1, Rº Wasserstoff ist, R Phenyl ist, und R' tert.-Butyl ist, sind bekannt, genauso wie diejenigen, in denen Q, n, p, Rº und R' diese Bedeutungen haben und die Reste R jeweils p-Chlorphenyl sind, wohingegen der Rest
entweder
oder
ist,
oder R 3,5-Dichlorphenyl ist, wohingegen der Rest
spezifisch
ist
(s. Jones et al., J. Chem. Soc. (B) 1308-1315, 1971), jedoch wurde keine biologische Aktivität für diese Verbindungen berichtet.
EP-350118 offenbart eine generische Klasse von Spiro- Azabicyclo-Verbindungen, die Muscarin-Agonisten sein sollen, einschließlich einer Subklasse, die der vorstehenden Formel (I) entspricht, wobei die Gruppe Q, die die 1'4'- Stellung überbrückt, eine Methylengruppe ist und der
Rest
ist, R wasserstoff ist, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy
oder ein gegebenenfalls substituierter gesättigter oder ungesättigter Kohlenwasserstoffrest. EP 350118 beschreibt jedoch nicht die chemischen oder biologischen Eigenschaften einer speziellen Verbindung dieser Subklasse.
Man erkennt, dass die vorstehend aufgeführten Maßgaben (i), (ii) und (iii) bei den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen nicht greifen.
Die Europäische Patentanmeldung Nr. 0 337 547 A1, veröffentlicht am 18. Oktober 1989, offenbart Verbindungen, die sich zur Behandlung von psychotischen Störungen, präseniler und seniler Demenz und anderer physiologischer Leiden eignen sollen, der nachstehenden Formel:
wobei die gestrichelte Linie eine wahlfreie Bindung in einer beiden Positionen angibt, A eine Gruppe der Formel
wiedergibt (worin R¹ und R² jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder spezielle Substituenten darstellt, V, N,
oder
ist, und W O, S oder NH ist, die mit bestimmten. Substituenten substituiert sein können), Q der Rest eines azyklischen oder azabizyklischen Systems ist, und zwei Gruppen aus X, Y und Z unabhängig ausgewählt sind aus O, S und N und die andere C ist, oder Y C=O sein kann. Diese Literaturstelle beschreibt jedoch keine Ergebnisse einer biologischen Untersuchung, stellt jedoch fest, dass einige der offenbarten Verbindungen (nicht angegeben) eine Affinität zu den 5-HT&sub3;-Rezeptoren aufweisen. Diese Literaturstelle gibt keine Hinweise auf die biologische Aktivität bezüglich der biologischen Aktivität zur Auswahl einer bestimmten Struktur vieler möglicher Strukturen, die durch Permutationen der Reste wiedergegeben werden, die mit den vorstehend genannten Symbolen Q, X, Y und Z bezeichnet werden, in Kombination mit dem essentiellen bizyklischen Rest A.
Der Brückenring in Formel (I) ist
I-Azabicyclo[2.2.2]oktan (Chinuclidin) oder 1-Azabicyclo[3.2.1]oktan.
Beispiele für den Ring, der spiroartig an den Oxazolin- oder Thiazolinring in Formel (II) ist, sind - wenn Q zwei Wasserstoffatome ist -Pyrrolidin, Piperidin und Hexamethylenimin, und - wenn Q etwas anderes als zwei Wasserstoffatome ist, 5-Azabicyclo[2.2.1]hexan, 6,6-Dimethyl-5-azabicyclo- [2.2.1]hexan, 7-Azabicyclo[2.2.1]heptan, 8-Azabicyclo[3.2.1]- oktan, 6-Azabicyclo[3.1.1]heptan, 7,7-Dimethyl-6-azabicyclo- [3.1.1]heptan, 8-Azybicyclo[3.2.1]oktan, 9-Azabicyclo[3.3.1]- nonan, 7-Azabicyclo[4.1.1]oktan, 8,8-Dimethyl-7-azabicyclo- [4.1.1]oktan, 9-Azabicyclo[4.2.1]nonan und 10-Azabicyclo- [4.3.1]decan.
Wie durch das Symbol R" in den Formeln (I) und (II) angegeben, können diese Ringsysteme durch Methyl oder OH ringsubstituiert sein.
Die erfindungsgemäß bereitgestellten Spiroverbindungen besitzen Aktivität auf das zentrale und periphere Nervensystem.
Bei der bevorzugten Praxis haben die Symbole den Formeln (I) und (II) die vorstehend definierten Bedeutungen, ausgenommen, dass nämlich der Rest
Rest
nur steht für
oder
und R nicht C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxy oder C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylthio sein kann.
Bei einer erfindungsgemäß bevorzugten Gruppe von Verbindungen der Formel (I) kann R Wasserstoff, NH&sub2;, NH-C&sub1;&submin;&sub6;- Alkyl, N(C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl)&sub2;, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl oder Aryl sein. Bei einer erfindungsgemäß bevorzugten Verbindungen der Formel (II) kann R ein Wasserstoffatom, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl oder Aryl sein, wohingegen R' Wasserstoff oder Methyl sein kann. Beispiele für die erfindungsgemäßen Verbindungen sind ohne Nachteil für die Allgemeingültigkeit der Erfindung:
2-Aminospiro(1,3-oxazolin-5,3')chinuclidin,
2-Methylspiro(1,3-oxazolin-5,3')chinuclidin,
2-Ethylspiro(1,3-oxazolin-5,3')chinuclidin,
2-Phenylspiro(1,3-oxazolin-5,3')chinuclidin
1-Methylpiperidin-4-spiro-4'-(2'-methyl-1',3'-oxazolin),
1-Methylpiperidin-4-spiro-4'-(2'-ethyl-1',3'-oxazolin),
2-Methylspiro(1,3-oxazolin-5,4')-1'-methylpiperidin,
2-Methylspiro(1,3-thiazolin-5,4')-1'-methylpiperidin,
2-Ethylspiro (1,3-oxazolin-5,4')-1'-methylpiperidin,
einschließlich deren Enantiomere, Racemate, Säureadditions- und quartären Salze.
Die Erfindung betrifft überdies pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von Erkrankun gen des zentralen und peripheren Nervensystems in Säugetieren, umfassend zumindest eine der erfindungsgemäßen Spiroverbindungen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen und pharmazeutischen Zusammensetzungen lassen sich bei Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen des zentralen und peripheren Nervensystems bei Säugetieren einsetzen, umfassend das Verabreichen einer zur Verwendung bei der Behandlung dieser Erkrankungen wirksamen Menge von zumindest einer der erfindungsgemäßen Spiroverbindungen an ein Säugetier. Die Maßgaben (i), (ii) und (iii) greifen nicht, wie vorstehend erwähnt, bei diesen Zusammensetzungen und Verfahren.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Herstellung der Oxazolinverbindungen der Formel (I)

Die vorstehenden Spiroverbindungen der Formel (I) lassen sich durch eine Reaktion herstellen, die die Bildung des Oxazolin- oder Thiazolinrings bewirkt. Bspw. lassen sich geeignete Ausgangsmaterialien für diese Cyclisierungsreaktionen gemäß der nachstehenden Reaktionsschemata A1 und B1 herstellen. Schema A1 Schema B1
Man beachte, dass in Schema B1 die Umsetzung von Natriumazid mit dem Epoxid von 3-Methylenchinuclidin in wässriger Lösung die Bildung eines einzigen Produktes 3- Azidomethylchinuclidin-3-ol bewirkt; die Zugabe zum letzteren nassaktiven Raney-Nickel bis zum Aufhören der Stickstoffentwicklung, ergibt die Bildung der gewünschten Verbindung. Die Hauptvorteile des Ansatzes in Schema B1 sind:
a) man muss keine Zwischenprodukte isolieren; und
b) man benötigt keine Hydrierungsvorrichtung, da der Wasserstoffgehalt des Katalysators ausreicht.
Man hat nun überraschend entdeckt, dass sich das 3- Aminomethylprodukt dieser beiden Reaktionsschemata leicht mit einer Carbonsäure RCOOH kondensieren lässt, so dass Spiroverbindungen erhalten werden, wohingegen man bisher annahm, dass die Bildung des Oxazolinrings durch Kondensation von Aminoalkohol und Carbonsäure nur ruhig verläuft, wenn der Aminoalkohol vollständig an dem Kohlenstoffatom, an das die NH&sub2;-Gruppe gebunden ist, substituiert ist [s. "Oxazolines, their Preparation, Reactions and Applications", J. A. Frunp, Chem. Rev. 71, 483-505 (1971)]. Das entsprechende Imidat RC(:NH)-O-Alkyl lässt sich alternativ anstelle der Carbonsäure RCOOH verwenden. Die Reaktionen, die Verbindungen der Formel I liefern, wenn der Brückenring bspw. Chinuclidin ist, lassen sich folgendermaßen darstellen: Schema C1
Zur Gewinnung der Spirochinuclidinverbindung, bspw. mit R = NH&sub2;, wird jedoch vorzugsweise Cyanogenbromid mit 3-Aminomethylchinuclidin-3-ol umgesetzt.
Man erkennt, dass man mit den vorstehenden Verfahren zwar effizient solche erfindungsgemäßen Verbindungen herstellen kann, bei denen X O ist und Y N ist, jedoch wären für die Anwendung ähnlicher Verfahren zur Herstellung der entsprechenden Subgruppe-(a)-Verbindungen, bei denen X N ist und Y O ist, ein geeignetes Ausgangsmaterial (veranschaulichend, wo der an Oxazolin spirogebundene Ring Chinuclidin ist) 3-Amino-3-hydroxymethylchinuclidin. Dieses Ausgangsmaterial lässt sich bspw. gemäß Schema D1 herstellen: Schema D1

Herstellung der Oxazolinverbindungen der Formel (II)

Die vorstehenden Spiroverbindungen der Formel (II) lassen sich herstellen, indem geeignet substituierte Verbindungen, die das gesättigte Nur-Stickstoff-Ringsystem enthalten, mit einem Reaktanten umgesetzt werden, der die Bildung eines Oxazolinrings bewirkt. Ein geeignetes Ausgangsmaterial ist daher bspw. 4-Aminomethyl-1-methylpiperidin-4-ol, das sich entweder aus 4-Nitromethyl-1- methylpiperidin-4-ol, bspw. als das HCl-Salz wie in Schema A2 oder aus 4-Azidomethyl-1-methylpiperidin-4-ol wie in Schema B2 herstellen lässt. Schema A2 Schema B2
Man beachte, dass in Schema B2 die Umsetzung von Natriumazid mit dem Epoxid von 4-Methylen-1-methylpiperidin in wässriger Lösung die Bildung eines einzigen Produktes 4- Azidomethyl-1-methylpiperidin-4-ol bewirkt; die Zugabe zum letzteren nassaktiven Raney-Nickel bis zum Aufhören der Stickstoffentwicklung ergibt die Bildung der gewünschten Verbindung. Die Hauptvorteile des Ansatzes in Schema B2 sind vorstehend in Zusammenhang mit Schema B1 angegeben.
Man hat jetzt überraschend entdeckt, dass das 3- Aminomethylprodukt beider Reaktionsschemata leicht mit einer Carbonsäure RCOOH kondensiert werden kann, so dass die Spiroprodukte erhalten werden, wohingegen man bisher annahm, dass die Bildung des Oxazolinrings durch Kondensation von Aminoalkohol und Carbonsäure nur ruhig verläuft, wenn der Aminoalkohol vollständig an dem Kohlenstoffatom, an das die NH&sub2;-Gruppe gebunden ist, substituiert ist [s. "Oxazolines, their Preparation, Reactions and Applications", J. A. Frunp, Chem. Rev. 71, 483-505 (1971)]. Das entsprechende Imidat RC(:NH)-O-Alkyl lässt sich alternativ anstelle der Carbonsäure RCOOH verwenden. Die Reaktionen, die Verbindungen der Formel II liefern (z. B. im Fall von Spirooxazolidin/Piperidinen), lassen sich folgendermaßen darstellen: Schema C2
Man erkennt, dass man mit den vorstehenden Verfahren zwar effizient solche erfindungsgemäßen Verbindungen herstellen kann, bei denen
gleich
jedoch wäre für die Anwendung ähnlicher Verfahren zur Herstellung der entsprechenden Subgruppe-(a)-Verbindungen, bei denen
gleich
ein geeignetes Ausgangsmaterial (veranschaulichend, wo der an Oxazolin spirogebundene Ring Piperidin ist) 4-Amino-4- hydroxymethyl-1-methylpiperidin. Dieses Ausgangsmaterial und das Endprodukt lassen sich bspw. gemäß Schema D2 oder E herstellen: Schema D2 Schema E

Herstellung der Oxazoline- und Thiazolinverbindungen (I) & (II)

Wenn
gleich
oder
lassen sich diese Verbindungen und Oxazolinanaloga durch die nachstehenden Schemata F und G herstellen, bspw. wenn der an Thiazolin oder Oxazolin spirogebundene Ring Piperidin oder Chinuclidin ist: Schema F Schema G
Zusätzliche Verfahren umfassen das Herstellen des entsprechenden Epoxids oder Thioepoxids und das Umsetzen mit einem geeigneten Nitril, wie in Schema H, wobei der an den Oxazolin- oder Thiazolinring spiroverknüpfte Ring Piperidin oder Chinuclidin ist. Schema H
(X = O oder S)
(X = O oder S)
Die Verbindungen der Formel (I) und (II) umfassen unabhängig davon, ob sie an sich eine erfindungsgemäße Ausführungsform darstellen oder in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten sind, oder in erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, Additions- und quartäre Salze dieser Verbindungen. Säureadditionssalze für den pharmazeutischen Gebrauch umfassen diejenigen, die aus Säuren hergestellt werden, wie Salz-, Bromwasserstoff-, Fumar-, Malein-, Oxal-, Malon-, Äpfel-, Essig-, Citronen-, Wein-, Dibenzoyl-D- und -L-Wein-, Ditoluoyl-D- und -L-Wein-, Salicyl-, Kohlen-, Asparagin- und Glutaminsäuren. Weisen die erfindungsgemäßen Spiroverbindungen optische Aktivität auf, lassen sich die Racemate mit den op tisch aktiven Säuren auflösen, wie Dibenzoyl-L- oder D- Weinsäure, Ditolyl-L- oder D-Weinsäure.
Es sind zumindest diejenigen erfindungsgemäßen Spiroverbindungen zentral aktive Muscarinagonisten, bei denen R Methyl ist. Diese Verbindungen können aufgrund ihrer pharmakologischen Eigenschaften zentrale cholinerge Funktionen unter Bedingungen aktivieren, unter denen das cholinerge System hypofunktionell ist.
Die erfindungsgemäßen Spiroverbindungen sind gewöhnlich potentiell geeignet für präsenile und senile Demenz, senile Demenz vom Alzheimer-Typ (SDAT), atypische Alzheimer-Erkrankung (Perry et al., Advances in Neurology, Hrsg. R. J. Wurtman et al., 51 : 41, 1990), kombinierte Multiinfarkt-Demenz und Alzheimer-Erkrankung, altersabhängige Gedächtnisstörungen (AAMI), akute Geistesverwirrungen, emotionale und Aufmerksamkeitssörungen, Manie, Spät- Dyskinesie, Hyperkinesie, Alzheimer-Parkinson- Mischerkrankung, Aphasie, halluzinatorische Zustände, postenzephalitisches Amnesiesyndrom, Alkoholentzugssyndrome, Huntington-Chorea, Pick-Erkrankung, Friedreich-Ataxie, Gilles-de-la-Tourette-Erkrankung und Down-Syndrom, da all diese Erkrankungen Störungen sind, bei denen eine zentrale cholinerge Hypofunktion zumindest in gewissem Ausmaß beteiligt ist. Die erfindungsgemäßen Spiroverbindungen sind zudem potentiell analgetische Mittel und eignen sich daher zur Behandlung schwerer schmerzhafter Leiden, wie Rheuma, Arthritis und einer unheilbaren Krankheit. Die erfindungsgemäßen Spiroverbindungen, in denen R Methyl ist, scheinen einen bestimmten potentiellen Wert zur Behandlung von SDAT und verwandter Störungen zu haben.
Die erfindungsgemäßen Spiroverbindungen lassen sich verwenden in Kombination mit Acetylcholinesterase- Inhibitoren, wie Physostigmin oder Tetrahydroaminoacridin; in Kombination mit Acetylcholin-Vorstufen, wie Cholin oder Lecithin; zusätzlich zu "Nootropika", wie Piracetam, Aniracetam, Oxiracetum oder Pramiracetam; zusätzlich zu Verbindungen, die mit Ca²&spplus;-Kanälen wechselwirken, wie 4- Aminopyridin oder 3,4-Diaminopyridin; oder zusätzlich zu Peptiden, die modulatorisch auf die Freisetzung von Acetylcholin wirken, wie Somatostatin; in Kombination mit einem peripheren antimuscarinischem Mittel (wie Pirenzepin, N-Methylatropin, N-Butylscopolamin, Propanthelin, Methanthelin, Glycopyrrolat, oder Tropenzilium), um periphere nachteilige Wirkungen zu bekämpfen, die bei hohen Dosen erwartet werden können, wie Speichelfluss, Diarrhö, Magensekretion oder Erbrechen, oder in Kombination mit transdermalem Scopolamin, wie Scopoderm®, um Übelkeit und/oder Erbrechen zu bekämpfen; in Kombination mit Antidepressiva, wie Nortriptylin, Amitryptilin, Imipramin, Minaprin, um die kognitiven Störungen und depressiven Symptome zu lindern, die gelegentlich mit SDAT, AAMI, SDAT/Parkinson- Mischerkrankung (PD) einhergehen; in Kombination mit M2- antimuscarinischen Medikamenten, wie Secoverin, AFDX-116 (vgl. Hammer et al., Life Sci. 38: 1653, 1986), um periphere nachteilige Nebenwirkungen zu bekämpfen, die bei hohen Dosen der Verbindungen erwartet werden, um inhibitorische Wirkungen dieser Agonisten an den zentralen inhibitorischen präsynaptischen und postsynaptischen Rezeptoren vom M2-Typ zu bekämpfen, und die Freisetzung von Acetylcholin über die Hemmung inhibitorischer M2- Autorezeptoren an intakten Nervenendfasern zu verstärken; in Kombination mit nikotinsauren Agonisten, wie Nikotin, um Nikotin- und Muscarinrezeptoren im Gehirn zu stimulieren; in Kombination mit einem adrenergen Agonisten (Clonidin oder Quanfamicin), um die kognitiven und anderen Störungen zu lindern, die mit einer cholinergen-noradrenergen Mischdefizienz bei SDAT einhergehen; in Kombination mit Inhibitoren der neuronalen Serotonin-Wiederaufnahme, wie Alaproclat, Zimelidin, um die kognitiven und anderen emotionalen Funktionen bei SDAT zu mildern, in Kombination mit Monoaminoxidase-B-Hemmern, wie Deprenyl, um kognitive und andere motorische Störungen zu lindern, die mit Mischleiden, wie SDAT/PD, einhergehen; in Kombination mit Nerven-Wachstumsfaktor (NGF, welcher entweder durch ein Nasenspray oder intracerebroventriculär verabreicht wird). Die erfindungsgemäßen Spiroverbindungen lassen sich mit oder ohne die vorstehend genannten aktiven Substanzen verabreichen, bspw. durch Injektion in einem geeigneten Verdünnungsmittel oder einem geeigneten Träger, oral, rektal in Form von Zäpfchen, durch Insufflation oder Nasenspray, durch Infusion oder transdermal in einem geeigneten Vehikel mit oder ohne Physostigmin oder Tetrahydroaminoacridin, bspw. durch Verwendung der Vorrichtung, die Gegenstand des US-Patentes Nr. 2 163 347 (ausgegeben am 29. November 1988).
Die erfindungsgemäßen Spiroverbindungen, insbesondere wobei R = Methyl, sind auch für die Behandlung von Störungen potentiell geeignet, die die Anwendung eines langwierigen cholinergen Mittels mit milder lokaler Aktivität erfordern. Ein solches Mittel wird bei Störungen, wie Glaukom, benötigt, da die Verbindung durch das Enzym, das Acetylcholin desaktiviert, nicht zerstört wird, d. h. Acetyl- und Butyrylcholinesterase. Es lässt sich auch zur Behandlung peripherer cholinerger Störungen, wie Myasthenia gravis, Harnblasendysfunktionen, Adi-Erkrankung und Eaton- Lambert-Erkrankung, verwenden. Diese Verbindungen lassen sich auch bei Störungen verwenden, bei denen eine cholinerge Unteraktivität durch Medikamente hervorgerufen wird.
Die erfindungsgemäßen Spiroverbindungen, insbesondere diejenigen, bei denen R C&sub3;&submin;&sub6;-Alkyl oder Aryl ist, sind anscheinend anticholinerge Mittel und können - unabhängig davon, ob spontan oder medikamenteninduziert - potentiell zur Behandlung von Störungen aufgrund einer cholinergen Hyperfunktion verwendet werden. Diese Verbindungen sind bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen potentiell nützlich, wie bei PD, Pseudo-PD, Misch-AD/PD, primären Dystonien, krampfhaftem Schiefhals, kranialer Dystonie, Depression, Fahrkrankheit, Akathisia (nach neuroleptischem Entzug), zentraler Hypertonie, Kopfverletzung beim Menschen, Spätdyskinesie-PD-Mischerkrankung, manischer Depression, als Hilfsmittel in der Chirurgie statt Atropin, Scopolamin usw., bei Intoxikation aufgrund einer erhöhten acetylcholinartigen Hemmung von Acetylcholinesterase. Die se lassen sich zudem in der Ophthalmologie verwenden, und zwar wenn entweder eine verlängerte oder kurzzeitige Mydriasis erforderlich ist.
Die erfindungsgemäßen Spiroverbindungen lassen sich auch potentiell bei der Behandlung von Erkrankungen einsetzen, die durch übermäßige peripher-ähnliche Aktivität gekennzeichnet sind, wie Asthma, chronische obstruktive Lungenerkrankung und Magengeschwür. Bei diesen peripheren Leiden wird empfohlen, quartäre Salze der Formeln (Ia), (Ib) und (IIa) einzusetzen.
wobei das tertiäre Stickstoffatom durch R" quarternisiert wird, wenn dieser Rest bspw. Nieder-(C&sub1;&submin;&sub6;)-alkyl, Aryl, wie Phenyl, oder arylsubstituiertes C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, wie Benzyl, ist.
Die Erfindung wird anhand der nachstehenden nicht- einschränkenden Beispiele beschrieben.

Beispiel 1: 2-Methylspiro(1,3-oxazolin-5,3')chinuclidin.

(a) 3-Nitromethylchinuclidin-3-ol.

Chinuclidin-3-on (125 g, 1 Mol) wurde durch azeotrope Destillation (40% Gew./Gew. in Toluol) getrocknet und in einem 3-1-Kolben vorgelegt, der mit einem mechanischen Rührer ausgestattet war. Es wurde 1 l methanolisches Natriumoxid zugegeben, und die klare Lösung wurde bei 15- 20ºC gerührt. Dann wurden 61 g Nitromethan(1,0 Mol), gelöst in 500 ml absolutem Ethanol über 0,5 Std. hinzugegeben, wobei die Temperatur unter 20ºC gehalten wurde. Die Lösung wurde mit HCl-Isopropanol auf pH-Wert 1 angesäuert, filtriert und getrocknet, so dass 160 g Rohprodukt erhal ten wurde, das als solche für den nächsten Schritt verwendet wurde.
¹H-NMR (D&sub2;O, DSS) (HCl-Salz) δ 3,79 (d als Teil eines AB-Spektrums, 1H von CH&sub2;NO&sub2;), 3,38-3,33 (m, 7H), 2,36 (m, 1H), 2,36-1,95 (m, 4H).

(b) 3-Aminomethylchinuclidin-3-ol

(i) Durch Reduktion von 3-Nitromethylchinuclidin-3-ol.

Eine Lösung von 3-Nitromethylchinuclidin-3-ol- Hydrochlorid in Methanol wurde durch katalytische Hydrierung mit 10% Pd auf Aktivkohle reduziert, so dass das HCl- Salz von 3-Aminomethylchinuclidin-3-ol erhalten wurde, das aus Methanol-Isopropanol umkristallisiert wurde, so dass das Produkt als weiße Kristalle erhalten wurden.

(ii) Über das Azid.

3-Methylenchinuclidinepoxid (25 g, 0,18 Mol) und Natriumazid (20 g, 0,3 Mol) wurden in 50 ml Wasser gelöst. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, mit Chloroform (2 · 200 ml) extrahiert, und die Extrakte wurden durch Eindampfen eingeengt. Der ölige Rückstand, der 3-Azidomethylchinuclidin-3-ol enthielt, wurde in Wassers gelöst und nassaktives Raney-Nickel wurde portionsweise unter Rühren hinzugegeben, bis die Wasserstoffentwicklung aufhörte (35 g). Das Gemisch wurde filtriert, das Filtrat wurde durch Eindampfen eingeengt, und der Rückstand wurde aus Isopropanol umkristallisiert, wobei 9a reines 3-Aminomethylchinuclidin-3-ol erhalten wurden.
m/z M&spplus;, Basis-Peak m/e 139 (M-NH&sub3;) und m/z 96, was für das Chinuclidin-Skelett typisch ist.
¹H-NMR (D&sub2;O, DSS) (freie Base): δ 1,3-2,0 (5H); 2,3-3 (8H).
(di-HCl-Salz): δ 1,8-2,4 (m, 5H); 3,2-3,5 (m, 8H).
Das ¹H-NMR-Spektrum des Dihydrochlorid-Salz zeigt gegenüber der freien Base eine Abwärtsverschiebung von sechs Wasserstoffatomen, die an Kohlenstoffatome neben Stickstoffatomen gebunden sind (bspw. δ 2,5-2,9 auf 3,3-3,5 ppm), was der erwarteten Struktur entspricht.

(c) 2-Methyl-spiro(1,3-oxazolin-5,3')chinuclidin (AF125).

(i) Ethylacetamid-Verfahren

3-Aminomethylchinuclidin-3-ol (9,1 g, 0,058 Mol) wurde in 500 ml Dichlormethan gelöst; Ethylacetamidat-HCl- Salz (14 g, 0,11 Mol) wurde hinzugegeben, und das Gemisch wurde sechs Std. bei 5ºC gerührt. Die Lösung wurde mit Dowex 1 alkalisch gemacht, filtriert, und das Lösungsmittel wurde verdampft, wobei ein öliger Rückstand erhalten wurden, der bei 60-65ºC/0,5 mm Hg destilliert wurde, wobei AF125 als farblose Flüssigkeit erhalten wurde.
m/z (M&spplus;) 181 Basis-Peak, 139 (M-CH&sub3;CN).
¹H-NMR (CDCl&sub3;-TMS): δ 1,97 (dd, 3H) (J = 1,3 Hz); 2,8-2,9 (m, 1H); 3,14 (d, 1H) (J = 12 Hz); 3,5 (dd, 1H) (J = 13 Hz), 3,12 (d, 1H) (J = 12 Hz); 3,5 (dd, 1H) (J = 13 Hz), 3,96 (dd, 1H) (J = 13 Hz, 1,3 Hz).
Die ¹H-NMR-Analyse und Spinentkopplungsexperimente ermöglichen die Zuordnung des Wasserstoffs neben C&sub2;, C&sub9; und dem Methylrest. Die Wasserstoffatome neben C&sub9; zeigen jeweils ein doppeltes Dublett (J = 13 Hz gem-Kupplung) und eine Homoallyl-Kupplung mit der Methylgruppe (J = 1,3 Hz). Die Strahlung bei 1,97 (Methylgruppe) bewirkt das Verschwinden der Homoallyl-Kupplung bei 3,5 und 3,9 ppm und umgekehrt. Die Strahlung bei 3,5 erzeugt das Signal bei 3,96 und umgekehrt, was auf der geminal-Kupplung von H9a und H9b (Tabelle 1) beruhen muss.
Das C¹³-NMR-Spektrum (in CDCl&sub3;) ist sehr informativ und ermöglicht die Zuordnung der meisten Resonanzen zu den geeigneten Kohlenstoffatomen.
¹³C-NMR (CDCl&sub3;-TMS): δ 13,2 (CH&sub3;); 20,5 (CH&sub2;CH); 21,5 (CH&sub2;CH); 30,0 (CHCH&sub2;); 45,3, 45,7 (CH&sub2;CH&sub2;N); 62,2 (CH&sub2;N); 84,0 (COCH&sub2;); 165 (CCH&sub3;).
GC (ein Peak: Säule 25 m, Durchmesser 0,2 mm, Packung 5% Phenymethylsilikon; Detektor-Typ FID; Temperatur: Säule 125ºC, Einspritzöffnung 220ºC, Detektor 220ºC, Trägergas: N&sub2;, 0,7 ml/min. Retentionszeit: 6,2 min. Tabelle 1: ¹H-NMR-SPEKTREN VON (+)AF125
n. e. nicht durchgeführt

(ii) Essigsäureverfahren.

3-Aminomethylchinuclidin-3-ol (10 g) wurde in Essigsäure (50 ml) gelöst, azeotrop destilliert in Xylol für 30 Std., und die Lösung wurde gekühlt und mit kaltem wässrigem Kaliumcarbonat alkalisch gemacht. Die organische Phase wurde getrocknet und verdampft, so dass 5,3 g Rohprodukt erhalten wurden, das unter reduziertem Druck (60-65ºC/0,5 mm Hg) destilliert wurde, so dass eine farblose Flüssigkeit erhalten wurde, die unter Kühlen fest wurde. Die erhaltene Verbindung war identisch zu dem durch Verfahren (c) (i) erhaltenen AF125.

(d) Optische Auflösung von AF125

(Vorbemerkung: Aufgrund der Möglichkeit, dass das zur Bestimmung der Daten der optischen Drehung verwendete Polarimeter nicht zuverlässig gewesen sein könnte, wurde die Reinheit der optischen Isomere wie nachstehend beschrieben mit ¹H-NMR bestimmt).
Zu einer gerührten kalten Lösung von AF125 (15,5 g, 0,085 M) in Aceton (150 ml) wurde tropfenweise eine Lösung von Dibenzoyl-L-Weinsäure (18,8 g, 0,05 M) gegeben. Sofort schied sich ein kristallines Material ab. Das ausgefällte Salz wurde gesammelt und gereinigt, indem es in heißem Isopropanol gelöst, gekühlt und die kalte Lösung bis zur Trübung mit Ether versetzt wurde. Eine Wiederholung dieses Vorgangs ergab ein Produkt mit konstanter optischer Drehung [α]D²&sup0; = -28º (MeOH): Schmp. 145ºC.
Auf ähnlich Weise wurde das entsprechende Salz des anderen Enantiomers erhalten, und zwar ausgehend von AF125 (14,74 g, 0,08 M) und Dibenzoyl-D-weinsäure (17,76 g, 0,047 M) der entsprechenden Weinsäure. Nach 3 Kristallisationenhatte das Produkt [α]D²&sup0; = +26º (MeOH); Schmp. 145ºC.
Die jeweiligen freien Basen wurden durch Neutralisation der Salze mit einer 10%igen K&sub2;CO&sub3;-Lösung und mehreren Chloroform-Extraktionen erhalten. Die vom Salz der Diben zoyl-D-Weinsäure hergeleitete freie Base hatte [α]D&sub2;&sub0; = - 43º (MeOH), wohingegen diejenige, die sich vom Salz der Dibenzoyl-L-Weinsäure ableitetet, eine [α]D&sub2;O = +36º (Me- OH).
Wie vorstehend angegeben, wurde die optische Reinheit der Enantiomere durch ¹H-NMR gezeigt. Somit ergab das ¹H- NMR-Spektrum von AF125 als Racemat in Gegenwart des optisch aktiven Trennmittels (s)(+) 2,2,2-Trifluor-1-(9- anthryl)-ethanol zwei optische Isomere. Der Unterschied der chemischen Verschiebung (in C&sub6;D&sub6;) eines der Wasserstoffatome, das an C&sub2; gebunden ist, ermöglichte die Bestimmung der optischen Reinheit von AF125. Jedes abgetrennte Enantiomer ergab nur ein Dublett (zur Hälfte ein AB-Spektrum) für eines dieser Wasserstoffatome an C&sub2;.

Beispiel 2: 2-Ethylspiro(1,3-oxazolin-5,3')chinuclidin (AF123)

Entsprechend Beispiel 1(c) wurde die Titelverbindung erhalten durch Kondensation von 3-Aminomethylchinuclidin- 3-ol mit Propansäure, gefolgt von Azeotropdestillation in Xylol. Die Reinigung des rohen AF123 wurde durch Vakuumdestillation unter reduziertem Druck bewerkstelligt.
m/z: M 195, Basis-Peak.
¹H-NMR (CDCl&sub3;-TMS): δ 4,0 (d, 1H) (J = 13 Hz); 3,55 (d, 1H) (J = 13 Hz); 3,1 (d, 1H); 2,7-2,9 (m); 2,3 (q, 2H) (J = 7,5 Hz, CH&sub2;CH&sub3;); 1,1 (t, 4H) (J = 7,5 Hz, CH&sub3;).
GC (gleiche Bedingungen wie für AF125; ein Peak): Retentionszeit, 8,86 min.

Beispiel 3: 2-Aminospiro(1,3-oxazolin-5,3')chinuclidin AF125 (N)

Das Aminooxazolin-Derivat AF125(N) ist ein Beispiel für einen elektronenreichen Oxazolinring, da der Amino- Stickstoff an die Doppelbindung konjugiert ist, was die negative Ladung am Imino-Sticktoff verstärkt.
N = C - NH&sub2; ←→ N&supmin; - C = NH&sub2;&spplus; < => NH - CH
3-Aminomethylchinuclidin-3-ol (6 g) und Cyanogenbromid (3,5 g) wurde in Methanol (200 ml) gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 5 Std. bei Raumtemperatur gerührt und dann unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde auf einer Aluminiumoxid-Säule (300 g) gereinigt, wobei ein Multisystem-Lösungsmittel als Elutionsmittel verwendet wurde (1,5 : 1,0 : 0,2 : 0,06 CHCl&sub3;/Ether/Methanol/NH&sub4;OH). Eine nahezu reine Fraktion von 450 mg wurde erhalten, die schließlich durch Verreiben mit Aceton gereinigt wurde, so dass ein reines kristallines Material erhalten wurde. Die erste chromatographischer Trennung ergab ebenfalls verschiedene Produkte, einschließlich 2 g des reinen gewünschten Produktes, welches auf einer Silicasäule weiter aufgetrennt wurde, wobei 2% NH&sub3; in Methanol als Elutionsmittel verwendet wurde. Das reine Produkt hatte einen Schmp. von 135- 136ºC.
¹H-NMR (CDCl&sub3;-TMS: δ 3,83, 3,43, 3,2 (3 Dubletts, 3H, Hb und Hc, J = 0,048 Hz); (m, 5H) 1,9 (b, 2H); 1,5 (m, 3).
FAB-MS zeigte ein molekulares Ion (M+1)&spplus; 182

Beispiel 4: 2-Phenylspiro(1,3-oxazolin-5,3')chinuclidin AF125 (pH-Wert)

Eine Suspension aus 3-Aminomethylchinuclidin-3-ol (2 g, 0,01 Mol) und Ethylimidobenzoat-Hydrochlorid (2 g, 0,01 Mol) in Ethanol (200 ml) wurde 24 Std. bei Raumtemperatur gemischt. Nach Filtration und Einengen des Filtrats durch Verdampfen wurde der rohe Rückstand mit NaHCO&sub3; basisch gemacht und mit Dichlormethan basisch gemacht. Die organischen Extrakte wurden durch Eindampfen eingeengt, und der rohe Rückstand wurde auf einer Aluminiumoxidsäule (30 g, 1,5 cm Durchmesser) aufgetrennt, wobei ein Multi- Lösungsmittel (1,0 : 1,0 : 0,2 : 0,026 CHCl&sub3;/Ether/Methanol/32% wässr. NH&sub4;OH) als Elutionsmittel verwendet wurde. Das Produkt wurde rasch eluiert (nach 40 ml). Das Lösungsmittel wurde ohne Erhitzen verdampft, und es wurde ein weißer Feststoff erhalten, Schmp. 65-70ºC.
¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 7,955 (2H), 7,72 (2H), 4,16 (d, 1H) 3,73 (d, 1H), 3,26 (d, 1H), 2,93 (d, 1H) und (t, 2H), 2,77 (t, 2H), 2,2 (m, 1H), 1,95 (m, 1H), 1,60-1,52 (m, 3H) ppm.
IR (CHCl&sub3;) 2920, 2900, 2850sh, 1640sh, 1630, 1625sh, 1440, 1337, 1265, 1250, 1070, 1050, 1035, 1005, 965 cm&supmin;¹. m/z: 242 (60%) [m+], 198 (30%), 171 (12%), 149 (10%), 139 (50%), 124 (17%), 122 (20%), 121 (20%), 117 (30%), 111 (12%), 105 (33%), 96 (100%), 82 (50%), 69 (42%) 55 (36%).

CHEMISCHE UND PHYSIKALISCHE EIGENSCHAFTEN DER VERBINDUNGENDER FORMEL(I)

Die meisten dieser Verbindungen sind relativ stabil. AF125 ist bspw. thermisch stabil und lässt sich bei 130ºC ohne Zersetzung destillieren. Sein chemisches Verhalten ähnelt dem bekannter 2-Oxazolin-Derivate. Die freie Base zeigt in wässriger Lösung eine leichte Zersetzung nach einigen Stunden, was mit der Zeit allmählich zunimmt. Die Bildung von Zersetzungsprodukten lässt sich mit ¹H-NMR durch Untersuchung an zwei Bereichen δ 3,3-3,5 (Erscheinen zweier Dublett) und 1,9-2,0 ppm (Erscheinen zweier zusätzlicher Singuletts) überwachen.
Das erwartete Zersetzungsmuster (wenn bspw. X O ist und Y N ist) umfasst die Öffnung des Oxazolinrings unter Bildung des Amids und des Esters, wie in Schema E gezeigt, wobei die von Chinuclidin-abgeleiteten Verbindungen veranschaulichend dargestellt sind. Die Bildung von zwei neuen Singuletts bei δ 1,9-2,0 ppm, wie erwartet für R = Me, dieser beiden Strukturen stimmt mit dieser Annahme überein. Schema J
Das gleich Zersetzungsmuster wird gezeigt für R = Et (AF123). Die Ringöffnung erfolgt viel schneller als in Gegenwart von verdünnter Salzsäure. Die Erwärmung der Tartrat- und Mandelat-Salze in Tetrahydrofuran bewirkte ebenfalls eine partielle Zersetzung. Das Bestreben dieser Salze, sich zu zersetzen, kompliziert die optische Trennung von Verbindungen, wie AF125 und AF123. Dieses Problem lässt sich durch Verwendung des Verfahrens bewältigen, das für die optische Trennung der AF125-Enantiomere beschrieben wurde, oder alternativ lassen sich die Aminoalkohole, wie 3-Aminomethylchinuclidin-3-ol auflösen, und die getrennten Enantiomere können dann mit einem Ester oder Imidat wie bereits beschrieben cyclisiert werden. Bei einer weiteren Alternative können die N-Acyl-Derivate von (bspw.) 3-Aminomethylchinuclidin-3-ol getrennt werden, und die getrennten Enantiomere lassen sich dann per se, wie in Schema K gezeigt, cyclisieren. Schema K
Für diese Cyclisierung lässt sich bspw. p-Toluolsulfonsäure oder Bortrifluoridetherat verwenden.

Beispiel 5: 2-Methyl-spiro(1,3-oxazolin-5,4')-1'-methylpiperidin (II, R = R' = Methyl = "AF150)

(a) 1-Methyl-4-nitromethylpiperidin-4-ol-Hydrochlorid

Dieses Ausgangsmaterial wurde unter leichter Abwandlung des Verfahrens von A. D. Cale (US 4 746 655, 1988) hergestellt. Ein Gemisch aus N-Methylpiperidinon (142 g, 128 Mol) und Nitromethan (78,1 g, 1,28 Mol) wurde zu einer gut gerührten 20%igen Natriumethoxid-Lösung (1,28 Mol) in Ethanol gegeben, wobei die Innentemperatur bei 5-8ºC gehalten wurde. Es fiel ein weißer Feststoff aus, und es wurde 20 min und weitere 40 min bei Raumtemperatur gerührt. Die erhaltene Lösung wurde mit 500 ml 7,2 N HCl in Isopropylalkohol angesäuert. Das Hydrochlorid und die anorganischen Salze wurden mit CH&sub3;OH (3 · 200 ml) extrahiert, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, so dass die Titelverbindung erhalten wurde, Schmp. 180-182ºC (nicht hygroskopisch).
m/z: 174 (M&spplus; der freien Base, 100%), 157 (M-OH, 20%), 127 (M-H-NO&sub2;, 25%), 113 (M-NO&sub2;-CH&sub3;, 40%).

(b) 4-Aminomethyl-1-methylpiperidin-4-ol-Hydrochlorid

Palladium auf Kohle (10% 4 g) wurde portionsweise zu einer Lösung aus 1-Methyl-4-nitromethylpiperidin-4-ol (133,5 g) in Methanol (1500 ml) gegeben. Die Verbindung wurde 48 Std. in einem Parr-Hydrogenator bei einem Druck von 55 psi bei Raumtemperatur hydriert. Die Lösung wurde vorsichtig filtriert, mit Aktivkohle behandelt, das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand mit Ethanol (200 ml) verrieben, so dass die Titelverbindung erhalten wurde, Schmp. 177-179ºC.
m/z: 144 (M&spplus; der freien Base, 15%), 127 (M-OH, 25%), 114 (M-CH&sub2;-NH&sub2;, 100%).

c) 2-Methyl-spiro(1,3-oxazolin-5,4')-1'-methylpiperidin (AF150)

Eine Lösung von KOH (1,43 g von 86%) in Methanol (50 ml) wurde zu einer Lösung von 4-Aminomethyl-1- methylpiperidin-4-ol-Hydrochlorid (3,61 g, 0,02 Mol) in absolutem Methanol (50 ml) gegeben. Nach 10minütigem Rühren wurde eine Lösung von Ethylacetimidat-Hydrochlorid (2,7 g) in 20 ml absolutem Methanol zugegeben, und es wurde weitere 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und der restliche Feststoff wurde in einer Lösung aus 2,8 g Na&sub2;CO&sub3; in 50 ml Wasser gelöst, die dann im Vakuum bis zur Trockne eingeengt wurde. Der weiße Feststoff wurde mit 2 · 50 ml Chloroform extrahiert, mit Aktivkohle behandelt, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und das Lösungsmittel entfernt, so dass die Titelverbindung erhalten wur de (62,5% Ausbeute), Schmp. 45ºC (sublimierte bei 40ºC/0,05 mm Hg), die einen einzigen Fleck bei Silica-DSC ergab, wobei mit 2% NH&sub3; in CH&sub3;OH, Rf = 0,4, eluiert wurde.
m/z: 168 (M&spplus; der freien Base, 100% bei 7,5 eV),
¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 3,56 (2H, q, J = 1,5 Hz), 2,53 (4H, m), 2,34 (3H, s), 1,96 (3H, t, J = 1,5 Hz), 1,82 (4H, m).
Durch Austauschen des in diesem Beispiel verwendete KOH durch die äquivalente Menge NaOH oder Et&sub3;N, wurden ähnliche Ergebnisse erhalten.

(d) 2-Methyl-spiro(1,3-oxazolin-5,4')-1'-methylpiperidin- Dibenzoyl-D-tartrat

Eine heiße Lösung von Dibenzoyl-D-weinsäure (5,4 g 15 mmol) in 500 ml Toluol wurde unter Rühren zu AF150 (5,5 g 32 mmol), gelöst in 200 ml wasserfreiem Toluol, gegeben. Der Niederschlag konnte absitzen, und die Überstandsflüssigkeit wurde abdekantiert. Der restliche Feststoff wurde mit 3 · 100 ml wasserfreiem Toluol gewaschen und unter reduziertem Druck getrocknet, wobei 8,4 g (80%ige Ausbeute) eines weißen, leicht hygroskopischen Feststoffs erhalten wurde.
DSC Chloroform/Aluminiumoxid (Merck, Art. 5581) Rf = 0,4 m/z: 168 (M&spplus;)
¹H-NMR (300 MHz, D&sub2;O mit 1,5 mg Na&sub2;CO&sub3;/0,5 ml D&sub2;O): δ 1,95 (s, 6H, CH3-C), 2,35 (s, 6H, CH&sub3;-N), 3,5 (s, 4H, CH&sub2;), 5,7 (s, 2H), 7,5-8,2 (m, 10H, aromatische Wasserstoffatome).

Beispiel 6: 2-Ethylspiro(1,3-oxazolin-5,4')-1'-ethylpiperidin (II; R = Ethyl, R' = Methyl)

Diese Verbindung wurde ähnlich zur Verbindung von Beispiel 5 hergestellt, wobei die äquivalente Menge Ethylpropionimidat-Hydrochlorid anstelle von Ethylacetimidat- Hydrochlorid verwendet wurde. Das Produkt wurde als Flüssigkeit erhalten, Sdp. 53ºC/0,03 mm Hg, in 60,5% Ausbeute.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 3,52 (2H, t = 1,5 Hz), 2,47 (4H, m), 2,30 (3H, s), 2,26 [2H, Quartett (J = 7 Hz) Tripletts (J = 1,5 Hz)], 1,86 (2 H, m), 1,72 (2H, m), 1,18 (3H, t).

Beispiel 7: 1-Methylpiperidin-4-spiro-4'-(2'-methyl-1',3'- oxazolin (II; R = R' = Methyl - "AF151")

(a) 1-Methylpiperidin-4-spiro-5'-hydantoin

Ein Gemisch von Lösungen von 1-Methylpiperidin-4-on (36,44 g, 0,322 Mol) in Ethanol (150 ml), Ammoniumcarbonat (93; 0 g, 0,968 Mol) in Wasser (400 ml) und Kaliumcyanid (25,8 g, 0,396 Mol) in Wasser (82 ml) wurde 2,5 Std. bei 60ºC erhitzt und dann über Nacht bei Raumtemperatur belassen, wobei sich 1-Methylpiperidin-4-spiro-5'-hydantoin abtrennte. Es wurde abfiltriert und mit kleinen Mengen kaltem Wasser, Ethanol und Ether gewaschen, wobei ein kristallines Pulver erhalten wurde (27,0 g). Die Einengung des Filtrats und Waschschritte ergaben eine zweite Ernte (20,0 g). Das Produkt wurde aus Methanol kristallisiert;
Schmp. 265-276º (Zers.).
IR (KBr) 3170 (NH); 1700 (C=O) cm&supmin;¹
m/z 183 (M+, 38%); 71 (100%)
¹H-NMR (300 MHz, D&sub2;O): δ 1,8 (2H), 2,06 (Sechstett, 2H), 2,49 (s, -CH3), 2,58 (t, 2H), 3,14 (t, 1H), 3,20 (t, 1H).

(b) 4-Amino-1-methylpiperidin-4-carbonsäure

1-Methylpiperidin-4-spiro-5'-hydantoin (9,75 g, 0,0533 Mol) und Bariumhydroxidoctahydrat (28,8 g, 0,00913 Mol) in Wasser (150 ml) wurden in einem Autoklaven 3 Std. bei 160ºC erhitzt. Der Inhalt der 4 Chargen wurde vereinigt, und das ausgefällte Bariumcarbonat wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde mit festem Kohlendioxid neutralisiert, und der Niederschlag wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde auf ein kleines Volumen eingeengt, so dass 4-Amino-1-methylpiperidin-4-carbonsäure (32,0 g, 95%ige Ausbeute), Schmp. 278-280 (Zers.) erhalten wurde.
IR (KBr) 3300, 1655, 1580 cm&supmin;¹
m/z 158 (M+, 90%); 141 (98%, M-OH); 1113 (12%, M-CO2H); 96 (100%); 71 (52%)
¹H-NMR (300 MHz, C&sub5;D&sub5; N + D&sub2;O): δ 1,2 (m, 2H), 1,48 (s, CH&sub3;N-), 1,7 (m, 2H), 1,9 (m, 2H), 2,0 (m, 2H).

(c) 4-Amino-4-hydroxymethyl-1-methylpiperidin

Lithiumaluminiumhydrid-Pulver (15,62 g, 0,412 Mol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) (600 ml) wurde 15 min unter Rückfluss erhitzt, wonach 4-Amino-1-methylpiperidin- 4-carbonsäure (31,0 g, 0,196 Mol) in Form eines trockenen Pulvers portionsweise unter Stickstoff und ausgiebigem Rühren, hinzugegeben wurden. Nach Beendigung der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch für vier Std. unter Rückfluss erhitzt, unter Rühren und Stickstoff auf 0ºC gekühlt und durch vorsichtige langsame Zugabe von Wasser (20 ml), 15%igem NaOH (20 ml) und wiederum Wasser (10 ml) aufgearbeitet. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, und das Präzipitat wurde mit siedendem THF (3 · 150 ml) extrahiert. Das THF-Filtrat und die Extrakte wurden vereinigt, und das Lösungsmittel bei 25 mm Hg entfernt, so dass ein gelbes viskoses Öl erhalten wurde (28,0 g, 98,9%ige Ausbeute).
IR (rein) 3320 (NH), 3200 (br, OH), 1587 (NH&sub2;), 1468, 1448 cm&supmin;¹
m/z 144 (m+, 15%); 127 (M-OH); 113 (M-CC&sub2;H); 96 (100%); 70 (41%).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,41 (m, 2H), 1,60 (m, 2H), 2,24 (s, CH&sub3;-N), 2,29 (m, 2H), 2,48 (m, 2H), 2,50 (br, -NH&sub2;), 3,29 (s, -CH&sub2;OH).

(d) 1-Methylpiperidin-4-spiro-4'-(2'-methyl-1',3'-oxazolin) (AF151)

Ein Gemisch aus 4-Amino-4-hydroxymethyl-1-methylpiperidin (1,80 g), Essigsäure (20 ml) und Xylol (20 ml) wurde 28 Std. azeotrop destilliert. Die restliche Essigsäure und Xylol wurde bei reduziertem Druck (25 mm Hg) entfernt, wobei ein restliches viskoses Öl zurückblieb, das mit einer wässrigen K&sub2;CO&sub3;-Lösung auf pH-Wert 11 basisch gemacht wurde. Die Extraktion mit Chloroform und Eindampfen des Extraktes ergaben eine kleine Menge eines braunen Restöls (0,27 g). Die wässrige Lösung, die nach der Chloroformextraktion zurückblieb, wurde zur Entfernung von Wasser eingedampft, der restliche Feststoff wurde mit Chloroform extrahiert, und der Extrakt wurde getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und verdampft, so dass ein sehr hygroskopischer Feststoff als Rückstand erhalten wurde (3,0 g). Die DSC zeigte, dass der letztere hauptsächlich einen Fleck ergab, der polarer als bei dem Ausgangs-Aminoalkohol war.
Ein Teil des hygroskopischen Feststoffs, der bei 150- 160ºC schmolz, wurde unter Vakuum erhitzt, und begann fast sofort als farbloses Öl bei 45ºC/0,15 mm Hg zu destillieren. Dieses Öl formte beim Aufbewahren im Kühlschrank kristalline bei Raumtemperatur schmelzende Nadeln. Das Destillat war das Essigsäuresalz der Titelverbindung.
IR (rein) 1664 (-C=N); 1565 & 1398 (-CO&sub2;&supmin;&supmin;); 1256 (C-O) cm&supmin;¹
m/z 168 (M&spplus; der freien Base); 109; 70.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;); δ 1,77 (m, 2H), 1,96 (m, 2H), 1,98 (s, CCH3-), 2,0 (s, CH3-), 2,49 (s, CH&sub3;-N-), 2,91 (m, 4H), 3,95 (s, -CH&sub2;O-), 9,30 (br s, -CO&sub2;H).
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 14,0 (CH&sub3;CO&sub2;-), 22,9 (CH&sub3;C=N-), 36,6 (C&sub3; und C&sub5;), 44,4 (CH&sub3;N&spplus;), 51,1 (C&sub2; und C&sub6;), 67,0 (C&sub4;), 77,4 (C5'), 164,3 (C-=N), 176,7 (-CO&sub2;-). ¹H-NMR der freien Base (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,64 (m, 2H), 1,84 (m, 2H), 1,98 (s, CH&sub3;-), 2,26 (m, 2H), 2,30 (s, CH&sub3;-), 2,69 (m, 2H), 3,94 (s, -CH&sub2;-).

Beispiel 8: 1-Methylpiperidin-4-spiro-4'-(2'-ethyl-1',3'- oxazolin)

Ein Gemisch aus 4-Amino-4-hydroxymethyl-1-methylpiperidin (3,0 g), Propionsäure (50 ml) und Xylol (90 ml) wurde 5 Std. azeotrop destilliert. Der Rückstand (7 ml) wurde mit einer wässrigen K&sub2;O&sub3;-Lösung auf pH-Wert 11-12 basisch gemacht. Die Extraktion mit Chloroform und Eindampfen des Extraktes ergaben ein Gemisch aus unpolaren Verbindungen (0,80 g). Die wässrige Lösung, die nach der Chloroformextraktion zurückblieb, wurde zur Entfernung von Wasser eingedampft, der restliche Feststoff wurde mit Chloroform extrahiert, und der Extrakt wurde getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und verdampft, so dass ein hygroskopischer Feststoff als Rückstand erhalten wurde (3,6 g). Die DSC zeigte, dass der letztere hauptsächlich einen Fleck ergab, der polarer als bei dem Ausgangs-Aminoalkohol war (Silicagel, Lösungsmittel 40 : 58 : 2 Methanol - Chloroform - wässriger Ammoniak).
Ein Teil des hygroskopischen Feststoffs (1,5 g) wurde unter Vakuum erhitzt und begann fast sofort, als viskoses farbloses Öl bei 50ºC/0,1 mm Hg zu destillieren. Das Destillat war das Propionäuresalz der Titelverbindung.
m/z 182 (M&spplus; der freien Base, 14%); 167 (5%), 154 (71%), 125 (9%), 109 (100%), 96 (45%), 81 (30%), 74 (57%), 70 (89%), 57 (64%).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,12 (t, J = 7,5 Hz, CHCH&sub2;-) 1,17 (t, J = 7,6 H&sub2;, CH&sub3;CH&sub2;-), 1,75 (m, 2H), 2,00 (m, 2H), 2,29 (q, J = 7,5, CH&sub3;CH&sub2;-), 2,30 (q, J = 7,6, CH&sub3;CH&sub2;-), 2,56 (s, CH&sub3; N-), 3,02 (m, 2= -CH&sub2;-), 3,95 (s, -CH&sub2;O), 7,52 (br, -CO&sub2;H).
Zu einer gerührten Lösung des vorstehenden Propionsäuresalzes (700 mg) in Chloroform wurde eine gesättigte wässrige Lösung von K&sub2;CO&sub3; zugegeben, bis die CO&sub2;- Entwicklung aufhörte. Das Gemisch wurde dann 0,5 Std. gerührt, und die Phasen wurden getrennt. Die wässrige Phase wurde mit Chloroform extrahiert, die vereinigte abgetrennte Chloroformphase und die Extrakte wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), und das Lösungsmittel wurde verdampft, so dass die Titelverbindung in freier Basenform als farbloses Restöl erhalten wurde (550 mg), was einen einzigen Fleck in der DSC aufwies.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,17 (t, J = 7,6 Hz, CH&sub3;CH&sub2;-), 1,61 (m, -CH&sub2;-), 1,86 (m, -CH&sub2;-), 2,18 (m, -CH&sub2;-), 2,29 (q, J = 7,6, CH&sub3;CH&sub2;-), 2,30 (s, CH&sub3; N-), 2,71 (m, -CH&sub2;-), 3,94 (s, -CH&sub2;O-).
m/z 182 (M&spplus;, 25%), 167 (9%), 154 (78%), 125 (17%), 109 (1005), 96 (65%), 81 (54%), 70 (96%), 57 (77%).
Ein alternativer Weg zu Verbindungen, wie AF150 und AF151, hängt von der Cyclodehydratation der geeigneten Amide ab, wie gezeigt in den nachstehenden Abbildungen:
Dehydratisierungsmittel, wie P&sub2;O&sub5;, Schwefelsäure, BF&sub3;- Etherat, CsCl&sub2; und Molekularsiebe, lassen sich für die vorstehenden Reaktionen verwenden. Die entsprechenden Thiazoline lassen sich durch analoge Reaktionen mit P&sub2;S&sub5; anstelle der Oxazoline erhalten.

Beispiel 9: 2-Methyl-spiro(1,3-thiazolin-5,4')-1'-methylpiperidin (II; R = R' = Methyl - "AF150 (S)")

(a) 4-Acetamidomethyl-4-hydroxy-1-methylpiperidin

4-Aminomethyl-4-hydroxy-1-methylpiperidin (0,83 g, 5,7 mmol) wurde in 10 ml Chloroform gelöst, und Essigsäureanhydrid (0,85 g, 5,7 mmol) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch erwärmte sich spontan auf 40-50ºC. Nach 30 min wurde das Lösungsmittel verdampft, und der rohe Rückstand wurde auf einer Silicagelsäule (Merck 7734) mit 33 : 67 2% wässrigem Ammoniak-Methanol als Elutionsmittel chromatographisch aufgetrennt.
m/z 186 (M&spplus;)
¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,60 (Multiplett, 4H, H3 und H4); 2,01 (Singulett, 3H, CH&sub3;-C), 2,29 (Singulett, 3H, CH3-N), 2,38 (Multiplett, 2H, H1), 2,55 (Multiplett, 2H, H2), 2,98 (Multiplett 1H, NH), 3,26 (Dublett, 2H, H5)ppm.
¹H-NMR (300 MHz, D&sub2;O): δ 1,42 (Multiplett, 4H, H3 und H4), 1,81 (Singulett, 3H, CH&sub3;-C), 2,08 (Singulett, 3H, CH&sub3;-N), 2,27 (Multiplett, 2H, H2), 2,46 (Multiplett, 2H, H2), 3,03 (Singulett 2H, H) ppm.
Die Verunreinigung ergab einen Peak bei 3,44 ppm.

(b) 2-Methyl-spiro(1,3-thiazolin-5,4')-1'-methylpiperidin

Ein Gemisch aus 4-Acetamidomethyl-4-hydroxy-1- methylpiperidin (6,5 g, 35 mmol) mit Phosphorpentasulfid (10 g, 22 Mol) wurde 30 min bei 220ºC erhitzt, abgekühlt und in 30 ml konzentrierter Salzsäure gelöst. Die saure Lösung wurde in 100 ml kaltes konzentriertes wässriges Natriumhydroxid überführt, mit 2 · 100 ml Chloroform extrahiert, und die vereinigten Extrakte wurden getrocknet und verdampft, so dass 5 g eines schwarzen öligen Rückstandes erhalten wurde, der durch Destillation bei 75ºC/1 mm Hg gereinigt wurde, so dass 1,8 g klare Flüssigkeit erhalten wurde.
m/z: 184 (M&spplus;)
¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,8-2,0 (m, 4H), 2,17 (t, 3H, CH&sub3;-C), 2,2 (s, 3H, CH&sub3;-N), 3,9 (q, 2H, CH&sub2;-Thiazolinring).

Biologische Tests

Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen pharmakologische Aktivität auf und eignen sich daher als Pharmazeutika, bspw. für die Therapie. Die Agonisten zeigen insbesondere Aktivität in den nachstehend erörterten Tests. In den Tabellen, die die Ergebnisse dieser Tests beschreiben, lassen sich bestimmte Verbindungen durch die nachstehenden Bezugszahlen bezeichnen:
*cis-2-Methylspiro(1,3-Oxathiolyn-5',3)chinuclidin (US 4 855 290)
+beispielhafte erfindungsgemäße Verbindungen

Test 1: Isoliertes Ileum-Präparat aus Meerschweinchen

Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden auf ihre agonistische und antagonistische Aktivitäten im Meerschweinchen-Ileumpräparat untersucht. Die Tabelle 2 fasst die Ergebnisse, die mit einigen der untersuchten Verbindungen erhalten wurden, qualitativ zusammen, von denen der wirksamste Agonist AF125 war. AF125 hat sich als vollständiger Agonist im Meerschweinchen-Ileumpräparat herausgestellt und sein EC50 wurde auf 1,3 uM berechnet. Der EPMRACh von AF125 betrug etwa 14, verglichen mit Werten zwischen 50-100, die für AF103B erhalten wurden. Diese Verbindun zeigte ebenfalls hohe Aktivität gegenüber muscarinischen Bindungsstellen im Gehirn. Der Vergleich zwischen AF102B und AF125 zeigte, dass AF125 um eine Größen ordnung aktiver als AF102B bezüglich seiner Fähigkeit zur Kontraktion des Meerschweinchen-Ileums war. AF125 induzierte somit eine viel stärkere Kontraktionsantwort als AF120B in der gleichen Konzentration. Tabelle 2: Wirkung verschiedener mutmaßlicher cholinerger Verbindungen auf das Meerschweinchen-Ileumpräparat
* Intensität der Kontraktionen. Die Antwort wird qualitativ durch die Anzahl der Pluszeichen beschrieben, wobei + für eine kleine Kontraktionsantwort und +++ für eine intensive Antwort steht. Ein -Zeichen bedeutet keine kontraktile Antwort.
Das Aminoanalogon von AF125, [AF125(N)] war ebenfalls als Agonist aktiv, jedoch wurden von dieser Verbindung höhere Konzentrationen zur Kontraktion des Ileums benötigt. AF125(N) ist wie ersichtlich nur in Konzentrationen aktiv, die um eine Größenordnung höher liegen als bei AF120B. AF125(Ph) ist ein Antagonist (IC&sub5;&sub0; = 0,7 uM). Im Gegensatz zum Aminoanalogon von AF125, stellte sich AF123 als Antagonist heraus.
Ähnliche Tests zeigten, dass die Verbindung aus Beispiel 5 (AF150) ein vollständiger muscarinischer Agonist ist - mit einem EC&sub5;&sub0; = 0,8 uM (blockiert durch 10 uM Atropin). Verglichen mit Acetylcholin (Ach), kann AF150 eine maximale Kontraktion des Ileums von 130% induzieren (Ach 100%). Überraschenderweise unterscheidet sich die Form der Kurve von AF150 von der von Ach. Diese Kurve lässt sich durch ein Zwei- oder sogar Dreistellen-Modell analysieren. Dies zeigt, dass AF150 unterschiedliche Affinitäten für die Subtypen der Muscarinrezeptoren aufweist, die in diesem Präparat gefunden wurden. Die Verbindung von Beispiel 7 (AF151) ist ebenfalls ein vollständiger muscarinischer Agonist und hat einen EC50 = 3 um (blockiert durch 10 uM Atropin).

Test 2: Bindung an Muscarin-Rezeptoren im Gehirn

Die Bindung von Agonisten an M1-Muscarin-Rezeptoren und die Wirkung von Guanylylimidophophat (GppNHp). Die Agonisten sind bekanntlich an Guaninnukleotid-bindende Proteine gekuppelt (G-Proteine). Es wurden zwar zahlreiche Untersuchungen an Agonisten geführt, die an den M2- Muscarin-Rezeptor binden (Pirenzepin niedriger Affinität), jedoch wurden nur relativ wenige Untersuchungen an Agonisten durchgeführt, die an M1-Muscarin-Rezeptoren binden (Pirenzepin hoher Affinität). Der Hauptgrund scheint zu sein, dass die meisten Agonisten (bspw. ausgenommen AF102B, US-Patent Nr. 4 855 290) eine höhere Affinität für den M2-Subtyp als für M11-Muscarinrezeptoren aufweisen.
Nicht hydrolysierbare Guanin-Nukleotide, wie GppNHp, dissoziieren das G-Protein vom Rezeptor und senken die Affinität des Rezeptors für Agonisten, jedoch nicht für Antagonisten. Unter speziellen Bedingungen lässt sich sowohl die Affinität als auch die Effizienz von Agonisten mit M1- Muscarinrezeptoren unter Verwendung niedriger Konzentrationen an ³H-Pirenzepin (3H-PZ) unterhalb seines KD-Wertes analysieren [Potter et al., Cell. Molec. Neurobiol. 8: 181-191 (1988); Potter und Ferrendelli, J. Pharmacol. Exp. Ther. 248: 974-978 (19889); Flynn et al., Eur. J. Pharmacol. 172: 363-372 (1989)].
Unter diesen Bedingungen binden hocheffiziente Agonisten ("Vollagonisten") direkt an den M1-Rezeptor-Subtyp mit zwei Affinitäten. Der höhere Affinitätszustand des M1- Rezeptor-Subtyps ist gegenüber Guaninnukleotiden und GppNHp empfindlich, indem bspw. der hochaffine Zustand in einen niedrigaffinen umgewandelt wird. Das Verhältnis von niedrigen und hohen Affinitäten (KL/KH) des M1-Rezeptors kann die relativen Effizienzen bestimmen, mit denen Agonisten mutmaßliche rezeptorvermittelte Second-Messenger- Systeme aktivieren.
Die Tabelle 3 fasst die Ergebnisse zusammen, die mit Oxotremorin-M und Carbachol (zwei volle, jedoch nichtselektive M1- und M2-Agonisten) für den selektiven M1- Agonisten AF102B (US-Patent Nr. 4 855 290), AAF150 und AF151 erhalten werden. Die quartären Vollagonisten Oxotremin-M und Carbachol zeigen erwartungsgemäß einen Zwei- Affinitäts-Zustand, und die relative Wirksamkeit dieser Verbindungen wird durch das Verhältnis von KL/KH bestimmt. AF102B und AF125 zeigen dagegen eine Massenwirkungskurve. Tabelle 3: Apparente Affinitätszustände für M1- Muscarinrezeptoren in Rattengroßhirnrinde
* Die Kompetitionskurven stimmten wesentlich besser mit einem Einstellenmodell überein (Massenwirkungskurve).
Bemerkungen zu Tabelle 3: Ki = KH oder KL = IC&sub5;&sub0;/1+C/KD, wobei C = 4,4 nM die Konzentration des radioaktiven Liganden (³H-PZ), und KD 13,9 nM ist seine Dissoziationskonstante. KH, KL, %H und %L sind die apparenten Inhibitionskonstanten der untersuchten Liganden für die Hoch- bzw. Niedrig-Affinitätsstellen. G ist GppNHp (Guanylylimidodiphosphat), das in einer Konzentration von 0,1 mM verwendet wurde. Die Verdrängung von 3H-PZ von den corticalen Bindungsstellen erfolgte in Tris/Mn-Puffer (pH-Wert 7,4) für eine Std. bei 25ºC; der Puffer enthielt 1 mM EDTA und 2 mM Mn&spplus;&spplus;-Ionen. Das Verfahren ähnelt dem Verfahren, beschrieben von Potter und Ferrendelli (J. Pharmacol. Exptl. Therap. 248: 974-978, 1989). Die Bindungsdaten wurden mit einem GraphPAD-Programm analysiert und wurden an ein oder zwei Komponenten angepasst. Die Werte sind Mittelwerte aus 1-3 Experimenten, die dreifach angefertigt wurden.
AF150 und AF151 zeigen überraschenderweise einen üblichen Zwei-Affinitäts-Zustand in Gegenwart von 3H-PZ mit einem sehr hohen KL/KH-Verhältnis für AF150. GppNHp verschob zudem den Hochaffinitätszustand zum Niedrig- Affinitätszustand. AF150 und AF151 zeigen jeweils hohe Affinität für mutmaßliche M1-Rezeptoren und eine hohe Wirksamkeit am gleichen Rezeptor. Dies lässt sich daraus schließen, dass 3H-PZ in den verwendeten Konzentrationen (1/3 ihrer KD-Werte) nur an M1-Rezeptoren bindet. Die Daten zeigen, dass AF150 und AF151 hocheffiziente Agonisten sind, die M1-Rezeptoren aktivieren. Man erwartet daher, dass sie den Transduktionsmechanismus, der an M1-Rezeptorgekuppelten Second Messengers beteiligt ist, wie bspw. Phosphatidylinositol-Umsatz und Ca²&spplus;-Mobilisierung, aktivieren. Die gleichzeitige Aktivierung von H- und L-Stellen kann sich für funktionelle Wirkungen als notwendig erweisen. AF150 und AF151 sind diesbezüglich für die Behandlung von Störungen mit cholinerger Hypofunktion, wie SDAT, besonders geeignet.

Test 3:

Der Zwei-Affinitäts-Zustand von AF150 wird von Homogenaten der Ratten-Großhirnrinde beibehalten, auch wenn die Verdrängung von ³H-PZ in einem 10 mM Natrium-Kalium- Puffer erfolgt. Demzufolge ist dies ein einzigartiger Agonist, verglichen mit anderen mutmaßlichen Muscarinagonisten (Tabelle 4). AF150 zeigt eine ausgezeichnete Selektivität und Effizienz für M1-Rezeptoren, wie gezeigt in den Tabellen 4 und 5. Diesbezüglich ist AF150 ein hervorragendes Medikament zur Behandlung von Störungen mit cholinerger Hypofunktion, wie SDAT, da die M1-Selektivität und die hohe Effizienz bei dieser Art von Störungen wahrscheinlich von einem bestimmten therapeutischen Wert sind.
Die Leistung der erfindungsgemäßen Verbindungen (und zum Vergleich von anderen cholinergen Verbindungen) bei der Verdrängung aus Rattengehirnhomogenaten, Cerebellum und Stirn-Cortex wurde anhand der nachstehenden ³H- markierten Verbindungen untersucht, nämlich (-)³H- Chinuclidinylbenzilat (³H-QNB; einem nicht-selektiven M1- und M2-Antagonisten) und ³H-Pirenzepin (³H-PZ; einem selektiven M1-Antagonisten. Für Vergleichszwecke wurden Oxotremorin (ein tertiärer M2> M1-Agonist), Oxotrmorin-M und Carbachol (gemischte quartäre M2- und M1/M2- Agonisten), AF102B (s. US-Patent Nr. 4 855 290) und McN-A-343 (ein quartärer M1-Agonist) aufgenommen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4 und 5 gezeigt. Tabelle 4: Apparente Affinitätszustände für M1- (Verdrängung von ³H-PZ aus Ratten-Großhirrinde) und für M2- Muscarinrezeptoren (Verdrängung von ³H-QNB aus Ratten- Cerebellum)
Die Verdrängungen der ³H-PZ- und ³H-QNB-Bindung erfolgten in 10 bzw. 50 mM Phosphat-Puffern. Ki = KH oder KL waren wie in Tabelle 3 ausgedrückt. Die KD-Werte für ³H-PZ und 3H-QNB waren 13,9 bzw. 0,093 nm (Fisher et al., J. Pharmacol. Exptl. Therap, 1991, im Druck). Tabelle 5: Apparente Affinitätszustände für M1- (Verdrängung von ³H-QNB aus Ratten-Großhirnrinde) und für M2- Muscarinrezeptoren (Verdrängung von ³H-QNB aus Ratten- Cerebellum)
* Die Kompetitionskurven waren wesentlich besser an ein Einstellen-Modell angepasst (Massenwirkungskurve). Bemerkung: Die K-Werte wurden durch eine nicht-lineare Kurvenanpassung der kleinsten Quadrate der Daten erzeugt, wobei die GRAPHPAD- 2-Zwei- und Ein-Stellenanalyse und statistische Verfahren zum Einsatz kamen, wie in Tabelle 1 gezeigt.
Die Verdrängung der 3H-QNB-Bindung (KD-Wert für 3H- QNB von 0,093 nM) erfolgte in 50 mM Phosphat-Puffer für eine Std. bei 37ºC (Fisher et al., J. Pharmacol. Exptl. Therap. 1991, im Druck).
Aus den Tabellen 4 und 5 ist ersichtlich, dass AF150 hohe Selektivität für M1-Muscarinrezeptoren aufweist. Zeigt AF125 eine apparente M2-Selektivität, so weist AF150 tatsächlich überraschenderweise eine hohe Selektivität für M1-Muscarinrezeptoren auf.

Test 4: Modifikation von Muscarin-Agonistenbindung an corticale Membranen durch Cu&spplus;&spplus;-Behandlung

Übergangsmetallionen und Guaninnukleotide üben starke Wirkungen auf die Affinität der Agonisten für Muscarinrezeptoren aus. Diese beruhen möglicherweise auf der Modifikation der Verhältnisse unterschiedlicher Agonisten-Bindungsstellen (Gurwitz und Sokolovsky, Biochem. Biophys. Res. Commun. 96: 1296-11301, 1980; Aronstam et al., Mol. Pharmacol. 14: 575- 582, 1978). Die Zugabe von Cu²&spplus;, das wie andere bestimmte Übergangsmetallionen bekanntlich stabile Koordinationskomplexe mit Proteinsulfhydrylresten bildet, erhöht die apparente Affinität von Muscarinagonisten durch Vergrößerung des Anteils an Hochaffinitätsstellen und eliminiert die Sensitivität gegenüber Guaninnukleotiden (Farrar und Hoss, Trans. Am. Soc. Neurochem. 13: 250, 1982; Gurwitz et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 120: 271-276, 1984).
Wie in Tabelle 6 gezeigt, modifizierte eine Cu&spplus;&spplus;- Behandlung die Affinität für die klassischen nicht-selektiven Muscarin-Antagonisten Atropin und Scopolamin, sowie für den selektiven Antagonisten Pirenzepin. Die Bindungsparameter der klassischen nicht-selektiven Agonisten, Carbachol und Oxotremorin, zeigte, dass Cu&spplus;&spplus;-Behandlung ihre apparente Affinität vergrößerte, d. h. die Kompetitionskurven wurden zu niedrigeren Agonistenkonzentrationen verschoben. Die Analyse der Kompetitions-Bindungsdaten, gemäß einem Zweistellen-Modell ist in Tabelle 6 zusammengefasst, und zeigt, dass die Cu&spplus;&spplus;- Behandlung den Anteil an Hochaffinitäts-Bindungsstellen von 32 auf 51% für Oxotremorin und von 25 auf 44% für Carbachol erhöhte, ohne wesentliche Änderungen ihrer beiden Affinitätskonstanten KH und KL.
Die Bindungsparameter für AF102B wurden ebenfalls durch Cu&spplus;&spplus; dahingehend beeinflusst, dass wie von den Daten in Tabelle 6 gezeigt dessen Wechselwirkung mit unbehandelten Membranen die Bindung an eine Einzelpopulation an Stellen mit Ki = 3,3 uM darstellt, wohingegen nach Cu&spplus;&spplus;- Behandlung ebenfalls ein Hochaffinitätsbindungszustand beobachtet wurde, der 26% der Gesamtstellen mit KH = 0,02 uM darstellt. Keine Änderung wurde bei der Niedrigaffinitäts- Bindungskonstante beobachtet. Es ist daher gezeigt worden, dass AF102B mit Muscarinrezeptoren im Großhirnpräparat auf eine für Agonisten typische Weise interagiert, d. h. der Rezeptor-Ligand-Komplex kann mit G-Protein(en) interagieren (Vgl. Diskussion von Gurwitz et al., 1984).
AF150 wies bei diesen Untersuchungen ebenfalls Agonistenbindungseigenschaften auf. Bei unbehandelten Membranen zeigte es multiple Affinitätszustände (0,32 uM und 33,5 uM für Hoch- bzw. Niedrigaffinitätstellen). Der Anteil der Hochaffinitätsstellen wurde nach Cu&spplus;&spplus;-Behandlung von 14 auf 37% erhöht, was darauf schließen lässt, dass AF150 wie Agonist für Muscarinrezeptoren der Großhirnrinde wirkt. Tabelle 6: Ki-Werte mittels (-)³H-QNB-Bindung an Ratten- Großhirn-Homogenaten mit und ohne Cu&spplus;&spplus;-Behandlung.
*% des Hochaffinitätszustandes.
In der vorstehenden Tabelle sind die angegebenen Werte Mittelwerte ± SEM von zumindest 3 Experimenten; jedes Experiment wurde an Dreifachproben durchgeführt. Der Test wurde in modifiziertem Krebs-Puffer bei pH-Wert 7,4 2 Std. bei 25ºC mit und ohne 30minütige Vorbehandlung von Membranen der Ratten-Großhirnrinde mit Cu&spplus;&spplus; (100 uM) durchgeführt (Fisher et al., J. Pharmacol. Exptl. Therap. 1991, im Druck).

Test 5: Wirkungen der Testverbindungen auf die Expression in Zellinien von Muscarinrezeptor-Subtypen

Vor dem Hintergrund der pharmakologischen Daten wurden Muscarinrezeptoren in drei Subtypen unterteilt (M1, M2 und M3). Molekulare Klonierungsuntersuchungen identifizierten fünf unterschiedliche Muscarinrezeptor-Subtypen (m&sub1;-m&sub5;). Die funktionelle Expression dieser Gene hat eine Korrelation zwischen genetisch und pharmakologisch definierten Subtypen gezeigt, wobei M1 = m&sub1;, m&sub4; und m&sub5;: M2 = m2; und M3 = m&sub3; (Buckley et al., Mol. Pharmacol. 35: 469- 476, 1989).
Die Stimulation von m&sub1;- und m&sub3;-Rezeptoren ruft dosisabhängige Anstiege bei der Hydrolyse von Phopshoinositiden (PI) hervor. Die Agonistenaktivierung des m1- Rezeptors ruft ebenfalls Anstiege von basalem und forskolinstimuliertem cAMP hervor, wohingegen der m3-Rezeptor keine Wirkung auf die intrazellulären cAMP-Spiegel aufweist (Buck und Fraser, Biochem. Biophys. Res. Comm. 173: 662-672, 1990). Die Stimulation der m&sub2;- und m&sub4;-Rezeptoren durch Muscarinagonisten bewirkte die bevorzugte Hemmung der Adenylatcyclase-(AC)-Aktivität (Mei et al., Life Sciences, 45: 1831-1851, 1989).
Die neuen Verbindungen AF150, AF151, AF150(S) und AF125 wurden untersucht auf ihre Befähigung zur Stimulation von PI in CHO-Zellen, die mit m&sub1;- bzw. m&sub3;-Rezeptoren transfiziert waren (Buck und Fraser, loc. cit), und in gezüchteten menschlichen Neuroblastom-Zellen, Linie SK-N-SH, welche vorwiegend den m&sub3;-Subtyp, jedoch nicht den m&sub1;-Subtyp exprimiert (Pinkas- Kramarski et al., Neurosci. Lett. 188: 335-340, 1990; Luthin et al., Mol. Pharmacol. 34: 327-333, 1988).
Diese Verbindungen wurden auch auf gezüchteten PC12- Zellen untersucht, die vorwiegend Rezeptoren des m&sub4;- Subtyps exprimieren, und an die Hemmung der AC-Aktivität gekuppelt sind (Pinkas-Kremarski et al., loc. cit).
Die Stimulation des PI-Abbaus wurde mit dem Verfahren untersucht, das von Stein et al. (EMBO J. 7; 3031-3035, 1988) beschrieben wurde, und die Modulation der AC- Aktivität wurde nach dem Verfahren von Stein et al., loc. cit und Pinkas-Kramarski et al. (Febs Lett., 239: 174-178, 1988) untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 aufgeführt und sind mit Carbachol einem Muscarin-Vollagonisten (M1/M2-Mischtyp) und mit AF102B verglichen. Tabelle 7: Wirkungen der Testverbindungen bei PI-Hydrolyse und AC-Aktivität in Zellkulturen, die m&sub1;-, m&sub3;- und m&sub4;- Rezeptorsubtypen exprimieren.

Bemerkungen zu Tabelle 7:

EC&sub5;&sub0;: effektive Konzentration (uM) bei 50%iger Aktivierung
+++ Vollagonist gegenüber Carbachol (die Vollagonistenaktivität wurde für alle Verbindungen bei 1 mM getestet)
+ partieller Agonist, gegenüber Carbachol
- keine Stimulation von P1 oder Hemmung von AC
PI Hydrolyse der Phosphoinositide
AC Adenylatcyclase-Aktivität, ausgedrückt als Änderung der cAMP-Konzentration
NT: nicht untersucht
a: % der Carbacholwirkung
b: effektive Konzentration (uM), welche die Wirkung induziert
c: 22 uM AF102B hemmten die Wirkung von 1 mM Carbachol
d: 1 mM AF120B hemmte die Wirkung von 1 mM Carbachol
In Tabelle 7 wird die Agonistenwirkung von ml- Rezeptoren durch erhöhte PI-Hydrolyse und AC-Aktivität bewiesen, wohingegen die Stimulation von m&sub4;-Rezeptoren durch die Hemmung der AC-Aktivität wiedergegeben wird; die m&sub3;- Stimulation bewirkt eine stärkere PI-Hydrolyse. Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, dass überraschenderweise sowohl AF150 als auch AF151 Vollagonisten an den m&sub1;- und m&sub4;- Muscarinrezeptor-Subptypen sind, jedoch nur partielle Agonisten an den m&sub3;-Subtypen. AF150 und AF151 sind zwar Vollagonisten bei m&sub1;-Rezeptoren, wie durch die PI- Hydrolyse bewiesen wird, jedoch unterscheiden sich diese Verbindungen überraschend von Carbachol, wie durch ihre sehr schwache Wirkung auf die Potenzierung der AC- Aktivität bei den gleichen Rezeptoren bewiesen wird. Die Carbachol-induzierte Aktivierung von M1-Muscarinrezeptoren ruft Anstiege von basalem und Forskolin-stimuliertem cAMP hervor (232-33356% bzw. 546-1382%), dennoch sind bei die sem Test sowohl AF150 bzw. AF151 gleichermaßen sehr schwach (33% bzw. 76%)
In einem typischen Experiment mit SK-A-SH- Neuroblastomzellen, wurde entdeckt, dass die Anreicherung von Inosital-1-phosphat (IP1) mit 10 mM Carbachol um das 7,46- fache gegenüber den Basalspiegeln erhöht wurde, um das 5,24fache mit 1 mM Oxotremorin-M und um das 1,42fache mit 1 mM AF125. Der M1-selektive Agonist AF102B (US-Patent Nr. 4 855 290) stimulierte die Phosphoinositid-Hydrolyse in diesen Zellen jedoch selbst bei 1 mM nicht, wohingegen er bei dieser Konzentration das Oxotremorin-M-induzierte Signal vollständig blockieren konnte. Diese Hemmung hing von der Oxotremorin-M- Konzentration ab; 1 mM AF103B blockierte bspw. die durch 10 uM Oxotremorin-M induzierte Phosphoinositid-Hydrolyse und hemmte das Signal von 1 mM Oxotremorin-M um 34%.
Die kombinierte Stimulation der Phosphoinositid- Hydrolyse durch Carbachol und durch bestimmte neue Verbindungen wurde überprüft. Im gleichen Experiment wurde die Anreicherung von IP1 6,11 fach gegenüber dem Basallevel durch Kombination von 10 mM Carbachol mit 1 AF125 stimuliert. Die neue Verbindung AF125 stimuliert somit die Phosphoinositid-Hydrolyse in menschlichen SK-N-SH- Neuroblastomzellen auf etwa 20-25% der Stimulation, die mit dem nicht-selektiven Vollagonisten Carbachol erhalten wird, und stört die Wirkung von Carbachol nur minimal (10- 20%). Die Bedeutung dieser Ergebnisse ist, dass AF125 eine einzigartige Aktivität als Muscarinagonist in dieser Zelllinie aufweist, die vorwiegend den m&sub3;- Muscarinrezeptor-Subtyp exprimiert.
Daraus folgt, dass diese Verbindungen eine einzigartige Aktivität und Selektivität aufweisen, und daher besonders geeignet für die Behandlung von SDAT sind (Braan et al., FEBS Lett. 230: 90-94, 1988).

Test 6: Die Wirkung der Testverbindungen auf synaptosomale Acetylcholine(Ach)-Freisetzung.

Die Wirkungen von AF150 (und für Vergleichszwecke AF1125, MeN-A-343 und Oxotremorin) auf die basale und K&spplus;- induzierte Freisetzung von ³H-Ach wurden an Synaptosomen untersucht, die aus Ratten-Großhirnrinde nach den Verfahren isoliert wurden, die von Pittel et al. (J. Neurochem. 55: 665-672, 1990) eingehend beschrieben wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Die beiden nahe verwandten Strukturen AF150 und AF125 hatten überraschenderweise unterschiedliche Wirkungen auf die ³H-ACh- Freisetzung. AF125 (1mM) hemmte die K&spplus;-induzierte ACh- Freisetzung, wohingegen AF150 (1mM) sie überraschenderweise verstärkte. Diese Ergebnisse zeigen, dass AF125 auf die präsynaptischen Rezeptoren wie Oxotremorin, einem klassischen M2-Agonisten, wirkt. Die Wirkung von AF150 auf präsynaptische Muscarinrezeptoren, die einen Anstieg der K&spplus;-induzierten ACh-Freisetzung verursacht, lässt sich dagegen als M2-antagonistischer oder M1-agonistischer Effekt ansehen. Hadhazy und Szerb (Brain Res. 123: 311-322, 1977) und Gulya et al. (Neurochem. Int. 15: 153-156, 1989) zeigten, dass Muscarinantagonisten die K+-induzierte ACh- Freisetung stimulieren. Suzuki et al. (Neurosci. Lett. 84: 209-212, 1988) und Pittel et al., loc. cit., zeigten, dass Muscarinantagonisten auch die basale ACh-Freisetzumg stimulieren können. Die letztere Studie legt nahe, dass stimulatorische Muscarinrezeptoren, die die ACh-Freisetzung modulieren, im ZNS zugegen sind und sich pharmakologisch als M1-Subtyp ansehen lassen. Die Existenz von Muscarin- Autorezeptoren, die die ACh-Freisetzung erhöhen, wurde ebenfalls im PNS in glatten Muskelpräparaten festgestellt (Kilbinger und Nafziger, Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 328: 304-309, 198 5). Tabelle 8: Wirkungen der Testverbindungen auf basale und K&spplus;-induzierte Freisetzung von Acetylcholin (ACh) aus Synaptosomen der Ratten-Großhirnrinde.

Bemerkungen zu Tabelle 8:

Die Ergebnisse stammen aus 1-3 Experimenten wenn nicht anders angegeben*
NT = Nicht untersucht +nM
Die antagonistische Wirkung von Pirenzepin (ein M1- Antagonist) auf die verstärkenden Wirkungen von AF150 auf die K&spplus;-induzierte ³H-ACh-Freisetzung (wie in Tabelle 8 ersichtlich) zeigt, dass AF150 als M1-Antagonist angesehen werden kann, der somit M1-exzitatorische Autorezeptoren aktiviert. Ungeachtet des Wirkungsmechanismus von AF150, d. h. ob dies bspw. (a) einer M1-post- und präsynaptischen Agonistenaktivität oder (b) M1-postsynaptischen agonistischen und einer M2-präsynaptischen antagonistischen Wirkung zugeordnet werden kann, sollte diese Verbindung besonders erfolgversprechend für die Bekämpfung von SDAT und verwandte Leiden sein.

Test 7: Elektrophysiologische Bewertung von AF150 in Hippocampus-Scheiben der Ratte

Acetylcholin (ACh) hat viele Wirkungen auf das Säugetiergehirn. Die Hauptwirkungen wurden in der Hippocampus- Scheibe beobachtet und umfassen:
(1) eine Blockierung des anhaltenden Kaliumausstroms (K+), der durch Depolarisation (IM) aktiviert wird;
(2) eine Blockierung des Ca&spplus;&spplus;-abhängigen K&spplus;-Stroms, der der langsamen Nach-Hyperpolarisation (AHP) unterliegt;
(3) eine Blockierung des anhaltenden K&spplus;-Ruhestroms;
(4) einen transienten K&spplus;-Ausstrom;
(5) beschriebene Wirkungen von ACh auf postsynaptische Potentiale (ein Anstieg der spontanen und ein Absenken der induzierten) und auf Ca&spplus;&spplus;-Ströme. (Segal, Brain Res. 452: 79-98, 1988; Dutter und Nicoll, J. Neurosci. 8: 4214-4224, 1988).
Die Ergebnisse unter Verwendung von Gallamin (ein M2- Antagonist) und Pirenzepin (PZ, ein M1-Antagonist) unterstellen, dass ein M2-Rezeptor die Depression des EPSP und die Blockierung des IM vermitteln. Die Depolarisation und die Blockierung der AHP, die gegenüber Gallamin unempfindlich ist und durch 0,3 uM PZX blockiert wird, werden wahrscheinlich durch M1-Rezeptoren vermittelt (Duttar und Nicoll, loc. cit).
Allgemein ausgedrückt wurden Mikrotröpfchen von AF150, ACh und PZX bei Ratten-Hippocampuszellen angewendet, die intrazellulär registriert wurden. Die genauen Konzentrationen des Medikamentes an den Rezeptorstellen lassen sich mit diesem Verfahren nicht feststellen. Dieses Verfahren hat jedoch gegenüber dem Perfusionsverfahren dahingehend einen Vorteil, dass es vom elektrophysiologi schen Standpunkt her ein genaueres Bild liefert (Segal, loc. cit)
Intrazelluläre Antworten auf AF150 von CA1-Neuronen in der Hippocampus-Scheibe wurden aufgezeichnet, wobei das Verfahren von Segal verwendet wurde. Kleine hyperpolarisierende Stromimpulse (Spurenströme nicht gezeigt) wurden wechselten mit der Stimulation der kommissuralen afferenten Schaffer-Fasern, die postsynaptische Potentiale erzeugen, ab. Topisch durch Mikrotröpfchen (100 um) aufgebrachtes AF150 verursachte eine starke Depolarisierungsreaktion. Die Hyperpolarisation der Zelle zur Regulation von Potentialen ergab einen tatsächlichen Anstieg des Eingangsruhewiderstandes. AF150 blockiert die langsame AHP, die durch eine Ca&spplus;&spplus;-abhängige K&spplus;-Leitfähigkeit vermittelt wird. AF150 verursacht eine kleine Reduktion der postsynaptischen Potentiale (PSPs). Pirenzepin (10 uM, ein M1- Muscarinantagonist) reduzierte deutlich die durch AF150 hervorgerufene Depolarisation. Der Anstieg des Eingangsruhewiderstandes wurde ebenfalls durch Pirenzepin verhindert. Die Blockierung des langsamen AHP durch AF150 wurde in pirenzepinbehandelten Scheiben deutlich reduziert. Die durch AF150 verursachte Reduktion der PSPs wurde durch Pirenzepin nicht beeinflusst.

Schlussfolgerungen

(1) AF150 verursacht eine Depolarisation, einen erhöhten Eingangswiderstand und blockiert die langsame AHP. Diese Wirkungen werden durch den M1-Rezeptorantagonisten Pirenzepin antagonisiert; eine Wirkung auf PSPs, die verglichen mit ACh gering war, wurde durch Pirenzepin nicht beeinflusst.
(2) AF150 scheint überraschenderweise für M1-Rezeptoren ein spezifischerer Agonist als für M2-Rezeptoren zu sein.
(3) Verglichen mit AF102B scheint es klar zu sein, dass AF150 viel effizienter ist und eine Depolarisation hervorruft (die durch Pirenzepin blockiert wird), die für AF102B nicht gezeigt wurde. Sowohl AF150 als auch AF102B blockieren die langsame AHP (pirenzepin-sensitive M1-Wirkung)

Test 8: Pharmakodynamisches Profil und allgemeine Toxizität

TEIL A

1. Aufgabe:

Die Aufgabe dieser Untersuchung war die Erstellung des primären pharmaodynamischen Profils und die Bestimmung der allgemeinen Toxizität von AF150, indem Mäuse nach Injektion von drei Dosismengen AF150 beobachtet wurden.

2. Materialien und Methoden:

a. Tiere: Mäuse, Männchen des CD-Stammes, 20-30 g.
b. Gruppengröße: n = 5
c. Verabreichungsweg: Intraperitoneal (i. p.)
d. Dosismengen: 1, 5 und 10 mg/kg.
e. Dosierungsvolumen: 10 ml/kg.
f. Herstellung von Testmaterial: AF-150 wurde in Salzlösung gelöst.
g. AF150 wurde in 3 Dosismengen i. p. an Mäuse (n = 5)verabreicht. Es wurden Verhaltensänderungen bis zu zwei Std. nach der Dosierung aufgezeichnet, sowie zusätzliche Beobachtungen bis zu 24stündiger Verabreichung bis zum Eintritt des Todes. Die analgetischen Wirkungen wurden durch das Schwanz-Abschnür-Verfahren 15, 30, 60 und 120 nach der Dosierung untersucht. Die Tiere wurden außer auf Analgesie auch auf die nachstehenden Wirkungen untersucht: das Auftreten von Zittern, Krämpfe, Atemstörungen, Speichelfluss, Diarrhö, Änderungen des Pupillendurchmessers, Exaphthalamus, Bewegungskoordination, Hypo- oder Hyperaktivität und Lautgebung.

3. Experimentelle Ergebnisse

1 mg/kg i. p.: Sehr leichter Speichelfluss und Diarrhö wurde etwa 30 min nach der Injektion beobachtet. Zu keinem Beobachtungszeitpunkt wurde eine Analgesie oder andere zentrale oder autonome Wirkungen beobachtet.
5mg/kg i. p.: Bis zu 60 min nach der Verabreichung wurde eine verringerte motorische Aktivität beobachtet, die sich dann wieder normalisierte. Partielle Analgesie wurde 15 min nach der Injektion beobachtet. Die Bewegungskoordination war bis zu 30 min nach der Injektion reduziert. Mydriasis wurde 5 min nach der Injektion beobachtet. Leichter Speichelfluss und Diarrhö trat 10 bis 60 min nach der Injektion auf.
10 mg/kg i. p.: Bei 2 der Tiere wurde 5 bis 75 min eine vollständige Hypoaktivität beobachtet, die restlichen 3 erlangten nach 120 min ihre Aktivität zurück. Kurzfristigesleichtes Zittern wurde 10 min nach der Injektion beobachtet. Die Bewegungskoordination war während der 2stündigen Beobachtung erheblich betroffen. Die Analgesie war 15 bzw. 30 min nach der Injektion komplett; keine Analgesie wurde bei 60 min beobachtet. Moderater Speichelfluss, Diarrhö, Tränenfluss und Mydriasis wurden 5 min nach der Injektion beobachtet und wurden 10 min nach Injektion schwerwiegend, die Schwere nahm jedoch ab, und sämtliche Anzeichen waren 90 min nach der Injektion verschwunden.

TEIL B

Männliche weiße Mäuse des CDl-Stammes (Charles River, UK) mit 18 bis 26 g Körpergewicht wurden für diese Untersuchung verwendet, die an AF123, AF125 und AF125(N) durchgeführt wurde.

AF125

Dosisbereichs-Findungsversuche mit AF125, i. p. in Mäuse in Dosismengen von 50 bis 200 mg/kg injiziert, zeig ten, dass die toxisch-letale Dosis von 100 bis 200 mg/kg reicht. Diese einleitenden Versuche zeigen eindeutig, dass die Hauptanzeichen von Reaktionen auf die Behandlung vorwiegend Anzeichen waren, die für die potentiellen cholinomimetischen Eigenschaften des Testmaterials charakteristisch sind, wie Zittern, Speichelfluss, Tränenfluss, Diarrhö, Analgesie, Hypothermie und Gefäßerweiterung. Die Überlebenden wiesen die ersten Anzeichen von Erholung etwa 2 bis 3 Std. nach der Injektion auf. Die Ergebnisse der oralen Gabe und der i. v. Injektion von AF125 in nichtletalen Dosen sind in der nachstehenden Tabelle 9 aufgeführt. Tabelle 9
* Die Zahlenwerte der angegebenen Daten stehen für die Anzahl der betroffenen Tiere von der Gesamtanzahl der behandelten Tiere. Die weiteren Abkürzungen sind nachstehend angegeben:
Tre = Zittern
Con = Krampfanfall, vorwiegend klonisch-tonisch
Res = Atemstörung, vorwiegend Hyperpnoe und Tachypnoe
Sal = Speichelfluss; sli = leicht; mod = moderat; sev = stark
Lac = Tränenfluss (sli; mod; sev); Dia = Diarrhö (sli; mod; sev)
Ana = Analgesie, indiziert durch Fehlen einer Reaktion beim Schwanz-Abschnüren
Myd = Mydriasis (sli; mod; sev)
Pil = Haarsträuben
Hyp = Hypothermie (sli; mod; sev)
Mittlere letale Dosis (LD&sub5;&sub0;) von AF125
Nachstehend sind die erhaltenen LD&sub5;&sub0;-Werte (95% Vertradenswerte) angegeben:
I. Intravenöse Injektion 68,9 mg/kg (66,6-71,2)
II. Orale Verabreichung 134,4 mg/kg (118,4-152,5)
Angesichts der primären Untersuchungsergebnisse an Mäusen scheint AF125 vorwiegend cholinomimetische Aktivität zu besitzen. Es sollte ebenfalls herausgestellt werden, dass hinsichtlich der Aktivitätsdauer, der Beginn der Erholung je nach der verabreichten Dosis etwa 1 bis 2 Std. nach der Behandlung eintrat. Insbesondere unter oralen Dosierungsbedingungen schien die vergleichbare Dauer bis zum Beginn der Erholung relativ kurz zu sein. Das scheinbare enge Verhältnis der beiden jeweiligen LD&sub5;&sub0;-Werte, sowie die vergleichenden "aktiven" Dosismengen entweder i. v. oder oraler Behandlung zeigen, dass AF125 ziemlich schnell durch den enterischen Weg absorbiert wird.

AF125(N), AF123

Die allgemeinen pharmakologischen Wirkungen dieser Verbindungen sind in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10
*Die Zahlenwerte der angegebenen Daten stehen für die Anzahl der betroffenen Tiere von der Gesamtanzahl der behandelten Tiere. Die weiteren Abkürzungen sind vorstehend eingehend beschrieben und zusätzlich:
P/H = Haarsträuben/Hypothermie (sli; mod; rev).

Test 9: Die Wirkungen der Testverbindungen in Scopolaminbehandelten Ratten bei einem passiven Vermeide-(PA)- Paradigma

Unerfahrene männliche 3 Monate alte Sprague-Dawley- Ratten (erhalten von Charles River Breeding, UK) wurden verwendet (Gewicht 200-300 g). Der passive Vermeide-(PA)- Test erfolgte gemäß Fisher et al., Neurosci Lett. 102: 325 (1989), jedoch wurden bei diesen Ratten die Amnesie durch Scopolamin induziert.
Acht Gruppen mit je 17-20 naiven Ratten wurden verwendet. Jede Gruppe wurde in zwei Subgruppen zu je 7-10 Ratten unterteilt. Der Subgruppe 1 wurde Scopolamin-HBr (0,5 mg/kg in Salzlösung, s. c. 15 min vor dem Schock) injiziert, und der Subgruppe 2 wurde Salzlösung (1 ml/kg, s. c., 15 min vor dem Schock) injiziert. Sieben Gruppen wurden innerhalb 1 min nach dem Schock mit einer der nachstehenden Dosen der Testverbindung behandelt: 0,1, 0,5, 1, 3, 5, 8, 10 mg/kg (in Salzlösung i. p.) und eine Gruppe erhielt Salzlösung (1 ml/kg, i. p.).

AF125

Die Anfangslatenz- und Retentionslatenz-Werte wurden in einem Zweiwege-ANOVA (Vor-Schock-Scopolamin- Behandlung/Nach-Schock-AF125-Behandlung) analysiert. Die Tabellen 11 und 12 zeigen die Mittelwerte ± SEM der Anfangs- bzw. Retentionslatenzen. Tabelle 11: Anfangslatenz-Werte von Vor-Schock-Scopolamin- Nach-Schock-AF125-behandelten Ratten Tabelle 12: Retentionslatenz-Werte von Vor-Schock- Scopolamin-Nach-Schock-AF125-behandelten Ratten Vor-Schock

SCHLUSSFOLGERUNGEN

Das Umkehr-Screening-Experiment mit Scopolamin als Vor-Schock-Behandlung und AF125 als Nach-Schock-Behandlung ergab eine signifikante Dosis-Reaktions-Kurve. Die Dosen 3, 5, 8 und 10 mg/kg hatten einen offensichtlichen Vorteil gegenüber allen anderen Dosen. Die mit den vorstehenden Dosen behandelten Ratten wiesen gegenüber den mit Salzlösung behandelten Ratten die längsten Retentionslatenzen auf. Die niedrigeren Dosen wiesen kurze Retentionslatenzen auf, was zeigt, dass keine Verbesserung der kognitiven Funktionen eintrat. Zwischen allen untersuchten Gruppen bestanden keine Unterschiede hinsichtlich der Anfangslatenzen.
Die Wirkung der Nach-Schock-AF125-Behandlung war signifikant (F = 104,77, df = 1/126, p< 0,001 =, 10 mg/kg (p< 0,05) steigerte signifikant die Retentionslatenz der scopolaminbehandelten Ratten. AF125 (5 mg/kg) senkte si gnifikant (p< 0,05) die Retentionslatenz der mit Salzlösung Vor-Schock-behandelten Ratten. Schließlich wurde ein signifikanter Unterschied zwischen der Retentionslatenz der Vor-Schock-Scopolamin-Nach-Schock-Salzlösung behandelten Ratten und der Vor-Schock-Salzlösung-Nach-Schock- Salzlösung behandelten Ratten (p< 0,001). Sämtliche Vor- Schock-Salzlösung behandelten Ratten, die den AF125- Nachschock in den Dosen 3,5, 8 und 10 mg/kg erhielten, zeigten Nebenwirkungen. Die Gruppe, die 3 mg/kg erhielt, hatte eine leichte Diarrhö, die mit 5 mg/kg behandelte Gruppe wies eine stärkere Diarrhö auf, und die mit 8- und 10 mg/kg behandelten Gruppen hatten schwere Diarrhö und Tränenfluss. Wichtig ist, dass die Vor-Schock-Scopolaminbehandelten Ratten keine Nebenwirkungen nach der AF125- Behandlung aufwiesen.
AF125 zeigte gegenüber AF102B (US-Patent Nr. 4 855 290) eine breitere Dosis-Reaktions-Kurve; AF102B hatte eine signifikante verstärkende Wirkung auf das Retentionsverhalten, wobei die Dosen 3 und 5 mg/kg verwendet wurden, wohingegen die verstärkende Wirkung von AF125 über einen weiteren Bereich von 3 bis 10 mg/kg anhielt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die vorteilhafte Wirkung von AF125 in diesem Model auf seiner leistungsfähigen zentralen agonistischen Wirkung auf Muscarinrezeptoren beruht, die an kognitiven Funktionen beteiligt sind.

AF125(N)

Aufgaben

Unerfahrene männliche 3 Monate alte Sprague-Dawley- Ratten (erhalten von Charles River Breeding, UK) wurden verwendet (Gewicht 200-300 g).

Verhaltenstest

Acht Gruppen mit jeweils 18-20 unerfahrenen Ratten wurden verwendet. Die Gruppen wurden jeweils in zwei Subgruppen zu je 9-10 Ratten unterteilt. Der Subgruppe 1 wurde Scopolamin-HBr (0,5 mg/kg in Salzlösung, s. c. 15 min vor dem Schock) injiziert, und der Subgruppe 2 wurde Salz lösung (1 ml/kg, s. c. 15 min vor dem Schock) injiziert. Sieben Gruppen wurden innerhalb 1 min nach dem Schock mit einer der nachstehenden AF125(N)-Dosen behandelt: 0,1, 0,5, 1, 3, 5, 8, 10 mg/kg (in Salzlösung i. p.) und eine Gruppe erhielt Salzlösung (1 ml/kg, i. p.).
Die Anfangslatenz- und Retentionslatenz-Werte wurden in einem Zweiwege-ANOVA (Vor-Schock-Scopolamin- Behandlung/Nach-Schock-AF125(N)-Behandlung) analysiert. Die Tabellen 13 und 14 zeigen die Mittelwerte ± SEM der Anfangs- bzw. Retentionslatenzen. Tabelle 13: Anfangslatenz-Werte von Vor-Schock-Scopolamin- Nach-Schock-AF125(N)-behandelten Ratten
Ein signifikanter Unterschied (F(7/140) = 2,37, p< 0,05) hinsichtlich der Anfangslatenz wurden zwischen den mit AF125(N) behandelten Gruppen gefunden (Tabelle 13). Es wurde zudem eine Wechselwirkung zwischen AF125(N)- Behandlungen und der Vor-Schock-Behandlung (Salzlösung vs Scopolamin) gefunden (F(7/140) = 22,43, p< 0,05). Ein Scheffe-Test zeigte spezieller, dass die Anfangslatenz der Vor-Schock-Scopolamin-Nach-Schock-AF125(N)-(0,5 mg/kg)- behandelten Ratten (62,9 ± 17,4 sec) signifikant (p< 0,025 = länger als die Anfangslatenz der Kontrollgruppe war (Vor- Schock-Scopolamin-Nach-Schock-Salzlösung, 39,1 ± 17,6 sec). Die Vor-Schock-Scopolamin-Nach-Schock-AF125(N)-(5 mg/kg)-behandelte Gruppe hatte auch eine signifikant längere Anfangslatenz gegenüber der Kontrollgruppe: Vor- Schock-Salzlösung-Nach-Schock-Salzlösung-behandelte Gruppe (65,1 ± 18,5 vs 26,7 ± 4,7 sec. p< 0,01). Die Wirkung der Nachschock-AF125(N)-Behandlung war signifikant (F(7/140 = = 3,51, p < 0,05) und Tabelle 14). Ein Scheffe-Test zeigte spezifisch, dass die Dosis von 0,5 mg/kg AF125(N) die Retentionslatenz der scopolaminbehandelten Ratten gegenüber den mit Salzlösung behandelten Ratten signifikant vergrößerte (332,7 ± 80,9 vs 141,1 ± 5, 5 sec, p< 0,005). Tabelle 14: Retentionslatenz-Werte von Vor-Schock- Scopolamin-Nach-Schock-AF125(N)-behandelten Ratten
*p< 0,005, verglichen mit Salzlsg.
AF125(N) (5 mg/kg, i. p.) senkten signifikant die Retentionslatenz der Vor-Schock-Salzlösung behandelten Ratten, gegenüber ihrer Kontrollgruppe (290,3 ± 52,1 vs 483,6 ± 64,9 sec, p< 0,005). Schließlich wurde ein signifikanter Unter schied zwischen der Retentionslatenz der Vor-Schock- Scopolamin-Nach-Schock-Salzlösung behandelten Ratten und der Vor-Schock-Salzlösung-Nach-Schock-Salzlösung behandelten Ratten (141,1 ± 55,5 vs 483,6 ± 64,8, p< 0,001). Die Behandlung mit AF125(N) verursachte keine offensichtlichen Nebenwirkungen bei einer der Dosen, die nach Scopolamin oder nach Salzlösung verabreicht wurden. Das Umkehr-Screening-Experiment mit Scopolamin als Vor-Schock-Behandlung und AF125(N) als Nach-Schock-Behandlung ergab eine positive signifikante Reaktion nur bei einer Dosis: 0,5 mg/kg i. p. Die mit dieser Dosis behandelten Ratten wiesen gegenüber den mit Salzlösung behandelten Ratten eine längere Retentionslatenz auf.

Test 10: Die Wirkungen von AAF150 in AF64A behandelten Ratten in einem passiven Vermeide-(PA)-Paradigma

Dieses Tiermodel ahmt bis zu einem gewissen Grad die cholinerge Hypofunktion bei SDAT nach (Fisher und Hanin, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 26: 161-181, 1986). Das in Fisher et al., (J. Pharmacol., Exptl. Therap. 1991, im Druck) und in Fisher et al. (Neurosci. Lett. 102: 325-331, 1989) beschriebene Verfahren wurden hier verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 gezeigt.
Der Tabelle zufolge erwies sich AF150 in diesem Tiermodell in allen drei untersuchten Dosen bei i. p.-Injektion als vorteilhaft. AF150 (in Form der freien Base) verbesserte signifikant die Retentionslatenz von A64A- behandelten Ratten, wenn es oral mit 0,2 und 1,0 mg/kg verabreicht wurde (nicht gezeigt). Der letztere Befund zeigt, dass die Verbindung gut absorbiert wird und effizient ist, wenn sie oral in sehr niedrigen Dosen verabreicht wird. Bemerkenswerterweise sind die niedrigen, im PA-Test wirksamen Dosen frei von offensichtlichen Nebenwirkungen. AF150 hat somit den Lern- und Gedächtnistests, wie PA, zufolge, einen breiten Sicherheitsspielraum.
Es wurden keine signifikanten Unterschiede bei den verschiedenen Tiergruppen festgestellt, die im Anfangslatenztest untersucht wurden; die Anfangslatenz reichte von 20 bis 30 sec. Bei allen Experimenten mit AF150 wurde die Verbindung als freie Base in 10 mM Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,35 gelöst. Tabelle 15: Passive Vermeide-Untersuchungen mit AF150
* 3 nmol/2 ul/Seite/icv
Bemerkungen zu Tabelle 15: Signifikante Wechselwirkung, wenn F(2,54) = 6,33, p< 0,005. Durch Analyse der vorhergehenden Daten gemäß der Hauptkontraste nach Scheffe wurden die nachstehenden signifikanten Ergebnisse gefunden:
(p< 0,005) AF150 (0,1 mg/kg) vs AF64-A-Puffer
(p< 0,025) A64-A-AF150 (0,2 mg/kg) vs AF64-A-Puffer
(p< 0,001) A64-A-AF150 (1,0 mg/kg) vs AF64-A-Puffer
(p< 0,05) A64-A-AF150 (1,0 mg/kg) vs AF64-A-AF150 (0,2 mg/kg)
(p< 0,05) Salzlsg.-Puffer vs AF64-A-Puffer
(p< 0,005) Salzlsg.-Puffer vs AF64-A-AF150 (1,0 mg/kg)
(p< 0,025) Salzlsg.-Puffer vs Salzlsg.-AF150 (1,0 mg/kg)

Test 11: Die Wirkungen von AF125 und AF150 in AF64A- behandelten Ratten einem Barmigen Radial-Labyrinth(RAM)- Paradigma

Dieses Tiermodel ahmt die cholinerge Hypofunktion und die kognitive Dysfunktion bei SDAT (Fisher und Hanin, loc. cit; Fisher et al., Neurosci Lett. 102: 325-331, 1989) nach; wobei das in der letzteren Veröffentlichung beschriebene Verfahren verwendet wurde.

TEIL A - AF12S

Die potentielle Wirkung von AF125 bei der Umkehr von Gedächtnismängeln wurde anhand der Leistung AF64A- injizierter reifer Ratten im RAM untersucht.

Methoden

a) Aufgaben

48 reife männliche Ratten (11-12 Monate) wurden in dieser Untersuchung verwendet. Ihnen wurde 8 Monate zuvor im Alter von 11 Monaten icv AF64A (3 nmol/2 ul/Seite) injiziert. Eine Woche vor dem Verhaltenstest wurden die Ratten in einzelne Käfige gesperrt und hungern gelassen, bis sie 90% ihres Freifütter-Gewichts erreicht hatten (die Ratten hatten freien Zugang zu Wasser). Der Raum wurde 12 Std. am Tag (6 : 00 bis 18 : 00) erleuchtet, und die Verhaltenstest-Experimente wurden morgens durchgeführt. Nach dem Erreichen von 90% des Freifütter-Gewichts, erhielten die Ratten etwa 4 Futterpellets pro Tag (Altromin, 15 g), so dass ihr Gewicht noch weiter gesenkt wurde. Zwei Tage vor dem Verhaltenstest wurden die Ratten mit Exaktfutterpellets (Bioserv. Inc.) gefüttert, die später als Belohnung im Labyrinth verwendet wurden.

b) Vorrichtung

Die Verhaltenstests wurden in einem erweiterten (70 cm) achtarmigen Radiallabyrinth aus PVC durchgeführt. Die Gänge (75 cm lang und 10 cm breit) ragten aus einem octagonalen Zentralbereich (40 cm breit). Am Ende jedes Gangs befand sich ein Futterautomat (45 mg Pellet-Dispenser Model 8000, Lafayette Instrument Company).

c) Verhaltenstest

1) Vortraining

Vor dem Beginn des eigentlichen Tests wurden die Ratten mit dem RAM vertraut gemacht. Über den gesamten Bereich des Labyrinthes wurden Pellets verstreut. Die Ratten wurden in den Zentralbereich, jeweils immer in die gleiche Richtung schauend, gesetzt. Sie konnten von Gang zu Gang laufen, bis sie alle 8 Gänge erkundet hatten oder bis 10 min verstrichen waren. Das Vortraining dauerte zwei Wochen (fünf Tage je Woche).

2) Training

Aufgrund der Größe des Ansatzes (48 Ratten) wurde das Experiment in zwei Phasen durchgeführt. An jeder Phase nahmen jeweils 12 Ratten, denen AF64A injiziert worden war und 12 Ratten, denen Salzlösung injiziert worden war, teil. Die Ratten wurden den unterschiedlichen Phasen zufällig zugeordnet. Die Ratten jeder Phase wurden weiter in zwei Subgruppen unterteilt - und zwar medikamentenbehandelte und Kontrollgruppen. An jedem Trainingstag wurden die Ratten jeweils 30 min nach einer Injektion mit entweder AF125 (0,5 mg/kg Lösung in Salzlösung i. p.) oder Salzlösung (1 mg/kg), i. p.) in den Zentralbereich gesetzt. Die Ratten konnten von Gang zu Gang laufen, bis sie 8 Pellets aufgesammelt hatten oder bis 15 min verstrichen waren. Für jede Ratte wurden die richtigen Auswahlen, die Anzahl der Irrtümer und die Gesamtdauer der 5 Trainingstage in einem Block gruppiert. Die Werte für die richtige Auswahl, Anzahl der Fehler und der Gesamtdauer wurde durch einen 2-Wege-ANOVA (2 · 2) (Injektions-AF64A/Salzlösung und Behandlung-AF125, 0,5 mg/kg/Salzlösung) analysiert.
Richtige Auswahlen: Es wurde ein signifikanter Unterschied in der durchschnittlichen Anzahl der richtigen Auswahlen der ersten acht Einsätze zwischen der Leistung von AF64Ainjizierten Ratten (6,0 ± 0,24) und derjenigen der Salzlö sung-injizierten Ratten (6,8 ± 0,15) (F(1/36) = 9,29, p< 0,005) gefunden. Zusätzlich wurde eine signifikante Wechselwirkung zwischen Injektion und Behandlung gefunden (F(1/36) = 6,35, p< 0,025 = . Der Scheffe-Test zeigte, dass AF125 die Leistung der AF64A-injizierten Ratten (6,53 ± 0,36) gegenüber den Ratten, die mit Salzlösung behandelt worden waren, (5,49 ± 0,26, p< 0,025), verbesserte. Es wurde desweiteren kein signifikanter Leistungsunterschied zwischen den AF64A-injizierten Ratten beobachtet, die mit AF125 behandelt worden waren, und den Salzlösunginjizierten Ratten, die mit Salzlösung behandelt worden waren.
Anzahl der Irrtümer: Die AF64A-injizierten Ratten irrten signifikant häufiger (7,69 ± 1,1) als die Salzlösunginjizierten Ratten (3,5 ± 0,59) (F(1/36) = 10,11, p< 0,001). Die AF125-Behandlung zeigte auf diesen Parameter keine Wirkung.
Gesamtdauer: Bei der Messung der Gesamtdauer bestand kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen.
Körpergewicht: Ein Vergleich der mittleren Gewichte der Ratten vor dem Verhaltenstest mit einem t-Test ergab einen signifikanten Gesamtunterschied (t = (38) = 4,05, p< 0,001 = zwischen den AF64A-injizierten Ratten (489,5 g) und den Salzlösunginjizierten Ratten (579 g). Die Wirkung von AF125 auf das Körpergewicht wurde nicht untersucht, da die Ratten auf Hunger gesetzt waren.
Nebenwirkungen: Die in dieser Untersuchung verwendete Dosis von 0,5 mg/kg verursachte weniger Nebenwirkungen als die höheren Dosen (1 und 3 mg/kg), die in dem MWM- Experiment verwendet wurden. Nur zwei der Salzlösunginjizierten Ratten, die mit AF125 behandelt worden waren, hatten Diarrhö. Andere Nebenwirkungen wurden nicht beobachtet.

SCHLUSSFOLGERUNGEN

1. AF64A-injizierte Ratten zeigten eine signifikante Abnahme der Leistung, die sich in beiden Parametern ausdrückte: Anzahl der richtigen Auswahlen bei den ersten acht Einsätzen und Anzahl der Irrtümer.
2. AAF125 (0,5 mg/kg, i. p.) verbesserte signifikant die Leistung der AF64A-injizierten Ratten. Dieses Ergebnis wird nur anhand des Parameters der richtigen Auswahlen bei den ersten acht Einsätzen belegt.
3. Die Nebenwirkungen der Testverbindung AF125 waren minimal, möglicherweise aufgrund der niedrigen Dosis - 0,5 mg/kg, gegenüber den höheren Dosen (1 und 3 mg/kg), die im MWM-Experiment verwendet wurden.

Teil B - AF150

Zusammengefasst wurden Salzlösung- und A64A- vorbehandelte Ratten (3 nmol/ 2 ul/Seite, icv) bei diesen Experimenten 2,5 Monate nach einer Verletzung verwendet. Das Experiment dauerte drei Wochen. Während der ersten Woche wurden die Ratten auf das Auffinden von Futterpellets in sämtlichen 8 Gängen des Labyrinthes trainiert. Nach dem Erlernen dieser Aufgabe wurden die Ratten mit dem Verzögerungsverfahren trainiert. Während einer Vorverzögerungsperiode wurden vier Gänge des Labyrinthes geschlossen und die Ratten sammelten Futterpellets in den übrigen vier Gängen. Während dieser Periode wurden Arbeitsgedächtnis- Irrtümer aufgezeichnet. Nach 2tägiger Verzögerung wurden die Ratten wieder ins Labyrinth gesetzt. Diesmal waren sämtliche Gänge geöffnet, jedoch waren nur die 4 Gänge, die bei der Vorverzögerungsperiode geschlossen waren, mit Futter versehen. Die Ratten mussten die Futterpellets ohne Eintritt in die zuvor erkundeten Gänge auffinden, gleichgültig, ob während der Vorverzögerungs- oder Nachverzögerungsperiode. Nach dem Erreichen einer Grundlinie wurden die Ratten auf ihre Fähigkeit während der dritten Woche des Experimentes untersucht, bei dem entweder 10 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7,3) oder AF150 (0,07 oder 1,0 mg/kg freie Base, gelöst in 10 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,4) sofort nach der Vorverzögerungsperiode 5 Tage lang einmal täglich verabreicht wurde. Die Ergebnisse wurden entsprechend der Woche (II oder III) aufgelistet, und sind in Tabelle 16 gezeigt. Tabelle 16: Arbeitsgedächtnis-Irrtümer (Periode I)
Sal. = Salzlsg.
Die Arbeitsgedächtnis-Irrtümer stiegen während der Vorverzögerungsperiode in der Gruppe der mit AF64A + Puffer behandelten Ratten; die Ratten wurden anscheinend mit fortschreitendem Lernprozess immer verwirrter, möglicherweise weil eine vorangegangene Erfahrung die nachfolgende nicht erleichtert sondern eher stört. AF150 war in den untersuchten Dosen (0,07 oder 1,0 mg/kg i. p.) signifikant vorteilhaft bei der Konsolidierung des Arbeitsgedächtnisses (nur in der Vorverzögerungsperiode) der mit AF64A behandelten Ratten. Die niedrigere Dosis von 0,07 mg/kg i. p. ist tatsächlich etwas besser als die untersuchte höhere Dosis. Die vorteilhafte Wirkung von AF150 bei diesem Experiment ist die Verhinderung der Verschlechterung der AF64A behandelten Ratten statt einer einfachen Verbesserung. AF150 hatte keine verbessernde Wirkung auf die Arbeitsgedächtnis-Irrtümer während der Nachverzögerungsperi ode, obwohl diese Irrtümer während dieser Periode ebenfalls anstiegen. Die Gründe für diese Wirkung könnten sein: (a) die Vorverzögerungsperiode ist eine einfachere Aufgabe als die Nachverzögerungsperiode, was daher eine geringere kognitive Leistung erfordert und sich leichter verbessern lässt; (b) AF150 wurde nach der Vorverzögerungsperiode verabreicht, wodurch die Konsolidierung der Gedächtnisspuren der ersten vier Eingänge verbessert wurden. Möglicherweise hatte die nachträgliche Verabreichung des Medikamentes keinen Einfluss auf die Nachverzögerungsperiode, nämlich beim Erlernen der anderen vier Eingänge, was ein anderer kognitiver Prozess sein kann.
Diese Ergebnisse und die Ergebnisse von AF150 im PA- Test scheinen zu zeigen, dass diese Verbindung ein sehr leistungsfähiger kognitiver Aktivator ist, und zwar überraschend leistungsfähiger als AF102B. AF150 ist daher für die Bekämpfung von SDAT besonders erfolgversprechend.

Test 12: Die Wirkungen von AF151 in AF64A ehandelten Ratten im Morris-Wasser-Labyrinth(MWM)-Paradigma

Dieses Tiermodel, das die cholinerge Hypofunktion und die kognitiven Störungen bei SDAT nachahmt, wurde wie von Fisher et al. (J. Pharmacol. Exptl. Therap. 1991, im Druck) beschrieben, verwendet.
Ratten wurde AF64A (3 nmol/2 ul/Seite, icv) oder Salzlösung (2 ul, icv) in Gegenwart von Phosphatpuffer oder AF151 injiziert. Die Ergebnisse, ausgedrückt als von der Ratte zurückgelegte Wegstrecke (cm), sind in Tabelle 17 gezeigt.
AF151 zeigte in allen drei Dosierungsraten eine signifikante dosisabhängige vorteilhafte Wirkung bei der Heilung der kognitiven Dysfunktion bei AA64A-behandelten Raten. AF151 ist somit ein erfolgversprechendes Medikament bei der Behandlung von SDAT, da es bei sehr niedrigen Dosen wirksam ist, ohne offensichtliche Nebenwirkungen aufzuweisen.
Die statistische Signifikanz der in Tabelle 17 aufgeführten Daten sind wie folgt:
AF151 (1,0 mg/kg, i. p.) vs AF64A + Phosphatpuffer: p< 0,01
AF151 (0,3 mg/kg, i. p.) vs AF64A + Phosphatpuffer: p< 0,05
AF151 (0,07 mg/kg, i. p.) vs AF64A + Phosphatpuffer: p< 0,07. Tabelle 17: Von der Ratte im MWM zurückgelegte Wegstrecke (cm)
Sal = Salzlsg. *0,2 ml/kg, i. p. +mg/kg, i. p.
Bemerkungen zu Tabelle 17: Zusammengefasst (vgl. Fisher et al., J. Pharmacol., Exptl. Therap. 1991, im Druck) wurde das Training an 5 aufeinanderfolgenden Tagen fortgesetzt, wobei jede Ratte vier Versuche täglich absolvierte; die Ergebnisse sind als Blöcke ausgedrückt (bspw. von 4 Versuchen/Tag). Während der Versuche 1-16 (Tage 1-4 Trainingsstufe) wurde die Plattform in der Mitte des Nordwest- Quadranten des Beckens aufgestellt. Bei Versuch Nr. 17 an Tag 5 wurde die Plattform vollständig aus dem Becken entfernt (ein Transfertest). Bei diesem Versuch wurde die Ratte für eine begrenzte Zeitspanne (6 sec) ins Wasser gesetzt, und ihre räumliche Vorliebe wurde gemessen. Während der Versuche 18-21 an Tag 5 wurde die Plattform in der Mitte des Süd-Ost-Quadranten (Umkehrtest) untergebracht. Es wurden vier Startpositionen verwendet: Norden, Süden, Ostoder West am Beckenrand. Die Reihenfolge der Positionen wurde täglich semizufällig geändert. AF151 und Phosphatpuffer wurden 5 Tage lang einmal täglich 30 min vor dem Test verabreicht. Das Experiment wurde mit einem Beobachtungssystem, bestehend aus einem an einen Mikrocomputer (8 MHz - IBM AT, Galai Laboratories, Ltd) angeschlossenen Bildanalysator, durchgeführt.

Claims

für die Vertragsstaaten AT, BE, DK, FR, DE, IT, LU, NL, SE, CH, LI und GB

1. Verbindungen der Strukturformeln (I) und (II)

einschließlich deren Enantiomere, Racemate, Säureadditionen und quaternären Salze,

worin ist:

Q in Formel (I) gleich -CH&sub2;CH,-, verknüpft mit dem Sechsring in 1',4'- oder 1',5'-Stellung, und in Formel (II) gleich zwei Wasserstoffatome, (CH&sub2;)m oder C(CH&sub3;)&sub2;, wobei m gleich 1, 2 oder 3 ist und n und p jeweils unabhängig voneinander 0, 1, 2 oder 3 sind, vorausgesetzt n + p = 1 - 3;

R&sup0; Wasserstoff, Methyl oder Hydroxyl;

der Rest

gleich

oder

R ausgewählt aus Wasserstoff, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, C&sub2;&submin;&sub6;- Alkenyl, C&sub2;&submin;&sub6;-Alkynyl, C&sub3;&submin;&sub7;-Cycloalkyl, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, substituiert mit 1-6 Halogenatomen, Hydroxy-C&sub1;&submin;&sub6;- Alkyl, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxy, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylthio, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxy-C&sub1;&submin;&sub6;- Alkyl, Carboxy-C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl, (C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxy)carbonyl- C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl, Amino-C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl, Mono-(C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl)amino- C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl, Di- (C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl) amino-C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl, 2-Oxopyrrolidin-1-yl-methyl, Aryl und C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, substituiert von ein oder zwei Arylgruppen, wobei R zusätzlich ausgewählt ist aus NH&sub2;, NH-C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl und N(C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl)&sub2;, wenn R Teil der Formel (I) ist;

R' unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, aus der R ausgewählt ist, wenn R ein Teil der Formel (I) ist, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkanoyl und Arylcarbonyl;

wobei Aryl steht für ein unsubstituiertes Phenyl oder ein Phenyl, substituiert mit ein bis drei Substituenten, ausgewählt aus Halogen, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxy und CF&sub3;;

mit den Maßgaben (i), (ii) und (iii), nämlich:

(i) in Formel II, ist Q zwei Wasserstoffatome, n = p = 1, R&sup0; Wasserstoff und R Phenyl, dann ist R' kein tert-Butyl;

(ii) in Formel II, ist Q zwei Wasserstoffatome, n = p = 1, R&sup0; Wasserstoff, R p-Chlorphenyl und R' tert-Butyl, dann ist der

Rest

weder

noch

(iii) in Formel II, ist Q zwei Wasserstoffatome, n = p = 1, R&sup0; Wasserstoff, R 3,5-Dichlorphenyl, und R' tert-Butyl, dann ist der

Rest

was anderes als

2. Verbindungen nach Anspruch 1, worin jeweils die Symbole in den Formeln (I) und (II) die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen, mit folgenden Ausnahmen, nämlich dass der

Rest

nur steht für

oder

und R nicht C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxy oder C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylthio ist.

3. Verbindung nach Anspruch 2, ausgewählt aus der Gruppe:

2-Aminospiro(1,3-oxazolin-5,3')chinuclidin,

2-Methylspiro(1,3-oxazolin-5,3')chinuclidin,

2-Ethylspiro(1,3-oxazolin-5,3')chinuclidin,

2-Phenylspiro(1,3-oxazolin-5,3')chinuclidin,

1-Methylpiperidin-4-spiro-4'-(2'-methyl-1',3'-oxazolin),

1-Methylpiperidin-4-spiro-4'-(2'-ethyl-1',3'-oxazolin),

2-Methylspiro(1,3-oxazolin-5,4')-1'-methylpiperidin,

2-Methylspiro(1,3-thiazolin-5,4')-1'-methylpiperidin,

2-Ethylspiro(1,3-oxazolin-5,4')-1'-methylpiperidin, einschließlich deren Enantiomere, Racemate, Säureadditionen und quaternären Salze.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Behandlung von Krankheiten des zentralen und peripheren Nervensystems in Säugetieren, umfassend eine Menge, die wirksam ist zur Verwendung in der Behandlung dieser Krankheiten, von mindestens einem Vertreter der Gruppe, bestehend aus den Verbindungen der Formeln (I) und (II), wie in Anspruch 1 definiert, ausgenommen, dass die Maßgaben (i), (ii) und (iii) nicht greifen, einschließlich deren Enantiomere, Racemate, pharmazeutisch kompatiblen Additionen und quaternären Salze.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Verbindungen der Formeln (I) und (II) wie in Anspruch 2 definiert sind, mit der Ausnahme, dass die Maßgaben (i), (ii) und (iii) nicht greifen.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Verbindungen der Formeln (I) und (II) wie in Anspruch 3 definiert sind.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, welche in einer Form vorliegt, geeignet zur oralen, rektalen, parenteralen oder transdermalen Verabreichung oder zur Verabreichung durch Insufflation oder als Nasenspray.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, welche in einer Form vorliegt, geeignet zur transdermalen Verabreichung und umfassend als weitere Komponente eine niedermolekulare Fettsäure.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, welche in Form von Doseneinheiten vorliegt.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei mindestens ein Vertreter zugegen ist in einer Menge im Bereich von 0,5 bis etwa 100 mg zusammen mit einem inerten Träger oder Verdünnungsmittel.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 10, die weiterhin enthält mindestens eine Verbindung aus der Gruppe Physostigmin, Tetrahydroaminoacridin, Cholin, Lecithin, Piracetam, Aniracetam, Pramiracetam, Oxiracetam, 4-Aminopyridin, 3,4-Diaminopyridin, Somatostatin, Pirenzepin, N-Methylatropin, N-Butylscopolamin, Scopolamin, Clonidin, Quanfamicin, Propanthelin, Metanthelin, Glycopyrrolat, Tropenzilium, Nortriptylin, Amitriptylin, Imipramin, Minaprin, Secoverin, AFDX-116, Nikotin, Alaproclat, Zimelidin, Deprenyl und Nervenwachs tumsfaktor und desweiteren einen inerten Träger oder ein inertes Verdünnungsmittel.