DE69118702T2

DE69118702T2 - Neue verwendung eines monoklonalen antikörpers

Info

Publication number: DE69118702T2
Application number: DE69118702T
Authority: DE
Inventors: Hans A-1238 Vienna Loibner
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1990-08-11
Filing date: 1991-08-08
Publication date: 1996-09-05
Anticipated expiration: 2011-08-09
Also published as: ATE136469T1; HUT64238A; AU8393291A; CA2088370C; AU657489B2; IE912823A1; DE69118702D1; DE4025499A1; PT98622A; JPH06500771A; EP0547079B1; EP0547079A1; KR930701193A; HU9300349D0; ZA916313B; CA2088370A1; TW223019B; WO1992003165A1

Description

Die Erfindung betrifft die neue Verwendung eines monoklonalen Antikörpers. Sie betrifft die Verwendung eines monoklonalen BR55-2-Antikörpers, oder dessen Fragment mit der Spezifität des monoklonalen BR55-2-Antikörpers, oder dessen Variante zur Behandlung von HIV-Infektionen, insbesondere von AIDS (erworbenes Immunschwächesyndrom).

Grundlage der Erfindung

Die Verwendung monoklonaler Antikörper in therapeutischen Anwendungen erfährt zunehmende Akzeptanz.
Die Hybridomtechnologie erlaubt die Produktion und Isolierung von monoklonalen Antikörpern mit definierter Bindungsaffinität gegen verschiedene Antigene, die auf der Oberfläche von Zellen exprimiert werden. Tumorzellen und mit Viren infizierte Zellen exprimieren charakteristische Antigene, die nicht auf normalen bzw. nicht-infizierten Zellen zu finden sind. Daher können Antikörper gegen solche Antigene in Diagnose und Therapie eingesetzt werden. Ein Hauptziel der Therapie ist die selektive Vernichtung infizierter Zellen. Das kann mit monoklonalen Antikörpern erreicht werden, die die natürlichen Effektorfunktionen nach Bindung der Zielzelle aktivieren und so Zellyse hervorrufen. Die Vernichtung von Zellen wird durch Aktivierung des menschlichen Komplementsystems und Aktivierung verschiedener menschlicher Effektorzellen (z. B. Monozyten, Makrophagen, natürlicher Killerzellen, Lymphozyten, Granulozyten) bewirkt.
Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung monoklonaler Antikörper als Vehikel zum zielgerichteten Transport zytotoxischer Substanzen. Diese zerstören die Zielzellen, nachdem die Antikörper an die Zelle gebunden haben. Komplette Antikörper oder Antikörperfragmente mit derselben Spezifität oder deren Varianten können, z.B.
gekoppelt an ein Zellgift wie Ricin, eine synthetische zytotoxische Substanz oder ein Radionuclid, eingesetzt werden.
A. Masakazu et al., J. Exp. Med., (1988), 167:323-331, berichten, daß HIV-infizierte T-Zellen an einen IgM-Antikörper namens BM-1 binden. Es wurde festgestellt, daß diese Antikörper spezifisch für die Lewis-Y-Determinante sind. In der EP 304663 wird berichtet, daß die Lewis-Y-Determinante auf HIV-infizierten T-Zellen vorkommt und eine Methode zur Verwendung des IgM-BM-1-Antikörpers zur Erkennung solcher Zellen vorgeschlsgen. J.-E. 5. Hansen et al., J. Virol., (1990), 64:2833-2840, berichtet, daß Vorbehandlung von HIV mit dern IgM-BM-1-Antikörper die Infektiösität reduziert. Weiter wird darin berichtet, daß Behandlung von HIV-infizierten Zellen mit dem Antikörper die Synzytienbildung reduziert. M. Blaszczyk-Thurin et al., J. Biol. Chern., (1987), 262:372-379, berichten, daß ein als BR55-2 bezeichneter Antikörper spezifisch für die Lewis-Y-Determinante ist.
Die Gruppe der monoklonalen Antikörper, bestehend aus BR55-2, dessen Fragmenten mit derselben Spezifität, und deren Varianten, ist z. B. in Wistar, EP 285059, M. Blaszczyk-Thurin et al., J. Biol. Chem., (1987), 262:372-379 oder Z. Steplewsky et al., Hybridoma, (1990), 9:201-210, beschrieben. Diese Veröffentlichungen geben auch ihre Reinigung und ihre Verwendung in der Erkennung und Therapie von Basalzellkarzinomen, Adenokarzinomen und ähnlichen Tumoren bekannt. Antikörper der Familie BR55-2 binden an ein auf Tumorzellen exprimiertes Kohlenhydratantigen und erkennen spezifisch die Difucosyl-Lewis-Blutgruppenantigene Y-6 und B-7-2, die normalerweise mit Adenokarzinomen assoziiert sind. Diese murinen IgG-Antikörper, nach ihrem Isotyp IgG3, IgG2a, IgG1 und IgG2b genannt, aktivieren, nachdem sie die Tumorzielzellen gebunden haben, sehr effektiv die menschlichen Effektorfunktionen und zerstören diese Zellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist jetzt überraschend gefünden worden, daß die BR55-2 und BR55-2-verwandten Antikörper eine ausgezeichnete hemmende Aktivität bei HIV-Infektionen haben. Therapeutisch brauchbar sind besonders solche IgG-Isotypen, insbesondere IgG3 und IgG2a, die die menschlichen Efffektorfunktionen aktivieren und spezifisch die Vernichtung von HIV-infizierten, Y-Antigen-positiven Zellen, vermitteln.
Die Erfindung umfaßt die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers oder dessen Fragment zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von HIV-Infektionen, wobei der monoklonale Antikörper oder das Fragment
ein Antigen erkennt, welches durch monoklonale Antikörpererkannt wird, die von den Hybridomzellen ATCC HB 9324 und ATCC HB 9374 produziert werden;
vom IgG-Isotyp ist; und
fähig zur Zerstörung von HIV-infizierten T-Zellen ist.
Die Erfindung umfaßt ferner eine Arzneimittelzusammensetzung, umfassend als aktives Agens einen monoklonalen Antikörper oder dessen Fragment, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, zur Verwendung bei der Behandlung von HIV-Infektionen, wobei der monoklonale Antikörper oder das Fragment ein Antigen erkennt, welches durch monoklonale Antikörper erkannt wird, die von den Hybridomzellen ATCC HB 9324 und ATCC HB 9347 produziert werden;
vom IgG-Isotyp ist; und
fähig zur Zerstörung von HIV-infizierten T-Zellen ist.
Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung von HIV-Infektionen, umfassend die Mischung eines monoklonalen Antikörpers oder dessen Fragment mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittels, wobei der monoklonale Antikörper oder das Fragment
ein Antigen erkennt, welches durch monoklonale Antikörper erkannt wird, die von den Hybridomzellen ATCC HB 9324 und ATCC HB 9347 produziert werden;
vom IgG-Isotyp ist; und
fähig zur Zerstörung HIV-infizierter T-Zellen ist.
In einem weiteren Aspekt behandelt die Erfindung die Verwendung eines monoklonalen BRS5-2-Antikörpers, oder dessen Fragment mit der Spezifität des monoklonalen BR55- 2-Antikörpers, oder dessen Variante, als Zielträger zum Transport von zytotoxischen Substanzen wie Ricin, synthetische zytotoxische Agenzien und Radionucliden.

Detaillierte Beschreibung

Die neue Verwendung basiert auf den folgenden Erkenntnissen:

1. Bindung von BR55-2-Antikörpern an HIV-infizierte menschliche T-Zellinien

Das von BR55-2-Antikörpern erkannte Lewis-Y-Kohlenhydratantigen ist auf HIV- infizierten menschlichen T-Zellinien stark exprimiert. Dies kann in BR55-2-Antikörper- Bindungsstudien mit z.B. den Zellinien HUT 78 und PALL in einem Zell-ELISA oder einem indirekten Immunfluoreszenznachweis gezeigt werden. Ergebnisse sind in Tabelle 1 und Figur 2 gezeigt.

2. Komplement-abhängige Lyse HIV-infizierter menschlicher T-Zellinien, vermittelt durch BR55-2-Antikörper

Nach Bindung HIV-infizierter menschlicher T-Zellinien aktivieren BR55-2-Antikörper abhängig von ihrem Isotyp, das menschliche Komplementsystem, das seinerseits die Zielzellen zerstört. Die Herkunft des in solchen Tests verwendeten Komplements kann menschliches Plasma oder Serum sein. Die Vernichtung von Zielzellen kann durch Freisetzung von zuvor aufgenommenen &sup5;¹Cr gemessen oder durch direktes Beobachten in einem Umkehrmikroskop entdeckt werden. Die Ergebnisse solcher Komplementvermittelten Zytolyseexperimente unter Verwendung der HIV-infizierten T-Zellinien JURKAT und HUT 78 sind in Tabelle 2 und Figur 3 gezeigt. Es ist zu sehen, daß BR55- 2-Antikörper die Lyse von HIV-infizierten menschlichen T-Zellinien durch Aktivieren des menschlichen Komplementsystems vermitteln.
Die vorstehend beschriebenen Ergebnisse zeigen den angegebenen selektiven lytischen Effekt der BR55-2-Antikörper auf HIV-infizierte menschliche T-Zellen.
Varianten von BR55-2 sind z.B. chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, Klassenwechselvarianten, markierte Antikörper und Immunkonjugate. Fragmente sind z.B. Fab und F(ab')&sub2;-Fragmente. Varianten und Fragmente können mit bekannten Verfahren, wie in EP 285059 beschrieben, hergestellt werden. Markierungen können z.B. ein Radioisotop, ein Arzneimittel, ein Immunmodulator, ein die biologische Antwort modifizierender Stoff, ein Lectin oder ein Toxin sein.
Bevorzugt ist kompletter BR55-2-Antikörper, besonders der IgG3-Isotyp.
Der Ausdruck "ein monoklonaler BR55-2-Antikörper, oder dessen Fragment mit der Spezifität des monoklonalen BR55-2-Antikörpers, oder dessen Variante" bedeutet einen monoklonalen Antikörper, ein Antikörperfragment oder eine Antikörpervariante, welches das Antigen erkennt, das von den monoklonalen Antikörpern erkannt wird, die von den hinterlegten Hybridomzellen BR55.2 (BR55-2/IgG3) und BR55.2S2a (BR55-2/IgG2a) produziert werden.
Diese Hybridomzellen sind bei der "American Type Culture Collection", Rockville, MD 20852, USA, nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags, unter den Hinterlegungsnummern ATCC HB 9324 und, bzw., ATCC HB 9347 hinterlegt.
BR55-2-Antikörper werden sehr gut toleriert. Nebeneffekte sind abhängig von der Dosierung, der Verabreichungsdauer und des verabreichten Antikörperisotyps. Nach Infusion von 50 mg bis 100 mg BR55-2/IgG3 wurden bei den meisten Patienten nur geringfügig Übelkeit und Erbrechen festgestellt.
Sofern ihre Verfügbarkeit oder Herstellung hier nicht spezifisch erwähnt ist, sind die Reagenzien und Materialien, die in der Ausführung der vorliegenden Erfindung benutzt werden, bekannt und verfügbar oder sie oder ihre Äquivalente können auf übliche Art und Weise hergestellt werden.
Im Hinblick auf ihre Eigenschaft, von Zellen aufgenommen zu werden, sind BR55-2- Antikörper besonders geeignet zum zielgerichteten Transport von Toxinen und Radioisotopen:
1. Die vorstehend definierten BR55-2-Antikörper und Fragmente und Derivate können als Vehikel zum Transport zytotoxischer Substanzen benutzt werden. Antikörperfragmente werden durch enzymatische Spaltung mit z.B. Pepsin hergestellt.
Eine Spaltung zum F(ab')&sub2;-Fragment kann z.B. auffolgende Art und Weise durchgeführt werden: 0,5 mg/ml BR55-2/IgG3 in Natriumacetat-Puffer, pH 4,8 werden mit Pepsin (BR55-2/Pepsin/50:1) bei 37ºC behandelt. Ein analytischer HPLC-Lauf auf Hydroxyapatit zeigt nach 30 Minuten vollständige Reaktion an. Deshalb wird die Spaltung nach 50 Minuten durch Titration auf pH 7 mit 1 M NaOH abgestoppt. Die Lösung wird darm 2 Stunden gegen 0,01 M Natriumphosphat-Puffer, pH 6,8 dialysiert. Weitere Reinigungsschritte können mittels eines präparativen HPLC-Systems ausgeführt werden. Die dialysierte Probe wird mit einem gleichen Volumen pyrogenfreiem Wasser verdünnt und auf eine Hydroxyapatitsäule injiziert (Gesamtvolumen 160 ml). Die Säule wird danach mit Elutionspuffer A (0,01 M Natriumphosphat-Puffer, pH 6,8; 0,01 mM Calciumchlorid) gewaschen, bis die UV-Absorption konstant ist. Das F(ab')&sub2;-Fragment wird über 30 Minuten mittels eines linearen Gradienten von 2% bis 100% Elutionspuffer B (0,3 M Natriumphosphat-Puffer, pH 6,8; 0,01 mM Calciumchlorid) eluiert. Das Peakvolumen des gewünschten Proteins ist 27 ml. Das Produkt des ersten Reinigungschrittes wird über Nacht gegen Puffer A dialysiert und in 3 Teile aufgeteilt. Jeder Teil (23 ml) wird in eine erneute Chromatographie eingesetzt. Nach Probeninjektion wird die Säule mit Elutionspuffer A gewaschen, bis die UV-Absorption konstant ist. Dann wird das F(ab')&sub2;-Fragment über 20 Minuten mit einem linearen Gradienten von 0% bis 50% eluiert. Die gesammelten Peaks der drei Auftrennungen werden vereint und über Nacht gegen phosphatgepufferte Salzlösung (ohne Natriumazid) mit zweimaligem Pufferwechsel dialysiert. Das Endprodukt wird in eine pyrogenfreie, sterile, versiegelte Flasche sterilfiltriert. Das erhaltene F(ab')&sub2;-Fragment hat eine Reinheit von mehr als 99% (HPLC).
2. Für die Radioimmuntherapie ist es notwendig, ein Radioisotop erfolgreich an einen Antikörper zu binden, so daß das resultierende Produkt stabil ist und die Fähigkeit behält, das Zielantigen zu binden. Bis vor Kurzem war Iodierung die meistbenutzte Methode, aber es gab eine enorme Entwicklung einer Reihe von Methoden zum Binden metallischer Isotope an Antikörper mittels eines bifunktionalen oder heterobifunktionalen Chelatbildners, der kovalent an Antikörper gebunden ist (Metalle können nicht direkt mit Antikörpern verbunden werden). Während bifunktionale Chelate konstruiert werden können, um an eine Vielzahl von Positionen im Antikörpermolekül zu binden, bindet die Mehrheit an die reichlich vorhandenen Lysinreste. Die Endkomplexbildung des Metallions wird unmittelbar vor Gebrauch vollendet und kann einfach ohne weiteren Verlust an Antikörperaktivität durchgeführt werden. BR55-2 wurde mittels des Hydroxysuccinimidesters von DTPA konjugiert, da die so erhaltenen Konjugate im allgemeinen die Antikörperbindungseigenschaften besser erhalten, als bei Verwendung der zyklischen Anhydridmethode: DTPA + Hydroxysuccinimid DTPA-Hydroxysuccinimidester Konjugat
Die Konjugation kann z.B. in der folgenden Art und Weise durchgeführt werden: 300 ml der Antikörper-Lösung (6,5 µmol, 3,4 mg/ml in PBS) werden mit NaOH auf pH 8,0 bis 8,2 eingestellt. 1,9 ml des DTPA-Hydroxysuccinimidesters werden tropfenweise zur Reaktionslösung gegeben (der pH-Wert wurde mit 0,1 N NaOH eingestellt) und 2 Stunden gerührt. Isolierung und Reinigung des Konjugats wird in der üblichen Art und Weise durchgeführt.
3. Die jeweilige Bindung von BR55-2, des DTPA-Konjugats und seines ¹¹¹Inmarkierten Derivats an die Y-Antigen-exprimierende menschliche Mammakarzinomzellinie SKBR-5 werden in einem Zell-ELISA mit dem folgenden Verfahren verglichen: Nach Behandlung von Nunc -Immunplatten II mit Poly-L-Lysin werden die SKBR-5-Zellen in die Vertiefungen (4 x 10&sup6; Zellen/ml) pipettiert und mit Glutardialdehyd fixiert. Freie Aldehydgruppen werden mit 1 % BSA gesättigt. Die Probenihkubation mit Anfangskonzentrationen von 100 µg/ml bis hinunter zu 0,02 µg/ml wird 1 Stunde bei 37ºC durchgeführt. Kaninchen-Anti-Maus-IgG-Peroxidase wird 40 Minuten bei 37ºC inkubiert, die Bindung des monoklonalen Antikörpers wird mittels des Peroxidasesubstrats O-Phenylendiamindihydrochlorid ermittelt. Sowohl für das Konjugat wie auch für das ¹¹¹In-markierte Derivat wird kein bedeutender Unterschied im Vergleich zu nicht-konjugiertem BR55-2-Antikörper gefünden (Figur 1).

BESCHREIBUNG DER FIGUREN:

Figur 1: Bindung des monoklonalen Antikörpers und der Konjugate an das Y- Antigen der SKBR-5-Zellinie:
1 = BR55-2/IgG3
2 = BR55-2/IgG3-DTPA-Konjugat
3 und 4 = ¹¹¹In-markiertes Derivat von 2 (395 µCi/mg Protein), (Doppelbestimmung)
Figur 2: Bindung von BR55-2/IgG3 an infizierte und nicht-infizierte HUT-78--
Zellinie (Zell-ELISA)
* = HIV-infizierte HUT 78
= nicht-infizierte HUT 78
Figur 3: Komplement-abhängige Zytotoxizität zu HIV-infizierter JURKAT- Zellinie, vermittelt durch BR55-2/IgG3:
* = BR55-2/IgG3
= MIgG
Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung. Die Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:
BSA: Rinderserumalbumin
CDC: Komplement-abhängige Zytolyse
DTPA: Diethylentriaminpentaessigsäure
ELISA: Enzym-gebundener Immunabsorptionsnachweis
FCS; fötales Kälberserum
FITC: Fluoresceinisothiocyanat
HIV: menschliches Immunschwächevirus
MAB: monoklonaler Antikörper
MIgG: polyklonaler Maus-IgG-Antikörper
PBS: Phosphatgepufferte Salzlösung
RPMI: Roswell Park Memorial Institute
SDS: Natriumdodecylsulfat
Die Materialien, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird, sind die folgenden: HUT-78-, JURKAT-, PALL-Zellinien: menschliche T-Zellinien
Medium A: RPMI 1640 + 2 g/l NaHCO&sub3;
100 Einheiten/ml Penicillin G
100 µg/ml Streptomycinsulfat
4 mM Glutamin
10% FCS (Hitze-inaktiviert, c-Globulin-frei)
PBS (vollständig):
8,0 g NaCl
0,2 g KH&sub2;PO&sub4;
0,2 g KCl
1,15 g Na&sub2;HPO&sub4;
0,13 g CaCl&sub2; 2H&sub2;O
0,1 g MgCl&sub2; 6H&sub2;O
auf 11 mit destilliertem H&sub2;O
PBS&supmin; (unvollständig):
138,0 mM NaCl
1,5 mM KOH
2,7 mM KCl
6,5 mM Na&sub2;HPO&sub4;
pH 7,2
Na&sub2;&sup5;¹CRO&sub4;: 1 mCi/ml.

Beispiel 1:

Bindung von BR55-2/IgG3-Antikörpern an HIV-infizierte oder nicht-infizierte HUT-78-Zellinie

(Zell-ELISA)

Die Zellinie HUT 78 wird durch Suspendieren der Zellen (10&sup6; Zellen/ml) in einer HTLV-IIIb-Suspension infiziert. Die Adsorption wird für 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach werden die Zellen abzentrifügiert, das Inoculum entfernt und die Zellen mit einer Dichte von 10&sup5; Zellen/ml resuspendiert. Die Konzentration des viralen p24-Antigens in den Überständen wird mit einem kommerziellen ELISA-Kit bestimmt und dient als Parameter zur Virusherstellung.
Mikrotiterplatten werden mit Poly-L-Lysin-Hydrobromid (20-30 kD; 20 µg/ml in PBS-; 100 µl/Vertiefung; 30 Minuten; Raumtemperatur> vorbehandelt, zweimal mit PBSgewaschen (200 µl/Vertiefung) und danach über Nacht bei 4ºC mit einer Suspension der Zellinie HUT 78 (HIV-infiziert oder rncht-infiziert) mit einer Konzentration von 4 x 10&sup6; Zellen/ml (50 µl der Zellsuspension/Vertiefung; Medium A) ihkubiert. Nach Zentrifugation und Entfernen des Überstandes werden die Zellen mit 50 µl Glutardialdehyd (0,1 % in physiologischer Salzlösung) pro Vertiefung 5 Minuten bei Raumtemperatur fixiert, abzentrifugiert, der Überstand entfernt, die Zellen in 200 µl/Vertiefung mit PBS&supmin;/1 % BSA/0,1% NaN&sub3; resuspendiert und 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen. Nach Entfernen der Überstände und zweimaligem Waschen mit 200 µl PBS/Tween20 (0,05 %) pro Vertiefung, werden die BR55-2/IgG3- Antikörper 1 Stunde bei 37ºC inkubiert (Verdünnungen in PBS&supmin;). 20 µg/ml werden als höchste Konzentration zur Bestimmung der Antikörperbindung an die Testzellen ausgewählt. Ungebundener Antikörper wird mit 2 x 100 µl eiskaltem PBS/Tween20 (0,05 %) pro Vertiefung fortgewaschen und die Kaninchen-Anti-Maus-IgG-Peroxidase (1:1000 in PBS-/2% FCS) zugesetzt. Nach Inkubation für 40-60 Minuten bei 37ºC werden die Vertiefungen dreimal mit der oben aufgefulrrten PBS/Tween-20Lösung gewaschen und danach 100 µl der folgenden Substratlösung zu jeder Vertiefung gegeben: 40 mg o-Phenylendiamindihydrochlorid, 100 ml Färbepuffer, 20 µl H&sub2;O&sub2; (30%). Nach etwa 5 Minuten wird die Färbereaktion durch Zugabe von 50 µl 4 N H&sub2;SO&sub4; pro Vertiefung abgestoppt.
Die Bindung des Antikörpers an HIV-infizierte und nicht-infizierte HUT-78-Zellen wird durch Messen der Extinktion bei 492 nm (Kalibrierung bei 620 nm) bestimmt. Alle Waschscbritte werden mit Zellzentrifugation und Resuspendierung ausgeführt. Die Ergebnisse sind in Figur 2 gezeigt und lassen erkennen, daß die Lewis-Y- Kohlenhydratantigene, die von BR55-2 erkannt werden, nur auf HIV-infizierten HUT- 78-Zellen stark exprimiert werden.

Beispiel 2:

Bindung von BR55-2/IgG3-Antikörpern an HIV-infizierte oder nicht-infizierte PALL-Zellinie

(Immunfluoreszenznachweis)

In einem kommerziell erhältlichen Immunfluoreszenznachweis-Kit (Waldheim, IFA-Kit) werden HIV-infizierte und nicht-infizierte PALL-Zellen auf Objektträger fixiert. Nach 30 Minuten Inkubation mit 1 % BSA bei 37ºC werden die Objektträger mit BR55-2/IgG3 in PBS- in geeigneten Konzentrationen 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Nicht relevante Maus-IgG-Antikörper dienen als Kontrolle. 100 µg/ml werden als höchste Konzentration für BR55-2/IgG3, 1000 µg/ml für die nicht-relevanten Maus-IgG eingesetzt. Ungebundener Antikörper wird dreimal mit PBS- abgewaschen und Ziege-Anti-Maus- IgG-FITC (1:30 in PBS-/2% FCS) zugegeben. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37ºC, dreimaligem Waschen mit PBS und Eindeckeln der Objektträger wird die Immunfluoreszenz in einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt: Tabelle 1 Antikörper Konzentration PALL nicht-infiziert PALL HIV-infiziert nicht-relevante Maus-IgG ++ = starke Immunfluoreszenz + = schwache Immunfluoreszenz - = keine Immunfluoreszenz
Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, daß das von BR55-2 erkannte Lewis-Y- Kohlenhydratantigen nur in HIV-infizierten PALL-Zellen stark exprimiert wird.

Beispiel 3:

Humankomplement-abhängige Zytolyse (CDC) von HIV-infizierten JURKAT- Zellinien, vermittelt durch BR55-2/IgG3

(&sup5;¹Cr-Freisetzungsnachweis)

Die menschliche JURKAT-T-Zellinie wird durch Suspendieren der Zellen (10&sup6; Zellen/ml) in einer HTLV-IIIb-Suspension infiziert. Die Adsorption wird für 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach werden die Zellen abzentrifugiert, das Inoculum entfernt und die Zellen mit einer Dichte von 10&sup5; Zellen/ml resuspendiert. Die Konzentration des viralen p24-Antigens in den Überständen wird mit einem kommerziellen ELISA-Kit bestimmt und dient als Parameter zur Virusherstellung.
Am Vortag des Nachweises werden die Zellen in frisches Medium A überführt und in einer Zellkulturflasche bei 37ºC/5% CO&sub2; gehalten.
Markierung der Zielzellen mit &sup5;¹Cr:
Die Zellen werden aus der Kulturflasche entnommen und mit einer Konzentration von 5 x 10&sup6; Zellen 2 Stunden in 800 µl Medium A bei 37ºC/5% CO&sub2; mit 100 µCi Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4; inkubiert. Danach werden die Zellen mit Medium A gewaschen, um den Überschuß an &sup5;¹Cr zu entfernen, in frischem Medium A aufgenommen und ihre Konzentration auf 2 x 10&sup5; bis 3 x 10&sup5; Zellen/ml eingestellt.
CDC:
Von der Zielzellsuspension werden 100 µl Aliquots in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten pipettiert und 50 µl Aliquots der Antikörperlösung, die auf die gewünschte Konzentration mit PBS- eingestellt wurde, zugefügt. Dann werden 100 µl Aliquots eines Humanserums (1:2-Verdünnung in Medium A; Endverdünnung des Humanserums 1:5) pro Vertiefung zugefügt und die Zellen über Nacht bei 37ºC/5% CO&sub2; inkubiert. Die Überstände werden mit einer Skatron-Harvesting-Press abgenommen und in einem c-Zähler gezählt. Dies ergibt den Wert der experimentellen Freisetzung.
Zur Bestimmung der gesamten &sup5;¹Cr-Freisetzung werden die Zellen wie oben behandelt, mit dern Unterschied, daß das Humanserum durch eine Lösung mit 2 % SDS, 50 mM Na&sub2;CO&sub3; und 10 mM EDTA ersetzt wird. Der Wert der spontanen &sup5;¹Cr-Freisetzung wird mittels Ersetzen des Humanserums durch Medium A und der Antikörperlösung durch 50 µl PBS ermittelt.
Die Ergebnisse werden wie folgt berechnet;
% Lyse = Experimentelle Freisetzung- Spontanfreisetzung/ Maximalfreisetzung - Spontanfreisetzung x 100
Die Ergebnisse sind in Figur 3 gezeigt und lassen erkennen, daß BR55-2/IgG3 die Lyse von HIV-infizierten JURKAT-Zellen durch Komplementaktivierung vermittelt.

Beispiel 4:

Humankomplement-abhängige Zytolyse (CDC) von HIV-infizierter und nichtinfizierter HUT-78-Zellinie, vermittelt durch BR55-2/IgG3

(Mikroskopischer Nachweis)

Die menschliche HUT-78-T-Zellinie wird infiziert, wie unter Beispiel 1 beschrieben. Am Vortag des Nachweises werden die HIV-infizierten und nicht-infizierten HUT-78-Zellen in frisches Medium A überführt und in einer Zellkulturflasche mit 3 x 10&sup5; Zellen/ml bei 37ºC/5 % CO&sub2; gehalten. 100 µl Aliquots der jeweiligen Zielzellsuspension werden in die Vertiefungen einer Lab-tek pipettiert und 50 µl der Antikörperlösung, die auf die entsprechende Konzentration mit PBS- verdünnt ist, zugefügt. Danach werden 100 µl Aliquots des Humanserum A (1:2 Verdünnung in Medium A; Endverdünnung des Humanserums 1:5) oder des Medium A pro Vertiefung zugefügt und die Zellen 2 Stunden bei 37ºC/5 % CO&sub2; inkubiert. Morphologische Änderungen der Zielzellen werden mittels eines Umkehrmikroskops nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt: Tabelle 2 Antikörper Konzentration HUT 78 nicht-infiziert HUT 78 HIV-infiziert mit Humanserum ohne Humanserum Kontrolle ohne Antikörper mit Humanserum + = Zellyse - = keine morphologischen Änderungen
Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, daß BR55-2/IgG3 die Lyse von HIV-infizierten HUT-78-Zellen durch Komplementaktivierung vermittelt.
Die Ergebnisse der vorstehenden Experimente deuten auf eine Verwendung der monoklonalen BR55-2-Antikörper, und deren Fragmente mit der Spezifität von BR55-2. und deren Varianten, in der Behandlung von HIV-Infektionen hin, insbesondere von AIDS.
Sie sind insbesondere geeignet für eine therapeutische Anwendung beim Menschen, da sie eine eingeschränkte Bindungsspezifität, verbunden mit dem Verlust an Kreuzreaktivität, zu verwandten Antigenen haben, die auf Blutzellen wie Erythrozyten exprimiert sind.
Natürlich wird die Dosierung für die angeführte Verwendung variieren, abhängig z.B. von der verwendeten Verbindung, dem Alter des Patienten, dern Stand der Erkrankung, der Art der Verabreichung oder der gewünschten Behandlung. Sie kann von einem Spezialisten in jeder individuellen Situation bestimmt werden. Sie kann ebenso variieren. wenn die Antikörper in Kombination mit chemotherapeutischen Agenzien oder Immunstimulatoren eingesetzt werden, z.B. mit Inhibitoren der reversen Transkriptase. Die Verabreichung erfolgt z.B. parenteral durch Injektion oder Infusion. Die verabreichte Dosis beträgt z.B. etwa 25 mg bis etwa 100 mg BR55-2-Antikörper, wie vorstehend erläutert, jeden zweiten Tag, bevorzugt durch langsame intravenöse Infusion.

Claims

1. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers oder eines Fragments hiervon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von HIV-Infektionen, wobei der monoklonale Antikörper oder dessen Fragment ein Antigen erkennt, welches durch monoklonale Antikörper erkannt wird, die von den Hybridomas ATCC HB 9324 und ATCC HB 9347 produziert werden, und vom IgG-Isotop ist.

2. Eine Arzneimittelzusammensetzung, umfassend als ein aktives Mittel zur Verwendung bei der Behandlung von HIV-Infektionen einen monoklonalen Antikörper oder dessen Fragment zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder einem Verdünnungsmittel, wobei der monokionale Antikörper oder dessen Fragment ein Antigen erkennt, welches durch monoklonale Antikörper erkannt wird, die von den Hybridomas ATCC HB 9324 und ATCC HB 9347 produziert werden, und vom IgG-Isotop ist.

3. Ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung bei der Behandlung von HIV-Infektionen, umfassend das Vermischen eines monoklonalen Antikörpers oder eines Fragments hiervon mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, wobei der monoklonale Antikörper oder dessen Fragment ein Antigen erkennt, welches durch monoklonale Antikörper erkannt wird, die von den Hybridomas ATCC HB 9324 und ATCC HB 9347 produziert werden, und vom IgG-Isotop ist.

4. Verwendung nach Anspruch 1, eine Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder ein Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Isotop IgG3 ist.

5. Verwendung nach Anspruch 1, eine Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder ein Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Antikörper ein F(ab')&sub2;-Fragment ist.

6. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel geeignet ist als Zielträger zum Transport von zelltoxischen Substanzen, synthetischen zelltoxischen Mitteln oder Radionukliden zu dienen.

7. Verwendung nach Anspruch 1, eine Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder ein Verfahren nach Anspruch 3, wobei der monoklonale Antikörper ein Antikörper ist, hergestellt durch die Hybridomas ATCC HB 9324 oder ATCC HB 9347 oder eine humanisierte Version davon.