HUT64238A

HUT64238A - Method for producing of medical products containing monoclonal antibody br 55-2 or fragments thereof

Info

Publication number: HUT64238A
Application number: HU9300349A
Authority: HU
Inventors: Hans Loibner
Original assignee: Sandoz Ag; Sandoz Ltd
Priority date: 1990-08-11
Filing date: 1991-08-08
Publication date: 1993-12-28
Also published as: KR930701193A; ZA916313B; AU657489B2; AU8393291A; WO1992003165A1; IE912823A1; DE69118702D1; PT98622A; TW223019B; HU9300349D0; ATE136469T1; CA2088370A1; EP0547079A1; DE4025499A1; DE69118702T2; EP0547079B1; JPH06500771A; CA2088370C

Description

A találmány tárgyát egy monoklonális antitest újszerű alkalmazása képezi. A találmány a BR55-2 monoklonális antitestnek vagy BR55-2 monoklonális antitest specifitással rendelkező fragmentumainak vagy ezek variánsainak a HÍV fertőzések, főként az AIDS (szerzett immunhiányos szindróma) kezelésében való felhasználására vonatkozik.

A monoklonális antitesteket (MAt) egyre növekvő mértékben alkalmazzák terápiás célokra.

A hibridóma technológia lehetővé teszi a sejtek felületén kifejeződő különböző antigénekkel szemben jól meghatározott kötési affinitással rendelkező monoklonális antitestek termelését. A tumor sejtek és a vírussal fertőzött sejtek olyan jellemző antigéneket fejeznek ki, amelyek nincsenek jelen a normál, illetve nem fertőzött sejteken. Ennélfogva az ilyen antigének ellen ható MAt-eket a diagnózisban és a terápiában alkalmazhatjuk. A terápiában a fertőzött sejtek szelektív elpusztítása a fő cél. Ezt olyan MAt-ekkel érhetjük el, amelyek a célsejtekhez való kötődés után aktiválják a természetes effektor funkciókat, és így a sejt lízisét okozzák. A sejt felbomlása a humán komplement rendszer aktiválása és a ..különböző humán effektor ölő sejtek (például monociták, makrofágok, természetes ölő sejtek, limfociták, granulociták) aktiválása révén következik be.

További lehetőség, hogy a MAt-et, mint vivőanyagot használjuk citotoxikus anyagok célbajuttatására. Ezek elpusztítják a célsejtet a kötődés után. A teljes monoklonális antitesteket • · • · · · · · · • · · · · · _e vagy e monoklonális antitestek fragmentumait, melyeknek azonos a specifitásuk vagy ezek variánsait például sejtméreghez kötve használhatjuk. Ilyen sejtméreg például a ricin vagy egy szintetikus citotoxikus anyag vagy egy radionuklid.

A monoklonális antitestek egy csoportját alkotják a BR55-2 Mat-ek, ezek azonos specifitású fragmentumai és variánsaik. Lásd például: Wistar EP 285059; M.Blaszczyk-Thurin et al., J . Bioi.Chem., 262 , 372-379 (1987) vagy Z.Steplewsky et al., Hybridoma, 9_, 201-210 (199o). Ezek a közlemények ismertetik az említett monoklonális antitestek előállítását, és főként adenokarcino'mák és hasonló tumorok felismerésében és terápiájában való felhasználását. A BR55-2 osztályba tartozó antitestek tumorsejtek felületén kifejeződő szénhidrát-antigénhez kötődnek és specifikusan ismerik fel az Y-6 és B-7-2 difukozil Lewis vércsoport antigéneket, amelyek általában adenokarcino'mákhoz társulnak. Ezek az egér IgG antitestek (IgG3, IgG2a, IgGl és IgG2b), izotípusoktól függően, miután hozzákötődnek a cél-tumorsejthez, igen erősen aktiválják a humán effektor funkciókat, és felbontják ezeket a sejteket.

Meglepő módon azt találtuk, hogy a fent említett BR55-2 és a BR55-2-vel rokon antitestek különösen jó gátló hatást fejtenek ki HÍV fertőzésekben. Főként azok az IgG izotípusok használhatók terápiásán, amelyek aktiválják a humán effektor funkciókat, és szelektíven mediálják a HIV-fertőzött, Y-antigén pozitív sejtek elroncsolását. Ilyenek főképpen az IgG3 és IgG2a izotípusok.

«· · · · · * • · · · · · · • · · ♦ · · ··· · ·· ·· ·

- 4 A találmány tehát a BR55-2 monoklonális antitesteknek, ezek BR55-2 MAt spéciticitású fragmentumainak vagy variánsaiknak ÍHIV-fertőzések kezelésében való felhasználásával foglalkozik .

Vonatkozik továbbá a találmány a BR55-2 monoklonális antitesteknek vagy BR55-2 MAt specificitással rendelkező fragmentumaiknak vagy variánsaiknak felhasználására HÍV fertőzések kezelésére szolgáló gyógyszer előállításában. A találmány tárgyát képezi a HÍV fertőzések kezelésének egy olyan módszere, mely szerint egy betegnek, akinek ilyen kezelésre van szüksége, egy BR55-2 monoklonális antitestből, vagy ennek BR55-2 MAt specificitású fragmentumából vagy ezek egy variánsából terápiásán hatásos mennyiséget adunk be.

A találmány tárgyát képezi egy HÍV fertőzések kezelésére alkalmas olyan gyógyszerkészítmény, amely a BR55-2 monoklonális antitestet, vagy ennek egy BR55-2 MAt specificitású fragmentumát vagy ezek egy variánsát egy a gyógyszergyártásban elfogadott hordozóval vagy higítószerrel együtt tartalmazza.

Vonatkozik továbbá a találmány egy eljárásra, mely HÍV fertőzések kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására szolgál, és az eljárás szerint a BR55-2 monoklonális antitestet vagy ennek egy BR55-2 MAt specificitású fragmentumát vagy ezek egy variánsát egy a gyógyszergyártásban elfogadott hordozóval vagy higítószerrel elegyítjük. A találmány egy további kiviteli alakjában a BR55-2 monoklonális antitestet, vagy ennek egy BR55-2 MAt specificitású fragmentumát, vagy ezek egy variánsát citotoxikus anyagok — ilyen a ricin, a szintetikus citotoxikus anyagok és a radionuklidok — szállítása céljára, mint célbajuttató vivőanyagot használjuk f el.

A monoklonális antitest újszerű felhasználása az alábbi megfigyeléseken alapul:

1. ) A BR55-2 antitestek kötődése HIV-fertőzött humán T sejt- vonalakhoz.

A BR55-2 antitestek által felismert Lewis Y szénhidrát-antigén szignifikánsan HIV-fertőzött humán T sejtvonalakon fejeződik ki. A BR55-2 antitestek kötődését például a HIIT 78 és a PÁLL sejtvonalakhoz kötési vizsgálatokkal mutathatjuk ki, sejt ELISA vagy indirekt immunfluoreszcenciás meghatározások segítségével. Az eredményeket az 1. táblázat és a 2. ábra mutatja be.

2. ) A HIV-fertőzött humán T sejtvonalak BR55-2 antitestek ál- tal közvetített komplement-függő lízise.

A BR55-2 antitestek, miután kötődtek a HIV-fertőzött humán T sejtvonalakhoz, izotípusuktól függően aktiválják a humán komplementet mely ezután elpusztítja a célsejteket. Az ilyen vizsgálatokban használt komplement forrása humán plazma vagy szérum lehet. A célsejtek felbomlását az előzőleg beépült 51g_r felszabadulásával mérhetjük, vagy invertált mikroszkóp segítségével, közvetlen megfigyeléssel észlelhetjük.

A ÜURKAT és HŰT 78 HIV-fertőzött T sejtvonalakkal végzett komplement-közvetítette citolízises kísérletek eredményét a 2. táblázat és a 3. ábra mutatja be. Ezekből látható, • · hogy a BR55-2 antitestek a humán komplement aktiválásával közvetítik a HIV-fertőzött humán T sejtvonalak lízisét.

A fenti eredmények — mint előbb ismertettük — bizonyítják, hogy a BR55-2 antitestek szelektív litikus hatást gyakorolnak a HIV-fertőzött humán T sejtvonalakra.

A BR55-2-nek a következő variánsai lehetnek: péládul kiméra antitestek, humanizált antitestek, más osztályhoz tartozóra változtatott antitestek (class-switch variants), jelzett antitestek és immunkonjugátumok. Fragmentumok például a következők lehetnek: Fab és FCab’^ fragmentumok. A variánsokat és a fragmentumokat ismert módszerek szerint állíthatjuk elő.. (Lásd például a EP 285059 számú európai szabadalmi leírást.) A jelzést például radioizotóppal, gyógyszerrel, immunmodulátorral, biológiai választ módosító anyaggal, lektinnel vagy toxinnal végezhetjük.

Előnyös az ép BR55-2 antitest, főként ennek IgG3 izotípusa .

A BR55-2 monoklonális antitest vagy ennek BR55-2 MAt spéciiicitású fragmentuma vagy ezek variánsa meghatározás egy olyan monoklonális antitestet vagy antitest fragmentumot vagy antitest variánst jelent, mely ugyanazt az antigént ismeri fel, mint a BR55-2 (BR55-2/IgG3) és a BR55-2S2a (BR55-2/IgG2a) letétbe helyezett hibridómák által termelt monoklonális antitestek .

Ezeket a hibridómákat az American Type Culture Collection (Rockville, MD., 20E52 USA) intézményben helyezték letétbe a Budapesti Egyezmény cikkelyei alapján ATCC HB 9324, illetve ATCC HB 9347 letéti számok alatt.

A BR55-2 antitestek nagyon jól tolerálhatok. A mellékhatások az adagolástól, az alkalmazás időtartamától, a beadott antitest izotípusától függenek. A legtöbb betegnél 50 - 100 mg BR55-2/IgG3 infúzióját követően csak mérsékelt hányingert és hányást figyeltek meg.

Amennyiben a találmány szerinti eljárásban használt reagensek és anyagok hozzáférhetőségére vagy előállítására vonatkozóan itt kifejezetten nem teszünk említést, úgy ezek vagy ismertek és beszerezhetők, vagy előállíthatok, vagy pedig az ezekkel azonos termékek hagyományos módon állíthatók elő.

A BR55-2 antitestek, azon tulajdonságaik alapján, hogy internálizálhatók, különösen alkalmasak toxinok és radioizotópok célba juttatására.

1. A BR55-2 antitesteket és a fentiek szerint meghatározott fragmentumokat és származékokat citotoxikus anyagok szállítására szolgáló vivőanyagok gyanánt használhatjuk fel. Ilyen fragmentumokat enzimes hasítással — például pepszin használatával — állítunk elő.

Az F(ab’)2 fragmentum előállítása céljából a hasítást például a következőképpen végezhetjük: nátrium-acetát pufferben (pH=4,8) 0,5 mg/ml BR55-2/IgG3 MAt-et 37 °C-on pepszinnel kezelünk (BR55-2/pepszin 50:1). Analitikai HPLC-vel, hidroxilapatiton végzett futtatás 30 perc múlva azt mutatja, hogy a reakció teljesen végbemegy. A hasítást tehát 50 perc múlva állítjuk le, amikoris az anyagot 1 mólos nátrium-hidroxid oldattal való titrálással pH =7-re állítjuk be. Ezután az oldatot 2 órán át 0,01 M nátrium-foszfát pufferrel (pH=6,8) szemben

dializáljuk. További tisztítási lépéseket iktathatunk be preparatív HPLC-t alkalmazva. A dializált mintát azonos mennyiségű pirogénmentes vízzel hígítjuk, és hidroxil-apatit oszlopra injektáljuk (összmennyiség 160 ml). Ezután az oszlopot az A oldattal (0,01 M nátrium-foszfát puffer, pH=6,8, 0,01 mM kalcium- klorid) mossuk, amíg az UV abszorpció állandó értéket nem mutat. Az F(ab’)2 fragmentumot lineáris grádienssel 2-100 % 8 oldat ^0,3 M nátrium-foszfát puffer, pH=6,8; 0,01 mM kalcium-klorid) használatával eluáljuk 30 percen át. A kívánt protein csúcs-tériogata 27 ml. Az első tisztítási lépés termékét A pufferrel szemben dializáljuk egy éjszakán át,majd 3 részre osztjuk el. Mindegyik részt (23 ml) külön futtatva újból kromatografáljuk. A minta felvitele után az oszlopot addig mossuk A oldattal, amíg az UV abszorpció állandó értékre nem áll be. Az F(ab’)2 fragmentumot ezután 0-50¾ lineáris gradiens használatával 20 percen át eluáljuk. A három elválasztás összegyűjtött csúcsfrakcioit egyesítjük és foszfáttal pufferolt konyhasó oldattal (PBS; nátrium-azid nélkül) szemben dializáljuk egy éjszakán át (kétszer cseréljük a puffért). A végterméket sterilre szűrjük egy pirogénmentes steril zárt palackba. A kapott F(ab’)2 fragmentum tisztasága 99 % (HPLC).

2. A radioimmunterápia szempontjából arra van szükség, hogy az antitesthez eredményesen tudjunk radioizotópot kapcsolni úgy, hogy a kapott termék stabil legyen, és még megtartsa a cél-antigénhez való kötődés képességét. Mostanáig a jódozás volt a legáltalánosabb módszer, de rövid időn belül számos különböző módszert fejlesztettek ki a fém-izotópok és az antitestek egymás-

« ·

*· • · ·· hoz kapcsolására. Az antitestekhez való konjugálás kovalensen kötött bifunkciós kelátképző anyagok segítségével végezhető. Míg a bifunkciós kelátok az antitest molekulán különböző helyekhez kapcsolódnak, addig a kelátok nagy többsége a bőségesen jelenlévő lizin maradékokhoz kapcsolódik. A fémion végső komplexbe vitelét közvetlenül a használat előtt végezzük, s ez az eljárás egyszerűen, az antitest aktivitás további vesztesége nélkül kivitelezhető. A BR55-2 MAt-et DTPA hidroxi-szukcinimid-észterével konjugáljuk, minthogy az így kapott konjugátumok inkább megtartják kötő tulajdonságukat, mint a ciklusos anhidrid módszer használata esetén. (Lásd a 4/1. ábralapot).

3. A BR55-2, illetve a DTPA konjugátum és ^In-jelzett származékai kötődését az Y antigént kifejező SKBR-5 humán emlőkarcinóma sejtvonalhoz sejt ELISA rendszerben hasonlítotTM , tűk össze a következő eljárással: Nunc lemezeket (immunoplates II) poli-L-lizinnel kezelünk, majd a tartályokba SKBR-5 sejteket pipettázunk (4 x 10^ sejt/ml), s a fixálást glutáraldehiddel végezzük. A szabad aldehid csoportokat 1 %-os BSA-val telítjük. A mintákat (a koncentrációkat 100 ^jg/ml-től 0,02 yjg/ml-ig állítjuk be) 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A nyúl anti-egér IgG/peroxidáz immunglobulint 40 percig 37 °C-on inkubáljuk. A monoklonális antitest sejtekhez való kötődése meghatározásához peroxidáz- szubsztrátumként o-fenilén-diamin-dihidrokloridot használunk. A konjugátumnak és a In-jelzett származéknak a nem konjugált BR55-2-vel való összehasonlításakor szignifikáns különbséget nem találtunk.

Az alábbiakban az ábrák magyarázata következik.

1. ábra: A MAt és a konjugátumok kötődése az SKBR-5 sejtvonal Y-antigénjéhez.

- BR55-2/IgG3 = BR55-2/IgG3 - DTPA konjugátum és 4 = két ^In-jelzett származék (395 pCi/mg protein) (kettős meghatározás)

2. ábra: A BR55-2/IgG3 kötődése fertőzött és nem fertőzött HŰT 78 sejtvonalhoz (sejt ELISA).

x = HIV-fertőzött HŰT 78

O = HIV-vel nem fertőzött HŰT 78

3. ábra: HIV-vel fertőzött JURKAT sejtvonallal szembeni BR55-2/IgG3 által közvetített komplement-függő citotoxicitás.

x - BR55-2/IgG3 □ = MIgG

4. ábra: BR55-2-0TPA-hidroxi-szukcinimid-észter konjugátum előállításának vázlata.

Az alábbi példákkal szemléltetjük a találmányt, anélkül azonban, hogy ezekkel a találmány oltalmi köret korlátoznánk.

A rövidítések jelentése.

BSA: bovine serum albumin = marha szérumalbumin;

CDC: complement-dependent cytolysis komplement-függő citolízis;

DTPA: diethylenetriaminepentaacetic acid = dietilén-triamin-pentaecetsav ;

ELISA: énzyme-linked immunosorbent assay enzim-immunassay ;

FCS: fetal calf serum = fetális borjúszérum; ( borjú magzatszérum);

FITC: fluorescein isothiocyanate = fluoreszcein-izotiocianát;

HÍV: humán immunodéiiciency vírus = humán immunelégtelenség vírus ; /

MAb: monoclonal antibody s:

MAt: monoklonális antitest;

MIgG:polyclonal mouse IgG antibody = poliklonális egér IgG antitest;

PBS: phosphate-buffered saline = foszfáttal pufferolt konyhasó oldat;

RPMI: Roswell Park Memória! Institute ;

SDS: sodium dodecyl sulphate = nátrium-dodécil-szulfát.

A példákban szereplő HŰT 78, JURKAT PÁLL sejtvonalak: humán T sejtvonalak.

A táptalaj: RPMI 1640 + 2 g/1 nátrium-hidrogén-karbonát

100 E/ml penicillin G

100 sztreptomicin-szülfát mM glutamin

10¾ FCS (hő-inaktivált, T-glo’°ulin mentes)

Kiegészített PBS: 8,0 g nátrium-klorid

0,2 g kálium-dihidrogén-faszfát

0,2 g kálium-klorid

1,15 g dinátrium-hidrogén-foszfát

0,13 g kalcium-klorid — víz (1/2)

0,1 g magnézium-klórid — víz (1/6)

Kiegészítve 1 literre desztillált vízzelHiányos PBS: 138,0 -mM nátrium-klorid

1.5 mM kálium-hidroxid

2,7 mM kálium-klorid

6.5 mM dinátrium-hidrogén-foszfát pH = 7,2

S1

Na CrO_d: 1 mCi/ml.

1. példa

A BR55-2/IgG3 antitestek kötődése HIV-fertőzött vagy nem-fertőzött HŰT 76 sejtvonalhoz (Sejt ELISA)

A HŰT 78 sejtvonalat úgy fertőzzük meg, hogy a sejteket (10⁶ sejt/ml) HTLV Illb vírus-szuszpenzióban szuszpendáljuk. Ezután 37 °C-on 2 órán át hagyjuk, hogy végbemenjen az adszorpció. A sejteket lecentrifugáljuk, az inokulumot eltávolítjuk, és a sejteket leP sejt/ml sűrűségben reszuszpendáljuk. A felülűszóban a p24 vírusantigén koncentrációját kereskedelmi ELISA kit (készlet) segítségével határozzuk meg, és ez az adat

szolgál a vírustermelés paraméteréül.

A mikrotitráló lemezek előkezelését poli-L-lizin-hidrogénbromiddal (20-30 k0; 20 yjg/ml hiányos PBS-ben; 100 jul/tartály; szobahőmérséklet) végezzük. A lemezeket kétszer mossuk hiányos PBS-ben (200 yjl/tartály) , majd egy éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk 4 x 10^ sejt/ml koncentrációjú HIV-vel fertőzött vagy nem-fertőzött HŰT 78 sejtvonal szuszpenziójavai (50 ^ul sejtszuszpenzió/tartály; A táptalaj). Centrifugálás és a felülúszó eltávolítása után a sejteket tartályonként 50 yul glutáraldehiddel (fiziológiás konyhasó oldatban 0,1 5 percig szobahőmérsékleten fixáljuk, lecentrifugáljuk, a felülúszót eltávo lítjuk, a sejteket tartályonként 200 y_il hiányos PBS/1 % BSA/0,1 % NaN-j oldatban reszuszpendáljuk, és 1 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A felülúszókat eltávolítjuk, a tartályokat kétszer mossuk 200 yul PBS/Tween 20 (0,05 %) oldattal, majd a sejteket a BR55-2/lgG3 MAt-tel 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk (a hígításokat hiányos PBS-sel végezzük). Az antitest és a teszt-sejtek kötődésének meghatározásához választott legmagasabb antitest koncentráció 20 yug/ml. A kötetlen antitesteket a tartályokból 2 x 100 y_il jéghideg PBS/Tween 20 (0,05 %) oldattal mossuk ki, majd a tartályokba nyúl anti-egér IgG-peroxidáz konjugátumot mérünk be 1:1000 hígításban (hígítás: hiányos PBS/2 % FCS). A lemezeket 40-60 percig 37 °Con inkubáljuk, majd a tartályokat háromszor mossuk a fenti PBS/Tween 20 oldattal. Ezután minden tartályba a következő szubsztr áturm oldatból 100 yul-t mérünk be: 40 mg o-fenilén-diamin-hidroklorid, 100 ml puffer (a festéshez), 20 yul hidrogén14

-peroxid (30 %). A szín kifejlődését körülbelül 5 perc múlva úgy állítjuk le, hogy minden tartályhoz 50 yj 1 2 M kénsavat adunk. Az antitest kötődését a HlV-fertőzött és nem-fertőzött HŰT 78 sejtekhez extinkció méréssel — 492 nm-en (kalibrálás 620 nm-en) — határozzuk meg. Minden mosási lépésnél a sejteket lecentrifugáljuk és reszuszpendáljuk. Az eredmények, melyek a 2. ábrán láthatók, azt mutatták, hogy a BR55-2 által felismert Lewis Y szénhidrát antigént csak a HIV-fertőzött HŰT 78 sejtek fejezik ki.

2. példa

A BR55-2/IgG3 antitestek kötődése HIV-fertőzött vagy nem-fertőzött PÁLL sejtvonalhoz (Immunfluoreszcenciás vizsgálat)

Egy kereskedelemből beszerezhető immunfluoreszcenciás kittel (Waldheim IFA-kit) végzett vizsgálatban HIV-fertőzött és nem-fertőzött PÁLL sejteket fixálunk lemezekre. A lemezeket 30 percig 37 °C-on 1 % BSA-val inkubáljuk, majd 1 órán át 37 °C-on a BR55-2/IgG3 megfelelő koncentrációival (hiányos PBS-ben) inkubáljuk. Sima (irreleváns) egér IgG-t használunk kontrollként. A BR55-2/IgG3 legmagasabb koncentrációja 100 yjg/ml, a kontroll egér-IgG legmagasabb koncentrációja 1000 yjg/ml.

A nem kötött antitest eltávolítására háromszor mossuk a lemeze két hiányos PBS-sel, majd hiányos PBS/2 % FOS oldattal 1:30 arányban hígított kecske anti-egér IgG-FITC konjugátumot mérünk be. A lemezeket ezután 30 percig inkubáljuk 37 °C-on, majd háromszori mosás következik hiányos PBS-sel, végül a lemezek beágyazása. Az immunfluoreszcenciát fluoreszcens mikroszkóppal olvassuk le. Az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza:

1. táblázat.

Antitest

Koncentráció

PÁLL

BR55-2/lgG3

Sima egér IgG (yug/ml) nem-fertőzött HIV-fertőzött

100

1000 + + = szignifikáns· fluoreszcencia + = enyhe fluoreszcencia

- = nincs fluoreszcencia

Az 1. táblázat adatai szerint a BR55-2 által felismert

Lewis Y szénhidrát antigént csak a HIV-fertőzöti PÁLL sejtek fejezik ki szignifikánsan.

3. példa

A HIV-fertőzött JURKAT sejtvonalak BR55-2/IgG3 által közvetített humán komplement-függő citolízise (CDC).

(⁵¹Cr-felszabadulás vizsgálata)

A humán JURKAT T sejtvonal befertőzését úgy végezzük, hogy a sejteket (10^ sejt/ml) HTLV Illb vírus-szuszpenzióban szuszpendáljuk. Két órán át 37 °C-on hagyjuk, hogy végbemenjen az adszorpció. Ezután a sejteket lecentrifugáljuk, az inokulomot eltávolít··♦· juk, és a sejteket 10⁵ sejt/ml sűrűségben reszuszpendáljuk. A felülúszóban a p24 vírusantigén koncentrációját kereskedelmi ELISA kit-tel határozzuk meg, . s ez szolgál a vírus-termelés paraméteréül.

A vizsgálat előtt egy nappal a sejteket friss A táptalajba visszük át, és sejt-tenyésztő palackban, 37 °C-on, 5 % szén-dioxid tartalmú atmoszférában tartjuk.

A célsejtek jelzése ^Cr-rel:

A sejteket összegyűjtjük a sejttenyésztő palackból, és 800 yjl A táptalajban 5 x 10^ sejtkoncentráció mellett 100 yuCi Na^^^CrO^-gyel inkubáljuk 37 °C-on 5 % szén-dioxid tartalmú atmoszférában 2 órán át. A sejteket ezután A táptalajjal mossuk a feleslegben lévő ^^Cr eltávolítása céljából. A sejteket ezután friss A táptalajjal mossuk, és a koncentrációt 2x10^ 3x10^ sejt/ml értékre állítjuk be.

CDC:

A célsejt szuszpenzióból 100 jul-eket pipettázunk mikrotitráló lemezek tartályaiba, és 50 yul-eket mérünk be hiányos PBS-sel a kívánt koncentrációra hígított antitest oldatból. Ezután egy humán szérumból (A táptalajjal 1:2 arányban hígítva; θ humán szérum végső hígítása 1:5) 100 /j1 mennyiségeket mérünk minden tartályba, és a sejteket egy éjszakán át 37 °C-on 5 % szén-dioxid mellett inkubáljuk. A felülúszókat Skatron-Harvesting-Press segítségével aratjuk le, és ^-számlálóban számláljuk. Ez adja a kísérleti felszabadulás értékét.

Az ossz ^^Cr felszabadulás meghatározása érdekében a sejteket úgy kezeljük, mint fent, de a humán szérumot 2 % SDS, ··

- 17 50 mM nátrium-karbonát és 10 mM EDTA tartalmú oldattal helyettesítjük. A spontán ⁵¹Cr kibocsátás értékét akkor kapjuk meg, ha a humán szérumot A táptalajjal és az antitest oldatot 50 y_il PBS-sel helyettesítjük.

Számlálás után az eredményt a következőképpen számítjuk ki :

(kísérleti felszabadulás mínusz spontán felszabadulás)xl00

Lízis % = -------------------------------------------------------------------ossz felszabadulás rninusz spontán felszabadulás

Az eredmények a 3. ábrán láthatók. Az ábra bemutatja, hogy a BR55-2/IgG3 MAt komplement aktiválás segítségével közvetíti a HIV-fertőzött JURKAT sejtek lízisét.

4. példa

A HIV-fertőzött és nem-fertőzött HŰT 78 sejtvonal BR55-2/IgG3 által közvetített humán komplement-függő citolízise (CDC). (Mikroszkópos észlelés)

A HŰT 78 humán T sejtvonalat az 1. példa szerint fertőzzük meg. A vizsgálatot megelőző napon a HIV-fertőzött és nem-fertőzött HŰT 78 sejteket átvisszük friss A táptalajba, és 37 °C-on, sejt-tenyésztő palackokban 5 % szén-dioxid mellett tartjuk (3x10^ sejt/ml). Az illető célsejtek szuszpenziójából

100 pl-eket pipettázunk egy Lab-tek lemez tartályaiba, és a' hiányos PBS-sel a kívánt koncentrációra hígított antitest oldatból 50 jjl-eket mérünk hozzá. Ezután 100-100 yjl humán szérumot (1:2 hígítás A táptalajjal; a szérum végső hígítása 1:5) vagy A táptalajt mérünk a tartályokba, és a sejteket 2 órán át 37 °C-on 5 % szén-dioxid tartalmú atmoszférában inkubáljuk.

A célsejtek morfológiai változásait invertált mikroszkóppal vizsgáljuk. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze.

2. táblázat.

Antitest

Koncentráció HŰT 78 (/ug/ml) nem-fertőzött

HŰT 78

HÍV-fertőzött

BR55-2/lgG320 humán szérum jelenlétében

BR55-2/lgG320humán szérum nélkül

KontrollO antitest nélkül, humán szérum jelenlétében + = sejt llzis

- = nincsenek morfológiai változások

A HŰT 78 sejtvonallal kapott eredményekből (lásd a 2. táblázatot) látható, hogy a BR55-2/IgG3 komplement aktiválás révén közvetíti a HIV-fertőzött HŰT 78 sejtek lízisét.

A fent ismertetett kísérleti eredmények alapján a BR55-2 monoklonális antitesteket, ezek azon fragmentumait, amelyek a BR55-2 spéciiicitásával rendelkeznek és az előbbiek variánsait a HIV-fertőzések — főként az AIDS — kezelésében való haszná19 latra javasoljuk.

Minthogy ezek korlátozott kötési spéciiicitást mutatnak, és ehhez nem társul vérsejteken (például vörösvérsejteken) kifejeződő rokon antigénekkel szembeni keresztreakció sem, ezért különösen alkalmasak emberek kezelésében való felhasználásra.

A fent említett felhasználás esetén az adagolás természetesen például a használt vegyülettől, a kezelt beteg korától, a betegség fokozatától, az alkalmazás módjától vagy a kívánt kezeléstől függően változik. Az adagolást minden egyedi esetben a szakorvos határozza meg. Változik az adagolás akkor is, ha az antitesteket kemoterapeutikumokkal vagy immunstimulátorokkal — például reverz transzkriptáz inhibitorokkal — kombináltan alkalmazzuk. Az alkalmazás például parenterálisan, injekcióban vagy infúzióban történhet. A fent meghatározott BR55-2 minden második nap beadott mennyisége például körülbelül 25 mg-tól körülbelül 100 mg-ig terjedhet, előnyösen intravénásán infundálva.

Claims

1. BR55-2 monoklonális antitest vagy ennek fragmentuma — mely a BR55-2 monoklonális antitest spéciiicitásával rendelkezik — vagy variánsaik felhasználása HÍV fertőzések kezelésére szolgáló gyógyszerek előállításában.

2. A BR55-2 monoklonális antitest vagy BR55-2 monoklonális antitest specificitású fragmentuma vagy ezek variánsai felhasználása HÍV fertőzések kezelésében.

3. HÍV fertőzések kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként BR55-2 monoklonális antitestet vagy ennek BR55-2 monoklonális antitest specificitású fragmentumát vagy ezek variánsait tartalmazza gyógyszerészeti szempontból elfogadott hordozóval vagy higítószerrel együtt.

4. Módszer HÍV fertőzések kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy betegnek, akinek ilyen kezelésre szüksége van, a BR55-2 monoklonális antitestből vagy ennek BR55-2 monoklonális antitest specificitású fragmsntumából vagy ezek variánsaiból terápiásán hatásos mennyiséget adunk be.

5. Eljárás HÍV fertőzések kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására, azzal jellemezve, hogy egy BR55-2 monoklonális antitestet vagy ennek BR55-2 monoklonális antitest specificitású fragmentumát vagy ezek egy variánsát gyógyszerészetileg elfogadott hordozóval vagy higítószerrel elegyítjük.

6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti felhasználás, a 3. igénypont szerinti összetétel, a 4. igénypont szerinti módszer, az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó antitest a BR55-2/IgG3.

7. Az 1. vagy a 2. igénypont szerinti felhasználás, a 3. igénypont szerinti összetétel, a 4. igénypont szerinti módszer, az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó antitest a BR55-2/IgG3 F(ab’)₂ fragmentuma.

8. A 2. igénypont szerinti felhasználás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó antitestet célbajuttató vivőanyagként alkalmazzuk citotoxikus anyagok, szintetikus citotoxikus szerek vagy radionuklitod szállítására.