DE69112059T2 - Monoklonale antikörper gegen gag-protein-vorläufer-p55 von hiv-virus. - Google Patents
Monoklonale antikörper gegen gag-protein-vorläufer-p55 von hiv-virus.Info
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Description
- Das menschliche Immunschwäche-Virus (HIV) ist das verursachende Agens des erworbenen Immundefektsyndroms ("acquired immunodeficiency syndrome", AIDS). HIV ist ein Mitglied der Lentivirus-Subfamilie der Retroviren und infiziert menschliche CD4+-T-Lymphocyten, Makrophagen und möglicherweise auch andere Zelltypen (vgl. A. S. Fauci: "The human immunodeficiency Virus: Infectivity and mechanisms of pathogenesis", Science 239 (1988), 617-622; D. D. Ho, R. J. Pomerantzk und J. C. Kaplan: "Pathogenesis of infection with human immunodeficiency virus", N. Engl. J. Med. 317 (1987), 278-286). Das Genom des Virus enthält, wie bei anderen Retroviren, gag-, Pol- und env-Gene, die die viralen Core-Proteine, virale Enzyme, einschließlich reverser Transcriptase, bzw. das virale Envelope-Protein codieren. Das Virus enthält außerdem mindestens fünf weitere Gene, von denen drei regulatorische Funktionen haben, wobei die Expression dieser Gene ziemlich sicher bei den pathogenen Mechanismen dieser Viren eine Rolle spielt.
- Zur Entwicklung von Arzneimitteln für die Therapie gegen MIV wurden in den letzten Jahren verschiedene Wege eingeschlagen (vgl. J. S. Oxford, A. R. M. Coates, D. Y. Sia, K. Brown und S. Asad: "Potential target sites for antiviral inhibitors of human immunodeficiency virus (HIV)", J. Antimicrob. chemother. 23, Ergänzungsband A, (1989), 9-27).
- Mögliche Ziele für Arzneimittel gegen HIV könnten die essentiellen viralen Funktionen sein, wie z.B. das Eindringen des Virus in die Zelle, Enzymaktivitäten und die zelluläre Aktivierung und Proliferation. Diese Funktionen werden über die Fxpression viraler Gene reguliert. Im Fall der gag-, Pol- und env-Gene werden Polypeptidvorstufen codiert, die durch proteolytische Prozessierung und andere Modifikationen posttranslational modifiziert werden. Interessante Ziele für Inhibitoren könnten die Enzymaktivitäten sein, die aus der pol-Gen-Polypeptidvorstufe hergeleitet werden, einschließlich Protease, reverser Transcriptase und Endonuclease. Die Protease spaltet das Vorstufenprodukt des gag-Gens, das Protein p55, in vier Strukturproteine des viralen Cores, zu denen p24, das wichtigste innere Core-Protein, und p17 zählen. Diese zwei Proteine kommen durch die Spaltung von aneinandergrenzenden Aminosäuresequenzen der Vorstufe p55 zustande. Die gleiche Protease spaltet auch die gag-pol-Vorstufe, wodurch die Protease selbst (autolytische Aktivierung), die reverse Transcriptase und die Endonuclease erhalten werden (vgl. W. G. Kobey, B. Safai, S. Oroszlan, L. O. Arthur, M. A. Gonda, R. C. Fallo und P. J. Fischinger: "Characterization of envelope and core structural gene products of HTLV-III with sera from AIDS patients", Science 228 (1985), 593-595; I. Katoh, T. Yasunaga, Y. Ikawa und Y. Yoshinaka: "Inhibition of retroviral protease activity by an aspartyl proteinase inhibitor", Nature 329 (1987), 654- 656; C. Debouck, J. G. Gorniak, J. E. Strickler, T. D. Meek, B. W. Metcalf und M. Rosenberg: "Human immunodeficiency virus protease expressed in Escherichia coli exhibits autoprocessing and specific maturation of the gag precursor", Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (1987), 8903-8906).
- Ein Hauptziel der wissenschaftlichen Forschung und der kommerziellen Verwendung bestand in den letzten Jahre darin, das Vorliegen von HIV-1 oder einen HIV-1-Kontakt bei Patienten nachzuweisen.
- Tests zum Nachweis von HIV-1 beruhen im allgemeinen auf immunologischen Reaktionen, wobei inaktivierte ganze Viren als Antigen-Reagens zur Erzeugung geeigneter Antikörper eingesetzt werden. In der neuesten Patentliteratur und der wissenschaftlichen Literatur werden auch Antikörper gegen HIV-1-Proteine beschrieben, die für die virale Replikation essentiell sind, außerdem wird deren Verwendung zum frühen Nachweis von HIV-1-Antigenen und zum Überwachen einer antiviralen Therapie bei HIV-1-infizierten Patienten beschrieben. Insbesondere wird ein monoclonaler Mausantikörper gegen HIV-1-gp41 in EP-A- 335134 beschrieben. Monoclonale Mausantikörper mit spezifischer Reaktivität gegenüber HIV-1-p24 werden in EP-A-345461 offenbart. Monoclonale und polyclonale Antikörper, die gegenüber gp48 spezifisch sind, werden in der Internationalen Patentanmeldung WO 90/00617 beschrieben.
- Die Verwendung von monoclonalen Antikörpern, die mit p24 und p17 reagieren, zum Nachweis des Vorliegens von p55, p24 und p17 mittels Western Blot-Analyse von Zellysaten von chronisch HTV-1-infizierten T-Lymphocyten wird von T. D. Meek et al.: "Inhibition of HIV-A-Protease in infected T-lymphocytes by synthetic peptide analogues", Nature 343 (1990), 90-92, offenbart.
- Rekombinante virale Core-Fusionsproteine und die Herstellung der jeweiligen Antikörper dagegen werden in EP-A-305777 beschrieben.
- Diese Erfindung stellt einen monoclonalen Antikörper gegen das Vorstufenprodukt der gag-Gene, d.h. gegen das Protein p55, oder gegen einen Teil davon bereit, das/der die p55- Spaltstelle der HIV-1-Protease enthält, wodurch die Polypeptide p24 und p17 erzeugt werden ("p24/p17-HIV-1-Proteasespaltstelle"). Der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper ist nützlich, um das Vorliegen der gag-Vorstufe von p24 und den anderen kleineren Polypeptiden in biologischen Flüssigkeiten und/oder Geweben, die diese enthalten, nachzuweisen, hiermit kann die Proteaseaktivität als Marker der viralen Aktivität überwacht werden, z.B. bei Personen, die mit HIV-1 in Kontakt gekommen sind und bisher noch kein AIDS entwickelt haben, oder bei Patienten, die bereits in Behandlung sind. Die Bezeichnung "biologische Flüssigkeiten und/oder Gewebe" umfaßt neben Säugervollblut, Plasma, Lymphocyten und Zellkulturen auch zelluläre oder bakterielle Extrakte, die über die Expression des gag-Gens in einem eukaryotischen oder prokaryotischen Wirt erhalten werden, und außerdem ein beliebiges Gemisch oder eine beliebige Lösung, die natürliche oder synthetische Polypeptide enthält, die die gleiche Aminosäuresequenz wie p55 oder eines Fragmentes davon umfassen, die/das die p55-Spaltstelle der HIV-1-Protease enthält, wodurch die Polypeptide p24 und p17 erzeugt werden.
- Eines der wichtigsten Anwendungsgebiete des erfindungsgemäßen Antikörpers sind somit Enzym-Immuntests von Serum und anderen Körperflüssigkeiten und/oder Geweben von Patienten, die mit HIV-1 in Kontakt gekommen sind.
- Eine weitere Verwendung des Antikörpers ist die Isolierung und/oder Reinigung von natürlichen oder synthetischen Peptiden, die die p55-Spaltstelle der HIV-1-Protease enthalten, wodurch die Polypeptide p24 und p17 erzeugt werden. Hierdurch kann die Proteinvorstufe in gewünschter Menge erhalten werden und für die Erforschung des viralen Replikationsmechanismus sowie die Herstellung und Isolierung von Substanzen verwendet werden, die min der Vorstufe um die HIV-1-Protease kompetieren und die potentielle prophylaktische und/oder therapeutische Arzneimittel darstellen.
- Die Antikörper können für solche Anwendungen nach Standardverfahren an einen inerten Träger gebunden werden, wobei eine Affinitätsmatrix erhalten wird (vgl. z.B. J.W. Goding: Monoclonal Antibodies Principles and Practice, Academic Press, New York, (1983), 188-207).
- Einige spezifische Beispiele zur praktischen Anwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers können aufgrund der Analogie außerdem aus EP-A-345461 und EP-A-335134 entnommen werden.
- Ein besonderes Merkmal des erfindungsgemäßen Antikörpers ist die spezifische Reaktivität mit einem Epitop des Proteins p55, das die Spaltstelle der HIV-1-Protease umfaßt, wodurch die Polypeptide p24 und p17 erzeugt werden; dieser Antikörper eignet sich besonders für einen Immuntest, womit man untersuchen kann, ob bekannte und auch unbekannte Substanzen in Flüssigkeiten, Geweben und gezüchteten Zellen eine HIV-1-Protease- Inhibitoraktivität zeigen. Tatsächlich beruhen die gegenwärtig zum Nachweis einer solchen Aktivität verwendeten Tests auf polyclonalen oder monoclonalen Antikörpern, die hauptsächlich gegen die viralen Polypeptide gerichtet sind, die bei der Spaltung der gag-Vorstufe entstehen. Diese Antikörper können nicht zwischen der gag-Vorstufe und dem gespaltenen Polypeptidprodukt (entweder p17 oder p24) unterscheiden und werden deshalb üblicherweise als primäre Antikörper in Western Blot- Techniken eingesetzt (vgl. T. D. Meek et al., Nature 343 (1990), 90-92, und McQuade et al.: "A synthetic HIV-1 protease inhibitor with antiviral activity arrests HIV-like particle maturation", Science 247 (1990), 454-456).
- Kurz gesagt werden die in Flüssigkeiten, Geweben oder Zellysaten enthaltenen Proteine durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) aufgetrennt und anschließend auf Nitrocellulosefilter geblottet. Die durch den primären Antikörper erkannten HIV-Proteine werden sodann durch Inkubation mit einem entsprechend markierten sekundären Antikörper sichtbar gemacht.
- Sodann kann man das Verhältnis von Vorstufe zu Produkt in unbehandelten Proben mit dem Verhältnis von Vorstufe zu Produkt in Proben, die mit einem Inhibitor der Proteasereaktion behandelt wurden, vergleichen und hieraus Informationen über die Wirksamkeit eines solchen Inhibitors in den behandelten Proben erhalten.
- Wenn ein Antikörper verfügbar wäre, der ausschließlich die Vorstufe und nicht ein beliebiges Protease-Spaltprodukt erkennt, könnte die PAGE des Proteintrennschritts vermieden werden. Ein Beispiel hierfür ist die Verwendung eines Sandwich-ELISA-Tests. Hierbei wird ein solcher Antikörper an einen festen Träger, z.B. Mikrotitervertiefungen, immobilisiert und sodann in diese Vertiefungen Flüssigkeit, Gewebe oder Zellysate von HIV-infizierten Zellen zugegeben, die das Proteasesubstrat enthalten. Hier wird nur die gag-Vorstufe (ein Fragment davon oder ein synthetisches Polypeptid, das die gleiche Aminosäuresequenz der p24/p17-Spaltstellenregion enthält: "Vorstufen-ähnliche Polypeptide") gebunden, während alle anderen Proteine viralen und zellulären (oder synthetischen) Ursprungs einfach abgewaschen werden können. Anschließend kann die Menge der gag-Vorstufe oder des Vorstufen-ähnlichen Polypeptids bestimmt werden, indem das Ganze mit einem anderen (mono- oder polyclonalen) Antikörper inkubiert wird, der ein anderes Epitop der Vorstufe erkennt (entweder auf deren p24- oder p17-Anteil) und der vorher mit einem Markerenzym (z.B. Meerrettich-Peroxidase oder alkalischer Phosphatase und dergleichen) markiert wurde.
- Beispiele, wie solche Tests durchgeführt werden können, sowie eine Beschreibung der Reaktionsbedingungen finden sich im Kapitel: "Practice and theory of enzyme immunoassays" von P. Tijssen im Band: "Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology", herausgegeben von R. H. Burden und P. H. van Knippenberg, Elsevier, 1985.
- Der selektive Antikörper dieser Erfindung kann mit anderen Reagentien und Mitteln kombiniert werden, die zur Durchführung des analytischen Tests als gebrachsfertiger Kit benötig werden.
- Ferner kann dieser Antikörper zum Absuchen potentieller Inhibitoren der HIV-1-Protease in einem Test eingesetzt werden, wobei als Protease-spezifisches Substrat ein HIV-gag-Fusionsprotein verwendet wird, das ein p55-Fragment enthält, welches seinerseits einen Anteil sowohl von p24 als auch von p17 umfaßt und die p24/p17-HIV-1-Proteasespaltstelle enthält, verknüpft mit einem Markerenzym, z.B. β-Galactosidase. Dieses Fusionsprotein kann hergestellt werden, indem z.B. das DNA- Fragment, das ein solches Proteinfragment codiert, aus dem viralen Genom des HIV-Stamms LAV isoliert und dieses DNA-Fragment in das Strukturgen von E. coli-β-Galactosidase, das im Vektorplasmid pVR292 enthalten ist, eingefügt wird. Eine solche Insertion, die im gleichen Leseraster wie die β-Galactosidase-codierende Sequenz liegt, erlaubt die Expression des gag- Proteinfragments in E. coli als Protein, das mit dem Enzym β- Galactosidase verknüpft ist.
- Ein Beispiel eines solchen Immuntests wird im folgenden Verfahren kurz beschrieben:
- 1) Inkubation des potentiellen Inhibitors mit einer Lösung, die die HIV-1-Protease und das HIV-gag-Fusionsprotein enthält;
- 2) Inkubation des vorstehenden Reaktionsgemisches mit dem immobilisierten monoclonalen Antikörper dieser Erfindung; dies erlaubt die selektive Bindung von ungespaltenem HIV- gag-Fusionsprotein an den Antikörper;
- 3) Entfernung der Testlösung, wodurch die durch die HIV-Aktivität entstehenden Produkte (gespaltenes HIV-gag- Fusionsprotein) vom ungespaltenen HIV-gag-Fusionsprotein abgetrennt werden, das an den immobilisierten Antikörper gebunden bleibt;
- 4) Zugabe eines Reaktionspartners für den Markerenzymteil des Fusionsproteins, z.B. eines β-Galactosidase-spezifischen chromogenen Substrats, wie z.B. p-Nitrophenylgalactopyranosid (PNPG), und Bestimmung der Enzymaktivität. Dieser letzte Schritt erlaubt die Quantifizierung des HIV-gag-Fusionsproteins, das nicht durch die HIV-1-Protease gespalten wurde, hieraus läßt sich die HIV-1-Proteaseaktivität durch Vergleich mit einer Leerprobe, die den potentiellen Inhibitor nicht enthält, bestimmen.
- Dieser Test ist sehr leistungsfähig und insbesondere auch zum raschen Absuchen einer großen Zahl von Proben geeignet, da er in Mikrotitervertierungen durchgeführt werden kann. Zu diesem Zweck kann der Test auch automatisiert werden. Die Testproben können einen beliebigen Ursprung haben. Verbindungen mit bekannter oder unbekannter Struktur können getestet werden, wobei sie aus einer chemischen Synthese oder aus natürlichen Produkten stammen können. Außerdem können gereinigte Substanzen oder komplexe Gemische getestet werden, d.h. zelluläre Extrakte, mikrobielle Fermentationsbrühen, Lösungen, die synthetische Produkte enthalten, oder Extrakte biologischer Stoffe, einschließlich Pflanzen.
- Dieser Test ist außerdem relativ unempfindlich gegenüber dem Vorliegen von niedrigen Konzentrationen (5 bis 10%) organischer Lösungsmittel, wie Methanol, Acetronitril oder DMSO, diese Eigenschaft ist besonders nützlich, wenn der Test eingesetzt wird, um die Reinigung einer Inhibitoraktivität zu überwachen
- Diese Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Herstellung des selektiven monoclonalen Antikörpers und die analytischen Tests oder Reingungsverfahren, bei denen dieser Antikörper eingesetzt wird. Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Antikörpers ist insbesondere auch zur Herstellung handelsüblicher Mengen dieses Antikörpers nützlich, da eine, möglicherweise gefährliche, direkte Verwendung des Virus oder essentieller viraler Proteine oder Polypeptide als Antigen nicht mehr nötig ist, sondern vielmehr die "inaktive" Vorstufe pss oder vorzugsweise ein gentechnisch hergestelltes Fusionsprotein verwendet wird, das Anteile der Polypeptide p24 und p17 enthält, umfassend die Spaltstelle der HIV-1-Protease, wodurch die zwei Polypeptide erzeugt werden.
- Der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper kann durch Antikörper-produzierende Zellinien hergestellt werden, die üblicherweise Hybridomzellinien sind. Die Hybridome werden durch die Fusion Antikörper-produzierender Zellen mit einer stabilisierten Zellinie hergestellt, wodurch die Hybridzellen eine anhaltende Stabilität in Zellkulturen erhalten. Die Antikörper-produzierenden Zellen können Milzzellen aus einem Tier sein, das mit dem Protein pss oder einen Teil davon immunisiert wurde, das/der die p24/p17-HIV-1-Protease-Spaltstelle enthält. Die immunisierten Tiere sind üblicherweise kleine Säuger, vorzugsweise Nager, wie z.B. Ratten oder Mäuse.
- Der zweite Fusionspartner, die stabilisierte Zellinie, kann eine lymphoblastoide Zellinie oder eine Myelomzellinie sein, wobei sie und der erste Fusionspartner vorzugsweise syngen sind. Mehrere Zellinien dieses Typs sind bekannt und in allgemein zugänglichen öffentlichen Sammlungen, wie z.B. der "American Type Culture Collection" (ATCC), Rockville, Maryland (USA) verfügbar. Ein Beispiel dieser Zellen ist die HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin)-sensitive nicht-produzierende Mausmyelomzellinie Sp 2/0-Ag 14.
- Die Fusionstechnik wird üblicherweise gemäß dem Standardverfahren von C. Milstein und G. Köhler, Nature 256 (1975), 495-497, durchgeführt und ist in "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", Hrsg. J. G. R. Hurrell, C.R.C. Press Inc. (1982), beschrieben.
- Das Antigen, das für die Immunisierung der Tiere verwendet wird, kann aus inaktivierten ganzen HIV-1-Viren oder aus teilweise gereinigtem natürlichem Protein p55 bestehen, vorzugsweise werden jedoch clonierte Proteine eingesetzt, die die p55-Sequenz oder ein Fragment davon umfassen, die/das die p24/p17-Spaltstelle enthält. Rekombinante Proteine dieses Typs haben den Vorteil, daß sie in ausreichenden Mengen erhalten werden können, um das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen, ohne daß der gefährliche Umgang mit HIV-1-infiziertem Wirtsmaterial nötig ist, wie das bei der Verwendung des natürlichen Proteins pss der Fall wäre. In der Patentliteratur und in der wissenschaftlichen Literatur werden Verfahren zur Expression von HIV-1-gag-Fusionsproteinen beschrieben, wobei Fusionsproteine bereitgestellt werden, die als Antigene zur Immunisierung der Tiere zum Erhalt des erfindungsgemäßen Epitop-spezlfischen monoclonalen Antikörpers nützlich sind, vgl. z.B. EP- A-305777, EP-A-345461 und C. Guenet et al., European Journal of Pharmacology - Molecular Pharmacology Section, 172 (1988), 443-451. Ein besonders geeignetes Antigen zur Herstellung des erfindungsgemäßen Antikörpers ist ein HIV-gag-Fusionsprotein, das das p55-Fragment enthält, welches seinerseits einen Anteil sowohl von p24 als auch von p17 umfaßt und die p24/p17-HIV-1- Proteasespaltstelle enthält, verknüpft mit einem geeigneten Markerenzym, z.B. β-Galactosidase. Ein typisches Beispiel des Fusionsproteins ist das HIV-gag-Fusionsprotein, das 110 Aminosäurereste enthält, die mit β-Galactosidase verknüpft sind (gal-gag 110), und das in Beispiel 1 beschrieben wird. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung kann der Antikörper, der eine spezifische Reaktivität mit einem Epitop des Proteins p55 zeigt, das die p24/p17-Spaltstelle der HIV-1- Protease enthält, hergestellt werden durch:
- (i) Immunisierung von Mäusen mit dem vorstehend erwähnten Fusionsprotein;
- (ii) Entnahme von Milzzellen aus den immunisierten Mäusen und deren Fusion mit den HAT-sensitiven nicht-produzierenden Mausmyelomzellen Sp 2/0-Ag 14;
- (iii) Untersuchung der erhaltenen Hybride mittels eines geeigneten Lmmuntests auf die Produktion von monoclonalen Antikörpern gegen den p56-Teil des Fusionsproteins;
- (iv) Subclonierung der Zellen, die im vorherigen Test positiv waren;
- (v) Analyse der subclonierten Zellen auf ihre Epitopspezifität und Auswahl derjenigen Hybridome für die Züchtung in größerem Umfang, die einen Antikörper sezernieren, der spezifisch ist für die p24/p17-HIV-1-Proteasespaltstelle des Fusionsproteins;
- (vi) Isolierung und Reinigung des spezifischen Antikörpers nach Standardverfahren.
- Der Immunsierungsschritt wird im allgemeinen durchgeführt, indem ein gereinigtes Präparat des Fusionsproteins verwendet wird, das die p24- und p17-Anteile enthält. Die Tiere erhalten drei bis fünf Injektionen mit jeweils 12 bis 17 Tagen Abstand. Ein befriedigender Antikörpertiter wird normalerweise 60 Tage nach Beginn der Immunisierung erhalten. Üblicherweise erhalten die Mäuse zwei bis fünf Tage vor dem Töten eine Boosterinjektion. Die Plasmazellen und andere lymphoide Zellen, die aus der Milz erhalten wurden, werden mit den Mausmyelomzellen fusioniert, normalerweise in Gegenwart eines Fusionspromotors, wie z.B. Polyethylenglykol 2500. Nach der Fusion werden die Myelomzellen durch Zusatz von HAT-Medium entfernt, während die nicht-hybridisierten Milzzellen innerhalb weniger Tagen spontan absterben.
- Die Antikörper-produzierenden Hybridome werden bestimmt, indem man die Überstände mit einem geeigneten Anti-HIV-gag- Protein-"Enzyme linked immunoadsorbent assay" (ELISA) testet, wobei die Reaktivität der durch die Hybridome sezernierten Antikörper gegenüber dem fusionierten HIV-gag/β-Galactosidase- Protein mit der Reaktivität gegenüber β-Galactosidase alleine verglichen wird. Die Hybridome mit den Überständen, welche auf das Fusionsprotein positiv und auf die β-Galactosidase negativ reagieren, werden subcloniert und ihre Überstände auf Epitopspezifität analysiert, indem ihre Reaktivität gegenüber dem Fusionsprotein vor und nach der Spaltung durch die HIV-1-Protease durch Immun-Blotting getestet wird. Die Clone mit Überständen, die eine gute Affinität für das Fusionsprotein vor der Spaltung zeigen und an das gleiche Protein nicht mehr binden, wenn es durch die Protease gespalten wurde, werden für die weitere Subclonierung und für eine Züchtung in großem Umfang selektiert.
- Ein repräsentatives Beispiel zeigt das Selektionsverfahren für Hybridome, die den selektiven Antikörper erzeugen, hierbei wurden in zwei Fusionsexperimenten 880 Clone abgesucht. 21 Clone zeigten sowohl auf das gal-gag 110-Fusionsprotein als auch auf β-Galactosidase eine positive Reaktion, acht reagierten nur auf β-Galactosidase positiv und sieben nur auf das gal-gag 110-Fusionsprotein. Die sieben Clone, die das galgag 110-Fusionsprotein erkannten, wurden subcloniert und selektiert, um sie weiter auf Epitopspezifität zu charakterisieren. Bei vier dieser sieben Clone wurde die positive Reaktion auf das gal-gag 100-Fusionsprotein vor der Spaltung erneut bestätigt, und nur ein Clon, der 1G12 genannt wurde und eine gute Affinität für das Fusionsprotein aufwies, zeigte nach der Spaltung des Fusionsproteins keinerlei Bindung. Anschließend wurde der Clon, der den spezifischen Antikörper produzierte, für die weitere Subclonierung und die Züchtung in großem Umfang selektiert, die gemäß Standardverfahren durchgeführt werden kann, z.B. durch Amplifikation in Mäusen oder durch Zellkultur in einem Hohlfaser-Bioreaktor.
- Die Isolierung und Reinigung des 1G12-Antikörpers kann durchgeführt werden, indem eine Lösung, die den Antikörper enthält, auf eine Affinitätschromatographie-Säule, z.B. eine Staphylococcus aureus-Protein-A-Sepharose-Säule, aufgetragen wird, die vorher mit einem Bindungspuffer, pH 8,9, äquilibriert wurde, sodann die ungebundenen Proteine durch Zusatz des Bindungspuffers ausgewaschen werden und anschließend die gebundene Fraktion mit einem spezifischen Elutionspuffer bei einem pH-Wert von 6 eluiert wird. Der gewonnene Antikörper wird sodann gegen PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) dialysiert, durch SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese) unter reduzierenden Bedingungen auf Homogenität getestet und bei -20ºC (minus zwanzig ºC) gelagert.
- Der gereinigte monoclonale Antikörper 1G12, der eine spezifische Reaktivität gegenüber einem Epitop der HIV gag-Proteinvorstufe p55 zeigte, das die p24/p17-Protease-Spaltstelle enthält, wird mittels eines ELISA-Tests weiter auf Klassenspezifität charakterisiert, wobei sich zeigte, daß er zur IgG&sub1;- Klasse zählt und leichte Ketten vom κ-Typ besitzt.
- Die SDS-PAGE-Analyse unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen zeigt ein ungefähres Molekulargewicht in der Größenordnung von 150 000 Dalton.
- Der ungefähre Wert der Affinitätskonstante des 1G12-Antikörpers für das gal-gag 110-Fusionsprotein, das Anteile der Proteine p24- und p17 mit der p24/p17-Protease-Spaltstelle enthält und kovalent mit β-Galactosidase verknüpft ist, beträgt 5 x 10&sup9; M&supmin;¹.
- Die folgenden Beispiele erläutern ein Verfahren zur Durchführung dieser Erfindung und sollen in keiner Weise den Umfang der Patentansprüche einschränken. Die folgenden Materialien, Verfahren, Zellinien und Medien wurden zusätzlich zu denjenigen verwendet, die in den Beispielen und Figuren speziell beschrieben werden. Alle verwendeten Chemikalien lagen in analytischer Qualität vor.
- Die folgenden speziellen Substanzen wurden verwendet: Protein-A Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Schweden); Schaf- Anti-Maus-Ig, Meerrettich-Peroxidase-gebundenes F(ab')&sub2;-Fragment (Amersham, International Little Chalfront, Buckingamshire, England), Ziegen-Anti-Maus-Igs (Janssen Biochimica, Beerse, Belgien), Überstände menschlicher Endothelzellen (HECS) von Janssen.
- Die HAT-sensitive nicht-produzierende Mausmyelomzellinie Sp 2/0-Ag 14 (M. C. Shulman, C. D. Wilde und G. Köhler: "A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies", Nature 276 (1978), 269-270), die für die Fusionsexperimente verwendet wurde, wurde in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gezüchtet, das mit 10% fetalem Kälberserum (FCS, Flow Laboratories), 1 mM Glutamin, 10 E/ml Penicillin und 0,01 mg/ml Streptomycin angereichert war. Die Hybridomlinien wurden in DMEM mit 5% FCS, 5% HECS, HAT (0,1 mM Hypoxanthin/0,4 uM Aminopterin/16 uM Thymidin), 1 mM Glutamin, 10 E/ml Penicillin und 0,01 mg/ml Streptomycin gehalten.
- Das HindIII-HindIII-Fragment von Bp 631 bis 1258 der HIV- gag-DNA (A. Wain-Hobson, P. Sonigo, O. Danos, S. Cole und M. Alizon, Cell 40 (1985), 9-17) wurde in die einzige HindIII- Stelle von pUC19 (GIBCC BRL, International Division, Gaithersburg, MD) subcloniert. Aus dem resultierenden Konstrukt wurde das PstI-PstI-Fragment, enthaltend 8 Bp aus dem pUC19-Polylinker (PstI-HindIII), verknüpft mit dem HindIII-PstI-Fragment von Bp 631 bis 961 der HIV-1-DNA, isoliert und in die einzige Pstl-Stelle von pUR292 (U. Ruther und B. Muller-Hill, EMBO J. 2 (1983), 1791-1794) eingefügt. Hierdurch wurde Plasmid pGA22 erhalten, in welchem das gag-Fragment mit dem Ende des lacZ- Gens im richtigen Raster verknüpft ist, so daß ein Fusionsprotein codiert wird. Die Struktur dieses "gal-gag 100"-Fusionsproteins wird in Fig. 1D beschrieben.
- Das Plasmid pGA22 wurde zur Transformation von E. coli Stamm JM109 verwendet.
- E. coli JM109 (pGA22) wurde in LB-Medium mit 50 ug/ml Ampicillin bei 37ºC gezüchtet. Bei OD&sub6;&sub0;&sub0; = 0,5 wurde IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugesetzt. Nach zwei Stunden wurden die Bakterien geerntet und in 1/50 Volumen von 50 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA (Puffer A), enthaltend 0,1 mM PMSF, 1 mM Benzamidin-HCl, 0,1 M Arginin und 1 mg/ml Lysozym, resuspendiert. Nach 30 Minuten bei 4ºC wurden die Zellen durch Beschallung aufgeschlossen und 10 Minuten bei 25 000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal gewaschen, indem es in Puffer A, der 70 mM 2-Mercaptoethanol (2-ME) und 0,05% Triton-X100 enthielt, resuspendiert und bei 25 000 g zentrifugiert wurde. Schließlich wurde das Pellet in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,8, 0,1 M NaCl, 1 mM MgCl&sub2;, 0,5 mM EDTA, 70 mM 2-ME (Puffer B), enthaltend 8 M Harnstoff, gelöst. Nach 20- minütiger Zentrifugation bei 50 000 g wurde der Überstand zuerst mit Puffer B auf 5 M Harnstoff verdünnt und anschließend gründlich gegen Puffer B ohne 2-ME dialysiert. Sodann wurde die Affinitätschromatographie auf TPEG-Sepharose durchgeführt, im wesentlichen wie beschrieben (A. Ullmann, Gene 29 (1984) 27-31).
- Die Gewinnung von gal-gag 110 in jedem Reinigungsschritt wurde durch SDS-PAGE mit dem Phast-Gel-System (Pharmacia) getestet.
- Das gereinigte Pusionsprotein wurde durch SDS-PAGE untersucht, wobei eine Hauptbande von etwa 120 000 Da erhalten wurde (vgl. Fig. 1A, Bahn NO EX). Dies entspricht 116 000 Da, dem Molekulargewicht der β-Galactosidase, plus etwa 14 000 Da, dem erwarteten Molekulargewicht des mit dem Enzym verknüpften gag- Anteils. Tatsächlich wird ein solches Protein durch die HIV- Protease gespalten (wie in Fig. 1A, Bahnen 0, 15 und 30, gezeigt), wodurch eine Bande von etwa 120 000 Da erhalten wird.
- Die verwendete HIV-Protease war eine rekombinante HIV-1- Protease, die durch Expression eines synthetischen Gens in E. coli gemäß C. Guenet et al., European Journal of Pharmacology - Molecular Pharmacology Section, 172 (1989), 443-451, erhalten wurde.
- Die Immun-Blot-Analyse des gereinigten Fusionsproteins vor und nach der Spaltung mit der HIV-Protease (Fig. 1B) zeigt, daß ein solches Protein sowohl vor als auch nach der Spaltung durch einen monoclonalen Antikörper erkannt wird, der für E. coli-β-Galactosidase spezifisch ist (Boehringer Mannheim, BRD).
- Das resultierende Protein enthält das Ala¹&sup0;&sup0;-bis-Ala²¹&sup0;- Fragment aus dem HIV-1-gag-Polypeptid (p55), verknüpft mit dem Carboxy-Terminus der E. coli-β-Galactosidase (Fig. 1D). Der gag-Anteil dieses "gal-gag 110"-Fusionsproteins umfaßt die p17/p24-HIV-1-Proteasespaltstelle Tyr¹³²-Pro¹³³ (A. Wain-Hobson, P. Sonigo, O. Danos, S. Cole und M. Alizon, Cell 40 (1985), 9-17), während der β-Galactosidase-Anteil eine einfach zu messende Enzymaktivität bereitstellt.
- Weibliche Balb/c-Mäuse wurden immunisiert, indem 0,050 mg des Fusionsproteins von Beispiel 1 in komplettem Freundschem Adjuvans (verdünnt 1:1) am Tag -60 ins Peritoneum der Tiere injiziert wurden. Die gleiche Menge in inkomplettem Freundschem Adjuvans wurde an den Tagen -42, -30 und -18 ins Peritoneum der Tiere injiziert. Am Tag -3 erhielten die Tiere eine letzte intravenöse Boosterinjektion mit 0,05 mg. Um die monoclonalen Antikörper zu erhalten, wurden am Tag 0 Milzzellen (5 x 10&sup7;) der immunisierten Mäuse mit 1 x 10&sup7; HAT-sensitiven nicht-produzierenden Mausmyelomzellen Sp 2/0-Ag 14 fusioniert. Die Fusion wurde mit Polyethylenglykol 1500 durchgeführt und die Zellen anschließend in DMEM, angereichert mit 5% FCS, 5% HECS, HAT, 1 mM Glutamin, 10 E/ml Penicillin und 0,01 mg/ml Streptomycin, auf fünf verschiedene Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Costar, One Alewife Center, Cambridge, MA, USA) plattiert. Die Überstände der wachsenden Hybride wurden alle zwei bis drei Tage mit einem "Enzyme iinked immunoadsorbent assay" (ELISA) auf die Produktion von monoclonalen Antikörpern gegen den gal-gag 100-Proteinanteil getestet (vgl. Beispiel 3:).
- Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Falcon-Beckton Dickinson) wurden in Streifen wechselweise beschichtet mit 0,05 ml/Vertiefung (0,000125 mg/Vertiefung) von a) gal-gag 100-Fusionsprotein in PBS (Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung), 0,1 M Natriumchlorid, pH 7,3, oder von b) β-Galactosidase im gleichen Puffer. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4ºC wurden die Platten mit PBS gewaschen und mit 1% BSA (Rinderserumalbumin), pH 7,3, in PBS eineinhalb Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden pro Vertiefung 0,05 ml der Hybridomüberstände zugesetzt und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen mit PBS, 0,005% Tween 20, wurden 0,05 ml/Vertiefung eines Anti-Maus-Igs Peroxidasekonjugierten F(ab')&sub2;-Fragmentes zugegeben. Nach eineinhalb Stunden wurden die Platten gewaschen und mit 0,15 ml/Vertiefung einer Lösung von 1 mg/ml ortho-Phenylendiamin in 0,1 M Citratpuffer, 1,75 mM H&sub2;O&sub2;, pH 5, inkubiert. Die Farbreaktion wurde mit 4,5 M H&sub2;SO&sub4; abgestoppt. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung eines Titertek Multiskan Spektrophotome-ters (Flow Laboratories, Irvine, Schottland, GB) bei 492 nm abgelesen.
- Mit diesem Verfahren wurden 880 Clone abgesucht, die in zwei Fusionsexperimenten erhalten wurden, welche wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt wurden. Von diesen Clonen reagierten 21 sowohl auf das gal-gag 100-Fusionsprotein als auch auf β-Galactosidase positiv, 8 reagierten nur auf β-Galactosidase und 7 nur auf das gal-gag 100-Fusionsprotein positiv. Die sieben Clone, die das gal-gag 100-Fusionsprotein erkannten, wurden für die weitere Subclonierung durch die Grenzverdünnungstechnik und zur Bestätigung der positiven Reaktion auf das gal-gag 100-Fusionsprotein selektiert. Nur vier Clone wurden bestätigt und anschließend in Beispiel 4 auf Epitopspezifität getestet.
- Eine Western Blot-Analyse der Gelelektrophorese des galgag 100-Fusionsproteins vor und nach der Inkubation mit HIV-1- Protease wurde durchgeführt, wobei die Überstände der vier Clone, deren positive Reaktion auf das gal-gag 100-Fusionsprotein bestätigt worden war (vgl. Beispiel 3), als primäre Antikörper gemäß den in Figur 1C dargestellten Bedingungen verwendet wurden.
- Ein HIV-Protein-Nachweis-Kit (Novapath Immunoblot Strips, BIORAD, Richmond, CA, USA), enthaltend HIV-1-Gesamtvirusproteine, geblottet auf verschiedene Nitrocellulosestreifen, wurde gemäß dem in Figur 2 beschriebenen Protokoll verwendet.
- Nur einer der vier Clone, die Affinität für das gal-gag 100-Fusionsprotein aufwiesen, zeigte nach Inkubation mit der Protease keine Bindung mehr an das gal-gag 100-Fusionsprotein (vgl. Figur 1C). Der Clon, der diesen Antikörper sezernierte, wurde für eine weitere Herstellung des monoclonalen Antikörpers in größerem Umfang und für seine Isolierung und Reinigung selektiert. Der Antikörper wurde mit 1G12 bezeichnet.
- a) Herstellung in großem Umfang
- Zwei Methoden zur Herstellung des monoclonalen Antikörpers 1G12 in großen Mengen wurden eingesetzt:
- 1) Im Maussystem wurden 1 bis 2 x 10&sup6; Hybridomzellen pro Maus injiziert, die vorher mit Pristan sensibilisiert worden war.
- 10 bis 15 Tage nach der Injektion wurde aus dem Peritoneum der Mäuse Ascitesflüssigkeit gewonnen (1 bis 10 ml), die die Antikörper im Bereich von 1 bis 10 mg/ml Ascitesflüssigkeit enthielt.
- 2) Das Zellkultursystem beruhte auf einem Hohlfaser-Bioreaktor (Vitafiber VLS - Amicon-Amicon Division, W.R. & Co. Danvers, MA, USA).
- In diesem System ist ein Flo-Path-Bioreaktor (eine Patrone von 3700 cm³), worin die Zellen wachsen, mit Nährstoff- und Umwälzpumpen, einem Temperatur-kontrollierten Inkubator, einer pH-Kontrolleinrichtung und Luftzufuhr ausgestattet.
- 5 x 10&sup8; Hybridomzellen wurden in den extrakapillären Raum der Patrone eingeimpft, wobei Nährmedium (DMEM + 10% FCS + 1 mM Glutamin, 10 E/ml Penicillin, 0,01 mg/ml Streptomycin) durch das Faserlumen strömt (Ausschluß 30 000 Da) und Feeder-Zellen im extrakapillären Raum wachsen. Der monoclonale Antikörper (150 000 Da) reicherte sich im extrakapillären Raum an und wurde täglich geerntet. Unter Verwendung dieses Systems wurden mehrere Gramm des monoclonalen Antikörpers 1G12 hergestellt.
- b) Gewinnung
- Der monoclonale Antikörper 1G12 wurde gemäß der folgenden Vorschrift aus der Flüssigkeit gereinigt: 10 ml der Flüssigkeit wurden mit 20 ml Acetatpuffer, 0,06 M, pH 4, und mit 0,5 ml Octansäure (Caprylsäure, Merck AG, Darmstadt, BRD) gemischt und sodann 30 Minuten bei Raumtemperatur kräftig geschüttelt. Anschließend wurde die Lösung 30 Minuten bei 20 000 Upm bei 15ºC in einem Beckman SW 28-Rotor zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und über Nacht gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, 0,02 M Natriumchlorid, pH 7,3, dialysiert. Die dialysierte Lösung (1 ml) wurde auf eine Säule mit Stanh. aureus-Protein A-Sepharose CL4B (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden) aufgetragen, die vorher mit einem Bindungspuffer, 1,5 M Glycin, 3 M Natriumchlorid, pH 8,9, äguilibriert worden war. Die ungebundenen Proteine wurden mit fünf Säulenvolumina Bindungspuffer ausgewaschen, während die gebunden Fraktion mit dem spezifischen Elutionspuffer (0,1 M Citronensäure, pH 6) eluiert wurde. Die Säule wurde mit einem Regenerationspuffer (0,1 M Citronensäure, pH 3) gereinigt. Der monoclonale Antikörper 1G12 wurde gegen PBS dialysiert, durch SDS- PAGE unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen auf Homogenität getestet (vgl. Figur 3) und bei -20ºC gelagert.
- Der monoclonale Antikörper 1G12 wurde durch einen "Enzyme linked immunoadsorbent assay" (ELISA) unter Verwendung des BIORAD-Kit (Maus-Typ, Sub-Isotyp-Panel, einschließlich: Kaninchen-Anti-Maus-Subklasse, spezifisch für IgG&sub1;, IgG2a, IgG2b, IgG&sub3;, IgM, IgA, κ-Kette, λ-Kette) auf Klassenspezifität getestet. Die Ergebnisse dieses Tests zeigen, daß der monoclonale Antikörper 1G12 zur IgG&sub1;-Klasse gehört und daß seine leichten Ketten zum κ-Typ zählen.
- Molekulargewicht: Das Molekulargewicht des monoclonalen Antikörpers wurde durch SDS-PAGE unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen bestimmt und mit Molekulargewicht-Standards verglichen (Fig. 3). Die SDS-PAGE-Analyse unter nichtreduzierenden Bedingungen zeigt, daß der monoclonale Antikörper 1G12, wie alle Immunglobuline der IgG&sub1;-Klasse, aus einer homogenen Bande von 150 000 Da besteht. Diese Bande wird durch 2-Mercaptoethanol zu zwei Banden von 50 000 und 25 000 Da reduziert, entsprechend den schweren und leichten Ketten der Immunglobuline.
- Affinität: Der ungefähre Wert der Affinitätskonstante des monoclonalen Antikörpers 1G12 für das Fusionsprotein beträgt 5 x 10&sup9; M&supmin;¹, bestimmt durch einen kompetitiven Enzymimmuntest.
- Verfahren: 0,000125 mg Fusionsprotein in 50 ul wurden pro Vertiefung auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen verteilt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Platten mit PBS, pH 7,3, gewaschen und anschließend mit 3 % PBS-BSA zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert (200 ul pro Vertiefung). Das kompetitive Experiment wurde in einer Lösung durchgeführt, zwischen einer festen Konzentration des monoclonalen Antikörpers 1G12, entsprechend 50% der Titrationskurve des Antikörpers, und verschiedenen Konzentrationen des Fusionsproteins (von 0,1254 mg/ml bis 0,00012 mg/ml), Volumen 1:1, wobei die Umsetzung zwei Stunden bei 37ºC ablief. Das Produkt des kompetitiven Experiments wurde sodann auf die Mikrotitervertiefungen plattiert und die Menge von 1G12, der nicht mit dem Antigen in Lösung reagierte, mit einem mit Peroxidase konjugierten Schaf-Anti-Maus-F(ab')&sub2;-Antiserum auf das Fusions- Protein titriert, wobei die Vorschrift des Enzymimmuntests angewendet wurde, der auch zum Absuchen der monoclonalen Antikörper eingesetzt worden war. Der 50%-Wert der Kompetitionskurve wurde als ungefährer Wert der Affinitätskonstante des Antikörpers für das Fusionsprotein genommen (M. W. Steward, J. Steensgaard, "Antibody Affinity", CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, USA, 1983).
- Jeweils 5 ul der Proben, die vermutlich HIV-1-Proteaseinhibitoren enthalten, wurden in Mikrotitervertiefungen (z.B. "MICROELISA", Greiner, BRD) mit 40 ul eines Gemisches vermischt, das 0,25 M 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure/Natriumhydroxid-Puffer, pH 6,0, 0,6% Rinderserumalbumin, 0,025% Tween 20 und vorzugsweise einen Cocktail aus Proteaseinhibitoren enthielt, um eine nicht-spezifische proteolytische Spaltung durch die Proteasen zu verhindern, die möglicherweise in den zu testenden biologischen Proben vorliegen. Hierfür könnte man z.B. 1 bis 5 ug/ml Leupeptin, 1 bis 10 mM Benzamidin, 0,5 bis 1 mM Natriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 0,2 bis 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) zufügen. Es wurde gezeigt, daß die Aktivität der HIV-1-Protease durch alle diese Proteaseinhibitoren bei den angegebenen Konzentrationen nicht gehemmt wurde. Zu jeder Vertiefung wurden 5 ul der geeignet verdünnten HIV-1-Protease oder 5 ul Rohextrakt aus rekombinantem E. coli, der die HIV-1-Protease exprimiert, zugegeben und die Lösungen eine bestimmte Zeit (üblicherweise 5 bis 20 Minuten) bei Raumtemperatur gehalten, um die Bindung der vermutlichen Inhibitoren an die HIV-1-Protease zu gestatten. Sodann wurden 25 ul des geeignet verdünnten gal-gag 100- Fusionsproteins von Beispiel 2 zu jeder Vertiefung zugesetzt und die Mikrotiterplatten 40 Minuten bei 37ºC inkubiert.
- Nach der Inkubation wurden 50 ul Lösung aus jeder Vertiefung in die entsprechende Vertiefung einer ähnlichen Mikrotiterplatte übertragen, auf die vorher der monoclonale Antikörper 1G12 immobilisiert worden war. Eine solche Bindung des monoclonalen Antikörpers 1G12 an die Kunststoffvertiefungen wurde durchgeführt, indem 50 ul einer 50 bis 100 ug/ml Lösung des monoclonalen Antikörpers in jeder Vertiefung einer solchen Mikrotiterplatte (d.h. MICROELISA) eine bestimmte Zeitspanne, die zwischen einer Stunde und über Nacht schwankte, bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Um alle Stellen auf dem Kunststoff zu blockieren, die nicht mit dem monoclonalen Antikörper 1G12 reagierten, wurden zu jeder Vertiefung 250 ul einer 3%igen Lösung von Rinderserumalbumin in PBS zugegeben und die Mikrotiterplatten sodann eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Abgießen der Lösungen und drei- bis viermaligem Waschen mit PBS waren die Platten gebrauchsfertig.
- Die Lösungen, die die HIV-1-Protease, das gal-gag 100-Fusionsprotein und die vermutlichen Inhibitoren enthielten, wurden mit dem immobilisierten monoclonalen Antikörper 1G12 zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, damit die durch den monoclonalen Antikörper 1G12 zustandekommende Bindung des ungespaltenen Fusionsproteins an die Mikrotitervertiefungen stattfinden konnte. Anschließend wurden die Lösungen verworfen und die Platten vier- bis fünfmal mit PBS, die 0,05% Tween 20 enthielt, gewaschen. Um die Stärke der β-Galactosidase-Aktivität nachzuweisen, die an die Vertiefungen gebunden blieb, wurden in jede Vertiefung 240 ul von 1 mg/ml p-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid in 50 mM Natriumchlorid, 1 mM Magnesiumchlorid und 70 mM 2-Mercaptoethanol zugegeben. Sodann wurden die Mikrotiterplatten eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und danach zum Abstoppen der β-Galactosidae-Reaktion 60 ul 1,5 M Natriumcarbonat zugesetzt. Anschließend wurde die Absorption bei 405 nm spektrophotometrisch gemessen, wobei ein Mikroplattenlesegerät, z.B. das Modell Titertek Multiscan (Flow Laboratories, Irvine, Schottland, OB), verwendet wurde.
- In einem solchen Test zeigten die Kontrollproben (kein HIV-1-Proteaseinhibitor) eine sehr niedrige Absorption (Hintergrundspiegel), da das gesamte gal-gag 100-Fusionsprotein durch die HIV-1-Protease gespalten wurde und aus diesem Grund nicht durch den immobilisierten Antikörper gebunden wurde. Im Gegensatz dazu wurde das gal-gag 100-Fusionsprotein in dem Fall, wenn ein HIV-1-Proteaseinhibitor vorlag, nicht gespalten und somit durch den immobilisierten Antikörper gebunden, wodurch ein viel höherer Absorptionswert erhalten wurde.
- In einem repräsentativen Experiment wurde dieser Test auf HIV-1-Protease mit Pepstatin (Sigma, St. Louis, MO, USA), einem bekannten Inhibitor von Apsaraginsäure-Proteasen, wie die HIV-1-Protease, getestet. Absorptionswerte, die über dem Hintergrundspiegel lagen, wurden mit so kleinen Mengen wie 1 bis 2 ug/ml Pepstatin erhalten, die HIV-1-Protease wurde bei einer Konzentration von 50 bis 100 ug/ml vollständig gehemmt.
- (A) SDS-PAGE-Analyse des gal-gag 100-Fusionsproteins vor und nach der Spaltung durch die HIV-1-Protease
- Bahnen: MW St) Molekulargewicht-Standards;
- NO EX) gereinigtes gal-gag 100-Fusionsprotein;
- INC. TIME 0, 15, 30) gal-gag 100-Fusionsprotein nach 0-, 15- bzw. 30-minütiger Inkubation bei 37ºC mit E. coli-Rohextrakt, enthaltend HIV-1-Protease;
- NO PR) gal-gag 100-Fusionsprotein nach 30-minütiger Inkubation bei 37ºC mit E. coli-Rohextrakt.
- Die Gelelektrophorese wurde unter Verwendung eines homogenen 7,5% Phast-Gel in einer Phast-Gel-Apparatur (Pharmacia, Uppsala, Schweden) gemäß der Gebrauchsanleitung des Herstellers durchgeführt. Als Reduktionsmittel wurde 2-Mercaptoethanol verwendet. Zur Färbung wurde Coomassie-Blau R-250 (BIORAD, Richmond, CA, USA) eingesetzt.
- (B) Immun-Blot-Analyse des Gels von (A), wobei ein monoclonaler Antikörper gegen die ß-Galactosidase (Promega, Madison, WI, USA) als primärer Antikörper eingesetzt wurde
- Die Anordnung der Bahnen war wie in (A).
- Die Übertragung der Proteine auf Nitrocellulosefilter wurde durchgeführt, indem das Gel 30 Minuten bei 70ºC erhitzt wurde, wie in der Phast-Gel-Bedienungsanleitung angegeben. Nach einstündiger Blockierung mit 5% BSA (Rinderserumalbumin) in PBS bei Raumtemperatur wurde das Filter über Nacht mit einer 1:1500-Verdünnung des Anti-β-Galactosidase-Antikörpers in PBS, enthaltend 0,25% BSA, inkubiert. Anschließend wurde der an das Filter gebundene Antikörper nachgewiesen, indem er erst mit Gold-markiertem Ziegen-Anti-Maus-Serum (Janssen, Beerse, Belgien) und sodann zur Verstärkung mit "Silver Enhancement" (Janssen) inkubiert wurde.
- (C) Immun-Blot-Analyse des Gels von (A), wobei der monoclonale Antikörper 1012 als primärer Antikörper eingesetzt wurde
- Die Anordnung der Bahnen war wie in (A).
- Proteintransfer und Filterblockierung wurden wie in (B) durchgeführt. Anschließend wurde das Filter über Nacht mit einer 1:5-Verdünnung von 1G12-Zellüberstand in PBS, enthaltend 0, 25% BSA, inkubiert. Der Nachweis der gebundenen Antikörper wurde wie in (B) durchgeführt.
- (D) Beschreibung des gal-gag 100-Fusionsproteins
- Immun-Blot-Analyse der HIV-1-Gesamtvirusproteine unter Verwendung menschlichen Serums eines AIDS-Patienten (Bahn a) oder des monoclonalen Antikörpers 1012 (Bahn b).
- Novapath Immun-Blot-Streifen (BIORAD, Richmond, CA, USA) wurden eine Stunde bei Raumtemperatur mit (a) einer 1: 100-Verdünnung von menschlichem Serum eines AIDS-Patienten in PBS, enthaltend 0,25% BSA, oder mit (b) einer 1:4-Verdünnung des 1G12-Zellüberstandes in PBS, enthaltend 0,25% BSA, inkubiert.
- Der Nachweis der gebundenen Antikörper wurde wie in (B) durchgeführt.
- Sie zeigt die SDS-PAGE-Analyse des monoclonalen Antikörpers 1012 unter nichtreduzierenden (Bahnen 1, 2, 3) und unter reduzierenden Bedingungen (Bahnen 4, 5). Bahnen: 1) Molekulargewicht-Standards; 2) 1G12-Ascitesflüssigkeit; 3) gereinigter 1012; 4) wie 3); 5) wie 1). Die Gelelektrophorese wurde unter Verwendung eines 10-15%-Gradienten-Phast-Gels in einer Phast-Gel-Apparatur gemäß der Gebrauchsanleitung des Herstellers durchgeführt. Als Reduktionsmittel wurde 2-Mercaptoethanol eingesetzt. Zur Färbung wurde Coomassie-Blau R-250 verwendet.
Claims (21)
1. Monoclonaler Antikörper gegen die
HIV-1-gag-Proteinvorstufe p55, gekennzeichnet durch seine Spezifität für ein
Epitop, das die p24/p17-HIV-1-Proteasespaltstelle
enthält.
2. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1, weiter
gekennzeichnet durch folgende Merkmale:
a) sein Molekulargewicht liegt in der Größenordnung von
150 000 Dalton;
b) er gehört zur IgG1-Klasse und besitzt leichte Ketten
vom κ-Typ;
c) er weist eine Affinitätskonstante mit einem Wert von
etwa 5 x 10&sup9; M&supmin;¹ auf.
3. Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, weiter dadurch
gekennzeichnet, daß er unter Verwendung eines
HIV-gag-Fusionsproteins als Antigen hergestellt wurde, das 110 mit
β-Galactosidase fusionierte Aminosäurereste enthält und
ein p55-Fragment umfaßt, das die
p24/p17-HIV-1-Proteasespaltstelle enthält (gal-gag 110-Fusionsprotein).
4. Zellinie, die den Antikörper nach einem der Ansprüche 1
bis 3 produziert und ein Hybridom ist.
5. Hybridom nach Anspruch 4, das aus einer Fusion einer
lymphopblastoiden Zelle oder einer Myelomzelle mit einer
Antikörper-produzierenden Zelle aus der Milz von Tieren
stammt, die gegen die HIV-1-gag-Proteinvorstufe p55 oder
ein Fragment davon immunisiert wurden, die/das die
p24/p17-HIV-1-Proteasespaltstelle enthält.
6. Hybridom nach Anspruch 4 oder 5, wobei die immunisierten
Tiere kleine Säugetiere, vorzugsweise Ratten oder Mäuse,
und die Fusionspartner syngen sind.
7. Hybridom nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die
Myelomzellinie die HAT-sensitive, nicht-produzierende
Mausmyelomzellinie Sp 2/0-Ag14 ist.
8. Hybridom nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei das
Immunogen ein rekombinantes HIV-gag-Fusionsprotein ist,
das ein p55-Fragment enthält, das seinerseits einen Teil
von p24 und p17 umfaßt und die
p24/p17-HIV-1-Proteasespaltstelle enthält, gebunden an β-Galactosidase.
9. Hybridom nach Anspruch 8, wobei das Immunogen das gal-
gag 110-Fusionsprotein ist.
10. Verfahren zur Herstellung eines monoclonalen Antikörpers
nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das die folgenden
Schritte umfaßt:
(i) Immunisierung von Mäusen mit einem
HIV-gag-Fusionsprotein, das die p55-Sequenz oder ein
Fragment davon umfaßt, die/das ihrerseits/seinerseits
einen Teil von p24 und p17 umfaßt und die p24/p17-
HIV-1-Proteasespaltstelle enthält, gebunden an β-
Galactosidase;
(ii) Entnahme von Milzzellen aus immunisierten Mäusen
und deren Fusion mit HAT-sensitiven
nicht-produzierenden Sp 2/0-Ag 14-Mausmyelomzellen;
(iii) Untersuchung der erhaltenen Hybride mittels eines
geeigneten Immuntests auf die Produktion von
monoclonalen Antikörpern gegen den p55-Anteil des
Fusionsproteins;
(iv) Subclonierung der in dem vorherigen Test positiven
Zellen;
(v) Analyse der subclonierten Zellen auf ihre
Epitopspezifität und Auswahl derjenigen Hybridome für
die Züchtung in größerem Umfang, die einen
Antikörper sezernieren, der spezifisch gegen die
p24/p17-HIV-1-Proteasespaltstelle des
Fusionsproteins gerichtet ist;
(vi) Isolierung und Reinigung der spezifischen
Antikörper nach Standardverfahren.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Immunogen ein
Fusionsprotein gemäß Anspruch 10 ist, das 110
Aminosäurereste, verknüpft mit β-Galactosidase, enthält.
12. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur
Verwendung in einem enzymatischen Immuntest zum Nachweis der
HIV-1-gag-Proteinvorstufe p55 oder eines Fragmentes
davon, die/das die p24/p17-HIV-1-Protease-Spaltstelle
enthält, eines natürlichen oder synthetischen Polypeptids,
das dieselbe Aminosäuresequenz wie p55 enthält, oder
eines Fragmentes davon, das die
p24/p17-HIV-1-Proteasespaltstelle enthält.
13. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1
bis 3 zur Isolierung und Reinigung der
HIV-1-gag-Proteinvorstufe p55 oder eines Fragmentes davon, die/das
die p24/p17-HIV-1-Proteasespaltstelle enthält, eines
natürlichen oder synthetischen Polypeptids, das dieselbe
Aminosäuresequenz wie p55 enthält, oder eines Fragmentes
davon, das die p24/p17-HIV-1-Proteasespaltstelle
enthält.
14. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1
bis 3 in einer Affinitätsmatrix zur Isolierung und
Reinigung nach Anspruch 13.
15. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur
Verwendung beim Absuchen auf HIV-1-Proteaseinhibitoraktivität.
16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei der Antikörper in
einem Sandwich-ELISA-Test eingesetzt wird.
17. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur
Verwendung in der Diagnose und Überwachung von
HIV-1-Exponierung.
18. Verwendung des monoclonalen Antikörpers nach einem der
Ansprüche 1 bis 3 gemäß Anspruch 15, wobei die auf HIV-
Proteaseinhibitoraktivität zu testende Probe ausgewählt
ist aus Zellextrakten, mikrobiellen Fermentationsbrühen,
synthetische oder natürliche Produkte enthaltenden
Lösungen oder Extrakten aus biologischen Materialien,
einschließlich Pflanzen.
19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei
(a) die zu testende Probe inkubiert wird mit einer HIV-
1-Protease und einem HIV-gag-Fusionsprotein, das ein
p55-Fragment enthält, das seinerseits einen Teil von
p24 und p17 umfaßt und die
p24/p17-Proteasespaltstelle enthält, gebunden an ein Markerenzym,
vorzugsweise β-Galactosidase;
(b) das Reaktionsgemisch mit einem immobilisierten
monoclonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3
inkubiert wird;
(c) das so erhaltene Reaktionsgemisch vom
immobilisierten Antikörper abgetrennt wird;
(d) ein Reaktionspartner des Markerenzymanteils des
Fusionsproteins, vorzugsweise ein chromogenes Substrat
spezifisch für β-Galactosidase, zu dem
immobilisierten monoclonalen Antikörper zugesetzt wird; und
(e) die HIV-1-Proteaseinhibitoraktivität durch
Quantifizierung des Markerenzyms gemessen wird, wobei als
Vergleich eine Leerprobe herangezogen wird, die den
potentiellen Inhibitor nicht enthält.
20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei das HIV-gag-Fusions-
Protein das gal-gag 110-Fusionsprotein ist.
21. Kit für die Verwendung nach einem der Ansprüche 12, 15,
16, 17, 18, 19 und 20, der den selektiven Antikörper
nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in Verbindung mit den
anderen Reagentien und Mitteln enthält, die für die
Durchführung eines analytischen Tests notwendig sind.
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