JPH05507409A

JPH05507409A - ヒト免疫不全ウイルスのｇａｇタンパク質前駆体に対するモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH05507409A
Application number: JP91509722A
Authority: JP
Inventors: ノリ，マリア・ルイザ・チエシラ; サルビ，エドアルド・ジヤコモ
Original assignee: グルポ・レペチツト・エス・ピー・エイ
Priority date: 1990-06-01
Filing date: 1991-05-21
Publication date: 1993-10-28
Also published as: IE68597B1; DE69112059D1; IE911866A1; KR930701619A; EP0535007A1; ATE126238T1; DK0535007T3; CA2083399A1; WO1991019000A1; ES2075958T3; GR3017444T3; DE69112059T2; EP0535007B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト免疫不全ウィルスのｇａｇタンパク質前駆体に対するモノクローナル抗体ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）は後天性免疫欠損症候群（ＡＩＤＳ）の病原性因子である。ＨＩＶはレトロウィルスのレンチウィルスの亜科の１メンバーでありそしてヒトＣＤ４＋Ｔ−リンパ球、マクロファージ、および多分性の細胞型を感染する［参照、Ａ、Ｓ、コアウシ（Ｆａｕｃｊ）：「ヒト免疫不全ウィルス：感染性および病原性のメカニズム（Ｔｈｅ　ｈｉｍ　ｊｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｊｅｎｃｙ　ｖｉｒｓ：Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｐａｔｈ。

ｇｅｎｅｓ　ｉ　ｓ）Ｊ、サイエンス（Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ）２３９　：　６１７−６２２．１９８８ｏＤ、Ｄ、　ホウ（Ｈｏ）　、Ｒ，Ｊ、ボメランズク（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚｋ）およびｉ　Ｃ，カブラン（Ｋａｐｌａｎ）＋「ヒト免疫不全ウィルスにより感染の病原性（Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓ　ｉｓ　ｏｆ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎ。

ｄｅｆｊｃｉｅｎｃｙ）Ｊ、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、）３１７：２７８−２８６゜１９８７］。このウィルスのゲノムは、他のレトロウィルスど同様に、ｇａ、ｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含有し、これらの遺伝子は、それぞれ、ウィルスのコアタンパク質、逆転写酵素を包含するウィルスの酵素およびウィルスのエンベロープタンパク質をコードする。このウィルスは、また、少なくとも５つの追加の遺伝子を含有し、これらのうちの３つは調節機能を有し、そしてこれらの遺伝子の発現はウィルスが発揮する病原性メカニズムに対する衝撃をほとんど確実に有する。

抗ＨＩＶ治療のための薬物を発見するためのい（つかのアプローチを最後の数年において用いた［参照、Ｊ、　Ｓ、オックスフォード（Ｏｘｆｏ　ｒｄ）　、Ａ、Ｒ，Ｍ、コーテス（Ｃｏａｔｅｓ）　、Ｄ、Ｙ、シア（Ｓｉａ）、Ｋ、プラウ：／　（Ｂｒｏｗｎ）およびＳ、アサド（Ａｓａｄ）：「ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の抗ウイルス阻害因子のための潜在的標的部位（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｔａｒｇｅｔ　５ｉｔｅｓ　ｆ。

ｒ　ａｎｔｉｖｉｒａｌ　１ｎｈｔｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎｆｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｔｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ（ＨＩＶ）Ｊ、ジャーナル・オブ・アンチマイクロバイアル・ケモセラビイ−（Ｊ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、）Ｊ　２３Ｓｕｐｐ１．Ａ、　、９−２７．１９８９］。

抗ＨＩＶ薬物のための潜在的標的は本質的にウィルスの機能、例えば、細胞の中へのウィルスの侵入、酵素の活性および細胞の活性化および増殖である。これらの機能はウィルスの遺伝子の発現により調節される。

ｇａｇ、ｐ’ｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の場合において、それらはタンパク質分解プロセシングおよび他の修飾により翻訳後に修飾される前駆体ポリペプチドをコードする。プロテアーゼ、逆転写酵素およびエンドヌクレアーゼを包含するｐｏｌ遺伝子のポリペプチド前駆体から誘導された酵素活性は、阻害因子のための興味ある標的と考えられる。プロテアーゼはｇａｇ遺伝子の前駆体産生物、ｐ５５タンパク質をウィルスのコアの４つの構造タンパク質に切断し、その中にｐ２４、主要な内部のコア能力およびｐ１７が存在する。これらの２つのタンパク質はｐ５５タンパク質の連続的アミノ酸配列の分割から誘導される。同一プロテアーゼは、また、ｇａｇ−ｐｏｌ前駆体を切断してプロテアーゼそれ自体（自己分解的活性化）、逆転写酵素およびエンドヌクレアーゼを生ずる［参照、Ｗ、　Ｇ、　ｏベイ（Ｒｏｂｅｙ）　、Ｂ、サファイ（ｓａｆａｉ）、Ｓ、オロスズラン（Ｏｒｏｓ　ｚ　Ｉ　ａｎ）　、Ｌ、　Ｏ，アーサー（Ａｒｔｈｕｒ）、Ｍ、Ａ、ゴング（Ｇｏｎｄａ）　、Ｒ，Ｃ，バｏ（Ｐａｌｌｏ）およびＰ、Ｊ、フィシンガー（Ｆｊｓｃｈｉｎｇｅｒ）：　ｒｚイズ患者からの血清を使用するＨＴＬＶ −Ｉ　Ｉ　Ｉのエンベロープおよびコアの構造遺伝子産生物の特性決定（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆｅｎｖｅｌｏｐｅ　ａｎｄ　ｃｏｒｅ　５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ＨＴＬＶ−ＩＩＩ　ｗｉｔｈ　ｓｅｒａｆｒｏｍ　ＡＩＤＳ　ｐａｔｉｅｎｔｓ）Ｊ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２８：５９３−５９５．１９８５゜■、カトウ、Ｔ、ヤスナガ、Ｙ、イカワおよびＹ、ヨシナカ：「アスバルチルブロティナーゼ阻害因子によるレトロウィルスのプロテアーゼ活性の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｂｙ　ａｎ　ａｓｐａｒｔｙ＋　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　１ｈｉｂｉｔｏｒ）Ｊ、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）３２９：６５４−６５６．１９８７゜Ｃ，デボラフ（Ｄｅｂｏｕｃｋ）　、Ｊ、Ｇ、　ゴルニアク（Ｇｏ　ｒｎ　ｉ　ａｋ）　、Ｊ、Ｅ、ストリックラー（Ｓｔｒｉｃｋｌｅｒ）、Ｔ、Ｄ、ミータ（Ｍｅ　ｅ　ｋ）　、Ｂ、　Ｖｖ’、メトカーフ（Ｍｅｔｃａｌｆ）およびＭ、ｏラセンバーブ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）：　ｒ大腸菌中で発現されたヒト免疫不全ウィルスのプロテアーゼはｇａｇ前駆体の自己プロセシングおよび特異的突然変異を示す（Ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｔａ　ｃｏｌｉ　ｅｘｈｉｂｔｓ　ａｕｔｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ａｎｄ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇａｇ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）Ｊ、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、８４：８９０３−８９０６、１９８７コ　。

患者におけるＨＩＶ−１の存在またはそれへの暴露の検出は、最も最近の数年間の科学的研究および商業的応用の主要な目標の１つであった。

ＨＩＶ−１の検出のアッセイは、一般に、免疫学的反応に基づき、そして不活性化された全ウィルスを抗原試薬として使用して適当な抗体を発生させる。ウィルスの複製に必須なＨＩＶ−１タンパク質に対する抗体、ならびにＨＩＶ−１抗原の初期の検出およびＨＩＶ−１で感染した患者における抗ウイルス治療の管理の両者におけるそれらの使用は、また、最近の特許および科学的文献に記載されている。と（に、ＨＩＶ−１のｇｐ４１に対するマウスのモノクローナル抗体は欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）公開第３３５１３４号に記載されている。ＨＩＶ−１のｐ２４に対して特異的反応性をもつマウスのモノクローナル抗体は、欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）公開第３４５４６１号に記載されている。ｇｐ４８に対して特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、国際特許出願公開第Ｗ０９０１００６１７号に記載されている。

ＨＩＶ−１で慢性的に感染したＴ−リンパ球の細胞リゼイトのウェスタンプロット分析により、ｐ２４およびｐ１７と反応性のモノクローナル抗体を使用してｐ５５、ｐ２４およびｐ１７の存在を検出することは、Ｔ、Ｄ、ミータ（Ｍｅｅｋ）ら：「感染したＴ−リンパ球の中のＩ（ＩＶ−Ａタンパク質の合成ペプチド類似体による阻害（ＩｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＨＩＶ−Ａタンパク質　ｉｎ　１ｎｆｅｃｔｅｄ　Ｔ−１ｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｂｙ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｃｌｅ　ａｎａ］、ｏｇｕｅｓ）Ｊ、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、３４３．９Ｏ−９２（１９９０）。

組み換え融合ウィルスのコア能力および関係する抗体の産生は欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）公開第３０５７７７号に開示されている。

本発明は、ｇａｇ遺伝子の前駆体産生物、すなわち、タンパク質ｐ５５、に対するモノクローナル抗体、またはｐ２４およびｐ１７ポリベブチドを発生するＨ　ｒ　Ｖ−１プロテアーゼによりｐ５５切断部位（［ｐ２４／ｐ１７ＨＩＶ−１プロテア一ゼ切断部位」）を含有するその一部分を提供する。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、ＨＩＶ−１に暴露されかつエイズを発生していない患者または治療学的処理を行っていない患者において、ウィルス活性のマーカーとしてプロテアーゼ活性をモニターする目的で、ｐ２４および他の小さいポリペプチドの両者のｇａｇ前駆体を含有する生物学的流体および／または組織の中のその存在を検出するために有用である。用語「生物学的流体および／または組織ゴは、哺乳動物の全血、血漿のほかに、リンパ球Ｒ細胞の培養物または真核生物、あるいはまた、原核生物の宿主におけるｇａｇ遺伝子の発現から誘導された細胞またはバクテリアの抽出物ならびにｐ２４およびｐ１７ポリベブチドを発生するＨＩＶ−１プロテアーゼによるｐ５５切断部位を含有するｐ５５の同一のアミノ酸配列を含有する自然または合成のポリペプチドまたはその断片を含有する任意の混合物または溶液を包含する。

したがって、本発明の抗体の主な使用の１つは、ＨＩＶ−１に暴露された人々の血清および他の体液および／または組織の酵素イムノアッセイにおいてである。

この抗体の他の使用は、ｐ２４およびｐ１７ポリペプチドを発生するＨＩＶ−１プロテアーゼによるｐ５５切断部位を含有する自然または合成ペプチドの分離および／または精製である。これにより、ウィルスの複製メカニズムの研究のためおよびＨＩＶ−１プロテアーゼに対して前駆体タンパク質と競争しそして潜在的予防および／または治療学的因子を発現する物質を生産および分離するために望ましい量で、前駆体タンパク質を得ることができる。

このような使用に従い、抗体を不活性な支持体に結合させてこの分野において知られている方法により親和性マトリックスを形成することができる［参照、例えば、Ｊ、Ｗ、　ボウディング（Ｇｏｄｉｎｇ）：モノクローナル抗体および原理および実施（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｊｃ　Ｐｒｅｓｓ）、＝ユーヨーり、１９８３．１８８−２０７］。

本発明の抗生物質の実際の使用についてのいくつかの特定の実施例は、また、欧州特許出願（Ｅ　Ｐ−Ａ）公開第３４５４６１号および欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）公開第３３５１３４号のように引き出すことができる。

本発明の抗体の特別の特性はｐ２４およびｐ１７ポリペプチドを発生するＨＩＶ −１プロテアーゼのｐ５５切断部位からなるｐ５５タンパク質のエピトープとの特異的反応性であるので、この抗体は既知および未知の両者の物質を流体、組織および培養した細胞におけるＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害活性についてスクリーニングするイムノアッセイ試験を案出するためにとくに適当である。事実、このような活性の検出に現在使用されている試験は、通常、ｇａｇ前駆体の切断から生ずるウィルスのポリペプチドに対して主として向けられたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体に頼る。前記抗体はｇａｇＦＪ駆体と切断されたポリペプチドの産生物（ｐ１８またはｐ２４）との間を区別することができず、したがって普通にウェスタンプロット分析において主要な抗体として使用される［参照、Ｔ、　Ｄ、ミータ（Ｍｅｅｋ）ら、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、３４３．９０−９２．１９９０およびマククエイド（ＭｃＱｕａｄｅ）ら：抗ウィルスをもつ合成ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害因子はＨＩＶ様粒子の成熟を阻止する（Ａ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ＨＩＶ−１ｐｒｏｔｅａｓｅ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｒｒｅｓｔｓ　ＨＩＶ −１ｆｋｅｐａｒｔｉｃｌｅ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）Ｊ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、　２４７、４５４−４５６、１９９０コ　。

簡単に述べると、既知の方法に従うと、流体、組織または細胞リゼイトの中に含有されるタンパク質をポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離し、次いでニトロセルロースのフィルター上にブロッティングする。引き続いて、主要な抗体により認識されるＨＩＶタンパク質を共有結合的に標識した第２抗体とインキュベーションすることによって可視化する。

結局、未処理試料の中の前駆体および産生物の間の比をプロテアーゼ反応の阻害因子で処理した試料における同一の比と比較することができ、したがって処理した試料の内側のこのような阻害因子の効能についての情報を得ることができる。

前駆体のみを認識しそしてプロテアーゼ切断産生物を認識しない抗体の入手可能性は、タンパク質分離工程のためのＰＡＧＥを回避する。１つの例はサンドイッチ−ＥＬＩＳＡ型アッセイの使用である。したがって、このような抗体を固体の支持体、例えば、マイクロタイターウェル上に固定化し、そしてこれらのウェルにプロテアーゼ基質を含有するＨＩｖ感染した細胞からの流体、組織または細胞リゼイトを添加することができる。結局、ｇａｇ前駆体（その断片またはＩ）２４／ｐ１７切断部位領域の同一のアミノ酸配列を含有する合成ポリペプチド：「前駆体様ポリペプチド」）のみは結合されるが、ウィルスおよび細胞（または合成）由来のすべての他のタンパク質は容易に洗浄除去することができる。

引き続いて、ｇａｇ前駆体または前駆体様ポリペプチドの量は異なる抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）とインキュベーションすることによって決定することができ、前記異なる抗体は前駆体の異なるエピトープ（そのｐ２４またはｐ１７部分上）を認識し、そしてマーカー酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼなど）で前２て標識されている。

このようなアッセイを実施するための異なる可能性の例ならびに反応条件の説明は、次の文献に記載されている：　「酵素イムノアッセイの実施および理論（Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）Ｊ、Ｐ、チジツセン（Ｐ、Ｔｉｊｓｓｅｎ）著、「生化学および分子生物学における実験室の技術（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕ］ａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｒ，Ｈ，バーデン（Ｂｕｒｄｅｎ）およびＰ。

Ｈ，パン・ニラベンバーブ（ｖａｎ　Ｋｎｊｐｐｅｎｇｅｒｇ）、エルセビーア（Ｅｌｓｅｃｉｅｒ）、１９８５゜本発明の選択的抗体は、すぐに使用できるキットにおいて分析アッセイの実施に必要な他の試薬および手段に関連させることができる。

この抗体のそれ以上の使用はＨＩＶ−１プロテアーゼの潜在的阻害因子のスクリーニングにおいてであり、この試験において、プロテアーゼ特異的基質として。

ｐ５５１Ｆｒ片を含有するＨＩＶ−ｇａｇ融合タンパク質を利用し、ｐ５５断片はｐ２４またはｐ１７の両者の部分からなり、そしてｐ２４／ｐ１７ＨＩＶ−１切断部位を含み、マーカー酵素、例えば、β−ガラクトシダーゼに結合している。この融合タンパク質は、例えば、ＨＩＶ菌株ＬＡＶのウィルスのゲノムからのこのようなタンパク質断片をコードするＤＮＡ断片を分離し、そしてこのようなりＮＡ断片をベクターのプラスミドｐＶＲ２９２の中に含有されるＥ、ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼの構造遺伝子の中に挿入することによって調製できる。

β−ガラクトシダーゼ解読配列の同一のリーディングフレームの中に存在するこのような挿入は、β−ガラクトシダーゼ酵素と融合したタンパク質としてＥ、ｃｏｌｉの中のｇａｇタンパク質断片の発現を可能とする。

このようなイムノアッセイの１例は、次の手順において簡単に概略的に示す１）潜在的阻害因子とＨＩＶ−１プロテアーゼおよびＨＩＶ−ｇａｇ融合タンパク質を含有する溶液とのインキュベーション。

２）上の反応混合物と本発明の固定化したモノクローナル抗体とのインキュベーション。これは切断しないＨＩＶ−ｇａｇ融合タンパク質の抗体への選択的結合を可能とする。

３）試験溶液を除去して、ＨＩＶ−１活性から生ずる産生物（切断したＨＩＶ− ｇａｇ融合タンパク質）を、固定化された抗体に結合した切断しないＨＩＶ−ｇａｇ融合タンパク質から分離すること。

４）融合タンパク質のマーカー酵素部分の反応成分、例えば、β−ガラクトシダーゼ特異的発色性基質、例えば、ｐ−ニトロ−フェニル−ガラクトピラノシド（ＰＮＰＧ）の添加、および酵素活性の決定。この最後の工程はＨＩＶ−１プロテアーゼにより切断されなかったＨＩＶ−ｇａｇ融合タンパク質の定量を可能とし、それゆえ潜在的阻害因子を含有しないブランク試料との比較により、ＨＩＶ− １プロテアーゼ活性の測定を与える。

このアッセイは非常に効率よく、そしてマイクロタイターウェル中で実施することができるので、多数の試料の迅速なスクリーニングのためにとくに適当である。このような目的のために、自動化は可能である。

試験試料は任意の由来であることができる。それらは、化学的合成または自然の産生物から誘導された、既知または未知の構造の化合物であることができる。また、それらは精製された物質または複雑な混合、すなわち、細胞の抽出物、微生物の発酵ブロス、合成産生物または、植物を包含する生物学的物質の抽出物であることができる。

このアッセイは、また、低い濃度（５〜１０％）の有機溶媒、例えば、メタノール、アセトニトリルまたはＤＭＳＯにより比較的影響を受けなず、これは、このアッセイを阻害活性の精製をモニターするために使用するとき、と（に有用な特徴である。

本発明は、また、選択的モノクローナル抗体を調製する方法、およびそれを使用する分析アッセイまたは精製手順を包含する。本発明の抗体の好ましい生産方法は、抗体を商業的量で生産するためにとくに有用である。なぜなら、この方法は潜在的に危険である、ウィルスまたは必須のウィルスの部分またはポリペプチドを抗原として直接の使用することを含まず、むしろ１．「不活性の」ｐ５５前駆体または、好ましくは１．２つのポリペプチドを発生するＨＩＶ−１プロテアーゼの切断部位からなるｐ２４またはｐ１７のポリペプチドの一部分を含有する、遺伝子操作した融合タンパク質の使用を包含するからである。

本発明のモノクローナル抗体は、通常ハイブリドーマ細胞系である、抗体生産細胞系により生産することができる。ハイブリドーマは、抗体生産細胞を、ハイブリッド細胞に長期間の組織培養安定性を付与する安定化された細胞系に融合することによって形成される。抗体生産細胞はｐ２４／ｐ１７ＨＩＶ−１切断部位を含有するタンパク質ｐ５５またはその一部分に対して免疫化された動物からの牌細胞であることができる。

免疫化された動物は、通常小さい哺乳動物、好ましくは醤書類、例えば、ラットまたはマウスである。

第２の融合相手、すなわち、安定化された細胞系は、リンパ芽球様細胞系または骨髄腫細胞系であることができ、好ましくは、第１融合相手とシンジエネイックである。この型のいくつかの細胞系は既知であり、そして公の菌株保存機関、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシａン（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）米国マリイランド州ロックビレ）から公衆に対して入手可能である。前記細胞の１例は、ＨＡＴ　（／１イボキサンチン、アミノプテリン、チミジン）感受性非生産体のマウス骨髄腫細胞系Ｓｐ２１０−Ａｇ１４である。

融合技術は、通常、Ｃ，ミルスタイン（Ｍｉｌｓｔａｉｎ）およびＧ。

ケーラー（ＫＯｈ　Ｉ　ｅ　ｒ）　、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）　、２５６．４９５−４９７　（１９７５）に記載されており、そして「モノクローナルイ１イブリドーマ抗体：技術および応用（Ｍｏｎｏ、ｃｌｏｎａｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄＡｐｐｌ　１ｃａｔｉｏｎｓ）Ｊ、Ｊ、　Ｇ、　、Ｒ，フレル（Ｈｕｒｒｅｌｌ）編、Ｃ，Ｒ，Ｃ，プレス・インコーホレーテッド（Ｐ　ｒ　ｅ　ｓ　ｓ　Ｉｎｃ、）（１９８２）に概観されている。

動物の免疫化に有用な抗原は不活性化した全ＨＩＶ−１ウィルス、または部分的に精製した自然ｐ５５タンパク質から構成することができるが、ｐ　２４／ｐ　１７切断部位からなるｐ５５配列またはその断片を含有するクローニングしたタンパク質を使用することが好ましい。この型の組み換えタンパク質は、自然ｐ５５タンパク質の利用を必要とするするときのような、ＨＩＶ−１感染した宿主の物質の危険な取り扱いなしに、本発明の方法の実施に十分な量でえられるという利点を有する。特許および科学文献は、動物を免疫化して本発明のエピトープ特異的モノクローナル抗体をえるための抗原として有用な融合タンパク質を提供することができる、ＨＩＶ−ｇａｇ融合タンパク質を発現する方法を報告している。参照、例えば、欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）公開第３０５７７７号、欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）公開第３４５４６１号およびＣ，グエネット（Ｇｕｅｎｅｔ）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ファーマコロシー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏ、）−モレキュラー拳ファーマコロジー・セクンａン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙＳｅｃｔｉｏｎ）、１７２．４４３−４５１　（１９８８）。

本発明の抗体の生産にとくに過当な抗原はｐ５５断片を含有するＨＩＶ−ｇａｇ融合タンパク質であり、ｐ５５断片はｐ２４／ｐ１７の両者の一部分からなりそしてｐ２４／ｐ１７ＨＩＶ−１プロテア一ゼ切断部位を含み、この融合タンパク質は適当なマーカー酵素、例えば、β−ガラクトシダーゼに融合している。前記融合タンパク質の典型的な例は、実施例１に記載するβ−ガラクトシダーゼ（ｇａ、ｌ−ｇａｇｌｌＯ）に融合した１１０アミノ酸残基を含有する）ＩＩＶ−ｇａｇ融合タンパク質である。

本発明の好ましい実施態様に従い、ＨＩＶ−１プロテアーゼのｐ２４／ｐ１７切断部位からなるｐ５５タンパク質のエピトープと特異的反応性を示す抗体は、（ｉ）マウスを前述の融合タンパク質で免疫化し、：（１１）免疫化したマウスから牌細胞を回収し、そしてそれらをＨＡＴ感受性非生産体のマウス骨髄腫Ｓ　ｐ　２１０−Ａｇ　１４と融合し：（１１１）得られたハイブリッドを適当なイムノアッセイにより融合タンパク質のｐ５５部分に対するモノクローナル抗体の生産について試験し；（１ｖ）前のアッセイに対して陽性の細胞をサブクローニングし：　（Ｖ）サブクローニングした細胞をエピトープの特異性について分析し、そしてより大きい培養のために融合タンパク質のｐ２４／ｐ１７ＨＩＶ−１プロテア一ゼ切断部位に対して特異的に向けられた抗体を分泌するハイブリドーマを選抜し；（ｖｉ）この分野において通常使用されている方法に従い、特異的抗体を分離および精製することによって生産することができる。

一般に、免疫化工種はｐ２４またはｐ１７の両者の部分を含有する融合タンパク質の精製した調製物を使用することによって実施する。動物は前の注射から１２〜１７日の間隔で３〜５回注射する。抗体の満足すべき力価は、通常、免疫化の開始後６０日で得られる。マウスは通常殺す前２〜５日に最後の促進を与える。

血漿および膵臓から取り出した他のリンパ球細胞をマウス骨髄腫細胞と、通常融合促進剤、例えば、ポリエチレングリコール２５００の存在下に融合する。融合後、骨髄腫細胞はＨＡＴ培地の添加により排除し、その間ハイブリダイゼーションしない牌細胞は数日で死亡する。

抗体生産ハイブリドーマは、適当なｇａｇタンパク質酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩ　ＳＡ）により上澄み液を試験することによって決定され、ここで融合したＨＩＶ−ｇａｇ／β−ガラクトシダーゼタンパク質に対するハイブリドーマにより分泌された抗体の反応性をβ−ガラクトシダーゼ単独に対するものと比較する。融合タンパク質に対して陽性でありかつβ−ガラクトシダーゼに対して陰性である、ハイブリドーマ供給上澄み液をサブクローニングし、そしてそれらの上澄み液をイムノブロッティングによりＨＩＶ−１プロテアーゼによる切断前後に融合タンパク質に対する反応性を試験することによってエピトープの特異性について分析する。切断前に融合タンパク質に対してすぐれた親和性を実証する上澄み液を生じそしてプロテアーゼにより切断したとき同一タンパク質に結合しないクローンを、それ以上のサブクローニングおよび大量培養のために選抜する。

選択的抗体生産ハイブリドーマの選抜の方法の代表的な実施例として、２つの融合実験において、８８０のクローンをスクリーニングした。

２１のクローンはｇａｌ−ｇａｇｌｌｏ融合タンパ融合タンパク−ガラクトシダーゼの両者に対して陽性であり、８つがβ−ガラクトシダーゼのみに対して、そして７つがｇａｌ−ｇａｇｌｌＯ融合タンパ融合タンパ対質て陽性であることが発見された。ｇａ　Ｉ−ｇａｇｌｌＯ融合タンパ融合タンパ対質７つのクローンをサブクローニングし、そしてエピトープ特異性についてさらに特性決定す、るために選抜した。これらの７つのクローンの間で、４つのクローンは切断前にｇａ　１−ｇａｇ１１０融合タンパ融合タンパ石質性について再確証されそして、１つ、ｌＧ１２と呼ぶ、のみは融合タンパク質に対してすぐれた親和性を実証し、融合タンパク質の切断後に結合性を示さなかった。次いで、特異的抗体を生産するクローンをそれ以上のサブクローニングおよび普通の技術に従い実施することができる大量培養のために選抜した。例えば、マウスにおける適用によるか、あるいは中空繊維のバイオリアクターの中の細胞培養による。

ｌＧ１２抗体の分離および精製は、前記抗体を含有する溶液を親和クロマトグラフィーのカラム、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）プロティンＡ−セファローズ（Ｓｅｐｈａ、ｒｏｓｅ）カラム、前２て結合緩衝液ｐ８．９と平衡化した、に適用し、結合しないタンパク質を結合緩衝液の添加により除去し、次いで結合した分画を特定の溶離緩衝液ｐＨ６で溶離することによって実施することができる。次いで、回収された抗体をＰＢＳ　（リン酸塩緩衝液）に対して透析し、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ドデシル硫酸ナトリウム〜ポリアクリルアミドゲルの電気泳動）により減少する条件において均質性について試験し、そして−２０６Ｃ（マイナス２０℃）において貯蔵する。

精製したモノクローナル抗体ｌＧ１２は、ｐ２４／ｐ１７切断部位を含有するｐ５５ＨＩＶ−１ｇａｇタンパク質前駆体のエピトープに対して特異的反応性を示し、さらに、ＥＬＩＳＡアッセイによりクラス特異性について特性決定し、モしてＩｇＧ＋クラスに属しそしてに型の軽鎖を有することが発見された。

還元性および非還元性条件における５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、１５０゜０００ダルトン程度の概算分子量を示す。

ｐ２４／ｐ１７切断部位をもつｐ２４またはｐ１７部分を含有しそしてβ−ガラクトシダーゼに共有結合したｇａｌ−ｇａｇｌｌＯ融合タンパ融合タンパ対質Ｇ１２抗体の親和性定数の概算値は、５・１０’Ｍ−１次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を限定しない。次の材料、方法、細胞系および培地を、実施例および図面に特記しない限り、使用した。使用したすべての化学物質は分析等級であった。

材料次の材料を使用したニブロチイン−Ａセファローズ（Ｓｅｐｈａｒ。

ｓｅ）［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ）、スウェーデン国つップセラ］　：ヒツジ抗マウスＩｇ１セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合Ｆ（ａｂ’）２断片［アマ−ジャム（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）　、英国パツキンガムシャイア−州インターナショナルリトルタルフロントコ、ヤギ抗マウスＩｇ［ジャンセン・バイオヒミカ（Ｊａｎｓｓｅｎ　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ）、ベルギー国ベーセ〕、ジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）からのヒト内皮細胞上澄み液（ＨＥＣＳ）。

細胞系および培地融合実験に使用したＨＡＴ感受性非生産体のマウス骨髄腫Ｓ　ｐ　２１０−Ａｇ１４　［Ｍ、Ｃ，シュルｖン（Ｓｈｕ　１ｍａｎ）　、Ｃ，Ｄ、’フイルデ（Ｗｉｌｄｅ）およびＧ、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）：　ｒ特異的抗体を分泌するハイブリドーマをつくるためによりすぐれた細胞系（ＡＢｅｔｔｅｒ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ　ｆｏｒ　ｍａｋｉｎｇ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｊｂｏｄｉｅｓ）にネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２７６．２６９−２７０．１９７８コを、１０％の胎児仔ウシ血清（ＦＣＳ、フロー・ラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１ミリモルのグルタミン、１．ＯＵ／ｍｌのペニシリン、Ｏ，０１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したダルベツコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させた。ハイブリドーマ系統は、５％のＦＣＳ、５％のＨＥＣＳ、ＨＡＴ（０，１ミリモルのハイポキサンチン１０．４μモルのアミノブレリン／１６ミリモルのチミジン）、１ミリモルのグルタミン、ＩＯＵ／ｍｌのペニシリン、０．０１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ中で維持した。

実施例１：　ｐ２４／ｐ１７切断部位を含有するｇａ　ｌ−ｇａｇｌｌ。

融合タンパク質の調製および特性決定ｂｐ６３１〜１２５８のＨＩＶ−ｇａｇ　ＤＮＡからのＨｉｎｄＩｌｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ断片［Ａ、ワイン（Ｗａ　ｉ　ｎ−Ｈｏ　ｂ　ｓ　ｏ　ｎ、　Ｐ。

ソニゴ（Ｓｏｎ　ｉ　ｇｏ）　、Ｏ，クラス（Ｄａｎｏｓ）　、Ｓ、：］−ル（Ｃｏｌｅ）およびＭ、アリシン（Ａｌｉｚｏｎ）：細胞（Ｃｅｌｌ）４０．９− １７．１９８５コをｐＵｃ１９　［ギブコ（ＧＩＢＣＯ）ＢＲＬ１インターナショナル・ディビジョン、マリイランド州ガイサーンヤーグ］の独特Ｈｉｎｄｌ１１部位の中にサブクローニングした。生ずる構成体から、ｂｐ６３１〜９６１のＨＩＶ−Ｉ　ＤＮＡからのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐｓｔｌ断片に融合したＴ）ＵＣ１９ポリリンカーから８ｂｐ（Ｐｓ　ｔ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ）を含有するＰｓｔｌ−Ｐｓｔｌ断片を分離し、そしてｐＵＲ２９２［Ｕ、ルザー（Ｒｕｔｈｅｒ）およヒＢ、ムラー−ヒル（Ｍｕ　Ｉ　Ｉ　ｅ　ｒ−Ｈｉ　ｌ　１）　：　ＥＭＢＯＪ、２．１７１〜１７９４．１９８３］の独特Ｐｓｔ１部位の中に挿入した。これはプラスミドｐＧＡ２２を与え、ここでｇａｇ断片はＬａｃＺ遺伝子の末端にインフレームで融合し、こうして融合タンパク質はエンコードされる。

このｒｇａｌ−ｇａｇｌＩＯＪ融合タンパク質の構造は第１Ｄ図に描写されている。　このプラスミドｐＧＡ２２を使用してＥ、ｃｏｌｉ菌株ＪＭＩ０９を形質転換した。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　（ｐＧＡ２２）を３７℃において５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを有するＬＢ培地中で成長させた。ＯＤ、。。において、ＩＰＴＧを１ミリモルの最終濃度に添加した。２時間後、バクテリアを収穫し、そして領　１ミリモルのＰＭＳＦ、１ミリモルのベンズアミジン−ＨＣｌ、０．１モルのアルギニンおよび１ｍｇ／ｍ＋のリゾチームを含有する１１５０体積の５０ミリモルのトリスＨＣＬｐＨ８，５０ミリモルのＮａＣｌ、１ミリモルのＥＤＴＡ　（緩衝液Ａ）、の中に再懸濁させた。４℃において３０分後、細胞を超音波処理により崩壊し、そして２５，０００ｇで１０分間遠心した。沈澱を７０ミリモルの２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）および０．０５％のトリトン−Ｘ１００を含有する緩衝液Ａの中に再懸濁させることによって２回洗浄し、そして２５，０００ｇ出遠心した。最後に、沈澱を８モルの尿素を含有する０、１モルのトリスＨＣＬ　ｐＨ７，８，０，１モルのＮａＣｌ。

１ミリモルのＭ　ｇ　Ｃ１ｘ、０．５ミリモルのＥＤＴＡ、７０ミリモルの２− ＭＥ　（緩衝液Ｂ）の中に溶解した。５０．０００ｇで２０分間遠心した後、上澄み液をまず緩衝液Ｂで５モルの尿素に希釈し、次いで２−Ｍを含まない緩衝液Ｂに対して広範に透析した。ＴＰＥＧ−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）の親和クロマトグラフィーを本質的に記載されているように実施したＥＡ、ウルマン（ＵＩ　Ｉｍａｎｎ）：遺伝子（Ｇｅｎｅ）２９．２７−３１．１９８４］。

各精製工程におけるｇａ　Ｉ−ｇａｇｌｌｏの回収は５ＤＳ−ＰＡＧＥによりＰＨＡＳＴ−ＧＥＬ系［ファーマシア（Ｐｈ　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ）コを使用してチユブラした。

精製したｇａｇ前駆体は５ＤＳ−ＰＡＧＥにより検査し、ここでそれは約１３０．０ＯＯＤの主要なバンドを与えた（参照、第１Ａ図、レーンＮｏ　ＥＸ）。これは１１６．０ＯＯＤ、β−ガラクトシダーゼの分子量＋１．４．０００Ｄ、酵素に融合した２８２部分の期待される分子量、に相当する。このようなタンパク質は事実ＨＩＶプロテアーゼにより切断されて（第１Ａ図、レーン０１１５および３０に示すように）約１２０．０ＯＯＤａにおけるバンドを生ずる。

使用したＨｒＶプロテアーゼは、Ｃ，グエネト（Ｇｕｅｎｅｔ）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏ、） −モレキュラー・ファーマコロジー・セクション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇＶ　５ｅｃｔｉｏｎ）、１７２．４４３−４５１　（１９８８）！＝従い、ｌ：、ｃｏｌｉの中の合成遺伝子の発現により得られた組み換えＨＩＶ−１プロテアーゼである。

ＨＩＶプロテアーゼによる切断の前後の精製した融合タンパク質のイムノプロット分析（第１Ｂ図）は、このようなタンパク質が切断の前後にＥ、ｃｏｌｉ　β −ガラクトシダーゼ［ベーリンガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、西ドイツ国］に対して特異的モノクローナル抗体により認識されることを示す。

生ずるタンパク質は、Ｅ、ｃｏｌｉ　β−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端に融合したＨＩＶ−１ｇａｇポリタンパク質（ｐ　５５）からのＡ１　ａ”０−Ａｌａ”’断片を含有する（第１Ｄ図）。このｒｇａｌ−ｇａｇｌｌＯＪ融合タンパク融合タンパ部質はｐ２４／ｐ１７ＨＩＶ−１プロテア一ゼ切断部位Ｔｙｒ１１２　ｐ　ｒｏｌＨからなる［Ａ、　ワイン（Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、Ｐ、ソニゴ（Ｓｏｎｉｇｏ）　、Ｏ，クラス（Ｄａｎｏｓ）、Ｓ、：ｌ−ル（Ｃｏ　１　ｅ）およびＭ、アリシン（ＡＩｉｚ。

ｎ）：細胞（Ｃｅ　Ｉ　１）４０．９−１７．１９８５コが、β−ガラクトシダーゼ部分は容易に測定可能な酵素活性を提供する。

実施例２：　ｇａｌ−ｇａｇｌｌｏ融合タンパ融合タンパ石質ノクローナル抗体の生産雌のＢａ１ｂ／Ｃマウスは、この動物の腹膜の中に完全フロインドアジュバントの中の実施例１の融合タンパク質の０．０５０ｍｇ　（１：　１）を−６０日に注射することによって免疫化した。不完全フロインドアジュバントの中の同一量を動物の腹膜に−４２，３０、−１８日に注射した。−３日に、０．０５ｍｇの最終の促進剤を動物に静脈内に与えた。

モノクローナル抗体を得るために、０日に、免疫化したマウスの詳細胞（５Ｘ１０’）をｌＸｌ０’のＨＡＴ感受性非生産体のマウス骨髄腫Ｓｐ２１０−Ａｇ１４細胞に融合した。融合はポリエチレングリコール１５００を使用して実施し、次いで細胞を５％のＦＣＳ、５％のＨＥＣ３ＳＨＡＴ、１ミリモルのグルタミン、ＩＯＵ／ｍｌのペニシリン、０．０１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭの中の５つの異なる９６ウエルのマイクロタイタープレート［コスタ−（Ｃｏｓｔ　ａ　ｒ）　、ワ＞　７Ｌ／’フイ７−センター（Ｏｎｅ　Ａｌｅｗｉｆｅ　Ｃｅｎｔｅｒ）、米国マサチュセッツ州ケンブリッジ〕上にプレイティングした。成長するハイブリッドの上澄み液を２〜３日毎に酵素結合免疫収着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりｇａｌ−ｇａｇｌｌＯタンパク質の一部分に対するモノクローナル抗体の生産について試験した。

実施例３：　抗ｇａ　！−ｇａｇ１１０タンパク質のモノクローナル抗体の酵素結合免疫収着アッセイ９６ウエルのマイクロタイタープレート［ファルコンーベックマン・ディックジン（Ｆａｌｃｏｎ−Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）］を交互のストリップで領　０５ｍ１／ウエル（０，０００１２５ｍｇ／ウェル）のａ）ＰＢＳ　（リン酸塩緩衝液）、０．１モルの塩化ナトリウムｐＨ７，３の中のｇａ、ｌ−ｇａｇｌｌｏ融合タンパ融合タンパ石質同一緩衝液の中のβ−ガラクトシダーゼでコーティングした。４℃において一夜インキユベーションした後、プレートをＰＢＳで洗浄し、そしてＰＢＳの中の１％のＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）ｐＨ７，３と室温において１．５時間インキュベーションした。次いで、０．０５ｍ１／ウエルの上澄み液のハイブリドーマを添加し、そして室温において２インキユベーシヨンした。ＰＢＳ、０．００５％のツイーン２０で洗浄後、０．０５ｍ１の／ウェルの抗マウスＩｇペルオキシダーゼ接合Ｆ（ａｂ’）２断片を添加した。１．５時間後、プレートを洗浄し、そして０．１５ｍ１／ウエルのオルト− フェニレンジアミン、１ｍｇ／ｍｌの０．　１モルのクエン酸塩緩衝液ｐＨ５／ウエル、１．７５ミリモルのＨ２Ｏ２／ウェルとインキュベーションした。着色した反応をＨ２Ｓｏ４４．５モルで停止させた。結果をタイターチク・マルチスカン（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ）分光光度計［フロー・ラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、英国スコツトランド、アービンコにより４９２Ｄｍにおいて呼んだ。

この手順を使用して、実施例２に記載するように実施した２つの融合実験において得られた８８０のコロニーをスクリーニングした。これらのクローンのうちで、２１はｇａ　１−ｇａｇｌｌｏ融合タンパ融合タンパ石質ガラクトシダーゼの両者に対して陽性であり、８つはβ−ガラクトシダーゼのみに対して陽性であり、そして７はｇａ　ｌ−ｇａｇｌｌ。

融合タンパク質のみに対して陽性であった。ｇａｌ−ｇａｇｌｌｏ融合タンパ融合タンパ石質７ｊｕｎｏクローンを、制限希釈技術およびｇａｌ−ｇａｇｌｌＯ融合タンパ融合タンパ石質性についての確証により、さらにサブクローニングするための選抜した。４つのクローンのみが確証され、そして連続して実施例４に従いエピトープ特異性について試験した。

実施例４：　エピトープの特性決定によりモノクローナル抗体ｌＧ１２を分泌するハイブリドーマの選抜ＨＩＶ−１プロテアーゼとのインキュベージジン前後のｇａ　ｌ　−ｇａｇ１１０融合タンパ融合タンパ重質泳動のウェスタンプロット分析を、第１Ｃ図に記載する条件に従い一次抗体としてｇａ　１−ｇａｇｌｌｏ融合タンパ融合タンパ石質性と確証された４つのクローンの上澄み液（参照、実施例３）を使用することによって実施した。

異なるニトロセルロースのストリップ上にブロッティングしたＨＩＶ−１の全体のウィルスタンパク質を含有するＨＩＶタンパク質検出キットｃツバパス・イムノプロット・ストリップ上（Ｎｖａｐａｔｈ　１ｍｍｕｎｏｂｌｏｔ　５ｔｒｉｐｓ）、バイオラド（Ｂ　Ｉ　０ＲＡＤ）　、米国カリフォルニア州すッチモンド〕を、第２図に記載するプロトコルに従い使用した。

ｇａ　ｌ−ｇａｇｌｌｏ融合タンパ融合タンパ石質和性を示す４つのクローンの１つのみは、プロテアーゼとのインキュベーション後、ｇａｌ−ｇａｇｌｌＯ融合タンパク質との結合を示さなかった（参照、第１Ｃ図）。この抗体を分泌するクローンを、モノクローナル抗体のそれ以上のより大きい規模の生産のために、およびその分離および精製のために選抜した。この抗体をｌＧ１２と呼ぶ。

実施例５：　ｌＧ１２の規模の調製および精製ａ）　規模の生産２つの方法を使用して大量のモノクローナル抗体ｌＧ１２を生産した１）ブリスタンで前以て増感した１〜２Ｘ１０’ハイブリドーマ細胞／マウスの注射から成るマウス系。

注射後１０〜１５日に、１〜１０ｍｇ／ｍ１のの腹水の範囲内の抗体を含有する、腹水をマウスの腹膜から回収した（１〜１０ｍ１）。

２）細胞の培養系は中空繊維のバイオリアクター［ビタファイバー（Ｖｉｔａｆ　１ｂｅｒ）ＶＬＳ−アミコン−アミコン−ディビジョン（Ａｍｉ　ｃｏｎ−Ａｍｉ　ｃｏｎ　Ｄｉ　ｖ　ｉ　５ｏｎ）　、Ｗ、Ｒ０＆Ｃｏ、、米国マサチュセッッ州デンバース］。

この系は細胞がその中で成長するブローバス（Ｐｌｏ−Ｐａｔｈ）バイオリアクター（３７００ｃｍ”のカートリッジ）ならびに供給および再循環ポンプ、温度；ントロールインジケーター、ｐＨコントローラーおよび空気供給を組み合わせて有する。

５Ｘ１０８ハイブリドーマ細胞をカートリッジの毛管外の空間において培地供給物（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＣ５＋１ミリモルのグルタミン、１０Ｕ／ｍｌのペニシリン、Ｏ，０１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン）で接種し、この培地供給物は繊維（３０，０００のカットオフ）の内腔通過しカリ毛管外の空間で成長する細胞を供給する。モノクローナル抗体（１５０，０００）は毛管外の空間の中に濃縮し、そして毎日収穫した。この系を使用して、数グラムのモノクローナル抗体ｌＧ１２が生産された。

ｂ）　回収モノクローナル抗体ｌＧ１２を次のプロトコルに従い流体から精製した：１０ｍ１の流体を２０ｍ１の酢酸塩緩衝液０．０６モル、ｐＨ４および０．５ｍｌのオタン酸［カプリル酸、メルク（Ｍｅｒｃｋ）ＡＧ。

西ドイツ国ダーマシュタット］と混合し、そして室温において３０分間激しく震盪した。次いで、この溶液を１５℃においてベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＳＷ２８．ｌｏ−ター中で２０．０００ｒｐｍで３０分間遠心した。上澄み液を集め、そしてリン酸塩緩衝液０．０２モルの塩化ナトリウムｐＨ７，３に対して一夜透析した。透析した溶液（１ｍ、　Ｉ　）を黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｂｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）プロティンＡ−セフ７０−ズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ４Ｂ　［ファーマシア（Ｐｈ　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ）　ＬＫＢバイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、スウェーデン国つップサラ］カラム、前以て結合緩衝液、１．５モルのグリシン、３モルの塩化ナトリウムｐＨ８，９と平衡化した、に適用した。結合しないタンパク質を５力ラム体積の結合緩衝液で洗浄除去し、一方結合した分画を特別の溶離緩衝液（０，１モルのクエン酸ｐＨ６）で溶離した。カラムを再生緩衝液（０，１モルのクエン酸ｐＨ３）でクリーニングした。モノクローナル抗体ｌＧ１２をＰＢＳに対して透析し、還元性および非還元性条件において５ＤＳ−ＰＡＧＥにより均質性について試験しく参照、第３図）そして−２０℃において貯蔵した。

実施例６：　モノクローナル抗体ｌＧ１２の特性決定モノクローナル抗体ｌＧ１２を、クラス特異性について、酵素結合免疫収着アッセイによりＢＩＯＲＡＤのキット［マウス−タイバー・サブ−アイソタイピング・パネル（Ｍｏｕｓｅ−Ｔｙｐｅｒ　Ｓｕｂ−ｉｓＯｌｙｐｉｎｇ　Ｐａｎｅ］）、次のものを包含する：ＩｇＧ、、ＩｇＧ２ａ、Ｉ　ｇＧ２ｂ、ｒ　ｇＧｓ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、に鎖、α 鎖］を使用して試験した。この試験の結果は、モノクローナル抗体ｌＧ１２がＩｇＧ。

クラスに属し、そしてその軽鎖はに型であることを示す。

分子量：モノクローナル抗体の分子量を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより還元性および非還元性条件において評価し、そして分子量の標準と比較した（第３図）。非還元条件における５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、モノクローナル抗体ｌＧ１２がＩｇＧ、クラスのすべての免疫グロブリンとじて１５０．０００の均質なバンドにより構成されていることを示す。このバンドは２−メルカプトエタノールにより、免疫グロブリンの重鎮および軽鎖に相当する５０．０００および２５，０ＯＯＤの２つのバンドに還元される。

親和性、融合タンパク質についてのモノクローナル抗体ｌＧ１２の親和性定数の概算の値は、競争酵素イムノアッセイにより評価して５Ｘ１０”Ｍ〜１である。

方法＝５０μｌ／ウェルの中の０．０００１２５ｍｇの融合タンパク質を９６ウエルのマイクロタイタープレート上で分布させ、そして４℃において一夜インキユベーションした。次の日にプレートをＰＢＳｐ８７．３で洗浄し、次いでＰＢＳ−ＢＳＡ３％と室温において２時間インキュベーションした（２００μＩ／ウエル）。競争を抗体の滴定曲線の５０％に相当するモノクローナル抗体ｌＧ１２の固定した濃度と、融合タンパク質の異なる濃度（０，１２５４ｍｇｍ１〜０．０００１２ｍｇｍｌ）との間の溶液１：１中で実施し、そして３７℃において２時間反応させた。次いで、競争の産生物をマイクロタイターの溶離上にプレイティングし、そして溶液の中の抗原と反応しないｌＧ１２の量を融合タンパク質について、ペルオキシダーゼと接合したヒツジ抗マウスＦ（ａｂ′）２抗血清を使用して、モノクロ−六ル抗体のスクリーニングの間に使用される酵素イムノアッセイのプロトコルに従い滴定した。競争曲線の５０％の値は融合タンパク質についての抗体の親和性定数の概算値と仮定する［Ｍ、　Ｗ、ステワード（Ｓ　ｔ　ｅｗａ　ｒｄ）　、　Ｊ、　スティーンスガード（Ｓｔｅｅｎｓｇａａｒｄ）：　ｒ抗体の親和性（Ａｎｔｉｂ。

ｄｙ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ）Ｊ、ＣＲＣブレス・インコーボレーテッド（Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、　米国フロリダ州ポカレイトン、１９８３）。

実施例７：　ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害活性の検出についての酵素イムノアッセイにおけるモノクローナル抗体ｌＧ１２の使用マイクロタイターウェル［例えば、「マイクロエライザ（ＭＩＣＲＯＥＬＩＳ人）」、ブレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）（ＦＲＧ）、から］において、推定上のＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害因子を含有する５μｍの試料を、０．２５モルの２− （Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，０，０，６％のウシ血清アルブミン、０．０２５％のツイーン２０および、好ましくは、試験すべき生物学的試料の中に存在することがあるプロテアーゼによる非特異的タンパク質分解的分解を防止するためのプロテアーゼのカクテル、を含有する４０μｌの混合物と混合した。１例として、これは１〜５μｇ／ｍｌのロイペプチン、１〜１０ミリモルのベンズアミジン、０．５〜１ミリモルのナトリウムエチレン−ジアミノテトラアセテート（ＥＤＴＡ）および０゜２〜１ミリモルのフェニル−メチルスルホニル−フルオライド（ＰＭＳＰ）を添加することによって達成できた。すべてのプロテアーゼ阻害因子は示した濃度においてＨＩＶ−１プロテアーゼの活性に影響を与えないことが発見された。５μｍの便利には希釈したＨＩＶ−１プロテアーゼ、または５ｍｌのＨＩＶ−１プロテアーゼを発現する組み換えＥ。

ｃｏｌｉからの粗製の抽出物を各ウェルに添加し、そして溶液をある時間（通常５〜２０分）の間保持して、推定上の阻害因子をＨ１〜′−１プロテアーゼに結合させた。２５μｌの便利には希釈した実施例２のｇａｌ−ｇａｇｌｌｏ融合タンパ融合タンパクルに添加し、そしてマイクロタイタープレートを３７℃において４０分間インキュベーションした。

インキュベーション後、各ウェルからの５０μｍの溶液をモノクローナル抗体ｌＧ１２が前辺て固定化されている同様なマイクロタイタープレートの対応するウェルの中に移した。プラスチックのウェルへのモノクローナル抗体ｌＧ１２のこのような結合は、５０μｌの５０〜１００μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体の溶液を同様なマイクロタイタープレート（すなわち、マイクロエライザ）の各ウェル中で室温において１時間〜−夜の間で変化する時間の間インキュベーションすることによって達成された。モノクローナル抗体ｌＧ１２と反応しないプラスチック上の部位のすべてをブロックするために、２５０μＩのＰＢＳの中のウシ血清アルブミンの３％の溶液を各ウェルに添加し、そしてマイクロタイタープレートを室温において１時間インキュベーションした。すべての溶液を廃棄しそしてＰＢＳで３〜４回洗浄した後、プレートは使用できる状態にありた。

ＨＩＶ−１プロテアーゼ、ｇａｌ−ｇａｇｌｌｏ融合タンパ融合タンパクル上の阻害因子を含有する溶液を、固定化したモノクローナル抗体ｌＧ１２と室温において２時間インキュベーションして、切断しない融合タンパク質のマイクロタイターウェルへのモノクローナル抗体ｌＧ１２仲介結合を可能とした。次いで溶液を廃棄し、そしてプレートを０．０５％のツイーン２０を含有するＰＢＳで４〜５回洗浄した。ウェルに結合したままであるβ−ガラクトシダーゼ活性の量を検出するために、５０ミリモルの塩化ナトリウム、１ミリモルの塩化マグネシウムおよび７０ミリモルの２−メルカプト−エタノールの中の２４０ｍ１の１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロ−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを各ウェルに添加した。マイクロタイタープレートを室温において１時間インキュベーションし、次いで６０μｌの１．５モルの炭酸ナトリウムを添加してβ−ガラクトシダーゼの反応を停止させた。次いで４０５ｎｍにおける吸収を分光光度測定的にマイクロプレートのリーダー、例えば、タイターチク・マルチスキャン（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ）型［フロー・ラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＬ英国スコツトランド州オアービン］を使用して測定した。

このようなアッセイにおいて、対照試料（ＨＩ　Ｖ−１プロテアーゼ阻害因子ではない）は非常に低い吸収（バックグラウンドのレベル）を示した。なぜなら、すべてのｇａ　Ｉ−ｇａｇｌｌｏ融合タンパ融合タンパクル１プロテアーゼにより切断され、したがって固定化された抗体により結合されなかったからである。

反対に、ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害因子が存在するとき、ｇａ　Ｉ−ｇａｇｌｌＯ融合タンパク質ｇａｌ−ｇａｇｌｌｏ融合タンパ融合タンパクルず、それゆえ固定化された抗体により結合され、非常に高い吸収値が生じた。

代表的な実験において、このＨＩＶ−１プロテアーゼのアッセイをペプスタチン［シグマ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）　、米国ミゾリー州セントルイス］、ＨＩＶ−１プロテアーゼに似たアスパラギン酸プロテアーゼの既知の阻害因子、を使用してチェックした。バックグラウンドより上の吸収値は１〜２μｇ／ｍ！程度に少ないペプスタチンを使用して得られたが、５０〜１００μｇ／ｒｎｌの濃度において、ＨＩＶ−１プロテアーゼは完全に阻害された。

（Ａ）ＨＩＶ−１プロテアーゼによる切断前後のｇａｌ−ｇａｇｌｌＯ融合タンパク質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析。

レーン：　ＭＷ　Ｓｔ）分子量標準；Ｎ０Ｅｘ（実施例ではない））精製したｇａｌ−ｇａｇ１１０融合タンパク質；ＩＮＣ，ＴＩＭＥ　（インキュベーション時間）０．１５．３０）ＨＩＶ−１プロテアーゼヲ含有ｔルＥ、ｃ　ｏ　Ｉ　ｉノ粗製抽出物と３７℃において、それぞれ、０１１５および３０分間インキュベーションした後のｇａｌ−ｇａｇｌｌｏ融合タンパ融合タンパクル（調製物ではない））Ｅ、ｃｏｌｉの粗製抽出物と３７℃において３０分間インキュベーションした後のｇａｌ−ｇａ、ｇｌｌｏ融合タ融合タンパクル電気泳動は、ファスト（Ｐｈａｓｔ）−ゲル装置［ファーマンア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、スウェーデン国つツブサラ］によりホモジエネアス（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）７．５％を使用して製造業者の指示に従い実施した。２−メルカプトエタノールを還元剤として使用した。

クーマツシープルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ）Ｒ−２５［バイオラド（ＢＩＯＲＡＤ）　、米国カリフォルニア州すッチモンドコを染色のために使用した）。

（Ｂ）−次抗体としてモノクローナル抗体の抗β−ガラクトシダーゼしプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、米国ウィスコンシン州マジジン］を使用する、（Ａ）におけるゲルのイムノプロット分析。

レーンは（Ａ）における順序である。

ニトロセルロースのフィルターへのタンパク質の転移は、ファスト（Ｐｈ、ａｓｔ）−ゲルの計器のマニュアルにおいて示唆されるように、ゲルを７０℃に３０分間加熱することによって実施した。室温においてＰＢＳの中の５％のＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）で１時間ブロッキングした後、フィルターを０．２５％のＢＳＡを含有するＰＢＳの中の抗β−ガラクトシダーゼの１１５００希釈物と一夜インキユベーションした。次いで、フィルターに結合した抗体は、ゴールド（Ｇｏｌｄ）標識したヤギ抗マウス血清［ジャンンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）、ベルギー国ベールセＪとインキュベーションし、次いで銀増強（ＳｉｌｖｅｒＥｎｈ、ａｂｃｅｍｅｔｎ）　［ジャンンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）コにより検出した。

（Ｃ）−次抗体としてモノクローナル抗体ｌＧ１２を使用する、（Ａ）におけるゲルのイムノプロット分析。

レーンは（Ａ）における順序である。

タンパク質の転移およびフィルターのブロッキングは（Ｂ）におけるように実施した。次いでフィルターを０．２５％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中のｌＧ１２細胞上澄み液の１＝５希釈物と一夜インキユベーションした。結合した抗体の検出は（Ｂ）におけるように実施した。

（Ｄ）ｇａｐ、−ｇａｇｌｌｏ融合タンパク質の記載。

第２図エイズ患者（レーンａ）またはモノクローナル抗体ｌＧ１２　（レーンｂ）からのヒト血清を使用して、ＨＩＶ−１の完全なウィルスのタンパク質のイムノプロット分析。

ツババス（Ｎｏｖａｐａｔｈ）イムノプロットのストリップ［バイオラド（ＢＩＯＲＡＤ）　、米国カリフォルニア州すッチモンド］を、（ａ）１２５％のＢＳＡを含有するＰＢＳの中のエイズ患者からのヒト血清の１　＋　１００希釈物またはＣｂ’）０．２５％のＢＳＡを含有するＰＢＳの中のｌＧ１２細胞の上澄み液の１：４希釈物と、室温において１時間インキュベーションした。結合した抗体の検出は第１Ｂ図におけるように実施した。

第３図それは非還元性条件（レーン１．２．３）および還元性条件（レーン４．５）におけるモノクローナル抗体ｌＧ１２の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を表す。レーン＝１）分子量標準；２）ＩＧ１２腹水；３）精製したｌＧ１２；４）３）と同一：５）１）と同一。ゲル電気泳動は、ファスト（Ｐｈａｓｔ）−ゲル装置により１０〜１５％の勾配のファスト（Ｐｈａｓｔ）−ゲルを使用して製造業者の指示に従い実施した。クーマツシープルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ）Ｒ−２５０を染色のために使用した。

クーマツシー　抗Ｂ−Ｇａｉ　モノクロナール抗体ブルーの染色　イムノプロット　１Ｇ１２イムノプロツト一二ュ脇、≧−２＝要約書ＨＩＶ−１プロテアーゼにより小さい構造タンパク質に切断された、ｐ５５と命名する前駆体タンパク質に対して特異的反応性を示すモノクローナル抗体。本発明の抗体は、ｐ２４およびｐ１７の構造タンパク質を発生するＨＴＶ−１プロテアーゼによる切断部位に相当する、ｐ５５タンパク質のエピトープに対して特異的反応性を示す。特異的抗体は１５０．０００ダルトン程度の分子量をもつＩ　ｇＧ、タンパク質であり、これはハイブリドーマにより生産され、そしてこのハイブリドーマはｐ２４／ｐ１７切断部位を含むｐ５５断片を含有するクローニングされた融合されたタンパク質で免疫化された動物の牌細胞と骨髄腫細胞系との融合から誘導される。この特異的抗体は、ＨＩＶ−１の暴露のモニター、ｐ５５配列を含有する自然または合成のペプチドまたはｐ２４／ｐ１７切断部位を含むその断片の分離および精製、およびＨ［’−１プロテアーゼ阻害活性についての基質のスクリーニングに有用である。

国際調査報告国際調査報告ＥＰ　９１００９４７Ｓ＾　４７４８６

Claims

【特許請求の範囲】１、ｐ２４／ｐ１７ＨＩＶ−１プロテアーゼ切断部位を含有するエピトープに対するその特異性により特徴づけられる、ＨＩＶ−１ｇａｇタンパク質前駆体ｐ５５に対するモノクローナル抗体。２、さらに、ａ〕その分子量は１５０，０００ダルトン程度である、ｂ）それはＩｇＧ１クラスに属しそしてｋ型の軽鎖を有する、ｃ）ほぼ５×１０９Ｍ−１の値の親和性定数を有する、という事実により特徴づけられる請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。３、さらに、抗原としてｇａｇ−ｇａｇ１００融合タンパク質を使用して生産されたことを特徴とする、請求の範囲第１および２項記載の抗体。４、ハイブリドーマである請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の抗体を生産する細胞系。５、リンパ芽球様細胞または骨髄腫細胞を、ｐ２４／ｐ１７ＨＩＶ−１プロテアーゼ切断部位を含有するＨＩＶ−１ｇａｇタンパク質前駆体ｐ５５またはその断片に対して免疫化された動物の脾臓からの抗体生産性細胞と融合することによって誘導された請求の範囲第４項記載のハイブリドーマ。６、免疫化された動物が小さい哺乳動物、好ましくはラットまたはマウスであり、そして融合の相手がシンジェネイックである、請求の範囲第４および５項記載のハイブリドーマ。７、骨髄腫細胞系がＨＡＴ感受性非生産体のマウス骨髄腫細胞系Ｓｐ２／０−Ａｇ１４である請求の範囲第４〜６項のいずれかに記載のハイブリドーマ。８、免疫化剤がｐ５５断片を含有する組み換えＨＩＶ−ｇａｇ融合タンパク質であり、それはｐ２４およびｐ１７の一部分からなり、そしてβ−ガラクトシダーゼに結合したｐ２４／ｐ１７ＨＩＶ−１プロテアーゼ切断部位を含む、請求の範囲第４〜７項のいずれかに記載のハイブリドーマ。９、免疫化剤がｇａ１−ｇａｇ１１０融合タンパク質である請求の範囲第８項記載のハイブリドーマ。１０、（ｉ）マウスをｐ５５配列を含有するＨＩＶ−ｇａｇ融合タンパク質またはその断片で免疫化し、それはｐ２４およびｐ１７の一部分からなり、そしてβ −ガラクトシダーゼに結合したｐ２４／ｐ１７ＨＩＶ−１プロテアーゼ切断部位を含み；（ｉｉ）免疫化したマウスから脾細胞を回収し、そしてそれらをＨＡＴ感受性非生産体のマウス骨髄腫Ｓｐ２／０−Ａｇ１４と融合し；（ｉｉｉ）得られるハイブリッドを適当なイムノアッセイにより融合タンパク質のｐ５５部分に対するモノクローナル抗体の生産について試験し；（ｉｖ）前のアッセイに対して陽性の細胞をサブクローニングし；（ｖ）サブクローニングした細胞をエピトープの特異性について分析し、そしてより大きい培養のために融合タンパク質のｐ２４／ｐ１７ＨＩＶ−１プロテアーゼ切断部位に対して特異的に向けられた抗体を分泌するハイブリドーマを選抜し；（ｖｉ）この分野において通常使用されている方法に従い、特異的抗体を分離およひ精製することからなる、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のモノクローナル抗体の製造方法。１１、免疫化剤がｇａ１−ｇａｇ１１０融合タンパク質である請求の範囲第１０項記載の方法。１２、ＨＩＶ−１ｇａｇタンパク質前駆体ｐ５５またはｐ２４／ｐ１７ＨＩＶ− １切断部位を含有するその断片、ｐ５５の同一のアミノ酸配列を含有する自然または合成のポリペプチドまたはｐ２４／ｐ１７ＨＩＶ−１プロテアーゼ切断部位を含有するその断片を検出するための酵素イムノアッセイにおいて使用するための請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の抗体。１３、ＨＩＶ−１ｇａｇタンパク質前駆体ｐ５５またはｐ２４／ｐ１７ＨＩＶ− １切断部位を含有するその断片、ｐ５５の同一のアミノ酸配列を含有する自然または合成のポリペプチドまたはｐ２４／ｐ１７ＨＩＶ−１プロテアーゼ切断部位を含有するその断片の分離および精製のための請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の抗体の使用。１４、請求の範囲第１３項記載の分離および精製のための親和性マトリックスにおける請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の抗体の使用。１５、ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害活性のスクリーニングにおいて使用するための請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の抗体。１６、抗体をサンドイッチＥＬＩＳＡ型アッセイにおいて使用するための請求の範囲第１５項記載の抗体。１７、ＨＩＶ−１の暴露の診断およびモニターにおいて使用するための請求の範囲第１５項記載の抗体。１８、ＨＩＶプロテアーゼ阻害活性について試験すべき試料が、細胞の抽出物、微生物の発酵プロス、植物を包含する生物学的物質の合成または自然の産生物または抽出物を含有する溶液から選択される請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のモノクローナル抗体の使用。１９、（ａ）試験すべき試料をＨＩＶ−１プロテアーゼおよびｐ５５断片を含有するＨＩＶ−ｇａｇ融合タンパク質とインキュベーションし、それはｐ２４およびｐ１７の両者の一部分からなりそして、マーカー酵素、好ましくはβ−ガラクトシダーゼに結合したｐ２４／ｐ１７ＨＩＶ−１プロテアーゼ切断部位を含み、（ｂ）反応混合物を請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の固定化したモノクローナル抗体とインキュベーションし、（ｃ）生ずる反応混合物を固定化した抗体から分離し、（ｄ）融合タンパク質のマーカー酵素部分の反応成分、好ましくはβ−ガラクトシダーゼ発色性基質を固定化したモノクローナル抗体に添加し、（ｅ）ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害活性を、マーカー酵素の定量により、潜在的阻害因子を含有しないプランクの試料と比較して測定する請求の範囲第１８項記載の使用。２０、ＨＩＶ−ｇａｇ融合タンパク質がｇａｌ−ｇａｇ１１０融合タンパク質である請求の範囲第１９項記載の使用。２１、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の選択的抗体を他の試薬および分析のアッセイの実施に必要な手段と関連してを含有する、請求の範囲第１２、１５、１６、１７、１８、１９および２０項のいずれかを使用するキット。