DE69030920T2

DE69030920T2 - Verfahren zur herstellung von pai-2

Info

Publication number: DE69030920T2
Application number: DE69030920T
Authority: DE
Inventors: Clive Leighton West Ryde Nsw 2114 Bunn; Michael Andrew Belrose Nsw 2085 Richardson; Peter Lawrence Glebe Nsw 2037 Whitfeld
Original assignee: Biotech Australia Pty Ltd
Current assignee: Biotech Australia Pty Ltd
Priority date: 1989-09-05
Filing date: 1990-09-04
Publication date: 1998-02-19
Anticipated expiration: 2010-09-05
Also published as: CA2041638A1; NZ235182A; ES2104610T3; EP0446315B1; ATE154362T1; KR920701436A; EP0446315A1; CA2041638C; DK0446315T3; AU6283190A; JPH04502108A; AU629980B2; WO1991003556A1; US5298400A; EP0446315A4; DE69030920D1

Description

Die Erfindung betrifft die verstärkte Sekretion von PAI-2, rekombinante Polynucleotidkonstrukte, die sich für die verstärkte Sekretion von PAI-2 eignet, sowie ein synthetisches Signalpeptid, das bei der Herstellung von glycosyliertem, sezerniertem PAI-2 verwendet wird.
BTA 1445, ein E.coli-Stamm mit einem für PAI-2 codierenden Konstrukt, wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA, am 11. Februar 1987 unter der Eingangsnummer ATCC 53585 gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt.
Bei dem Plasminogenaktivator (PA)-Inhibitortyp 2 (PAI-2) handelt es sich um eine von vier immunologisch unterschiedlichen Gruppen vön PA-Inhibitoren. PA-Inhibitoren gehören zu der Serpin-Genfamilie.
PAI-2, das auch als Minactivin bezeichnet wird, wurde aus der Human-Monocytenzellinie U937 (Internationale Patentanmeldung ACT/AU85/00191, veröffentlicht als W086/01212 sowie PCT/AU87/00068, veröffentlicht als W087/05628) isoliert. Es wurde auch in Schwangerschaftsplasma und in dem konditionierten Medium verschiedener Humanzellinien, darunter peripheralen Blutmonocyten, HT-1080-Fibrosarcomzellen und HEP3-Larynxkarzinomzellen nachgewiesen.
Aufgrund ihres Molekulargewichts wurden unterschiedliche Arten von PAI-2 bestimmt:
Eine Form mit 46kDist nicht glycosyliert und in erster Linie mit Zellen assoziiert. Diese Form wurde in Lysaten von U937-Zellen gefunden und aus dem konditionierten Medium von mit Phorbolester (PMA) stimulierten U937-Zellen isoliert (Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/AU87/00068).
Weiter wurde eine glycosylierte Form mit 60kD gefunden, die von U937-Zellen sezerniert wird (Genton et al., 1987) sowie im mütterlichen Plasma schwangerer Frauen vorhanden ist (Lecander und Astedt, 1986).
Die nichtglycosylierte intrazelluläre Form mit 46kDmacht 80-90% des in U937-Zellen (Genton et al., 1987) und HT-1080-Zellen (Medcalf et al., 1988) synthetisierten PAI-2 aus.
Aus einer Untersuchung der Primäraminosäuresequenz von PAI-2 geht hervor, daß bei dem Molekül die typischen transienten Signalpeptide, die sich normalerweise am Amino(NH&sub2;)-terminalen Ende sezernierter Proteine befinden, fehlen. Obwohl das NH&sub2;-terminale Ende der gereinigten 46kD-Form von PAI-2 aus U937-Zellen nicht bestimmt worden ist, angeblich weil es blockiert ist (Kruithof et al., 1986), wurde berichtet, daß das NH&sub2;-terminale Ende des glycosylierten Typs mit 60kD den Initiator Methionin darstellt (Rest 1, Ye et al., 1988). Dies läßt darauf schließen, daß die Sekretion ohne Abspaltung eines Signalpeptids von PAI-2 stattfindet. Die Art und Weise, auf die PAI-2 durch die Zelle transportiert wird, ist bis jetzt unbekannt, es wurde jedoch ein internes Signal vorgeschlagen (Ye et al., 1988).
Wie dies bei den meisten hochwirksamen biologisch aktiven Proteinen der Fall ist, wird PAI-2 in sehr kleinen Mengen in vivo produziert und ist so auf üblichem biochemischem Weg schwer zu reinigen und zu charakterisieren. Dadurch, daß man vor kurzem das PAI-2-Gen kloniert und in Bakterienzellen exprimiert hat (Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/AU87/00068), kann man nun größere Mengen an gereinigtem 46kd-PAI-2, das für die Auswertung der biologischen Wirksamkeit für klinische Zwecke erforderlich ist, produzieren. Dieses aus Bakterien stammende Material ist jedoch weder glycosyliert noch ähnlich wie bei von Humanzellen sezerniertem Material posttranslationell modifiziert. Es ist daher wünschenswert, glycosylierte Formen von PAI-2 mit Hilfe von transfizierten Säugetierzellen zu produzieren, da sich die beiden PAI-2-Formen bezüglich ihrer biologischen Wirksamkeit, z.B. Bindungsaffinität für Urokinase, PA-Spezifität, Immunogenität, in-vivo-Halbwertszeit usw., unterscheiden können.
Das native PAI-2-Gen ist bereits in mehreren heterologen Säugetierexpressionssystemen exprimiert worden (Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/AU87/00068). Obwohl PAI-2 in diesen Systemen synthetisiert wird, sind die Expressionsniveaus niedrig, und der Großteil des Produkts (ungefähr 90%) ist nichtglycosyliert und intrazellulär In dieser Form produzier tes PAI-2 ist ein geeignetes Molekül für prophylaktische, therapeutische und/oder diagnostische Verwendungszwecke, seine Verwendung ist jedoch durch die erhältlichen Mengen und die beschränkte Glycosylierung beschränkt. Es besteht daher weiterhin ein Bedarf an wirksamer Sekretion des glycosylierten 60kD-Moleküls um das Molekül im klinischen Maßstab für prohylaktische, therapeutische und/oder diagnostische Zwecke verwenden zu können.
Die Forscher haben nicht nur versucht, PAI-2 in Säugetierzellen zu exprimieren (Internationale Patentanmeldung Veröf fentlichungs-Nr. WO-A-8705628), sondern auch, die 60kD-Form von PAI-2 zu sezernieren. Eine schwedische Gruppe versuchte, PAI-2 von transfizierten CHO-Zellen zu sezernieren, konnte jedoch keine Sekretion des 60kD-PAI-2 nachweisen (Ny et al., 1988, Ny et al, 1989). Von einer Schweizer Gruppe wurde versucht, PAI-2 unter Verwendung von transfizierten PAI-2-Zellen zu sezernieren, aber es wurde ebenfalls gefunden, daß der Großteil des PAI-2-Materials zu der intrazellulären Form gehörte. Obwohl in dem Kulturmedium eine gewisse Menge an Material mit hohem Molekulargewicht beobachtet wurde, wurde nicht nachgewiesen, daß das Material glycosyliert war (Behn, D., Wohlwend, A. und Vassalli, J.D. (1989); Behn, D., Wohlwend, A., Schleuning, W-D, Kruithof, E.K.O. und Vassalli, J.D. (1989)). Da sich die Mobilität des Materials von PAI-2 mit hohem Molekulargewicht aus U937 unterschied, könnte es teilweise glycosyliert gewesen sein.
Aus früheren Untersuchungen geht hervor, daß bei Erweiterung des NH&sub2;-terminalen Endes eines Cytoplasma-Proteins um eine heterologe hydrophobe Signaldomäne unter Umständen zu einer Verlagerung des Cytoplasma-Proteins durch das endoplasmatische Retikulum hindurch führen kann (Hiebert und Lamb, 1988). Eine Verlagerung durch das ER hindurch ist der erste Schritt bei der Sekretion. Von der Art des heterologen Signal peptids (z.B. ob es von dem Protein abgespalten wurde oder nicht) und den Eigenschaften, die dem Cytoplasma- Protein innewohnen (z.B. Vorhandensein anderer Transportsignale oder Signale für die Retention der Membran) hängt es dann ab, ob das chimärische Protein sezerniert, an einer Zellmembran verankert oder abgebaut wird.
Aufgrund der Kompliziertheit des Sekretionsmechanismus ist es nicht möglich, ein nichtglycosyliertes Cytoplasma-Molekül in ein sezerniertes glycosyliertes Molekül auf vorhersagbare Weise umzuwandeln. Auch wenn durch Hinzufügen einer Signalsequenz ein Cytoplasma- Molekül sezerniert wird, so kann doch das Processing (z.B. Abspaltung) der hinzugefügten Signalsequenz an unterschiedlichen, nicht vorhersagbaren Stellen stattfinden.
Die an den meisten sezernierten Proteinen zu beobachtenden trans ienten NH&sub2;- terminalen Signalsequenzen sind durch drei unterschiedliche Regionen gekennzeichnet, nämlich eine basische N-terminale Region, die geladene Reste enthalten kann, einen hydrophoben Mittelteil und eine die Erkennungsstelle für die Signalpeptidase enthaltende C-terminale Region.
Für die Erkennung von Signalpeptidasen existiert keine Konsens-Sequenz, obwohl von Heijne (1986) Regeln erarbeitet hat, die viele bekannte Spaltstellen berücksichtigen. Die Anwendung dieser Regeln gestattet jedoch nicht zwingend eine Vorhersage von Spaltstellen, wenn sie auf Cytoplasma-Moleküle mit heterologen Signalsequenzen angewandt werden.
Die Glycosylierung und Sekretion von PAI-2 in humanen U937-monocyten Zellen wurde von Ye, R.D. et al (J. Biol. Chem. 263 Nr. 11: 5. 4869-4875 (1988)) untersucht.
Die Klonierung von PAI-2 ist in mehreren Publikationen veröffentlicht (EP-A-0278696; J. Biol. Chem. 264: S. 5495-5502, (1989), DE-A-3722673, DE-A-3713272 und J. Biol. Chem. 262: S. 3718-3725 (1987)). PAI-2-spezifische Antikörper sind auch in DE-A-3722673 und DE-A-3713272 veröffentlicht worden.
In FR-A-2611723 wird die Verwendung des Signalpeptids von humanem α-1-Antitrypsin bei der Sekretion von Hirudin beschrieben.
In JP-A-63233789 werden Signalpeptide beschrieben, die auf dem natürlichen Signalpeptid von Albumen- Lysocym beruhen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung erleichtert die Erweiterung von PAI-2 um ausgewählte oder entwickelte Signalsequenzen nicht nur die Sekretion der glycosylierten 60kD-Form von PAI-2, sondern steuert auch das richtige Processing des Signals. Außerdem wurde durch Verwendung dieser Signalsequenzen PAI-2 entweder mit oder ohne seinen N-terminalen Methioninrest sezerniert.

Definitionen

In der gesamten Beschreibung beziehen sich die Ausdrücke "PAI-2-Variante" und "Variante von PAI-2" auf ein Molekül, das sich von PAI-2 durch Veränderung des NH&sub2;-terminalen Endes ableitet, um eine wirksame Signalsequenz für die Sekretion des glycosylierten Moleküls aus einer Wirtszelle zur Verfügung zu stellen.
Der im vorliegenden Zusammenhang verwendete Ausdruck "parenteral" beinhaltet subcutane Injektionen und intravenöse oder intramuskuläre Injektions- oder Infusionstechniken.
Der in der gesamten vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck "synthetische Signalpeptide" bezieht sich auf ein durch Translation einer synthetisierten Oligodesoxyribonucleotidsequenz in vitro oder in vivo hergestelltes Peptid.
In einer ersten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem, glycosyliertem, sezerniertem PAI-2 oder rekombinantem, glycosyliertem, sezerniertem PAI-2 ohne das N-terminale Methionin zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren umfaßt, daß man:
ein Konstrukt bereitstellt, das ein erstes Polynucleotidmolekül umfaßt, das PAI-2 oder PAI-2 ohne das N-terminale Methionin kodiert;
ein Polynucleotidmolekül, das eine transiente Signalsequenz kodiert, so an das 5'-Ende des ersten Polynucleotidmoleküls anheftet, daß das entstehende Hybridprotein, das von dem Konstrukt exprimiert wird, aus einer transienten Signalsequenz, die an das NH&sub2;-Ende von PAI-2 oder PAI-2 ohne das N-terminale Methionin gebunden ist, besteht; und das Konstrukt in einer eukaryontischen Wirtszelle exprimiert, wobei die transiente Signalsequenz augewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Aminosäuresequenz Met Lys Cys Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ala Phe Val Pro Leu Val Arg Ala und dem Signalpeptid des Proteins α-1-Antitrypsin.
Das Signalpeptid kann entweder an das N-terminale Methionin von PAI-2 geheftet werden, oder das N-terminale Methionin kann deletiert und das Signalpeptid an den nächsten Rest, nämlich Glutaminsäure, angeheftet werden.
Das Signalpeptid ist dergestalt, daß es während der Verlagerung des PAI-2-Moleküls durch das endoplasmatische Retikulum der Wirtszelle hindurch abgespalten werden kann.
Bei dem Signalpeptid kann es sich um ein synthetischessignalpeptid handeln.
Im allgemeinen ist die synthetische Signalsequenz dergestalt, daß sie über drei unterschiedliche Regionen verfügt - eine basische N-terminale Region, die geladene Reste enthalten kann, einen hydrophoben Mittelteil und eine die Erkennungsstelle für die Signalpeptidase enthaltende C-terminale Region. Sollen Signalpeptidase-Spaltstellen entworfen werden, so kann man das Verfahren von von Heijne (1986) zu Hilfe ziehen.
Ein bevorzugtes synthetisches Peptid lautet:
M K C L L L A L G L L A F V P L V R A
wie in SEQ ID-Nr. 1 beschrieben.
Das Signalpeptid kann auf natürliche Weise vorkommen.
Bei einem bevorzugten natürlichen Signalpeptid handelt es sich um das Signalpeptid aus dem. Protein humanes α-1-Antitrypsin:
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA
wie in SEQ ID Nr. 2 beschrieben.
In einer zweiten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird das folgende synthetische Signalpeptid zur Verfügung gestellt:
MKCLLLALGLLAFVPLVRA (SEQ ID-NR. 1)
In einer dritten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird ein Polynucleotid-Molekül- oder -Konstrukt zur Verfügung gestellt, das eine wie in der ersten Ausgestaltung definierte PAI-2-Variante kodiert.
Bei dem Polynucleotid-Molekül oder -Konstrukt handelt es sich vorzugsweise um ein DNA-Molekül.
Die signalcodierenden Sequenzen werden vorzugsweise mittels DNA-Synthese hergestellt, und zwar unabhängig davon, ob es sich um synthetische oder natürlich vorkommende Signalsequenzen handelt.
Das rekombinante DNA-Molekül kann ein Polynucleotid-Molekül gemäß der dritten Ausgestaltung, wobei es sich um ein DNA-Molekül handelt, sowie Vektor-DNA enthalten.
Bei der Vektor-DNA handelt es sich typischerweise um Plasmid-DNA.
Zu bevorzugten erfindungsgemäßen Plasmidvektoren gehören pGEM4Z und pSVL.
Eine Wirtszelle kann vorteilhaft mit einem wie oben beschriebenen rekombinanten DNA-Molekül transformiert werden.
Die Wirtszellinie kann von eukaryontischen Organismen stammen, z.B. Affennieren-COS-Zellen, der Affennieren-Zellinie Vero, Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), der humanen histiocytischen Lymphom-U937-Zellinie, Derivaten von CHO-K1-Zellen, zum Beispiel DG44, der Hamsternieren-Zellinie BHK-21, der Humannieren-Zellinie 293, der Linie HeLa S3, die von einer Human-Epithelzelle stammt, und der humanen Monocyten-Zellinie HL6O, sowie Zellinien, die von den Insekten Spodoptera frugiperda und Bombyx mori stammen.
Die Transformation wird vorzugsweise nach dem Calciumphoshphatverfahren oder mittels Elektroporation durchgeführt.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt die 414 Aminosäuren umfassende Form von PAI-2 ohne das N-terminale Methionin des nativen PAI-2 in glycosylierter Form zur Verfügung. Außerdem stellt die Erfindung rekombinantes, glycosyliertes, sezerniertes 60kD-PAI-2 zur Verfügung.
Zu den erfindungsgemäßen Verfahren gehören: ein Verfahren zur Herstellüng eines wie oben beschriebenen rekombinanten DNA-Moleküls, wobei man ein DNA-Molekül gemäß der dritten Ausgestaltung in eine Vektor-DNA insertiert;
ein Verfahren zur Herstellung einer wie oben beschriebenen transformierten Wirtszelle, wobei man eine Wirtszelle für die Transformation kompetent macht und diese kompetente Wirtszelle mit einem wie oben beschriebenen rekombinanten DNA-Molekül transformiert; sowie
ein Verfahren zur Herstellung eines wie oben definierten PAI-2-Moleküls, wobei man eine wie oben beschriebene transformierte Wirtszelle kultiviert und das Expressionsprodukt von der Kultur abtrennt.
Die Expressionsprodukte der PAI-2-Varianten, nämlich die 414 Aminosäuren umfassende Form von PAI-2 und rekombinantes glycosyliertes sezerniertes 60kD-PAI-2, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, eignen sich zur Anwendung in folgenden Gebieten:
Therapie, Prophylaxe und Diagnose von Entzündungskrankheiten;
Therapie, Prophylaxe und Diagnose von Krebsmetastasen und -ausbreitung;
Therapie von Krisensituationen bei Transplantatund Plazentaabstoßungen sowie bei Transplantatgegen-Empfänger-Reaktionen;
Therapie und Diagnose von Autoimmunkrankheiten und Krankheiten im Zusammenhang mit überschüssiger Sauerstoffradikalbildung;
Therapie und Prophylaxe von Wund- und Knochenheilungsstörungen, Gewebsschäden bei oder nach akuter Reperfusion sowie subarachnoidalen Blutungsstörungen;
als topische Medikamente zur Förderung der Fibrinadhäsion zur Förderung der Heilung von Wunden und Verbrennungen;
Behandlung von Asthma sowie Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten im Zusammenhang mit hoher Leukozytenaktivität; sowie
Hemmung des Monocyten-Macrophagen-Systems.
Als Beispiele für die oben genannten Krankheitstypen können im einzelnen genannt werden:
Rheumatoide Arthritis
Osteoarthritis
Colitis ulcerosa
systemischer Lupus erythematosus
multiple Sklerose
Psoriasis
Pemphigus
Hornhaut- und Zwölffingerdarmgeschwüre
Purpura
Peridontitis
Muskeldystrophie
Die Menge an Expressionsprodukt, 60kD-glycosyliertes sezerniertes rekombinantes PAI-2 oder die 414-Aminosäureform von PAI-2, die mit dem Träger zwecks Erhalt einer Einzeldosisform kombiniert werden kann, hängt von der behandelten Krankheit, dem zu behandelnden Subjekt sowie der jeweiligen Verabreichungsart ab.
Es ist auch klar, daß die jeweilige Dosierung für einen bestimmten Patienten von verschiedenen Faktoren, darunter der Aktivität des jeweiligen verwendeten Proteinprodukts oder Antikörpers, dem Alter, dem Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht, der Ernährung, dem Verabreichungszeitpunkt, dem Verabreichungsweg, der Exkretionsrate, der Arzneistoffkombination, dem jeweiligen behandelten Zustand sowie der Schwere der jeweiligen behandelten Krankheit abhängt.
Die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Zusammensetzung kann parenteral oder topisch oder möglicherweise über die Schleimhaut in Einzeldosisformulierungen verabreicht werden, die je nach Wunsch übliche nichttoxische, pharmazeutisch unbedenkliche Träger, Streckmittel, Hilfsstoffe und/oder Exzipienten enthalten.
Injektionspräparate, zum Beispiel sterile wäßrige oder ölige Injektionssuspensionen, können nach dem Stand der Technik unter Verwendung von geeigneten Dispersionsoder Netzmitteln und Suspendiermitteln formuliert werden.
Bei dem sterilen Injektionspräparat kann es sich auch um eine sterile Injektionslösung oder -suspension in einem nichttoxischen parenteral unbedenklichen Streck- oder Lösungsmittel, zum Beispiel eine Lösung in 1,3-Butandiol, handeln. Zu den unbedenklichen Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, gehören Wasser, Ringersche Lösung sowie isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich werden üblicherweise sterile fixierte Öle als Lösungsmittel oder Suspensionsmedium verwendet. Zu diesem Zweck können beliebige nichtaggressive fixierte Öle, darunter auch synthetische Mono- oder Diglyceride, verwendet werden. Außerdem können Fettsäuren wie Ölsäure zur Herstellung von Injectabilia verwendet werden.
Unter dem Begriff "pharmazeutisch unbedenklicher Hilfsstoff" sind entweder die zur Verabreichung an den Menschen geeigneten Standardzusammensetzungen oder die typischen, zur Impfung von Tieren verwendeten Hilfsstoffe zu verstehen.
Zur Zeit ist jedoch Alaun der einzige registrierte Hilfsstoff zur Verwendung am Menschen, es wird jedoch an weiteren Hilfsstoffen für die Verwendung am Menschen gearbeitet und man nimmt an, daß sich diese weiteren Hilfsstoffe zur Verwendung bei der Herstellung von erfindungsgemäßen Zusammensetzungen für die Impfung von Menschen eignen würden.
Geeignete Hilfsstoffe für die Impfung von Tieren umfassen Ölemulsionen wie Freundsches Adjuvans (vollständig oder unvollständig (nicht zur Verwendung an Nutztieren geeignet), Marcol 52: Montanide 888 (Marcol ist ein Warenzeichen von Esso, Montanide ist ein Warenzeichen von SEPPIC, Paris), Squalan oder Squalen, Adjuvans 65 (enthält Erdnußöl, Mannidmonooleat und Aluminiummonstearat), mineralische Gele wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Calciumphosphat und Alaun, oberflächenaktive Mittel wie Hexadecylamin, Octadecylamin, Lysolecithin, DimethyldioctadecylamMonbromid, N,N-Dioctadecyl-N',N'-bis (2-hydroxyethyl)propandiamin, Methoxyhexadecylglycerin und Pluronic-Polyole, Polyanionen wie Pyran, Dextransulfat, Polyacrylsäure und Carbopol, Peptide und Aminosäuren wie Muramyldipeptid, Dimethylglycin, Tuftsin und Trehalosedimycolat, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein. Die erfindungsgemäßen Expressionsprodukte können auch nach Einbau in Liposomen oder andere Mikroträger oder nach Bindung an Polysaccharide, Proteine oder Polymere oder in Kombination mit Quil-A unter Bildung von "Iscoms" (immunstimulierende Komplexe) (Morein et al., Nature 308, 457-460 [1984]) verabreicht werden. Weitere Hilfsstoffe, die sich für die erfindungsgemäße Verwendung eignen, umfassen Konjugate aus dem Expressionsprodukt und einem membranständigen Protein prokaryontischen Ursprungs, wie z.B. Trat. (Siehe PCT/AU87/00107)
Sowohl Verabreichungswege als auch zu verabreichende Dosen und Häufigkeit der Injektionen sind Faktoren, die auf der Basis von normalem Fachwissen optimiert werden können. Der Erstimpfung folgt bzw. folgen typischerweise einige Wochen später eine oder mehrere Auffrischungsimpfungen, wobei das Endresultat die Produktion hoher Antikörpertiter gegen das Immunogen ist.
Zusammensetzungen für die topische Verabreichung umfassen Cremen, Salben und Pasten. Die die Salbenbasis darstellenden Bestandteile (z.B. Petrolatum, Wachse) werden zusammengeschmolzen, Arzneimittelbestandteile in Pulverform werden zugegeben, und das Ganze wird unter Kühlen geruhrt. Im allgemeinen wird das Produkt dann durch eine Walzenmühle gegeben, so daß man die für den dispergierten Feststoff erwünschte Teilchengrößenordnung erzielt. Bei Pasten handelt es sich um Salben mit einem relativ hohen dispergierten Feststoffanteil; die Herstellung ist ähnlich.
Bei Cremen handelt es sich um halbfeste Emulsionen, und zwar entweder Wasser-in-Öl- oder Öl-in-Wasser- Emulsionen. Ein fester Bestandteil kann der geeigneten Phase vor dem Emulgieren zugefügt werden oder zu einem bestimmten Zeitpunkt nach dem Emulgierschritt dispergiert werden. Zu den topischen Dosisformen gehören scheibenförmige Arzneiformsysteme, die für die transdermale Abgabe von therapeutischen Agentien verwendet wurden. Sie gestatten eine einheitliche und protrahierte Arzneistofffreisetzung.
Bei Patienten, die an bestimmten Krankheitszuständen leiden, wäre es wünschenswert, die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen entweder oral, rektal oder möglicherweise sogar vaginal zu verabreichen. Auf diese Art verwendbare Zusammensetzungen könnten folgendermaßen hergestellt werden:
Zäpfchen für die rektale oder vaginale Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung können dadurch hergestellt werden, daß man die Zusammensetzung mit einem geeigneten nichtreizenden Exipienten wie Kakaobutter, Kakaoöl, glycerinierter Gelatine oder Polyethylenglykolen, die bei Normaltemperaturen fest, jedoch bei der Rektal- oder Vaginaltemperatur oder durch Kontakt mit in der jeweiligen Körperhöhle vorhandenen Flüssigkeiten flüssig sind und die daher im Rektum bzw. in der Vagina schmelzen und den Arzneistoff freisetzen, vermischt.
Feste Arzneiformen für die orale Verabreichung können Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granulate umfassen. Bei solchen festen Arzneiformen können Expressionsprodukte, rekombinantes glycosyliertes sezerniertes 60kD-PAI-2 oder die 414-Aminosäurenform von PAI-2 mit mindestens einem inerten Streckmittel wie Saccharose, Lactosestärke oder hydrolysierter Gelatine vermischt werden. Solche Arzneiformen können außer inerten Streckmitteln auch weitere Substanzen, z.B. Schmiermittel wie Magnesiumstearat, enthalten, was normalerweise der Fall ist. Bei Kapseln, Tabletten und Pillen können die Arzneiformen auch Puffersubstanzen enthalten. Tabletten und Pillen können außerdem mit magensaftresistenten Überzügen versehen werden.
Flüssige Arzneiformen für die orale Verabreichung können Nanopartikel, Mikrokapseln, LTB-Konjugate, Cholera oder deren Untereinheit B als Konjugat oder auch Vitamin- B12-Konjugate in pharmazeutisch unbedenklichen Emulsionen, Sirupen, Lösungen, Suspensionen und Elixieren, die üblicherweise in diesem Gebiet verwendete Streckmittel wie z.B. Wasser enthalten, umfassen. Solche Zusammensetzungen können auch Hilfsstoffe wie Netzmittel, Emulgatoren, Suspensionsmittel oder Trat in Konjugatform, Süßstoffe, Geschmacks- und Aromastoffe, darunter auch Zucker wie Saccharose, Sorbit, Fruktose usw., Glykole wie Polyethylenglykol, Propylenglykol usw., Öle wie Sesamöl, Olivenöl, Sojaöl usw., antiseptische Substanzen wie Alkylparahydroxybenzoat usw. sowie Geschmackstoffe wie Erdbeergeschmack, Pfefferminz usw. enthalten.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte gestatten die Expression von sezernierten und glycosylierten PAI-2-Formen.
Die Erfindung soll nun unter Bezugnahme auf die unten stehenden Zeichnungen genauer beschrieben werden, wobei in diesen Zeichnungen folgendes dargestellt ist:
Figur 1 und SEQ ID-Nr. 5 bis 10 zeigen die Sequenz der Oligonucleotide und kodierten Signalpeptide, die bei der Konstruktion der in-vitro- und in-vivo-PAI-2- Expressionsvektoren verwendet werden.
Figur 2 zeigt die Konstruktion der in-vitro Expressionsvektoren:
A: pBTA 821 mit dem PAI-2-Gen ohne Signal
B: pBTA 822 mit dem PAI-2-Gen mit synthetischem Signal
C: pBTA 823 mit dem PAI-2-Gen mit einem α-1-Antitrypsinsignal
Figur 3 zeigt die Konstruktion von Säugetierzellexpressionsvektoren:
A: pBTA 824 mit dem PAI-2-Gen ohne Signal
B: pBTA 825 und pBTA 827 mit dem PAI-2-Gen mit synthetischem Signal
C: pBTA 826 und pBTA 828 mit dem PAI-2-Gen mit α-1- Antitrypsinsignal
D: pBTA 839 mit dem PAI-2-Gen mit synthetischem Signal
Figur 4 zeigt die in einem zellfreien System translatierten und elektrophoretisch an SDS-PAG gereinigten Produkte des PAI-2-Gens und Signalvarianten.
Figur 5 zeigt in transfizierten Säugetierzellen exprimierte PAI-2-Gene und Signalvarianten. Aliquote Teile des Mediums wurden mit einem Anti-PAI-2-Antikörper immungefällt, und die Fällungsprodukte wurden an SDS-PAG laufengelassen.
Figur 6 zeigt die Bindung von Urokinase an von transfizierten COS-Zellen sezerniertem, mit Anti-PAI-2- Antikörpern immungefälltem und durch SDS-PAG elektrophoretisch gereinigtem PAI-2.
Figur 7 und SEQ ID-Nr. 11 zeigen die DNA und die Aminosäuresequenzen von prea-PAI-2 gegenüber PAI-2 plus synthetischem Signal. Die Aminosäuren in Blockbuchstaben stellen die Signalsequenz dar.
Figur 8 und SEQ ID-Nr. 12 zeigen die DNA- und Aminosäuresequenzen von preb-PAI-2- gegenüber PAI-2 plus α-1-Antitrypsinsignal. Die Aminosäuren in Blockbuchstaben stellen die Signalsequenz dar.
Figur 9 zeigt die Verdauung des von transfizierten COS-Zellen sezernierten 60000Mr-PAI-2 mit verschiedenen Glycosidasen. Die Produkte wurden mittels SDS-PAGE getrennt.
Figur 10 zeigt die Radioaktivitätspeaks, die während wiederholter Edman-Abbauzyklen an markiertem 60000Mr-PAI-2 freigesetzt wurden, wobei dieses 60000Mr- PAI-2 von mit
A: pBTA 825 (mit dem PAI-2-Gen mit synthetischem Signal)
B: pBTA 826 (mit dem PAI-2-Gen mit alpha-1-Antitrypsinsignal)
transfizierten COS-Zellen sezerniert worden war.
Figur 11 zeigt die Sekretion des 60000Mr-PAI-2 in das Medium, und zwar aus einer stabil mit pBTA 827 transfizierten CHO-K1-Zellinie. Das PAI-2 wurde aus dem Mediumimmungefällt und anschließend mittels SDS-PAGE in Fraktionen geteilt.
Die erfindungsgemäßen transformierten Wirtszellen und rekombinanten DNA-Moleküle werden nach Standardmethoden der Molekularbiologie hergestellt.
Gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Expressionsprodukte werden dadurch erhalten, daß man die erfindungsgemäßen transformierten Wirtszellen unter Standardbedingungen, die sich für die jeweilige Wirtszelle eignen, kultiviert und das Expressionsprodukt aus der Kultur nach Standardverfahren abtrennt. Das Expressionsprodukt kann in unreiner Form verwendet werden oder nach Standardverfahren gereinigt werden, was von dem jeweils hergestellten Expressionsprodukt abhängt.
Die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Zusammensetzung werden durch Mischen, vorzugsweise homogenes Mischen, des Expressionsprodukts, rekombinanten, sezernierten, glycosylierten 60kD-PAI-2 oder der 414-Aminosäurenform von PAI-2 mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger, Streckmittel, Exzipienten und/oder Hilfsstoff nach Standardverfahren der Galenik hergestellt.
Die zur Herstellung einer Einzeldosisform erforderliche Menge an Expressionsprodukt, rekombinantem, glycosyliertem, sezerniertem 60kD-PAI-2 oder der 414-Aminosäurenform von PAI-2 hängt von dem zu behandelnden Krankheitszustand, dem zu behandelnden Patienten und der jeweiligen Verabreichungsart ab. Das jeweilige Dosisniveau für einen beliebigen Patienten hängt von verschiedenen Faktoren ab, darunter der Aktivität des verwendeten Expressionsprodukts bzw. PAI-2-Moleküls, dem Alter, dem Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht und der Ernährung des Patienten, dem Verabreichungszeitpunkt, dem Verabreichungsweg, der Ausscheidungsrate, der Arzneistoffkombination und der Schwere der behandelten Krankheit.
Die Zusammensetzung kann parenteral oder topisch oder möglicherweise mittels Inhalationsspray, vaginal, oral oder rektal in Einzeldosisformulierungen verabreicht werden, die je nach Bedarf übliche nichttoxische pharmazeutisch unbedenkliche Träger, Streckmittel, Exzipienten und/oder Hilfsstoffe enthalten.
Antikörper werden in geeigneten Wirten unter Verwendung üblicher Impfbehandlungen erzeugt. Der Wirt wird mit einem Expressionsprodukt, rekombinanten, glycolyiserten, sezernierten 60kD-PAI-2 oder der 414-Aminosäurenform von PAI-2 oder einer nach einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Zusammensetzung geimpft.
Die Antikörperzusammensetzung wird durch Mischen, vorzugsweise homogenes Mischen, des Antikörpers mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger, Streckmittel, Exzipienten und/oder Hilfsstoff nach Standardverfahren der Galenik hergestellt.
Die zur Herstellung einer Einzeldosisform erforderliche Menge an Antikörper hängt von dem zu behandelnden Krankheitszustand, dem zu behandelnden Patienten und der jeweiligen Verabreichungsart ab. Das jeweilige Dosisniveau für einen beliebigen Patienten hängt von verschiedenen Faktoren ab, darunter der Aktivität des verwendeten Antikörpers, dem Alter, dem Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht und der Ernährung des Patienten, dem Verabreichungszeitpunkt, dem Verabreichungsweg, der Ausscheidungsrate, der Arzneistoffkombination und der Schwere der behandelten Krankheit.
Die Antikörperzusammensetzung kann parenteral in Einzeldosisformulierungen, die je nach Wunsch übliche nichttoxische pharmazeutisch unbedenkliche Träger, Streckmittel, Exzipienten und/oder Hilfsstoffe enthalten, verabreicht werden.
Diagnosebestecke werden dadurch hergestellt, daß man das Expressionsprodukt und/oder die Antikörper und/oder das rekombinante glycolysierte sezernierte 60kD-PAI-2 und/oder die 414-Aminosäurenform von PAI-2 in einer geeigneten Konzentration für die nachzuweisende(n) Substanz(en) mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger, Streckmittel, Exzipienten und/oder Hilfsstoff formuliert. Ein positiver Kontrollstandard, bei dem die Konzentration der nachzuweisenden Substanz bekannt ist, wird auf ähnliche Weise hergestellt. Der negative Stan dard enthält nur Träger,. Streckmittel, Exzipienten und/oder Hilfsstoff. Diagnosebestecke umfassen zum Beispiel ein Tumordiagnostikum, bei dem das Reagens Antikörper gegen das Expressionsprodukt enthält und die positive Kontrolle einen Expressionsproduktstandard in einer bekannten Konzentration enthält.
Es wurden zwei Varianten von PAI-2, die wirksam von Säugetierzellen sezerniert werden, konstruiert; beide enthalten ein NH&sub2;-terminales Signal, das während der Verlagerung durch das endoplasmatische Reticulum (ER) hindurch abgespalten werden soll. Bei einem dieser Signale handelt es sich um ein künstliches Signal, das gemäß der obigen Beschreibung der Signalpeptide konstruiert wurde. Es verfügt über die in SEQ ID-Nr. 1 dargestellte Sequenz:
MKCLLLALGLLAFVPLVRA
Bei dem zweiten Signal handelt es sich um das natürliche Signalpeptid aus dem Protein Human-α-1-Antitrypsin, wie in SEQ ID-Nr. 2 dargestellt:
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA
Es ist jedoch auch möglich, daß andere natürliche Signalpeptide, wenn diese mit dem NH&sub2;-terminalen Ende von PAI-2 fusioniert sind, auf analoge Weise wie das α-1- Antitrypsinsignal funktionieren können.
Die erste signalhaltige PAI-2-Variante wurde so konstruiert, daß das künstliche Signal mit dem NH&sub2;-terminalen Methionin von PAI-2 fusioniert war. Ein richtiges Processing dieses Signalpeptids in der Zelle sollte ein reifes PAI-2-Molekül mit 415 Aminosäuren und mit Met am NH&sub2;-terminalen Ende ergeben. Die zweite Variante von PAI-2 wurde dadurch konstruiert, daß man das Human-α-1- Antitrypsinsignalpeptid mit PAI-2 ohne dessen NH&sub2;-terminales Methionin fusionierte. Nach richtigem Processing in der Zelle sollte ein reifes PAI-2-Molekül mit 414 Resten und mit einem Glutaminsäurerest am NH&sub2;-terminalen Ende erzeugt worden sein. Einzelheiten der Konstruktion der Signal-PAI-2-Moleküle und ihre Expression sowohl in in-vitro- als auch in-vivo-Systemen sind unten beschrieben.
Als Alternative zum Anfügen von heterologen Signalpeptiden an PAI-2, um PAI-2 wirksam aus Säugetierzellen zu sezernieren, könnte man die native PAI-2-Sequenz modifizieren. Die ersten 22 Aminosäuren von PAI-2 enthalten einen Abschnitt hydrophober Reste, was für ein Signalpeptid charakteristisch ist. Aus den nachfolgend beschriebenen Versuchen geht jedoch hervor, daß sich dieser Bereich nicht wie ein typisches Signal verhält, d.h. daß er nicht die Verlagerung von PAI-2 durch das ER hindurch fördert. Da jedoch gewisse Mengen an hochmolekularern glycosylierten PAI-2 in Kulturmedien und Plasma gefunden wurden, könnten die Reste 1-22 ein unwirksames Signal darstellen. Die Hydrophobizität der NH&sub2;-terminalen 22 Reste von PAI-2 wird von 2 Asparaginsäureresten (Positionen 8 und 14), einem Lysin in Posi tion 17 und einem Histidin in Position 18 beeinträchtigt. Die in-vitro-Mutagenese dieses Bereiches zwecks Ersatz eines oder mehrerer dieser Reste mit einer stärker hydrophoben Aminosäure (z.B. Leu, Phe, Ala, Met, Thr, Ser, Ile, Val) könnte die Wirksamkeit, mit der dieser Bereich als Signalpeptid agiert, verbessern. Eine Erkennungsstelle für Signalpeptidase wird nach Ala&sub2;&sub2; vorhergesagt. Diese PAI-2-Varianten können daher ohne ihre ersten 22 Reste sezerniert werden. Obwohl dieser Bereich zwischen Mitgliedern der Serpingenfamilie konserviert ist, ist sein Vorhandensein möglicherweise nicht. für die biologische Aktivität von PAI-2 erforderlich.

Konstruktion von Vektoren für die Expression von Signal- PAI-2-Varianten

Bezüglich Einzelheiten der verwendeten DNA- Rekombinationstechniken siehe Maniatis et al (1982). Die für die Signalpeptide kodierenden Oligonucleotide (Figur 1 sowie SEQ ID-Nr. 5 bis 10) wurden mit einem DNA-Synthesizer von Applied Biosystems (Modell 380A) synthetisiert und über ein Polyacrylamidgel gereinigt. Die komplementären Oligonucleotide (A1 und A2 [SEQ ID-Nr. 5 und 6] oder B1 und B2 [SEQ ID-Nr. 7 und 8] oder C1 und C2 [SEQ ID-Nr. 9 und 10]) wurden in einem molaren Verhältnis von 1:1 vermischt und mit 5 Einheiten T4-Polynucleotidkinase in 65mM Tris-Cl pH 7,5, 10mM MgCl&sub2;, 5mm Dithiotreit und 1mM ATP phosphoryliert. Die Mischung wurde 3 Minuten auf 100ºC erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um reassozueren zu lassen.
Die reassozuerten Signalpeptidoligonucleotide wurden mit den für PAI-2 kodierenden Sequenzen ligiert und in die Vektoren pGEM4Z (Promega), pSVL (Pharmacia) pBTA6L3 und pBTA830 kloniert. Der erste Vektor, pGEM4Z, kann für die Expression von Genprodukten in einem zellfreien Transkriptions/Translationssystem verwendet werden; pSVL kann für die transiente Expression in Affennieren-COS-Zellen verwendet werden; pBTA6L3 und pBTA830 sind Vektoren, die selektiert und stabil in Säugetierzellinien wie Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), Vero, BHK und U937 integriert werden können. Die Signal-PAI-2-Genkonstrukte könnten auch in einen beliebigen anderen Vektor, der für die Expression in Eukaryontenzellen konstruiert ist, kloniert werden.
Die Konstruktion der rekombinanten Plasmide, die das native PAI-2-Gen und die Signal-PAI-2-Varianten in einem in-vitro-System und in Säugetierzellen exprimieren, ist in den Figuren.2 und 3 dargestellt. Die verschiedenen Restriktionsfragmente ("Inserts" für die Klonierung) wurden folgendermaßen hergestellt. Es wurden von gereinigter Plasmid-DNA Restriktionsenzymverdaue in vom Zulieferer empfohlenen Puffern durchgeführt. Die erforderlichen DNA-Fragmente wurden von dem Plasmid durch Gelelektrophorese in 0,8-1,5% Sea-Plaque-Agarose (FMC Corporation) in Tris-Borat-Puffer getrennt (Maniatis et al, 1982). Die Fragmente wurden durch Färben mit Ethidiumbromid und UV-Durchleuchtung sichtbar gemacht. Die das betreffende Fragment enthaltende Agarosebande wurde aus dem Gel herausgeschnitten und bei 65ºC geschmolzen, und die DNA wurde dadurch, daß man das verdünnte Material wie vom Zulieferer empfohlen durch eine NACS-Säule (BRL) laufen ließ, extrahiert. Die DNA wurde dann mit Ethanol in der Gegenwart von Träger-TRNA (10 µg/ml) gefällt.
Die Vektoren wurden typischerweise folgendermaßen hergestellt. Plasmid-DNA, die mittels CsCl-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt worden war, wurde mit den jeweiligen Restriktionsenzymen verdaut, der Verdau wurde mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert und die DNA wurde mit 2,5 Volumsteilen Ethanol gefällt. Die verdaute DNA wurde wieder in 50mM Tris-Cl pH 9,0, 1mM MgCl&sub2;, 0,1mM ZnCl&sub2; und 1mM Spermidin suspendiert und mit 1-2 Einheiten alkalischer Phosphatase Kälberdarm(Boehringer Mannheim) 30-60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Das Enzym wurde 15 Minuten bei 70ºC hitzeinaktiviert, und die DNA wurde anschließend mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt.
Die Ligationen wurden folgendermaßen durchgeführt. Vektor und Insert-DNAS wurden in einem molaren Verhältnis zwischen 1:1 und 1:5 (1:10, falls das Insert kleiner als 100bp war) in 1mM ATP, 10mM MgCl&sub2;, 5mM DTT sowie 65mM Tris-Cl pH 7,5 in einem Volumen von 10-20 µl vermischt. Die Ligationen wurden über Nacht bei 16º mit 0,5-1 Einheit T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim) durchgeführt. Die Ligationsmischungen wurden mit dH&sub2;O auf 30µl verdünnt, und 10µl wurden für die Transformation in einen kompetenten E. coli-K12-Wirt (Hanahan, 1985) entfernt. Die Transformanten wurden durch Ausplattieren auf
Trypton-Soya-Agarplatten mit 100µg/ml Ampicillin selektiert.
Die Plasmid-DNA wurde aus einzelnen Kolonien extrahiert (Birnboim und Doly, 1979) und die richtigen rekombinanten Plasmide wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Die 5'-Enden des PAI-2-Gens in pBTA821, 822 und 823 wurden sequenziert, um zu bestätigen, daß sich die Signalpeptid- und Methionin-Startcodons im gleichen Raster wie der Rest der PAI-2-Sequenz befanden. Sequenziert wurde an doppelsträngiger Plasmid-DNA, und zwar unter Verwendung des Sequenase-DNA-Sequenzierbestecks (USB), wie in der Anleitung beschrieben. Bei dem verwendeten Primer handelte es sich um T7-Primer (Promega).
Die bei dieser Arbeit verwendeten Plasmide und Stämme sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. TABELLE 1: Plasmide und Bakterienstämme Tabelle 1 (Fortsetzung)
A hergestellt von Biotechnology Australia Pty Ltd (siehe Text unten)
B Siehe Maniatis et al 1982
C Von Promega gekauft
D Von Pharmacia LKB Biotechnology gekauft
E Botterman und Zabeau (1985)
F E. coli K12 C600λ = thiA1l, thr1, leuB6, SupE(glu )44, lacY1, fhuA21(λ)T
G Gottesman et al (1980)
H Stamm bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville MD 20852, USA, am 11. Februar 1987 unter der Eingangsnummer ATCC 53585 hinterlegt und in PCT/AU87/00068 beschrieben
I Yanisch-Perron et al (1985)
Das Plasmid pBTA641 läßt sich folgendermaßen von pBTA438 ableiten. pBTA438 wird partiell mit XhoII plus Dral verdaut, und ein 1550bp-Fragment wird isoliert und mit dem mit BglII und 5mai geschnittenen Vektor pLK58 ligiert. Das entstandene Plasmid P8TA446 wurde mit BglII linearisiert und mit einem synthetischen doppelsträngigen 27-mer-Oligonucleotid mit der wie in SEQ ID-Nr. 3 beschriebenen Sequenz GATCT(N)&sub1;&sub6;ATGGAG, wobei N für ein beliebiges Nucleotid steht, welches eine Bakterienribosomenbindungsstelle und die ersten Nucleotide des nativen PAI-2-Gens enthält, ligiert, wodurch man das Plasmid pBTA641 erhält.
pBTA67g enthält ein 1,3kb-Fragment des PAI-2-Gens (darunter auch der gesamte genannte Codierbereich). Das 1,3kb-Fragment wurde aus dem 1,6kb-EcoRI-Dral-Fragment aus pBTA438 dadurch erhalten, daß man 3oobp des 3'-nichttranslatierten Bereichs zwischen dem Stop-Codon und der Drai-Schnittstelle (bei 1604) unter Verwendung von Bal-31-Nuclease deletierte. Das entstandene Fragment mit beidseitig ligierten Linkem wurde in die HindIII-BamHI- Schnittstellen der von pUC18 abgeleiteten Mehrfachklonierungssequenz subkloniert (Yanisch-Perron et al, 1985). Der Endpunkt der Deletion wurde durch Sequenzieren bestimmt.
Bei pBTA830 handelt es sich um einen Säugetierzellexpressionsvektor. Fremdgene werden dadurch exprimiert, daß man in die Mehrfachklonierungssequenz (von pUC18) kloniert, die stromaufwärts von dem frühen Promoter aus SV40 und stromabwärts von dem kleinen t-Intron und frühen Polyadenylierungssignalen aus SV40 flankiert ist. pBTA830 umfaßt die folgenden Fragmente in dieser Reihenfolge: das 345bp-PvuII-HindIII-Fragment des SV40- Startpunkts (Bethesda Research Laboratories), Slbp- HindIII-EcoRI-Mehrfachklonierungssequenzen aus pUC18, das 853pb-Xhoi-BamHI-Fragment aus pMSG (eukaryontischer Expressionsvektor von Pharmacia) mit beidseitig angehefteten EcoRI- und AatII-Linkern (GAATTC, GGACGTCC, New England Biolabs), das 2262bp-AatII-EagI-Fragment aus pBR327 (Soberon et al, 1980), das 345bp-PvuII-HindIII- Fragment des SV40-Startpunkts, das 1320bp-HindIII-SmaI- Fragment aus Tn5, das für Neomycin-Phosphortransferase kodiert (Pharmacia, Beck et al, 1982), das 141bp-Sau3a- Fragment des kleinen t-Intronbereichs von SV40, das 293bp-Sau3a-Fragment des frühen Polyadenylierungsbereich von SV40, das 288bp-EagI-SalI-Fragment von pBR327, das 345bp-PvuII-HindIII-Fragment des SV40-Startpunkts, das für Maus-Dihydrofolatreduktase kodierende 734bp-HindIII- BglII-Fragment aus pSV2-DHFR (ATCC 37146, Subramani et al, 1981), das 141bp-Sau3a-Fragment des kleinen t-Intronbereichs von SV40 und das 293bp-Sau3a der frühen Polyadenylierungsregion von SV40. Wo nicht anders angegeben, wurden nichtkompatible Enden mit 51-Nuclease stumpf gemacht oder mit dNTPs und DNA-Polymerase I (Klenow) aufgefüllt.
Bei pBTA613 handelt es sich um einen Säugetierzellexpressionsvektor. Fremdgene werden dadurch exprimiert, daß man in die stromaufwärts von dem frühen Promoter von SV40 und stromabwärts von SV40-Polyadenylierungssignalen flankierte Mehrfachklonierungssequenz kloniert. pBTA613 umfaßt die folgenden Fragmente in der angegebenen Reihenfolge. Das 345bp-PvuII-HindIII- Fragment des SV40-Startpunkts, die 51bp-HindIII-EcoRI- Mehrfachklonierungssequenzen aus pUC18, das 75bp-EcoRI- AatII-Fragment von pBR327, das 853bp-BamHI-XhoI-Fragment von pMSG mit beidseitig angehefteten AatII-Linkern, das 2262bp-AatII-EagI-Fragment von pBR327, das wie in SEQ ID- Nr. 4 angegebene 27bp-Oligonucleotid (GGCCCATATGATATCTCGAGACTAGTC), das 288bp-EagI-SalI- Fragment von pBR327, das 345bp-PvuII-HindIII-Fragment des SV40-Startpunkts, das für Maus-Dihydrofolat-Reduktase kodierende 734bp-HindIII-BglII-Fragment von pSV2-DHFR, das 141bp-Sau3a-Fragment des kleinen t-Intronbereichs von SV40 und das 293bp-Sau3a-Fragment des frühen Polyadenylierungsbereichs von SV40. Die HindIII-Schnittstelle am 5'-Ende des dhfr-Gens wurde unter Verwendung von S1- Nuklease deletiert, und andere inkompatible Enden wurden unter Verwendung von 51-Nuklease stumpf gemacht oder mit dNTPs und DNA-Polymerase I (Klenow) aufgefüllt.

In-vitro-Translation

In pBTAB21, 822 und 823 kommt das PAI-2-Gen stromabwärts des T7-RNA-Polymerasepromoters zu liegen. Um RNA-Transkripte des nativen PAI-2-Gens und der Signalvarianten zu erzeugen, wurde in CsCl-Dichtegradienten gereinigte Plasmid-DNA linearisiert und dann unter Verwendung des käuflichen Riboprobe Gene transcription System (Promega) transkribiert. Wurden käufliche Bestecke verwendet, so wurden die Versuche nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Die Plasmid-DNA wurde typischerweise durch Verdauung mit EcoRI linearisiert. Die mit EcoRI verdaute DNA wurde mit Proteinase K behandelt [400µg/ml], dann mit Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert, mit 2,5 Volumsteilen Ethanol gefällt und wieder in 10mM Tris-Cl pH 8,0, lmm EDTA, suspendiert. Ungefähr 1µg lineare DNA wurde in 25µl Reaktionsmischung mit 1 × Transkriptionspuffer (Promega), 10mM DTT, jeweils 0,5mM ATP, CTP, GTP und UTP, 40 Einheiten Rnasin und 7,5 Einheiten T7-RNA-Polymerase (Promega) 60 Minuten bei 37º transkribieren gelassen.
Die RNA-Transkripte wurden anschließend in einem Kaninchenreticulocytenlysat-Cocktail translatiert. Typischerweise wurde 1µl der Transkriptionsreaktionsmischung (RNA) zu einem Cocktail gegeben, der 8µl Kaninchenreticulocytenlysat (Amersham), 12,5µCi³&sup5;S-Methionin (SJ1015 Amersham, 1000Ci/mmol), 20µM Aminosäuremischung ohne Met, 20 Einheiten RNAsin in einem Gesamtvolumen von 12,5µl enthielt. In einigen Versuchen enthielt die Translationsreaktionsmischung auch IEq-Mikrosomen (Promega). Es wurde 1 Stunde bei 30ºC inkubiert.
Nach der Translation wurden aliquote Teile zwecks weiterer Behandlung oder Analyse durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese entfernt.
Um herauszufinden, ob die am NH&sub2;-terminalen Ende von PAI-2 angehefteten synthetischen oder heterologen natürlichen Signalpeptide funktionell waren und ein richtiges Processing durchlaufen hatten, wurde die Reticulocytenlysat-Translationsmischung mit Mikrosomenvesikel aus Hundepankreas (Promega) versetzt. Mikrosomen werden vom endoplasmatischen Retikulum (ER) erzeugt und gestatten die Untersuchung von Vorgängen bei der Abspaltung des Signalpeptids, der Proteinverlagerung und der Kernglycolysierung. Jegliche bei der Verlagerung durch das ER hindurch an Asparaginsäurereste von PAI-2-Molekülen angefügte Kernkohlenhydrate werden durch Verdauung des Translationsprodukts mit Endoglycosidase H entfernt. Das Ausmaß der Verlagerung eines Proteins durch die Membran hindurch wird durch Inkubation des in-vitro- Translationsprodukts, das ein Processing durchlaufen hatte, mit Proteinase K beurteilt. Jegliches nicht vollständig in das Lumen des Mikrosomenvesikels verlagerte Protein ist gegen Verdauung durch Proteinase K anfällig.
Verdaue mit Endoglycosidase H wurden dadurch durchgeführt, daß man 2µl Translationsmischung plus 4µl RIPA-Puffer (1% Triton X100, 1% Natriumddesoxycholat, 0,1% SDS, 150mM NaCl, 50mM Tris-Cl pH 7,5, 5mm EDTA) plus 1µg Aprotinin mit 2mE Endo H (Boehringer Mannheim) 1 Stunde bei 37º in 10µl Reaktionsmischung inkubierte.
Verdaue mit Proteinase K wurden folgendermaßen durchgeführt. 2µl Translationsmischung plus 5µl phosphatgepufferte Kochsalzlösung plus 0,1µg/µl Proteinase K wurden 60 Minuten auf Eis inkubiert. Manche Reaktionsmischungen enthielten 1µl 1% Triton X-100. Die Proben wurden in 1,5% SDS und 1% 2-Mercaptoethanol aufgekocht, bevor man eine elektrophoretische Trennung an 10% Polyacrylamid-SDS-Gelen durchführte.
In Figuren 4A und 4B sind die Ergebnisse typischer zellfreier Translationsversuche dargestellt. Das Autoradiogramm in Figur 48 zeigt, daß das primäre Translationsprodukt des nativen PAI-2-Gens (pBTA821) aus einem Molekül mit 43000 Mr besteht (Fig. 4B Bahn b). Es wird nicht in die Mikrosomen verlagert, da Proteinase K das Produkt verdaut, egal ob Mikrosomen vorlagen (Fig. 4B Bahn d) oder nicht (Fig. 48 Bahn a). Auch ist das native Produkt nicht glycosyliert, da eine Verdauung mit Endoglycosidase H (Figur 4A Bahn d) keine Auswirkung auf das Wandern des Produkts mit Mr 43000 hat. Dieses Produkt mit einem Mr von 43000 wurde auch mit einem monoklonalen Antikörper gegen PAI-2 immungefällt. Im Gegensatz dazu verfügen die primären Translationsprodukte der beiden Signal-PAI-2-Varianten (pBTA822 und pBTA823, siehe Figur 4A, Bahnen g und 1) über höhere Molekulargewichte (44000-45000) als das native PAI-2 (Fig. 4A, Bahn b), und zwar aufgrund des zusätzlichen Signalpeptids. Wenn auch Mikrosomen an der Reaktion teilnehmen, so wandern die Translationsprodukte von pBTA822 und pBTA823 langsamer (Mr 45000-46000) aufgrund des Processing des Signals und des Hinzufügens von Kohlehydraten. Es existieren zwei unterschiedliche Produkte (mit Mr von 44500-46000), die gegen Verdauung mit Proteinase K vollständig geschützt sind (Figur 4B, vgl. Bahn i und j bzw. o und p). Beide Produkte werden bei Verdauung mit Endo H verkleinert, und zwar auf ein Mr von 43000 und 41000 (Figur 4a, vgl. Bahn h und i bzw. m und n). Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß die Vergrößerung von PAI-2 um eines der beiden Signalpeptide die Verlagerung von PAI-2 durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums hindurch sowie Glycosylierung gestattet. Weiterhin wird das hinzugefügte Signal während der Translokation abgespalten.

Vorübergehende Expression in Säugetierzellen

Bezüglich Einzelheiten der verwendeten Gewebekulturtechniken, siehe Freshney (1987). Um zu bestimmen, ob die an PAI-2 angehefteten Signale das Processing und die Sekretion von PAI-2 aus Säugetierzellen fördern, wurden die Gene für das native PAI-2 und die zwei Signalvarianten von PAI-2 stromabwärts des späten Promoters von SV40 in den eukaryontischen Expressionsvektor pSVL (Pharmacia) eingefügt. Die Konstruktion dieser Vektoren pBTA824, pBTA825 und pBTA826 wurde oben beschrieben und wird in Figur 3 zusammengefaßt.
Die Plasmide pBTA824, pBTA825 und pBTA826 wurden nach der Calciumphosphatmethode (Spandidos und Wilkie, 1984) in die Affennieren-COS-Zellinie transfiziert. loml nach Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium mit einem Zusatz von 10% (v/v) fötalem Kälberserum, 2mm Glutamin, 50iE ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin in einer 100mM-Kulturschale wurden mit ungefähr 6 × 10&sup5; Zellen beimpft. Zehn Mikrogramm mit CsCl gereinigte DNA wurden mit Calciumphosphat gefällt und zu den Zellen gegeben. Nach 4 Stunden wurden die Zellen mit einem Glycerinschock behandelt und in dem oben genannten Medium ungefähr 42 Stunden kultiviert.
Um auf Expression und Sekretion von PAI-2 aus diesen Zellen zu testen, wurde das Medium ungefähr 42 Stunden nach dem Glycerinschock entfernt und durch Eaglesches essentielles Minimalmedium ohne Methionin (Flow) mit einem Zusatz von 100µCi/ml³&sup5;S-Methionin (Amersham SJ1015 1000Ci/mmol) ersetzt. Nach 4stündiger Stoffwechselmarkierung wurde das Medium für Analysenzwecke gewonnen und die Zellen mit einer eiskalten phosphatgepufferten Kochsalzlösung gewaschen, geerntet und lysiert. Die Zellen wurden mit 1% Triton X100, 0,1% SDS, 150mM NaCl, 50mM Tris-Cl pH 7,5 und 5mM EDTA lysiert. Das PAI-2 wurde von aliquoten Teilen des Mediums und der Zellysate durch Inkubation mit 25µg/ml monoklonalem Antikörper gegen PAI-2 aus der Maus (MAI-21, Biopool) bei 4ºC über Nacht in einer Lösung mit 1% Triton X100 und 10µg/ml Aprotinin immungefällt. Komplexe aus Antikörper und PAI-2 wurden mit 20µl Anti-Maus-IgG-Agaroseperlen (Sigma) in 10mM Natriumphosphat pH 7,2 und 0,5M NaCl extrahiert. Das PAI-2 wurde aus den Perlen mit 0,15M NaCl/0,1M Glycin pH 2,4 eluiert, durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter reduzierenden Bedingungen analysiert und durch Autoradiographie wie in Figur 5 dargestellt sichtbar gemacht. Einige Zellen wurden 18 Stunden vor und während der Markierung mit 5µg/ml Tunicamycin inkubiert, um N-gebundene Glycosylierung zu verhindem
Das rekombinante PAI-2 ist aus Fig. 5, Bahn f und h, in Form einer breiten Bande mit einem Mr von 53000-60000 ersichtlich. Hierbei handelt es sich um Proben des Mediums von Zellen, die mit dem synthetischen Signal-PAI-2-Gen wie in SEQ ID-Nr. 11 (pBTA825) beschrieben bzw. alpha-1-Antitrypsinsignal-PAI-2-Gen wie in SEQ ID-Nr. 12 beschrieben (pBTA826) transfiziert worden waren. Das Medium von pseudo-transfizierten Zellen (d.h. ohne DNA-Zusatz) und von Zellen, die nur mit dem Vektor (pSVL) transfiziert worden waren, enthalten kein Material mit einem Mr von 60000 (Bahn b und c). In dem Medium der mit pBTA824 transfizierten Zellen (Bahn d) befindet sich jedoch eine kleine Menge an Material mit einem Mr von 60000 und eine größere Menge eines Materials mit einem Mr von 43000. Das Material mit einem Mr von 43000 scheint nicht glycosyliert zu sein (vgl. Bahn d und e).
Es ist klar, daß die Erweiterung des PAI-2-Moleküls um das Signalpeptid die Sekretion der glycosylierten 60000Mr-Form aus COS-Zellen stark erhöht.
Die biologische Aktivität der PAI-2-Formen mit einem Mr von 58-60000 wurden mit einem Urokinase (uPA)- Bindungstest bestimmt. Ein aliquoter Teil Medium, der ³&sup5;S-markiertes PAI-2 aus transfizierten COS-Zellen enthielt, wurde mit Urokinase versetzt (45 IE, niedermolekular, American Diagnostica). Es wurde 90 Minuten bei Raumtemperatur binden gelassen. Die Komplexe aus uPA und PAI-2 wurden aus der Reaktionsmischung mit Antikörpern gegen PAI-2 aus der Ziege oder Anti-uPA-Serum aus Kaninchen und einem zweiten Festphasenantikörper immungefällt. Material wurde aus den Immunperlen durch Kochen in einem Puffer mit 1,5% SDS und 1% (v/v) 2-Mercaptoethanol eluiert und dann mittels SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert.
Die Ergebnisse solch eines Versuchs sind in Figur 6 dargestellt. Das aus mit dem nativen Gen transfizierten COS-Zellen freigesetzte nichtglycosylierte PAI-2 mit einem Mr von 43000 (Fig. 6, Bahn c) bildet bei Zugabe von uPA einen Komplex mit einem Mr von 76000 (Fig. 6, Bahn d). Das von mit einem beliebigen der Signal-PAI-2-Konstrukte transfizierten COS-Zellen sezernierte glycosylierte PAI-2 mit 58-60000 bindet ebenfalls uPA, und ein Komplex mit einem Mr von ungefähr 89000 wird gebildet (Fig. 6, Bahn f und h). Dieser Komplex kann sowohl mit Antikörpern gegen PAI-2 als auch mit Antikörpern gegen uPA immungefällt werden. Dies zeigt, daß die glycosylierte, sezernierte 58-60kD-Form von PAI-2 biochemisch aktiv ist.

Anheftung von Kohlenhydraten

Um zu bestimmen, um welche Art Kohlenhydrate es sich bei denen, die an das PAI-2 mit einem Mr von 60000 angeheftet worden waren, handelt, wurde das von COS-Zellen sezernierte Material mit verschiedenen Endoglycosidasen verdaut (siehe Glycanalysis Systems Manual, Genzyme Corp. USA). Die 60000Mr-Form wurde aus dem Medium von mit pBTA826 transfizierten Zellen wie oben beschrieben immungefällt. Aliquote Teile dieses Materials wurden folgendermaßen verdaut.
(a) 1% Triton X-100, 1% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS, 150mm NaCl, 50mM Tris-Cl pH 7,5, 5mm EDTA, 2mE Endoglycosidase H (Boehringer Mannheim), 1 Stunde bei 37ºC.
(b) 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 10mM Natriumphosphat pH 7,2, 400mE Glycopeptidase F (Boehringer Mannheim), 1 Stunde bei 37º.
(c) 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 10mM D-Galactonoγ-lacton, 10mM Natriumphosphat pH 7,2, ime Neuraminidase und/oder ime Endo-α-N-Acetylgalactosaminidase (Boehringer Mannheim), 1 Stunde bei 37ºC.
Nach der Verdauung wurden die Produkte mit SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Eine Verdauung mit Endo H hatte keine Auswirkung auf die Mobilität von 60000Mr-PAI-2 (Figur 9, Bahn B), was zeigte, daß jedes Ngebundene Kohlenhydrat komplexe Zucker enthielt, die im Golgi-Apparat eingebaut wurden. Eine Verdauung mit Glycopeptidase F (welche alle N-gebundenen Kohlenhydrate entfernt) reduzierte das 60000Mr-Material jedoch auf ein Paar mit einem Mr von 49000 bzw. 50000 (Figur 9, Bahn C). Diese Formen sind höhermolekular als nichtglycosyliertes PAI-2 (43000 Mr). Die Möglichkeit, daß auch etwas O-gebundenes Kohlenhydrat an das PAI-2 angeheftet worden war, wurde dadurch bestätigt, daß man die 60000Mr-Form mit Glycopeptidase F, Neuraminidase und Endo-α-N-acetylgalactosaminidase (welche 0-gebundene Zucker entfernt) verdaute. Die Kombination dieser drei Enzyme reduzierte die 60000Mr-Form zu einer 43000mr-Form (Figur 9, Bahn E), was der Größe von nichtglycosyliertem PAI-2 entspricht (Figur 9, Bahn F).

Bestimmung des NH&sub2;-terminalen Endes

Um den NH&sub2;-terminalen Rest der sezernierten 60000Mr-Form von PAI-2 zu bestimmen, wurde mit ³&sup5;S-Methionin oder ³H-Leucin markiertes Material, das von transfizierten COS-Zellen sezerniert worden war, mit dem monoklonalen Antikörper gegen PAI-2 aus der Maus (MAI-21, Biopool) wie oben beschrieben immungefällt.
Ein aliquoter Teil des mit ³&sup5;S-Met markierten PAI-2, das aus dem Medium gewonnen wurde, wurde mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese analysiert, und es wurde gezeigt, daß es Material mit einem Mr von 60000 enthielt. Das mit ³&sup5;S-Met markierte PAI-2 mit einem Mr von 60000wurde auf das Proteinsequenzierungsgerät von Applied Biosystems (Modell 470A) aufgetragen und mehreren Zyklen eines Edman-Abbaus unterworfen (siehe Anweisungen für Proteinsequenzierungsgerät) Fraktionen wurden von jedem Zyklus gewonnen und in einem Flüssigkeits-Scintillationszählgerät gezählt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung (Figur 10A) zeigten, daß es sich bei dem NH&sub2;-terminalen Rest des von mit pBTA825 transfizierten COS-Zellen sezernierten PAI-2 mit einem Mr von 60000 um Met handelt.
Die mit ³H-leuu markierten 60000Mr-Formen von PAI-2 wurden elektrophoretisch an SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und durch Elektro-Blotting auf eine Pro Blot PVDF-Membran überführt (Matsudaira, 1987). Ein Fragment der Membran, das das 60kDa-PAI-2 enthielt, wurde herausgeschnitten, auf das Proteinsequenzierungsgerät aufgetragen und wie oben sequenziert, wobei das Programm des Sequenzierungsgeräts nach Speicher, 1989, modifiziert wurde.
Aus den Ergebnissen (Figur 8A, 8B) ging hervor, daß das von mit pBTA825 transfizierten COS-Zellen sezernierte PAI-2 mit einem Mr von 60000 über Leu-Reste in den Positionen 4, 10 und 13 verfügte, d.h. daß das synthetische Signalpeptid abgespalten worden war, wodurch PAI-2 mit Met als NH&sub2;-terminalem Ende übrigblieb. Das von mit pBTA826 transfizierten COS-Zellen sezernierte PAI-2 mit einem Mr von 60000 verfügt jedoch über Leu-Reste an den Positionen 3, 9 und 12. Dies zeigt, daß das alpha-1- Antitrypsinsignal abgespalten wurde, wodurch ein glycosyliertes PAI-2-Molekül mit Glu am NH&sub2;-terminalen Ende übrigblieb.
Diese Ergebnisse beweisen, daß die Signalpeptide während des Processing des PAI-2 durch die Zelle abgespalten worden waren, daß die Abspaltung der synthetischen Signalpeptide zwischen Ala 19 und Met 20 erfolgt (SEQ ID-Nr. 11 sowie Figur 7), daß die Abspaltung des alpha-1-Antitrypsinsignals zwischen Ala 24 und Glu 25 erfolgt (SEQ ID-Nr. 12 sowie Figur 8), und daß das von mit pBTA825 transfizierten COS-Zellen sezernierte PAI-2 mit einem Mr von 60000 über 415 Aminosäurereste verfügt. Das von mit pBTA826 transfizierten COS-Zellen sezernierte PAI-2 mit einem Mr von 60000 enthält jedoch 414 Aminosäurereste.

Stabile Expression in Säugetierzellen

Bezüglich Einzelheiten der verwendeten Gewebekulturtechniken siehe Freshney (1987). Die stabile Expression von in Wirtszellgenome integrierten PAI-2- Genen wurde in verschiedenen Zellinien untersucht. Die Zellinie CHO-K1 (ATCC CCL 61) stammt von einer Eierstockzelle des Chinesischen Hamsters ab. Bei der Zellinie U937 handelt es sich um die Zelle, die sich von menschlichen Monocyten ableitet, PAI-2 exprimiert und aus der das PAI- 2-Gen isoliert worden war (Antalis et al, 1988). Zu anderen Wirtszellen für die Expression von PAI-2 gehören die Hamsternieren-Zellinie BHK-21 (ATCC CCL10), die Humannieren-Zellinie 293 (ATCC CRL1573), die Linie HeLa S3 (ATCC CCL2,2), die von einer Human-Epithelzelle stammt, die Humanmonocyten-Zellinie HL60 (ATCC CCL 240) sowie Insektenzellinien, die von Spodoptera frugiperda (Sf9, ATCC CRL1711) und Bombyx mori (Maeda et al, 1984) stammen.
Die um Signalsequenzen erweiterten PAI-2-Gene wurden in den Vektor pBTA830 insertiert, der das Gen für Resistenz gegen das Aminoglycosid-Antibiotikum G418 und das dhfr-Gen aus der Maus enthält (Figuren 3B und 3C). Die entstandenen Plasmide pBTA827, pBTA828 wurden nach der beschriebenen Calciumphosphatmethode in die oben genannten Zellinien transfiziert, und zwar unter Verwendung von 20µg Plasmid-DNA/2 × 10&sup5; Zellen, insgesamt 3 × 10&sup6;, oder mittels Elektroporation. Die Elektroporation wurde unter Verwendung von 10µg linearisierter Plasmid- DNA/10&sup7; in phosphatgepufferter Kochsalzlösung/272mM Saccharose, pH 7,4, suspendierten Zellen bei 4ºC mit Stößen von 150-300 V bei einer Kapazität von 250µFD durchgeführt (Ausubel et al, 1987). Bei dem verwendeten Gerät handelte es sich um einen Gen-Pulser von Bio-Rad.
Die Selektion von Transfektanten der Zellinie CHO-K1 gelang in der nucleosidfreien alpha-Modifikation des Eagleschen Mediums (αMEN) mit 2% (v/v) dialysiertem fötalem Rinderserum und 400µg/ml G418. Diese Behandlung selektierte sowohl auf das dhfr- als auch das G418- Resistenzgen, die in dem für PAI-2 codierenden Plasmid vorlagen. Transfektanten anderer Zellinien wurden mit αMEN oder RPMI-1640-Medium (Cytosystems) mit 2-10% fötalem Rinderserum und 400µg/ml G418 selektiert. Nach der Selektion wurden die PAI-2-Gene gemeinsam mit den kotransfizierten (und Wirts-)dhfr-Genen dadurch amplifiziert, daß man die Kulturen mit steigenden Mengen Methotrexat von 0,1µM bis 10µM über einen Zeitraum von drei Monaten wie von Zettlemeisl et al. (1987) beschrieben behandelte.
Die entstandenen transfizierten Kulturen mit stabil integrierten amplifizierten PAI-2-Genen wurden auf Sekretion von PAI-2 in serumfreies Kulturmedium mit einem ELISA (Biopool, Schweden) untersucht, der gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt worden war. Unterschiedliche Kulturen (Range), die Zellen aus vielen hundert Transfektionsvorgängen enthielten, wurden ELISA-getestet, und die Range mit der höchsten Expression von PAI-2 wurden ausgewählt. Die Identität der von diesen Kulturen sezernierten Molekulargewichtsformen von PAI-2 wurde durch Immunfällung von Kulturüberständen und SDS- Polyacrylamidgel -Elektrophorese wie oben beschrieben überprüft. Hochmolekulare glycosylierte Formen von PAI-2 werden von repräsentativen Kulturen wie in Figur 11 dargestellt produziert. Die biologische Aktivität der sezernierten Formen von PAI-2 kann dadurch bestimmt werden, daß man einen gekoppelten fotometrischen Test auf Plasminogenaktivator verwendet (Coleman und Green, 1981). Der erste Reaktionsschritt besteht darin, daß man das gereinigte Plasminogen mit uPA zu Plasmin aktiviert. Die Aktivität des Plasmins wird dann durch die Bildung eines gelben Thiophenolat-Anions nachgewiesen. Die Aktivität von PAI-2 wird in Ploug-Einheiten/ml ausgedrückt.
Schließlich werden Klone einzelner Zellen aus den am stärksten exprimierenden Zellrangen mittels des beschränkenden Verdünnungsverfahrens isoliert (Freshney, 1987). Die Zellkolonien werden dadurch auf PAI-2 geprüft, daß man sie wie von Raetz et al. (1982) beschrieben auf Nylonfilter überführt und PAI-2 mittels Western-Blot- Analyse nachweist. Die Kolonien mit der höchsten Expression von PAI-2 werden isoliert und neu kloniert, und die sezernierten Formen des PAI-2 werden wie oben beschrieben überprüft.
Die stabile Expression von in Wirtsgenome integrierten PAI-2-Genen wurde weiter in verschiedenen Zelllinien untersucht, darunter CHO, DG44 und Vero. Bei der Zellinie DG44 handelt es sich um einen Abkömmling der Eierstockzelle des Chinesischen Hamsters CHO-K1; sie enthält eine Deletion des Gens für Dihydrofolatreduktase (dhfr, Urlaub et al., 1986). Vero stammt von einer Nierenzelle der Afrikanischen Meerkatze ab (ATCC CCL81).
Das um die Signalsequenz erweiterte PAI-2-Gen wurde in den Vektor pBTA613 insertiert, der das dhfr-Gen aus der Maus enthält (Figur 3D). Das entstandene Plasmid pBTAB3g wurde nach der beschriebenen Calciumphosphatmethode unter Verwendung von 10µg Plasmid-DNA/2 × 10&sup5; Zellen, insgesamt 2 × 10&sup6; Zellen, oder durch Elektroporation in die oben genannten Zell-linien transfiziert. Die Elektroporation wurde wie von Barsoum (1990) beschrieben unter Verwendung des Gen-Pulsers von Bio-Rad durchgeführt.
Die Selektion von Transfektanten der Zellinie DG44 gelang in dem nucleosidfreien Medium αMEM (Cytosystems) mit 2% (v/v) dialysiertem fötalem Rinderserum und 0,1-0,5µm Methotrexat. Die Selektion von Transfektanten der Vero-Zellen wurde in dem gleichen Medium durchgeführt. Dieses Verfahren selektiert auf Transfektanten mit einer erhöhten Kopienzahl des integrierten Plasmids. Nach der Selektion wurden die PAI-2- Gene gemeinsam mit kotransfizierten (und Wirts-)dhfr- Genen dadurch amplifiziert, daß man die Kulturen mit steigenden Mengen Methotrexat, bis zu 10µm, nach der Methode von Zettlemeisl et al (1987) behandelte. Die entstandene transfizierte Kultur mit stabil integrierten amplifizierten PAI-2-Genen wird auf Sekretion von PAI-2 in das serumfreie Kulturmedium mit einem nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführten ELISA für PAI-2 (Biopool, Schweden) untersucht. Einzelkolonien, die durch die Transfektion entstanden, sowie Range mit Zellen, die aus mehreren tausend Transfektionsvorgängen stammten, werden mittels ELISA getestet, und diejenigen mit der stärksten Expression von PAI-2 werden gewählt. Die Identität der von diesen Kulturen sezernierten Molekulargewichtsformen von PAI-2 wird durch Immunfällung von Kulturüberständen und SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese wie oben beschrieben überprüft.
Klone einzelner Zellen werden aus den am stärksten exprimierenden Zellrangen mittels des beschränkenden Verdünnungsverfahrens isoliert (Freshney, 1987). Die Zellkolonien werden dadurch auf PAI-2 geprüft, daß man sie wie von Raetz et al. (1982) beschrieben auf Nylonfilter überführt und PAI-2 mittels Western-Blot- Analyse nachweist. Die Kolonien mit der höchsten Expression von PAI-2 werden isoliert und neu kloniert, und die sezernierten Formen des PAI-2 werden wie oben beschrieben überprüft.

Fehlen einer wirksamen Signalsequenz in nativem PAI-2

Durch den in-vitro-Translationsversuch mit Mikrosomen wurde zum ersten Mal gezeigt, daß natives PAI-2 keine Signalsequenz enthält, die wirksam von dem in manchen Säugetierzellextrakten vorhandenen Proteinverlagerungsmechanismus erkannt wird. Dies könnte die Beobachtungen erklären, nach denen es sich bei PAI-2 hauptsächlich um ein intrazelluläres Protein handelt. Die geringen Mengen, die sezerniert werden, sind häufig nicht glycosyliert und können von den Zellen durch einen unbekannten Mechanismus, an dem nicht der Transport von PAI-2 über den normalen Sekretionsweg des ER und des Golgi-Apparats beteiligt ist, ausgeschieden werden. Formen von PAI-2 mit hohem Mr wurden jedoch ebenfalls beobachtet; PAI-2 muß daher über die Fähigkeit, sich in das ER und den Golgi-Apparat (wo Kohlenhydrate angeheftet werden) zu verlagern, verfügen. Das Signal, das diesen Vorgang gestattet, ist noch unbekannt. In Anbetracht der mit dem oben beschriebenen in-vitro-System erhaltenen Ergebnisse muß jegliches Signal in nativem PAI-2 von dem Signalerkennungsprotein auf äußerst unwirksame Weise erkannt werden. Um diesem Problem abzuhelfen und zu garantieren, daß große Mengen der hochmolekularen Formen von PAI-2 wirksam aus Säugetierzellen sezerniert werden, wurde das NH&sub2;-terminale Ende von PAI-2 um ein Signalpeptid erweitert. Aus den oben genannten Ergebnissen geht hervor, daß, um ein Molekül zu schaffen, das durch das endoplasmatische Retikulum hindurch verlagert wird, entweder ein künstliches Signalpeptid oder ein natürliches Signalpeptid an PAI-2 angeheftet werden kann. Das Signal wird abgespalten und PAI-2 wird im Ausscheidungsweg einem Processing unterzogen. Diese hochmolekularen PAI-2-Formen sind glycosyliert und binden an uPA.

Aufreinigung

Das sezernierte PAI-2 wird nach üblichen und veröffentlichten Verfahren aufgereinigt (siehe Inter nationale Patentanmeldung Nr. PCT/AU87/00068).

Anwendungen in der Industrie

Die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Expressionsprodukte sezerniertes glycosyliertes rekombinantes 60kD-PAI-2 sowie die 414-Aminosäurenform von PAI-2 können als Diagnostika oder Therapeutika in folgenden Gebieten verwendet werden:
Therapie, Prophylaxe und Diagnose von Entzündungskrankheiten;
Therapie, Prophylaxe und Diagnose von Krebsmetastasen und -ausbreitung;
Therapie von Krisensituationen bei Transplantatund Plazentaabstoßungen sowie bei Transplantatgegen-Empfänger-Reaktionen;
Therapie und Diagnose von Autoimmunkrankheiten und Krankheiten im Zusammenhang mit überschüssiger Sauerstoffradikalbildung;
Therapie und Prophylaxe von Wund- und Knochenheilungsstörungen, Gewebsschäden bei oder nach akuter Reperfusion sowie subarachnoidalen Blutungs störungen;
als topische Medikamente zur Förderung der Fibrinadhäsion zur Förderung der Heilung von Wunden und Verbrennungen;
Behandlung von Asthma sowie Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten im Zusammenhang mit hoher Leukozytenaktivität; sowie
Hemmung des Monocyten-Macrophagen-Systems.
Als Beispiele für die oben genannten Krankheitstypen können im einzelnen genannt werden:
Rheumatoide Arthritis
Osteoarthritis
Colitis ulcerosa
systemischer Lupus erythematosus
multiple Sklerose
Psoriasis
Pemphigus
Hornhaut - und Zwölff ingerdarmgeschwüre
Purpura
Peridontitis
Muskeldystrophie

LITERATURANGABEN

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Claims

1. Verfahren zur Herstellung von rekombinantem, glycosyliertem, sezerniertem PAI-2 oder rekombinantem, glycosyliertem&sub1; sezerniertem PAI-2 ohne das N-terminale Methionin, wobei das Verfahren umfaßt, daß man:

ein Konstrukt bereitstellt&sub1; das ein erstes Polynucleotidmolekül umfaßt, das PAI-2 ode PAI-2 ohne das N-terminale Methiqnin kodiert;

ein Polynucleotidmolekül, das eine transiente Signalsequenz kodiert, an das 5'-Ende des ersten Polynucleotidmoleküls bindet, so daß das entstehende Hybridprotein, das von dem Konstrukt exprimiert wird, aus einer transienten Signalsequenz besteht, die an das NH&sub2;-Ende von PAI-2 oder PAI-2 ohne das N-terminale Methionin gebunden ist; und

das Konstrukt in einer eukaryontischen Wirtszelle exprimiert, wobei die transiente Signalsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Aminosäuresequenz Met Lys Cys Leu Leu Leu Ala Len Gly Leu Len Ala Phe Val Pro Leu Val Arg Ala und dem Signalpeptid des Proteins α-Antitrypsin.

2. Synthetisches Signalpeptid mit der Sequenz Met Lys Cys Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ala Phe Val Pro Leu Val Arg Ala.

3. Polynucleotid-Konstrukt, das ein transientes Signalpeptid kodiert, das Met Lys Cys Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ala Phe Val Pro Leu Val Arg Ala oder das Signalpeptid des menschlichen Proteins α-1-Antitrypsins ist, das an das NH&sub2;-terminale Methionin oder die NH&sub2;-terminale Glutaminsäure von PAI-2 gebunden ist.

4. Polynucleotid-Konstrukt nach Anspruch 3, worin das Molekül oder Konstrukt ein DNA-Molekül oder -Konstrukt ist.

5. Rekombinantes DNA-Molekül umfassend DNA, wie in Anspruch 4 beansprucht, zusammen mit Vektor-DNA.

6. Wirtszelle transformiert mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 5.

7. Wirtszelle nach Anspruch 6, die eine Zelle einer Zellinie ist, die aus einem eukaryontischen Organismus stammt, z.B. Affennieren-COS-Zellen, die Affennieren- Zellinie Vero, Eierstockzellen des chinesichen Hamsters, die humane histiocytische Lymphom-U937-Zellinie, ein Derivat der CHO-K1-Zellen, DG-44, die Hamsternieren- Zellinie BHK-21, die Humannieren-Zellinie 293, die Linie HeLa S3, die von einer Human-Epithelzelle stammt, und die Humanmonocyten-Zellinie HL60 oder Zellinien, die aus den Insekten Spodoptera frugiperda und Bombyx mori stammen.