DE69020968T2

DE69020968T2 - Kontrolle der Anhäufung von abweichenden Expressionsvektoren während der Fermentationsverfahren.

Info

Publication number: DE69020968T2
Application number: DE69020968T
Authority: DE
Inventors: William Lawrence Muth
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1989-06-26
Filing date: 1990-06-22
Publication date: 1995-12-21
Anticipated expiration: 2010-06-23
Also published as: AU617057B2; GR3017703T3; HUT54415A; ATE125300T1; DK0405858T3; DE69020968D1; IE902289L; IE902289A1; HU903975D0; EP0405858A2; IE67799B1; CA2019696A1; US5824496A; EP0405858B1; IL94847A0; ES2076318T3; AU5780590A; JPH0347081A; EP0405858A3

Description

Fermentationsprozesse wurden für Jahrzehnte zur Herstellung von Antibiotika verwendet und ein Großteil dieser Wissenschaft erwies sich auch für die genetisch veränderte Proteinproduktion als brauchbar. Im Gegensatz zu anderen Fermentationsverfahren, die die Kultivierung von ursprünglichen Mikroorganismen beinhalten, die das interessante Molekül bilden und oft sekretieren, sind die genetisch veränderten Zellen im Aufrechterhalten des Expressionsvektors und der anschließenden Bildung des gewünschten Produkts oft unzuverlässig.
Extrachromosomale Elemente, wie Plasmide und andere Expressionsvektoren gehen oft verloren, wenn sie der Wirtszelle keinen Wachstums- oder Überlebensvorteil bieten. Während Fermentationsprozessen leiden Wirtszellen, die die extrachromosomalen Elemente verloren haben nicht mehr länger unter der metabolischen Belastung, diese Expressionsvektoren zu erhalten und sind daher in ihrer Wachstumsgeschwindigkeit nicht behindert. In einer kurzen Zeitspanne werden die Wirtszellen, die diese extrachromosomalen Elemente nicht enthalten, jene Wirtszellen überwachsen, deren Wachstum durch die Expression und Anhäufung des interessanten Produkts verzögert ist. Dieser Prozess einer negativen Selektion auf unvorteilhaftes genetisches Material wurde jahrelang bei der Untersuchung von Arzneimittel-resistenten Bakterien dokumentiert. Es ist erwiesen, daß die Entfernung des Antibiotikums, gegenüber dem durch ein auf einem Plasmid kodierten Gen eine Resistenz verliehen wird, zu einer Bakterienpopulation führt, bei der das Arzneimittel-resistente Plasmid nur bei einem sehr kleinen Prozentsatz der Bakterien erhalten bleibt.
Antibiotikumresistenzgene werden oft in Expressionsvektoren eingebaut, um die Selektion der Transformanden und Transfektanden zu erlauben und um einen Selektionsdruck auf die Erhaltung des Expressionssystems während der langen Kultivierung bereitzustellen. Der durch das Antibiotikum ausgeübte Selektionsdruck stellt den Erhalt des Arzneimmittel-resistenten Phänotyps sicher aber schließt nicht das Auftreten von Plasmiden aus, die eine Antibiotikumresistenz verleihen, denen aber die Fähigkeit zur Bildung des interessanten Produkts fehlt. Die Herstellung eines Fremdproteins ist eine metabolische Belastung für die Zellen, die das interessante Polypeptid exprimieren und anhäufen und führt so zu einem Selektionsdruck auf Zellen, die dieses Produkt nicht mehr bilden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Zugabe eines Antibiotikums oder einer Kombination von Antibiotika in bakteriostatischen oder bakteriziden Konzentrationen zum Fermentationsgemisch etwa zu dem Zeitpunkt, zu dem die Produktexpression induziert wird. Die Zugabe von bakteriostatischen oder bakteriziden Konzentrationen eines Antibiotikums etwa zum Zeitpunkt der Produktinduktion erfaßt alle Zellen, jedoch sind die Zellen, die das Produkt bilden, bereits in der Zellteilungsfähigkeit gehemmt und die Antibiotikumzugabe bewirkt daher das Überwachsen von anormalen Expressionssystemen.
Die Verwendung von Antibiotika für diesen Zweck wurde vorher noch nicht beschrieben. Der Stand der Technik zeigt, daß Antibiotika oft zur Eliminierung von Plasmiden und anderen extrachromosomalen Elementen aus Wirtszellen verwendet werden. Michel-Briand, et al., 1986, J. Antimicrob. Chemother. 18: 667-674 beschreiben die Verwendung von mehreren 4-Chinolonderivaten, einschließlich Cinoxacin und Novobiocin zur Eliminierung von verschiedenen Arzneimittel-resistenten Plasmiden von Vertretern der Enterobacteriaceae. Verschiedene andere Literaturstellen einschließlich Trevors, 1986, FEMS Microbiol. Rev. 32: 149-157, Wolfson et al., 1982, J. Bacteriol. 152: 338-344 und Weissner und Wiedemann, 1987, J. Antimicrob. Chemother., 18: 575-584 beschreiben ähnlich die Verwendung von Antibiotika zum Plasmid-Curing. Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich von der Antibiotikaverwendung zur Eliminierung von Expressionsvektoren gemäß dem Stand der Technik deutlich, in der Tat stünde dies im Gegensatz zum Zweck der Erfindung.
Bis zur vorliegenden Erfindung war kein Verfahren zur Sicherstellung bekannt, daß die Zellen in einem Fermentationsprozeß nicht durch Zellen überwachsen werden, die die Fähigkeit zur Produktexpression verloren haben und zum Wachstum mit erhöhter Geschwindigkeit fähig sind.
Zum Zweck der Erfindung, wie sie hierin beschrieben und beansprucht ist, werden die folgenden Ausdrücke wie folgt definiert.
Wirtszelle - Eine Zelle, die zur Transformation oder Transfektion mit einem Expressionsvektor geeignet ist.
Expressionssystem - Eine Kombination aus Wirtszelle und Expressionsvektor, die zur Expression eines interessanten Polypeptids fähig ist.
Induktion - Fermentationsbedingungen, die zur Veranlassung der erhöhten Expression des interessanten Polypeptidprodukts geeignet sind.
Expression - Transkription und Translation eines interessanten Produkts.
Fermentation - Aerobe oder anaerobe Bedingungen, die für das Wachstum von Mikroorganismen geeignet sind.
Bakteriostatisch - Eine Konzentration eines Antibiotikums, das die mikrobielle Zellteilung verhindert.
Bakterizid - Eine Konzentration eines Antibiotikums, die aktiv wachsende mikrobielle Zellen abtötet.
Anormaler Expressionsvektor - Ein Expressionsvektor, der aufgrund einer Deletion seiner regulatorischen oder kodierenden Regionen nicht länger das interessante Produkt exprimiert.
Anormales Expressionssystem - Eine Wirtszelle, die einen anormalen Expressionsvektor enthält.
Verläßlichkeit - Fähigkeit eines Expressionsvektors, die Produktexpression aufrechtzuerhalten.
Derivat des Rinderwachstumshormons - Ein Polypeptidprodukt, das eine zum Rinderwachstumshormon ähnliche Bioreaktivität aufweist.
Expressionsvektor - Jedes Agens, das zur autonomen Replikation oder genomischen Integration fähig ist, einschließlich aber nicht beschränkt auf Plasmide, die ein DNA Molekül umfassen, in das eine oder mehrere Transkriptions- und Translationsaktivierungssequenz(en) und ein Gen, das ein interessantes Polypeptid kodiert, so eingebaut wurden, daß die Expression des Gens möglich ist, das das interessante Polypeptid kodiert.
Die folgenden Figuren werden bereitgestellt, um die Erfindung leichter zu verstehen.
Die Figur 1 ist ein Fließschema, das die Konstruktion von Plasmid pBW32 erläutert.
Die Figur 2 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pNM789.
Die Figur 3 erläutert die Konstruktion von Plasmid 120.
Die Figur 4 ist ein Fließschema, das die Konstruktion von Plasmid pL110 erläutert.
Die Figur 5 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pCZR125.
Die Figur 6 erläutert die Beziehung zwischen der Induktion der Produktexpression und der Bildung von EK-bGH. Cinoxacin wurde etwa nach 6 Stunden zugegeben.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sicherstellung der Vektorzuverlässigkeit in Fermentationsprozessen, die rekombinante Expressionsvektoren verwenden. Wenn Expressionssysteme zur Produktexpression induziert werden, wird ein negativer Selektionsdruck auf alle Zellen ausgeübt, die ein Fremdprotein bilden. Der Selektionsdruck auf ein Ausbleiben der Produktexpression führt oft zu einer Anhäufung von deletierten Expressionsvektoren. Die Verwendung von Antibiotika in Fermentationen gemäß dem Stand der Technik wirkt ausgenommen in Bezug auf Arzneimittel-resistente Phänotypen nicht als Kontrolle der deletierten Expressionsvektoren.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Zugabe eines Antibiotikums oder einer Kombination von Antibiotika in bakteroistatischen oder bakteriziden Konzentrationen zum Fermentationsgemisch etwa zu dem Zeitpunkt, zu dem die Produktexpression induziert wird. Die Zugabe von bakteriostatischen oder bakteriziden Konzentrationen eines Antibiotikums etwa zum Zeitpunkt der Produktinduktion erfaßt alle Zellen, jedoch sind die Zellen, die das Produkt bilden, bereits in der Zellteilungsfähigkeit gehemmt und daher verhindert die Antibiotikumzugabe das überwachsen von anormalen Expressionssystemen.
Die Verwendung eines Antibiotikumresistenzgens in einem Expressionssystem ist in der Technik bekannt und erwünscht, da das geeignete Resistenzgen einen Selektionsdruck zur Erhaltung des Expressionsvektors bereitstellt. Die Beispiele 1, 2, 3 und 4 verkörpern neben der Erläuterung der vorliegenden Erfindung auch die Verwendung eines Selektionssystems mit Antibiotikumresistenz, das Tetracyclin im Fermentationsmedium und das Vorkommen eines Tetracyclinresistenzgens auf dem Expressionsvektor verwendet. Es ist jedoch entscheidend zu erwähnen, daß beim Stand der Technik die Verwendung von Antibiotika lediglich den Erhalt eines Antibiotikum-resistenten Phänotyps sicherstellt.
Das zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Expressionssystem ist ein thermoinduzierbares Expressionssystem, das eine starke Expression eines Derivats des Rinderwachstumshormons (bGH) liefert. Der Expressionsvektor pCZR125, der EK-hGH, das zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahren verwendete bGH-Derivat, kodiert, wird aus einer Vielzahl an frei erhältlichen Ausgangsmaterialien konstruiert.
Das Plasmid pCZR125 wird konstruiert, indem man zuerst das Plasmid pKC283 aus E. coli K12 8E1201/pKC283 isoliert. Diese Kultur kann vom NRRL unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-15830 erhalten werden. Das Plasmid pKC283 enthält einen Hybrid-lpp-pL- Promotor des Bakteriophagen Lambda. Dieses Plasmid wird aus den E. coli K12 8E1201 Zellen erhalten, da diese Zellen einen in die zelluläre DNA integrierten temperatursensitiven cI Repressor enthalten. Der nicht benötigte lacZ-Teil des Plasmids pKC283 wird herausgeschnitten, indem man das Plasmid zuerst mit dem Restriktionsenzym PvuII verdaut. Dann werden spezifische DNA Linker zur verdauten DNA gegeben, um die PvuII Schnittstellen in eine XhoI Einzelschnittstelle umzuwandeln, was zu Plasmid pKC283PX führt. Eine detaillierte Beschreibung der Isolierung der Plasmide pKC283 und pKC283PX ist jeweils in den Beispielen 6 und 7 angegeben. Restriktions- und Funktionskarten der Plasmide pKC283 und pKC283PX sind in Figur 1 der Zeichnungen gezeigt. Wie in Beispiel 8 erklärt, wird das Plasmid pKC283PX in E. coli K12 MO(Lambda&spplus;) transformiert. E. coli K12 MO(Lambda&spplus;) ist vom NRRL unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-15993 erhältlich.
Das Plasmid pKC283PX wird als nächstes mit den Restriktionsenzymen BglII und XhoI verdaut. Nachdem der Vektor gereinigt wurde, werden DNA Linker mit BglII und XhoI Enden an den Vektor unter Bildung von Plasmid pKC283-L ligiert. Der BglII-XhoI Linker enthält auch eine XbaI Schnittstelle. Die XhoI Schnittstelle von Plasmid pKC283-L wird als nächstes in eine BamHI Schnittstelle umgewandelt. Dies wird durch einen Totalverdau von Plasmid pKC283-L mit dem Restriktionsenzym XhoI, gefolgt von einer Behandlung mit Klenow und einer anschließenden Zugabe von BAMHI Linkern unter Bildung von Plasmid pKC283-LB erreicht. Detaillierte Beschreibungen der Konstruktionen der Plasmide pKC283-L und pKC283-LB sind jeweils in Beispiel 9 und 10 angegeben. Restriktions- und Funktionskarten der Plasmide pKC283-L und pKC283-LB sind in Figur 1 der Zeichnungen gezeigt.
Die nicht von E. coli stammende DNA wird als nächstes aus dem Plasmid pKC283PX durch einen Totalverdau mit dem Restriktionsenzym SalI, gefolgt von einer Behandlung des 4,0 kb Vektors mit Klenow und einer Zugabe von EcoRI Linkern herausgeschnitten. Nach der Rezirkularisierung durch Ligation wird das Plasmid pKC283PRS gebildet. Das Plasmid pKC283PRS wird dann mit den Restriktionsenzymen PstI und SphI verdaut und das 0,85 kb PstI-SphI Restriktionsfragment wird isoliert. In analoger Weise wird das Plasmid pKC283-LB mit den Restriktionsenzyinen PstI und SphI verdaut und das 3,0 kb Fragment wird isoliert. Das 0,85 kb PstISphI Fragment von pKC283PRS wird dann mit dem 3,0 kb PstI-SphI Vektorfragment von pKC283-LB unter Bildung von Plasmid pL32 ligiert. Detaillierte Beschreibungen der Konstruktion der Plasmide pKC283PRS und pL32 sind in Beispiel 11 angegeben. Restriktions- und Funktionskarten der Plasmide pKC283PRS und pL32 sind in Figur 1 der Zeichnungen gezeigt.
Als nächstes wird das Plasmid pNM789 vom NRRL in E. coli K12 RV308/pNM789 unter der Hinterlegungsnummer B-18216 erhalten. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pNM789 ist in Figur 2 der Zeichnungen gezeigt. Das Plasmid pNM789 wird partiell mit dem Restriktionsenzyen PvuII verdaut, vollständig mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut und dann mit alkalischer Phosphatase behandelt. Als nächstes wird ein neuer PvuII-BamHI Linker mit dem verdauten, dephosphorylierten Vektor pNM789 unter Bildung von Plasmid 120 ligiert. Das Plasmid 120 wird dann vollständig mit den Restriktionsenzymen XbaI und BamHI verdaut und das 0,6 kb XbaI- BamHI EK-bGH-kodierende Restriktionsfragment wird isoliert. Das Plasmid pL32 wird ebenfalls mit den Restriktionsenzymen XbaI und BAMHI verdaut und das 3,9 kb Vektorfragment wird isoliert. Das 0,6 kb XbaI-BamHI Fragment von Plasmid 120 wird dann mit dem 3,9 kb Vektorfragment von Plasmid pL32 unter Bildung von Plasmid pL47 ligiert. Detaillierte Beschreibungen der Konstruktionen der Plasmide 120 und pL47 sind in den Beispielen 11 und 12 angegeben. Restriktions- und Funktionskarten der Plasmide 120 und pL47 sind jeweils in den Figuren 3 und 4 der Zeichnungen gezeigt.
Das Plasmid pPR12 umfaßt das temperaturempfindliche pL Repressorgen cI857 und das Tetracyclinresistenz-verleihende Gen von Plasmid pBR322. Das Plasmid pPR12 ist in der US-A 4 436 815 vom 13. März 1984 beschrieben und beansprucht. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pPR12 ist in Figur 4 der Zeichnungen gezeigt. Die EcoRI Schnittstelle wird aus Plasmid pPR12 entfernt, indem das Plasmid zuerst mit dem Restriktionsenzym EcoRI vollständig verdaut wird und dann eine Klenowbehandlung erfolgt. Der Vektor wird dann unter Bildung von Plasmid pPR12ΔR1 rezirkularisiert. Das Plasmid pPR12ΔR1 wird dann mit dem Restriktionsenzym AvaI verdaut und mit Klenow behandelt. Das AvaI-verdaute, Klenow-behandelte pPR12ΔR1 wird als nächstes mit EcoRI Linkern ligiert, mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten und dann unter Bildung von Plasmid pPR12AR1 rezirkularisiert. Eine detaillierte Beschreibung der Konstruktion von Plasmid pPR12AR1 ist in Beispiel 13 angegeben. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pPR12AR1 ist in Figur 4 der Zeichnungen gezeigt.
Das 2,9 kb PstI-EcoRI Restriktionsfragment von Plasmid pPR12AR1 wird isoliert, nachdem das Plasmid zuerst mit den Restriktionsenzymen PstI und ECORI verdaut wurde. Das Plasmid pL47 wird mit den Restriktionsenzymen PstI und BamHI verdaut und das 2,7 kb PstI-BamHI Restriktionsfragment wird isoliert. In einer getrennten Reaktion wird das Plasmid pL47 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI verdaut und das 1,03 kb EcoRI-BamHI Fragment wird isoliert. Die 2,7 kb PstI-BamHI und 1,03 kb EcoRI- BamHI Restriktionsfragmente von Plasmid pL47 werden mit dem 2,9 kb PstI-EcoRI Restriktionsfragment von Plasmid pPR12AR1 unter Bildung von Plasmid pL110 ligiert. Eine detaillierte Beschreibung der Konstruktion von Plasmid pL110 ist in Beispiel 14 angegeben Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pL110 ist in Figur 4 der Zeichnungen gezeigt.
Das Plasmid pL110 wird mit den Restriktionsenzymen XbaI und BamHI verdaut und das -5,8 kb Fragment wird isoliert. Das 5,8 kb Fragment von Plasmid pL110 wird dann mit einer synthetischen DNA Sequenz ligiert, wie dies in Beispiel 15 beschrieben ist. Die Gegenwart des ersten Cistrons fördert eine stärkere Expression des met-EK-bGH Produkts. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pCZR125 ist in Figur 5 der Zeichnungen gezeigt.
E. coli RV308 kann von den Northern Regional Research Laboratories in lyophilisierter Form unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-15624 erhalten werden. Die E. coli RV308 Wirtszellen werden mit Plasmid pCZR125 transformiert, um das Expressionssystem zu erzeugen, das in dieser Beschreibung zur beispielhaften Darstellung der verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Die E. coli K12 RV308/pCZR125 Expressionssysteme werden während der frühen Stadien des Fermentationsprozesses vorzugsweise bei 33ºC gehalten, wobei die Expressionssysteme lediglich zur Erlangung ausreichender Zellzahlen für die optimale Produktexpression replizieren. Wenn ausreichend hohe Zellzahlen vorhanden sind, wird die Temperatur zur Expressionsinduktion des EK-bGH erhöht. Die Figur 6 zeigt die Induktion der EK-bGH Bildung. Die Zeitspanne von 0 bis etwa sechs Stunden stellt die Zeit dar, in der die Expressionssysteme zu ausreichenden Zahlen für eine optimale Fermentationsproduktion replizieren können. Nach etwa 6 Stunden wird die Temperatur erhöht und dabei der temperatursensitive Repressor inaktiviert. Nach der Inaktivierung des Repressors beginnt die starke Produktexpression.
Wenn thermoinduzierbare Expressionssysteme verwendet werden, werden Antibiotika zum Zweck der vorliegenden Erfindung etwa zu dem Zeitpunkt zugegeben, zu dem die Temperatur des Fermentationsgemisches erhöht wird. Der Fachmann erkennt neben der breiten Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung, daß eine kinetische Analyse der Expressionsvektorreplikation und der Produktexpression erforderlich wäre, wenn andere Expressionssysteme als die, die hierin beispielsgemäß verwendet werden, zum Zweck der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die vorliegende Erfindung beschreibt, daß bei einer Zugabe von Antibiotika in bakteriostatischen oder bakteriziden Konzentrationen etwa zu dem Zeitpunkt, zu dem die Produktexpression induziert wird, die Anhäufung von anormalen Expressionssystemen verhindert wird.
Ein thermoinduzierbares Expressionssystem wird lediglich zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung verwendet. Die vorliegende Erfindung ist in keiner Weise auf die Verwendung dieses Expressionssystemtyps beschränkt, dessen Details lediglich zum besseren Verständnis der Erfindung bereitgestellt werden. Jedes Expressionssystem, das ein rekombinantes Produkt exprimiert und anschließend anhäuft ist ein Selektionsnachteil in einem Fermentationsprozeß und würde daher von der Beschreibung der vorliegenden Erfindung profitieren.
Daher sollte erwähnt werden, daß die vorliegende Erfindung nicht auf thermoinduzierbare Systeme beschränkt ist. Expressionssysteme, in denen die Produktexpression durch induzierbare Promotoren gesteuert wird, wie beispielsweise der trp-, lac- und tac- Promotor, sind Beispiele für andere Promotoren, die weitere Ausführungsformen der Erfindung liefern. Die Induktion der Produktexpression mittels Expressionsvektoren, die die vorher erwähnten Promotoren verwenden, folgt auf die Zugabe von Derepressoren, Substanzen, die die Wirkung der Repressorproteine aufheben. Beispielsweise führt die Zugabe von 3-Indolylessigsäure zu Expressionssystemen, die den trp-Promotor verwenden, zur Derepression des Promotors und zur anschließenden Expression des Gens, das das interessante Produkt kodiert. Expressionssysteme, die den lacoder tac-Promotor verwenden, werden ähnlich nach Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalaktosid dereprimiert. Die Verwendung der vorliegenden Erfindung würde bei diesen Expressionssystemen die Zugabe von bakteriostatischen oder bakteriziden Konzentrationen von Antibiotika etwa zu dem Zeitpunkt umfassen, bei dem die Produktexpression durch die Zugabe eines geeigneten Derepressors induziert wird.
Der Fachmann weiß, daß temperatursensitive Mutanten von vielen Repressoren in der Technik bekannt sind. Die Induktion der Produktexpression in Systemen, die diese temperatursensitiven Regulationssysteme verwenden, tritt dann auf, wenn die Kulturbedingungen erhöht werden. Maniatis et al., "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", 1982, Cold Spring Harbor, NY, faßt verschiedene Expressionssysteme zusammen und diskutiert deren Induktionsmechanismen. Die Anwendung der vorliegenden Erfindung auf jedes Expressionssystem, das eine prokaryontische Wirtszelle verwendet, die mit einem Expressionsvektor transformiert oder transfiziert ist, erfordert nur die Zugabe einer bakteriostatischen oder bakteriziden Konzentration eines Antibiotikums etwa zu dem Zeitpunkt, bei dem die Produktexpression induziert wird.
Der Ausdruck "etwa zu dem Zeitpunkt" beinhaltet kurze Zeitspannen vor und nach der Induktion der Produktexpression. Vor der Induktion der Produktexpression existiert eine Zeitspanne, in der die Expressionssysteme lediglich replizieren können. Das "Animpfen" eines Fermentationsprozesses mit weniger als der optimalen Anzahl an Expressionssystemen ist in der Fermentationstechnik üblich. Daher findet für die Zwecke der vorliegenden Erfindung die Zugabe von bakteriostatischen oder bakteriziden Konzentrationen zumindest eines Antibiotikums statt, wenn ausreichend Expressionsvektoren vorhanden sind und kann kurz vor der Induktion der Produktexpression stattfinden. Ähnlich kann die Zugabe bakteriostatischer oder bakterizider Konzentrationen zumindest eines Antibiotikums anschließend an die Produktinduktion stattfinden. Die Zugabe von bakteriostatischen oder bakteriziden Konzentrationen zumindest eines Antibiotikums ist ebenfalls im Ausdruck "etwa zum Zeitpunkt" enthalten, wenn das Antibiotikum innerhalb eines kurzen Zeitraums nach der Produktinduktion zugegeben wird. Der kurze Zeitraum nach der Induktion der Produktexpression, während dem die Zugabe von bakteriostatischen oder bakteriziden Konzentrationen zumindest eines Antibiotikums zur Durchführung der vorliegenden Erfindung ausgeführt werden kann, liegt vor dem Zeitpunkt im Fermentationsprozeß, bei dem die Anhäufung des interessanten Produkts innerhalb der das Produkt exprimierenden Zellen sie in Bezug auf die Zellteilung in einen Nachteil versetzt und so das Heranwachsen von Zellen fördert, die das Produkt nicht exprimieren. Im allgemeinen wird die Zugabe des Antibiotikums zur Durchführung der vorliegenden Erfindung innerhalb von etwa zwei Stunden nach der Induktion der Produktexpression und vorzugsweise innerhalb etwa einer Stunde nach der Produktexpression vorgenommen.
Die DNA Synthesehemmstoffe, wie beispielsweise Nitrofurane, Acrosaxacin, Novobiocin, Oxolinsäure, Pipemedsäure, Piromidsäure, Norfloxacin, Anthramycin, Bleomycin, Nitroimidazole und speziell Cinoxacin sind für die erfindungsgemäßen Zwecke am meisten bevorzugt. Andere Antibiotika, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beinhalten Zellwandinhibitoren, wie beispielsweise Penicilline, Cephalosporine, Vancomycin, Cycloserin, Alafosfolin, Clavulansäure, Bacitracin, Moenomycin und Ristocetin und insbesondere Ampicillin. Vitaminanaloga, wie beispielsweise Sulfonamide und Trimethoprim, und Enzyminhibitoren, wie beispielsweise Clavulansäure sind ebenfalls für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet und daher sind sie auch in deren Schutzumfang enthalten. Der Fachmann erkennt, daß die vorher genannten Antibiotika lediglich erläuternde Antibiotika sind, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet sind und daß ein Austausch gegen verschiedene andere Antibiotika möglich ist, ohne den Schutzumfang der Erfindung zu überschreiten.
Die vorliegende Erfindung wurde sowohl in definierten als auch in komplexen Medienformulierungen durchgeführt. Komplexe Medien sind für die Verwendung der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Die Beispiele l und 3 erläutern das erfindungsgemäße Verfahren jeweils in definierten und komplexen Medien, während das Beispiel 2 als Kontrollgruppe für das erste Beispiel dient und das Beispiel 4 als Kontrolle für das Beispiel 3 dient. Der Fachmann erkennt, daß das in einem Fermentationsverfahren verwendete Medium für die Maximierung der Produktexpression entscheidend ist. Die Nahrungsanforderungen unterscheiden sich von Expressionssystem zu Expressionssystem und eine Vielzahl an Medien, einschließlich die, die in Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor, NY, diskutiert sind, sollten getestet werden, um das zur Durchführung der Erfindung verwendete beste Medium für das im einzelnen verwendete Expressionssystem zu bestimmen.
Die Ergebnisse der in den Beispielen 1, 2, 3 und 4 ausgeführten Fermentationen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Die Daten der deletierten Expressionsvektoren erhält man durch einen Restriktionsverdau der Expressionsvektoren, die aus dem Fermentationsgemisch am Ende der Fermentation isoliert werden. Die Verwendung der Restriktionsanalyse zur Charakterisierung der Expressionsvektoren ist in der Technik gut bekannt. Die Methodik für die Herstellung und Interpretation der Restriktionskartierung von Expressionsvektoren ist in der Technik gut bekannt. Maniatis, Fritsch und Sambrook liefern in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, eine ausgezeichnete Zusammenfassung zu diesem Thema. Tabelle I Beispiel Medium Cinoxacin (20 ug/ml) Zelltrockengewicht (g/l) Relative Stärke ohne Dimension Deletionen definiert komplex Ja Nein
Die Tabelle I zeigt deutlich, daß ein Antibiotikum, wenn es gemäß der Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, die Anhäufung von deletierten Expressionsvektoren während der Fermentationsprozesse verhindert, wenn man entweder definierte oder vorzugsweise komplexe Medienformulierungen verwendet.
Die Werte der relativen Stärke sind ein Maß für die Aktivität des Rinderwachstumsfaktors. Das Verfolgen der Bildung des Rinderwachstumshormonderivats wird durch eine Kombination von chromatographischen und biologischen Testverfahren erreicht.
Die Konzentration des bGH-Derivats wird in den Fermentationsproben durch Vergleich zu Referenz-EK-bGH mittels Standard- HPLC-Techniken bestimmt. Die Aktivität von EK-bGH in den Proben wird mittels des biologischen Tests bestimmt, wie er in Beispiel 5 beschrieben ist. Der Fachmann erkennt, daß der biologische Test für anfängliche Bestimmungen jedes Biomoleküls essentiell ist. Biochemische und immunologische Tests sind zur Bestimmung der Gesamtmenge von bGH brauchbar, jedoch liefern die biologischen Tests eine Information über die Menge an funktionsfähigem Material. Biologische Tests sind ein bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung der bGH-Aktivität in Proben. Wenn die Ergebnisse der biologischen Tests durchwegs mit der HPLC-Analyse übereinstimmen, oder beispielsweise mit Radio-Immuntests oder enzymgebundenen Immunosorbenttests, ist es bevorzugt, sich auf diese billigen und weniger zeitraubenden Analysen zu verlassen. Die Bestimmungen der relativen Stärke, die in Tabelle I und in Figur 6 angegeben sind, stammen von einer HPLC-Analyse, die gut mit den Daten des biologischen Tests korreliert.
Komplexe Medien sind für die erfindungsgemäße Verwendung bevorzugt, wie dies in Bezugnahme zur Tabelle I deutlich wird. Es wird eine leichte Unterdrückung der Bildung des Rinderwachstumsfaktors beobachtet, wenn das komplexe Medium etwa zum Beginn der Produktexpression mit Cinoxacin versetzt wird. Eine wesentliche Unterdrückung der EK-bGH Bildung wird beobachtet, wenn definiertes Medium verwendet wird. Die Anzucht von Expressionssystemen in definiertem Medium und die Aufwertung des definierten Mediums zum komplexen Medium etwa zum Zeitpunkt, zu dem die Antibiotika zugegeben werden und die Produktexpression induziert wird, wird ebenfalls von der vorliegenden Erfindung erfaßt und ist in ihrem Schutzumfang enthalten.
Die mit Cinoxacin erhaltenen Daten erläutern lediglich die Erfindung und der Fachmann erkennt, daß jedes Antibiotikum, das nicht die Expression des interessanten rekombinanten Polypeptidprodukts zerstört, für die erfindungsgemäßen Zwecke geeignet ist und daher im Schutzumfang enthalten ist.
Cinoxacin ist ein bevorzugtes Antibiotikum zur Duchführung der vorliegenden Erfindung. Der Fachmann erkennt, daß der wirksame Konzentrationsbereich der Antibiotika den bakteriostatischen oder bakteriziden Bereich des im einzelnen verwendeten Antibiotikums oder der im einzelnen verwendeten Antibiotika umfaßt. Der wirksame Bereich der Antibiotikakonzentration wird leicht durch den Fachmann bestimmt und hängt von den einzelnen Expressionssystemen, der Zelldichte der Expressionssysteme, des oder der im einzelnen verwendeten Antibiotikums oder Antibiotika, wie auch von den Fermentationsbedingungen ab.
Wenn Cinoxacin zur Durchführung der vorliegenden Erfindung bei Fermentationen mit dem E. coli RV308/pCZR125 Expressionssystem für die EK-bGH Produktion verwendet wird, liegt die bevorzugte Cinoxacinkonzentration im Bereich von etwa 5 ug/ml bis etwa 50 ug/ml, wobei etwa 10 ug/ml bis etwa 20 ug/ml besonders bevorzugt sind. Die oben erwähnten bevorzugten Konzentrationen beziehen sich auf EK-bGH im RV308/pCZR125 Expressionssystem und erläutern die vorliegende Erfindung lediglich und beschränken den Schutzumfang hiervon nicht.
Um das erfindungsgemäße Verfahren weiter zu erläutern, werden Fermentationen unter Verwendnung von Ampicillin und Novobiocin (beide von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. 63178 bezogen) im E. coli RV308/pCZR125 EK-bGH Fermentationsprozeß ausgeführt. Ampicillin wird in einer Konzentration von etwa 25 ug/ml verwendet, während Novobiocin mit etwa 50 ug/ml verwendet wird. Beide vorher ,erwähnten Antibiotika sind, wenn sie etwa zu dem Zeitpunkt zugegeben werden, zu dem die Produktexpression induziert wird, bei der Verhinderung der Anhäufung von deletierten Expressionsvektoren wirksam. Die verwendeten Antibiotikakonzentrationen sind lediglich erläuternd und der Fachmann erkennt, daß die Konzentration jedes zum Zweck der vorliegenden Erfindung verwendeten Antibiotikums nur durch die Konzentrationen beschränkt ist, die den bakteriostatischen oder bakteriziden Bereich dieses Antibiotikums umfassen.
Die vielen Antibiotika, die für die erfindungsgemäßen Zwecke brauchbar sind, die Kompatibilität der vorliegenden Erfindung mit einer Vielzahl an Medien und die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die vielen Wirtszell/Expressionsvektorsysteme zeigt, daß die vorliegende Erfindung ein deutlicher Fortschritt in der Fermentationstechnik ist.
Die zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung verwendete Wirtszelle ist E. coli K12 RV308 und dieser Stamm ist bevorzugt. Der Fachmann erkennt, daß andere Wirtszellen, wie beispielsweise andere Enterobacteriaceae, Bacillus-Arten und Streptomyces-Arten ebenfalls für das erfindungsgemäße Verfahren zugänglich wären.
Die zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung beschriebenen Beispiele sind lediglich repräsentative Polypeptidprodukte, die mittels der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können. Ein Derivat des Rinderwachstumshormons ist das Polypeptidprodukt, das in den Beispielen zur Erläuterung der Erfindung verwendet wird, wobei jedoch der Fachmann erkennt, daß andere interessante Polypeptidprodukte, die auf Expressionsvektoren kodiert sind, zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet wären, wie beispielsweise β-Galaktosidase, humanes Prä-Proinsulin, humanes Proinsulin, die A-Kette des Humaninsulins, die B-Kette des Humaninsulins, nichthumanes Insulin, humanes Wachstumshormon, insulinähnliche Wachstumsfaktoren, Rinderwachstumshormon, humanes Interferon, nicht-humanes Interferon, virale Antigene, Urokinase, Gewebstyp- Plasminogenaktivator, Interleukine 1-6, Kolonie-stimulierende Faktoren, Erythropoetin und dergleichen.
Die folgenden Beispiele erleichern das Verständnis der Erfindung. Speziell verwendete Meterialien, Arten und Bedingungen erläutern lediglich die Erfindung und sind nicht beabsichtigt, den Schutzumfang hiervon zu beschränken.

Beispiel 1

Die vorliegende Erfindung wird mittels Cinoxacin erläutert (erhältlich von Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN 46285), um das Auftreten von detektierbaren Mengen an deletierten Plasmiden während eines Fermentationsprozesses zur Herstellung eines Derivats des Rinderwachstumshormons zu verhindern.
Eine Medienformulierung, die von Domach et al., 1984, Biotechnology and Bioengineering, Band XXVI: 203-206 beschrieben wurde, wird zur Demonstration der Erfindung verwendet, wobei das Salzmedium besteht aus: Ammoniumsulfat technischen Reinheitsgrades, 0,125 % (VanWaters & Rogers, 7425 E. 30th St. Indianapolis, IN 46219), monobasisches Kaliumphosphat 0,150 % (Ulrich Chemical Inc., 3111 North Post Rd., Indianapolis, IN 46226), Natriumchlorid 0,001 % (Central Indiana Supply Co., P.O. Box 762, Indianapolis, IN 46206), dibasisches Kaliumphosphat 0,3 % (Ulrich Chemical Inc., Terre Haute, IN 47808), Eisen-(II)-sulfat 0,1 % (Mays Chemical Co., Inc. Indianapolis, IN 46226), Natrium-EDTA-7 H&sub2;O 0,00372 % (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178), Magnesiumsulfat zur Fermentation 0,01 % (VanWaters & Rogers, Indianapolis, IN 46219), Glucose (80 %), 0,85 %, Thiamin 0,0005 % (SST Corporation, Clifton, NJ 07012) und Tetracyclin 0,0015 % (Sigma Chemical, St. Louis, MO 63178) werden als Zugaben zum Grundmedium von Donach et al., jeweils zu Ernährungs- und Selektionszwecken gegeben.
Die transformierten Mikroben werden unter Bedingungen kultiviert, die zum Wachstum geeignet sind, bis eine Anzahl erreicht ist, die zur optimalen Produktexpression geeignet ist. Die Expression des rekombinanten Polypeptidprodukts wird induziert und etwa zum selben Zeitpunkt wird sterilfiltriertes Cinoxacin zugegeben, um eine Endkonzentration von 20 ug/ml zu erreichen. Die Fermentation wird in Gegenwart von Cinoxacin fortgesetzt und die Expression des rekombinanten Polypeptidprodukts wird durch Probenahme aus dem Fermentationsgemisch und Austestung auf die Rinderwachstumshormonaktivität verfolgt. Eine repräsentative Fermentation ist in Figur 1 gezeigt.

Beispiel 2

Es wird eine weitere Fermentation im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 durchgeführt. In diesem Verfahren wird kein Cinoxacin zugegeben, wodurch dies als Kontrolle dient und somit die Bestimmung erlaubt, in was für einem Ausmaß Cinoxacin die Anhäufung von deletierten Expressionsvektoren verhindern kann.

Beispiel 3

Das erfindungsgemäße Verfahren wird ferner durch die Verwendung eines komplexen Mediums beschrieben, das durch die Zugabe von 0,5 % G/V autolysierter Hefe (Difco Laboratories, Inc., Detroit, MI 48232) zum Medium vom Beispiel 1 hergestellt wird. Die Zellen werden unter Bedingungen kultiviert die zum Wachstum geeignet sind, bis ausreichende Zellzahlen erhalten werden. Die Produktexpression wird induziert und etwa zur selben Zeit wird Cinoxacin zugegeben, um eine Endkonzentration von 20 ug/ml zu erhalten. Die Fermentation wird in Gegenwart von Cinoxacin fortgesetzt.

Beispiel 4

Es wird eine weitere Fermentation im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 ausgeführt. In diesem Verfahren wird kein Cinoxacin zugegeben, da dies als Kontrolle dient und somit die Bestimmung erlaubt, in was für einem Ausmaß Cinoxacin die Anhäufung von deletierten Expressionsvektoren verhindern kann.

Beispiel 5

Biologischer Test auf die Aktivität des Rinderwachstumshormons

Die Aktivität des Rinderwachstumshormons wird auf die biologische Aktivität mittels des folgenden "Tibia-Tests" bestimmt.
Weibliche Ratten, die im Alter von 25 Tagen hypophysenektomiert werden, wird zusätzlich zum Rattenfutter 5 % Glusosewasser nach Belieben für die ersten 48 Stunden nach der Hypophysenektomie verabreicht, wonach normales Leitungswasser verwendet wird. Am Tag 7 (im Alter von 32 Tagen) nach der Hypophysenektomie werden Tiere, die offensichtlich krank oder schwach sind eliminiert. Alle verbleibenden Ratten werden am Ohr markiert und gewogen. Am Tag 14 (im Alter von 39 Tagen) nach der Hypophysenektomie werden die Ratten erneut gewogen. Ratten, die mehr als 10 Gramm während der siebentägigen Periode zugenommen haben und jene, die mehr als 120 Gramm wiegen, werden eliminiert.
Die Testverbindung wird in möglichst wenig 0,01 M NaHCO&sub3;, pH 8,0 gelöst und wird dann auf das gewünschte Volumen durch die Zugabe physiologischer Kochsalzlösung (0,1 N NaCl) oder destilliertem Wasser gebracht.
Am Tag 14 nach der Hypophysenektomie (im Alter von 39 Tagen) werden die Tiere willkürlich in Kontroll- und Behandlungsgruppen eingeteilt. Ein Gruppe dient als Kontrolle und erhält nur Träger. Alle Behandlungen werden in einem Volumen von 0,1 ml durch subkutane Injektion einmal am Tag 4 Tage lang verabreicht. Die einzelnen Körpergewichte werden am Beginn der Behandlung aufgezeichnet. Etwa 18-24 Stunden nach der vierten Injektion werden die Körpergewichte erneut aufgezeichnet und die Ratten werden durch Asphyixie mittels Kohlendioxid getötet. Die Sella Turcica jeder Ratte wird visuell auf die Vollständigkeit der Hypophysenektomie untersucht. Die rechte Tibia jeder Ratte wird entnommen, vom weichen Gewebe befreit und in einer mittelsagittalen Ebene mit einem Skalpel gespalten, um einen Querschnitt der proximalen epiphysealen Knorpelplatte zu exponieren.
Die so entnommenen und gespaltenen Tibien werden der folgenden histologischen Präparation unterzogen. Die Knochenhälften werden
(1) In 10 %igem neutralem Formalin für mindestens 72 Stunden fixiert.
(2) Ausgiebig für eine Stunde in entionisierten Wasser gewaschen.
(3) Für eine Stunde in Aceton eingelegt.
(4) Erneut für eine Stunde in entionisiertem Wasser gewaschen.
(5) In 2 % Silbernitrat für exakt 2 Minuten getaucht, und dann sofort in entionisiertes Wasser gelegt, während sie für 6 Minuten starkem Licht ausgesetzt sind (calcifizierte Teile erscheinen dunkelbraun).
(6) Rasch aus dem Wasser entfernt und unmittelbar in 10 % Natriumthiosulfat für etwa 30 Sekunden fixiert.
(7) Ausgiebig für 30 Minuten in entionisiertem Wasser gewaschen und bis zum Auswerten in entionisierten Wasser liegengelassen.
Nach der Auswertung werden die Knochen in 80 % Ethanol im Dunkeln gelagert.
Es wird die Breite des nicht-calcifizierten epiphysealen Knorpels bestimmt. Ein binokulares Seziermikroskop mit einer lofachen Okularlinse (Augenstück mit Fadenkreuzmikrometer mit 0,1 mm Einteilungen) und einer 4fachen Objektivlinse wird zur Bestimmung der Knorpelplattenbreite verwendet. Die getrennten Auswertungen werden über die epiphysiale Platte bestimmt und in einem Datenblatt aufgezeichnet. Unter Verwendung eines Vergrößerungsfaktors mit der obigen Linsenkonfiguration wird die Breite der epiphysealen plate in Mikrometer durch Multiplikation jedes Werts mit 25 (mit dieser Linsenkonfiguration ist 1 mm auf einem Lineal mit 40 kleinen Unterteilungen auf dem Fadenkreuz bedeckt und daher entspricht eine Unterteilung = 25 Mikrometer). Die arithmetischen Mittel aller zehn Auswertungen werden für jeden Knochen errechnet. Der Mittelwert aller Knochen innerhalb einer Behandlungsgruppe wird ebenfalls berechnet.
Mittels des obigen Verfahrens werden die in der im folgenden gezeigten Tabelle erhalten. Das Rinderwachstumshormon wird gegen den Träger als Kontrolle und einer Probe aus der Hypophyse als Standardrinderwachstumshormon verglichen, die von der Northern Pituitary Agency erhalten wurde (Verbindung II).

Beispiel 6

Isolierung von Plasmid pKC283

Lyophilisierte E. coli K12 BE1201/pKC283 werden vom Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604 unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-15830 erhalten. Die lyophilisierten Zellen werden in Röhrchen dekantiert, die 10 ml LB Medium (10 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt und 10 g NaCl pro Liter, pH wird auf 7,5 eingestellt) enthalten und dann zwei Stunden bei 32ºC inkubiert, wonach dann die Kulturen auf 50 ug/ml Ampicillin gebracht werden und bei 32ºC über Nacht inkubiert werden. Die E. coli K12 BE1201/pKC283 Zellen werden bei 32ºC kultiviert, da die Zellen ein in die zelluläre DNA integriertes temperaturempfindliches cI Repressorgen enthalten. Wenn Zellen, die ein pL Repressorgen eines Wildtyplambdas enthalten oder keinen Lambda pL- Promotor enthalten, bei diesem Plasmidisolierungsverfahren verwendet werdend wie es in den anschließenden Beispielen beschrieben ist, beträgt die Inkubationstemperatur 37ºC.
Ein kleiner Teil der übernachtkultur wird auf 50 ug/ml Ampicillin enthaltende LB-Agarplatten (LB Medium mit 15 g/l Bacto- Agar) so ausplattiert, daß Einzelkolonieisolate von E. coli K12 BE1201/pKC283 erhalten werden. Die erhaltene Einzelkolonie wird in 10 ml LB Medium geimpft, das 50 ug/ml Ampicillin enthält und bei 32ºC über Nacht unter starkem Schütteln inkubiert. Die 10 ml Übernachtkultur wird in 500 ml LB Medium geimpft, das 50 ug/ml Ampicillin enthält und unter starkem Schütteln bei 32ºC inkubiert, bis die Kultur die stationäre Phase erreicht.
Das folgende Verfahren ist von Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory) übernommen.
Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 4 000 x g für 10 Minuten bei 4ºC geerntet und der Überstand wird verworfen. Das Zellpellet wird in 100 ml eiskaltem STE Puffer (0,1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,8 und 1 mM EDTA) gewaschen. Nach dem Waschen wird das Zellpellet in 10 ml Lösung 1 (50 mM Glucose, 25 mM Tris-HCl pH 8,0 und 10 mM EDTA) resuspendiert, worin 5 mg/ml Lysozym enthalten sind und bei Raumtemperatur für 10 Minuten stehengelassen. Zwanzig ml Lösung 2 (0,2 N NaOH und 1 % SDS) werden dann zu den lysozymbehandelten Zellen gegeben und die Lösung wird vorsichtig durch Kippen gemischt. Das Gemisch wird für 10 Minuten auf Eis inkubiert.
Fünfzehn ml eiskaltes 5 M Kaliumacetat pH 4,8 werden zum lysierten Zellgemisch gegeben und die Lösung wird durch Kippen gemischt. Die Lösung wird für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die 5 M Kaliumacetatlösung wird durch Zugabe von 11,5 ml Eisessig zu 28,5 ml Wasser und 60 ml 5 M Kaliumacetat hergestellt, wobei die entstehende Lösung in Bezug auf Kalium 3 M ist und in Bezug auf Acetat 5 M ist.
Das lysierte Zellgemisch wird in einem Beckman SW27 (oder einem Aquivalent hiervon) bei 20 000 Upm für 20 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Die Zell-DNA und der Debris bilden am Boden des Röhrchens ein Pellet. Etwa 36 ml Überstand werden gewonnen und 0,6 Volumina Isopropanol werden zugegeben, vermischt und die entstehende Lösung wird bei Raumtemperatur für 15 Minuten stehengelassen. Die Plasmid DNA wird durch Zentrifugation bei 12 000 x g für 30 Minuten bei Raumtemperatur gesammelt. Der überstand wird dekantiert und das DNA Pellet wird bei Raumtemperatur mit 70 %igem Ethanol gewaschen. Die Ethanolwaschlösung wird dekantiert und das Pellet wird in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Das Pellet wird dann in 8 ml TE Puffer (10 mM Tris-HCI pH 8,0 und 1 mM EDTA) resuspendiert.
Acht Gramm CsCl werden zur DNA Lösung gegeben. Etwa 0,8 ml einer 10 mg/ml Lösung Ethidiumbromid in Wasser werden zu jeweils 10 ml CsCl-DNA Lösung gegeben. Die schließliche Dichte der Lösung beträgt etwa 1,55 g/ml und die Ethidiumbromidkonzentration beträgt etwa 600 ug/ml. Die Lösung wird in ein Beckman Typ 50 Zentrifugenröhrchen überführt, bis oben mit Paraffinöl aufgefüllt, verschlossen und bei 45 000 Upm für 24 Stunden bei 20ºC zentrifugiert. Nach der Zentrifugation sind zwei DNA Banden bei normalem Licht sichtbar. Nach Entferung des Deckels vom Röhrchen wird die untere DNA Bande mittels einer Spritze mit einer Hypodermisnadel Nr. 21 entfernt, die durch die Seite des Zentrifugenröhrchens eingeführt wird.
Das Ethidiumbromid wird durch mehrere Extraktionen mit wassergesättigtem 1-Butanol entfernt. Das CsCl wird durch Dialyse gegen TE Puffer entfernt. Nach den Extraktionen mit gepuffertem Phenol und Chloroform wird die DNA gefällt, mit 70 %igem Ethanol gewaschen und getrocknet. Etwa 1 mg des Plasmids pKC283 wird erhalten und bei 4ºC in TE Puffer bei einer Konzentration von etwa 1 ug/ul gelagert. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pKC283 ist in Figur 1 der Zeichnungen gezeigt.

Beispiel 7

Konstruktion von Plasmid pKC283PX

Etwa 10 ul der in Beispiel 1 hergestellten Plasmid pKC283 DNA werden mit 20 ul lofach Restriktionspuffer mittleren Salzgehaltes (500 mm NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2; und 10 mM DTT), 20 ul l mg/ml RSA, 5 ul Restriktionsenzym PvuII ( 50 Einheiten, wie sie von den Bethesda Research Laboratories (BRL) definiert werden, wovon alle hierin verwendeten Restriktionsenzyme bezogen wurden), und 145 ul Wasser gemischt und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die hierin beschriebenen Restriktionsreaktionen werden routinemäßig durch Phenol- und Chloroformextraktionen beendet, die von einer DNA Fällung, einem Ethanolwaschschritt und der Resuspendierung der DNA in TE Puffer gefolgt werden. Nach Beendigung des wie oben beschriebenen PvuII Verdaus wird die PvuII-verdaute Plasmid pKC283 DNA gefällt und dann in 5 ul TE Puffer resuspendiert.
Etwa 600 Picomol (pm) XhoI Linker (5'-CCTCGAGG-3') werden in einem Gemisch, das 10 ul 5 fach Kinasepuffer (300 mM Tris-HCl pH 7,8, 50 mM MgCl&sub2; und 25 mM DTT), 5 ul 5 mM ATP, 24 ul H&sub2;O, 0,5 ul T4 Polynukleotidkinase (etwa 2,5 Einheiten, wie dies von P-L Biochemicals definiert wird), 5 ul 1 mg/ml RSA und 5 ul 10 mM Spermidin enthält, durch eine Inkubation des Gemisches bei 37ºC für 30 Minuten phosphoryliert.
Etwa 12,5 ul der phosphorylierten XhoI Linker werden zu den 5 ul der PvuII-verdauten Plasmid pKC283 DNA gegeben, und dann werden 2,5 ul 10 fach Ligasepuffer (300 mM Tris-HCl pH 7,6, 100 mM MgCl&sub2; und 50 mM DTT), 2,5 ul l mg/ml RSA, 7 ul 5 mM ATP, 2,5 ul (etwa 2,5 Einheiten, wie dies von P-L Biochemicals definiert wird) T4 DNA Ligase, 2,5 ul 10 mM Spermidin und 3 ul Wasser zur DNA gegeben. Die entstehende Ligationsreaktion wird bei 4ºC über Nacht inkubiert. Nach der Ligationsreaktion wird das Reaktionsgemisch so eingestellt, daß es die Zusammensetzung des Hochsalzpuffers aufweist (0,1 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl pH 7,5, 10,0 mM MgCl&sub2; und 1 mM DTT). Etwa 10 ul (100 Einheiten) Restriktionsenzym XhoI werden zum Gemisch gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert.
Die Reaktion wird gestoppt und die XhoI-verdaute DNA wird wie oben beschrieben gefällt, resuspendiert und ligiert, außer daß keine XhoI Linker zum Ligationsgemisch gegeben werden. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pKC283PX. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pKC283PX ist in Figur 1 der Zeichnungen gezeigt.

Beispiel 8

Konstruktion von E. coli K12 MO(Lambda&spplus;)/pKC283PX

E. coli K12 MO(Lambda&spplus;) kann von den Northern Regional Research Laboratories in lyophilisierter Form unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-15993 erhalten werden. E. coli K12 MO(Lambda&spplus;) enthält das cI Repressorgen des Lambdawildtyps für pL, so daß die Transkription vom erfindungsgemäßen pL-lpp Hybridpromotor in E. coli K12 MO(Lambda&spplus;) Zellen nicht auftritt. Die lyophilisierten Zellen werden rekonstituiert, Einzelkolonien von MO(Lambda&spplus;) werden isoliert und eine 10 ml Übernachtkultur der MO(Lambda&spplus;) Zellen wird im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 6 hergestellt, außer daß die Inkubationstemperatur 37ºC beträgt und kein Ampicillin im Wachstumsmedium verwendet wird.
Fünfzig ul der Übernachtkultur werden zur Beimpfung von 5 ml LB Medium verwendet, das auch 10 mM MgSO&sub4; und 10 mM MgCl&sub2; enthält. Die Kultur wird über Nacht unter starkem Schütteln bei 37ºC inkubiert. Am folgenden Morgen wird die Kultur auf 200 ml mit LB Medium verdünnt, das 10 mM MgSO&sub4; und 10 mM MgCl&sub2; enthält. Die verdünnte Kultur wird bei 37ºC unter starkem Schütteln inkubiert, bis die Absorption bei 550 nm (A&sub5;&sub5;&sub0;) etwa 0,5 beträgt, das eine Zelldichte von etwa 1 x 10&sup8; Zellen/ml anzeigt. Die Kultur wird für zehn Minuten in einem Eiswasserbad gekühlt und dann werden die Zellen durch Zentrifugation bei 4 000 g für 10 Minuten bei 4ºC geerntet. Das Zellpellet wird in 100 ml kaltem 10 mM MgSO&sub4; resuspendiert und dann sofort erneut durch Zentrifugation pelletiert. Das Zellpellet wird in 100 ml 30 mM CaCl&sub2; resuspendiert und für 20 Minuten auf Eis inkubiert.
Die Zellen werden erneut durch Zentrifugation gesammelt und in 10 ml 30 mM CaCl&sub2; resuspendiert. Ein einem halben Milliliter entsprechender Teil der Zellen wird zu der in Beispiel 7 hergestellten DNA gegeben, wobei die DNA vorher auf 30 mM CaCl&sub2; gebracht wurde. Das Zell-DNA Gemisch wird für eine Stunde auf Eis inkubiert, bei 42ºC für 90 Sekunden einem Hitzeschock unterzogen und dann für etwa 2 Minuten auf Eis gekühlt. Das Zell-DNA Gemisch wird in 10 ml LB Medium in 125 ml Kolben verdünnt und bei 37ºC für eine Stunde inkubiert. Einhundert ul Teile werden auf LB Agarplatten ausplattiert, die Ampicillin enthalten und bei 37ºC inkubiert, bis Kolonien auftreten.
Die Kolonien werden einzeln kultiviert und die Plasmid DNA der Einzelkolonien wird durch Restriktionsanalyse und Gelelektrophorese untersucht. Die Plasmid DNA Isolierung wird in einem kleineren Maßstab gemäß dem Verfahren von Beispiel 6 durchgeführt, aber der CsCl Gradientenschritt wird weggelassen, bis die gewünschten E. coli K12 MO(Lambda&spplus;)/pKC283PX Transformanden identifiziert wurden. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pKC283PX ist in Figur 2 der Zeichnungen gezeigt.

Beispiel 9

Konstruktion von E. coli K12 MO(Lambda-+)/pKC283-L

Zehn ug der gemäß dem Verfahren von Beispiel 6 hergestellten Plasmid pKC283PX DNA werden in 20 ul 10 fach Hochsalzpuffer, 20 ul l mg/ml RSA, 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym BglII, 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym XhoI und 150 ul Wasser gelöst und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für zwei Stunden inkubiert. Die Reaktion wird gestoppt und nach der Fällung der BglII-XhoI verdauten DNA wird die DNA in 5 ul TE Puffer resuspendiert.
Ein DNA Linker mit einzelsträngigen DNA Enden, die für die Restriktionsschnittstellen BglII und XhoI typisch sind, wird synthetisiert und phosphoryliert. Der Linker wird im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 7 phosphoryliert. Der DNA Linker hat die folgende Struktur:
Der oben dargestellte Linker wird aus einzelsträngigen Desoxyoligonukleotiden durch in der Technik bekannte Verfahren synthetisiert. Die einzelsträngigen Desoxyoligonukleotide können mit kommerziell erhältlichen Geräten, wie dem 380A DNA Synthesegerät hergestellt werden, das von Applied Biosystems (850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404) vertrieben wird, das die Phosphoramiditchemie verwendet. Andere Verfahren zur Synthese von DNA sind ebenfalls in der Technik bekannt. Das herkömmliche modifizierte Phosphotriesterverfahren zur Synthese von einzelsträngiger DNA, ist in Itakura et al., 1977, Science 198: 1056 und in Crea et al., 1978, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75: 5765 beschrieben. Zusätzlich ist ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Synthese von DNA in Hsiung et al., 1983, Nucleic Acids Research 11: 3227 und Narang et al., 1980 Methods in Enzymology 68: 90 beschrieben.
Der Linker und das BglII-XhoI-verdaute Plasmid pKC283PX werden im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 7 ligiert. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pKC283-L. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pKC283-L ist in Figur 1 der Zeichnungen gezeigt. Die Plasmid pKC283-L DNA wird zur Transformation von E. coli K12 MO(Lambda&spplus;) verwendet und die entstehenden E. coli K12 MO(Lambda&spplus;)/pKC283-L Transformanden werden im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 8 identifiziert.

Beispiel 10

Konstruktion von E. coli K12 MO(Lambda&spplus;)/pKC283-LB

Etwa 10 ug Plasmid pKC283-L DNA, die im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt wurde, werden in 20 ul 10fach Hochsalzpuffer, 20 ul 1 mg/ml RSA, 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym XhoI und 155 ul H&sub2;O gelöst und die entstehende Reaktion wird für zwei Stunden bei 37ºC inkubiert. Die XhoI-verdaute Plasmid pKC283-L DNA wird dann aus dem Reaktionsgemisch durch die Zugabe von drei Volumina 95 %igem Ethanol und einem Zehntel Volumen 3 M Natriumacetat, einer Inkubation in einem Trockeneis-Ethanolbad für 5 Minuten und einer Zentrifugation ausgefällt. Das entstehende DNA Pellet wird mit 70 %igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 2 ul 10 fach Nicktranslationspuffer (0,5 M Tris-HCl pH 7,2, 0,1 M MgSO&sub4; und l mM DTT), 1 ul einer Lösung mit jeweils 2 mM der Desoxynukleotidtriphosphate, 15 ul H&sub2;O, 1 ul ( 6 Einheiten nach der Definition von P-L Biochemicals) Klenow, das das große Fragment der E. coli DNA Polymerase I ist, und 1 ul 1 mg/ml RSA resuspendiert. Die entstehende Reaktion wird bei 25ºC für 30 Minuten inkubiert und die Reaktion wird durch eine fünfminütige Inkubation der Lösung bei 70ºC gestoppt.
BAMHI Linker (5'-CGGGATCCCG-3') werden phosphoryliert und an die XhoI-verdaute, mit Klenow behandelte Plasmid pKC283-L DNA im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 7 ligiert. Nach der Ligationsreaktion wird die DNA mit 100 Einheiten BamHI für etwa 2 Stunden bei 37ºC in Hochsalzpuffer verdaut. Nach dem BamHI Verdau wird die DNA für die Ligation im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 präpariert.
Das 5,9 kb BamHI Restriktionsfragment wird durch Ligation zirkularisiert und in E. coli K12 MO(Lambda&spplus;) im wesentlichen gemäß den Verfahren der Beispiele 7 und 8 transformiert. Die E. coli K12 MO(Lambda&spplus;)/pKC283-LB Transformanden werden identifiziert und dann wird die Plasmid pKC283-LB DNA im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 6 präpariert. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pKC283-LB ist in Figur 1 der Zeichnungen gezeigt.

Beispiel 11

Konstruktion von E.coli K12 MO(Lambda&spplus;)/pL32

Etwa 10 ug Plasmid pKC283PX werden mit dem Restriktionsenzym SalI in Hochsalzpuffer verdaut, mit Klenow behandelt und an die EcoRI Linker (5'-GAGGAATTCCTC-3') im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 10 mit Ausnahme des Ausgangsplasmids, der Restriktionsenzyme und Linker, die verwendet wurden, ligiert. Nach dem Verdau mit dem Restriktionsenzym ECORI, der zu einem Herausschneiden einer 2,1 kb DNA führt, wird das 4,0 kb EcoRI Restriktionsfragment durch Ligation unter Bildung von Plasmid pKC283PRS zirkularisiert. Die ligierte DNA wird im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 8 zur Transformation von E. coli K12 MO(Lambda&spplus;) verwendet. Nach der Identifizierung der E. coli K12 MO(Lambda&spplus;)/pKC283PRS Transformanden wird die Plasmid pKC283PRS DNA im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 6 präpariert. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pKC283PRS ist in Figur 2 der Zeichnungen gezeigt.
Etwa 10 ug von Plasmid pKC283PRS werden in 200 ul Hochsalzpuffer mit jeweils etwa 50 Einheiten der Restriktionsenzyme PstI und SphI verdaut. Nach der Inkubation der Reaktion bei 37ºC für etwa 2 Stunden wird das Reaktionsgemisch einer Elektrophorese auf einem 0,6 %igen Gel aus bei niedrigen Temperaturen gelierender Agarose (FMC Corporation, Marine Colloids Division, Rockland, Maine 04841) für 2-3 Stunden bei 130 V und 75 mA in Tris-Acetat- Puffer einer Elektrophorese unterzogen.
Das Gel wird in einer verdünnten Ethidiumbromidlösung gefärbt und die das 0,85 kb PstI-Sphl Restriktionsfragment enthaltende Bande, die mittels langwelligem UV-Licht sichtbargemacht wird, wird aus dem Gel in einem kleinen Segment ausgeschnitten. Das Volumen des Segments wird durch Gewicht und Dichte des Segments bestimmt und ein gleiches Volumen 10 mM Tris-HCl pH 7,6 wird zum Röhrchen gegeben, das das Segment enthält. Das Segment wird dann durch eine Inkubation bei 72ºC geschmolzen. Etwa 1 ug des 0,85 kb PstI-SphI Restriktionsfragments von Plasmid pKC283PRS wird in einem Volumen von etwa 100 ul erhalten. In analoger Weise wird das Plasmid pKC283-LB mit den Restriktionsenzymen PstI und SphI verdaut und das entstehende 3,0 kb Restriktionsfragment wird durch Agarosegelelektrophorese isoliert und für die Ligation präpariert.
Das 0,85 kb PstI-SphI Restriktionsfragment von Plasmid pKC283PRS wird mit dem 3,0 kb PstI-SphI Restriktionsfragment von Plasmid pKC283-LB im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 7 ligiert. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pL32. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pL32 ist in Figur 1 der Zeichnungen gezeigt. Das Plasmid pL32 wird in E. coli K12 MO(Lambda&spplus;) Zellen im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 8 transformiert. Die Plasmid pL32 DNA wird im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 6 aus den E. coli K12 MO(Lambda&spplus;)/pL32 Transformanden präpariert. Eine Analyse der Plasmid pL32 DNA zeigte, daß mehr als ein EcoRI Linker an die Klenowbehandelten SalI Enden von Plasmid pKC283PX gebunden wurde. Das Vorkommen von mehr als einem EcoRI Linker beeinträchtigt die Brauchbarkeit von Plasmid pL32 oder von Derivaten von Plasmid pL32 nicht und kann durch das Vorkommen einer XhoI Restriktionsschnittstelle detektiert werden, die erzeugt wird, wenn zwei der EcoRI Linker aneinander ligiert werden. Alternativ dazu kann das Plasmid pL32 durch Ausführung der SalI-EcoRI Excision und Ligation des ersten Abschnitts dieses Beispiels mit dem Plasmid pKC283-LB konstruiert werden.

Beispiel 12

Konstruktion von E. coli K12 MO(Lambda&spplus;)/pL47

E. coli K12 RV308/pNM789 kann von den Northern Regional Research Laboratories in lyophilisierter Form unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18216 erhalten werden. Eine Restriktions- und Funktionskarte von pNM789 ist in Figur 3 der Zeichnungen gezeigt. Die Plasmid DNA wird im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 6 aus der Kultur extrahiert, außer daß die Inkubationstemperatur 37ºC beträgt. Zehn Mikrogramm pNM789 werden in 200 ul PvuII Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM NaCl und 6 mM MgCl&sub2;) suspendiert. Eine Einheit PvuII wird zugegeben und das Reaktionsgemisch wird für 5 Minuten bei 37ºC inkubiert. Das Enzym wird durch eine zehnminütige Erhitzung auf 65ºC inaktiviert. 30 ul 10 fach BamHI Puffer (200 mm Tris-HCl (pH 8,0), 1 M NaCl und 70 mM MgCl&sub2;), 70 ul H&sub2;O und 10 Einheiten BamHI werden als nächstes zugegeben und die Reaktion wird für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Anschließend erfolgt eine Zugabe von 5 Einheiten alkalischer Phosphatase und eine Inkubation für 1 Stunde bei 65ºC. Die DNA Fragmente werden in einem 1 %igen Agarosegel getrennt und ein DNA Fragment (Figur 4) mit der Größe eines einfach geschnittenen Fragments wird gereinigt.
Ein DNA Linker mit einem stumpfen Ende und einem BamHI Ende wird im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 9 synthetisiert. Der Linker (gezeigt in Figur 4) hat die folgende Struktur:
Der Linker wird phosphoryliert und mit dem BamHI-PvuII verdauten Plasmid pNM789 im wesentlichen gemäß der Beschreibung von Beispiel 9 ligiert. Dieses Ligationsgemisch wird zur Transformation von E. coli K12 RV308 Zellen verwendet und die Plasmidisolierung wird mit diesen Transformanden im wesentlichen gemäß der Beschreibung von Beispiel 8 durchgeführt. Es werden einige Plasmide ausgewählt, die das PvuII Fragment (494 bp) und das XbaI-BamHI Fragment (628 bp) mit der richtigen Größe aufweisen. Die Sequenz von mindestens zwei hiervon wird durch Sequenzierung von der BamHI Schnittstelle zur SmaI Einzelschnittstelle bestimmt und ein Klon wird mit der gewünschten Sequenz isoliert. Das als Zwischenstufe benötigte Plasmid wird als Plasmid 120 bezeichnet. Eine schematische Darstellung dieses Verfahrens und eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid 120 ist in Figur 4 der Zeichnungen gezeigt.
Um die EK-BGH-kodierende DNA zu isolieren, werden etwa 10 ug von Plasmid 120 in 200 ul Hochsalzpuffer verdaut, der jeweils etwa 50 Einheiten der Restriktionsenzyme XbaI und BamHI enthält. Die Produkte des Verdaus werden durch Agarosegelelektrophorese getrennt und das 0,6 kb XbaI-BamHI Restriktionsfragment, das EK-BGH kodiert wird isoliert und zur Ligation im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 11 präpariert.
Das Plasmid pL32 wird ebenfalls mit den Restriktionsenzymen XbaI und BamHI verdaut und das 3,9 kb Restriktionsfragment wird isoliert und zur Ligation präpariert. Das 3,9 kb XbaI-BamHI Restriktionsfragment von Plasmid pL32 wird mit dem 0,6 kb XbaI- BamHI Restriktionsfragment von Plasmid 120 im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 7 unter Bildung von Plasmid pL47 ligiert. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pL47 ist in Figur 5 der Zeichnungen gezeigt. Das Plasmid pL47 wird in E. coli K12 MO(Lambda&spplus;) im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 8 transformiert und die E. coli K12 MO(Lambda&spplus;)/pL47 Transformanden werden identifiziert. Die Plasmid p147 DNA wird aus den Transformanden im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 6 isoliert.

Beispiel 13

Konstruktion von E. coli K12 RV308/pPR12AR1

Das Plasmid pPR12 enthält das temperaturempfindliche pL Repressorgen cI857 und das Tetracyclinresistenz-verleihende Gen von Plasmid pBR322. Das Plasmid pPR12 ist in der US-A 4 436 815 vom 13. März 1984 beschrieben und beansprucht. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pPR12 ist in Figur 5 der Zeichnungen gezeigt.
Etwa 10 ug von Plasmid pPR12 werden mit etwa 50 Einheiten Restriktionsenzym EcoRI in 200 ul Hochsalzpuffer bei 37ºC für zwei Stunden verdaut. Die EcoRI verdaute Plasmid pPR12 DNA wird gefällt und mit Klenow im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 10 behandelt. Nach der Klenowreaktion wird die EcoRI-verdaute, Klenow-behandelte Plasmid pPRI2 DNA durch Ligation im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 7 rezirkularisiert. Die ligierte DNA, die aus dem gewünschten Plasmid pPR12ΔR1 besteht wird zur Transformation von E. coli K12 RV308 im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 8 verwendet, außer daß die Selektion auf Tetracyclinresistenz (5 ug/ml) basiert und nicht auf Ampicillinresistenz. E. coli K12 RV308 ist vom NRRL unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-15624 erhältlich. Nachdem E. coli K12 Rv308/pPR12ΔR1 Transformanden identifiziert wurden, wird die Plasmid pPR12ΔR1 DNA im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 6 aus den Transformanden präpariert.
Etwa 10 ug Plasmid pPR12ΔR1 werden mit etwa 50 Einheiten Restriktionsenzym AvaI in 200 ul Puffer mit mittlerem Salzgehalt bei 37ºC für 2 Stunden verdaut. Die AvaI-verdaute Plasmid pPR12ΔR1 DNA wird gefällt und im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 10 mit Klenow behandelt. Nach der Klenowreaktion wird die Avai-verdaute, Klenow-behandelte Plasmid pPR12ΔR1 DNA im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 7 mit EcoRI Linkern (5'-GAG- GAATTCCTC-3') 1igiert. Nach der Linkerligation wird die DNA gefällt und dann in etwa 200 ul Hochsalzpuffer resuspendiert, der etwa 50 Einheiten Restriktionsenzym EcoRI enthält. Die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für etwa 2 Stunden inkubiert. Nach dem Ecorl Verdau wird das Reaktionsgemisch auf ein Agarosegel aufgetragen und das 5,1 kb EcoRI Restriktionsfragment wird im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 11 gereinigt. Das 5,1 kb EcoRI Restriktionsfragment wird im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 durch Ligation rezirkularisiert. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pPR12AR1. Die Plasmid pPR12AR1 DNA wird im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 8 in E. coli K12 RV308 transformiert, außer daß die Selektion auf Tetracyclinresistenz basiert und nicht auf Ampicillinresistenz. Nach der Identifizierung der E. coli K12 RV308/pPR12AR1 Transformanden wird die Plasmid pPR12AR1 DNA im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 6 präpariert. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pPR12AR1 ist in Figur 5 der Zeichnungen gezeigt.

Beispiel 14

Konstruktion von E. coli K12 RV308/pL110

Etwa 10 ug Plasmid pPR12AR1 DNA werden in etwa 200 ul Hochsalzpuffer suspendiert, der jeweils etwa 50 Einheiten der Restriktionsenzyme PstI und EcoRI enthält und der Verdau wird bei 37ºC für etwa 2 Stunden inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird dann auf ein Agarosegel aufgetragen und das 2,9 kb PstI-EcoRI Restriktionsfragment von Plasmid pPR12AR1 wird isoliert und im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 11 zur Ligation präpariert.
Etwa 10 ug von Plasmid pL47 werden mit den Restriktionsenzymen PstI und BamHI in 200 ul Hochsalzpuffer bei 37ºC für 2 Stunden verdaut. Die Psti-BamHI-verdaute DNA wird auf ein Agarosegel aufgetragen und das 2,7 kb PstI-BamHI Restriktionsfragment, das den Replikationsursprung und einen Teil des Ampicillinresistenzverleihenden Gens enthält, wird isoliert und im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 11 für die Ligation präpariert. In einer getrennten Reaktion werden etwa 10 ug Plasmid pL47 DNA mit den Restriktionsenzyeflen EcoRI und BamHI in 200 ul Hochsalzpuffer bei 37ºC für zwei Stunden verdaut und das 1,03 kb EcoRI-BamHI Restriktionsfragment, das die neue Transkriptions- und Translationsaktivierungssequenz und die EK-BGH kodierende DNA enthält, wird im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 11 isoliert und zur Ligation präpariert. Die erhaltenen 2 ug des 1,03 kb EcoRI-BamHI Restriktionsfragments werden bei der Konstruktion von Plasmid pL110 verwendet.
Die 2,7 kb PstI-BamHI und 1,03 kb EcoRI-BamHI Restriktionsfragmente von Plasmid pL47 werden mit dem 2,9 kb PstI-EcoRI Restriktionsfragment von Plasmid pPR12AR1 zur Konstruktion von Plasmid pL110 ligiert und die ligierte DNA wird im wesentlichen gemäß dem Verfahren der Beispiele 7 und 3 zur Transformation von E. coli K12 RV308 verwendet, außer daß Tetracyclinresistenz und nicht Ampicillinresistenz als Grundlage für die Selektion der Transformanden verwendet wird.
Zwei PstI Restriktionsschnittstellen sind in der EK-BGH kodierenden Region vorhanden, die nicht in den Restriktions- und Funktionskarten der Zeichnungen gezeigt sind. Eine Restriktionsund Funktionskarte von Plasmid pL110 ist in Figur 5 der Zeichnungen gezeigt.

Beispiel 15

Konstruktion von Plasmid DCZRI2S

Etwa 26 ug von Plasmid pL110 werden folgendermaßen mit XbaI verdaut. Der lofach XbaI Puffer besteht aus 600 mM Tris-HCl, 100 mm MgCl&sub2;, 1 M NaCl und 10 mM 2-Mercaptoethanol pH 7,5 (bei 37ºC). 50 ul lofach XbaI Puffer, 15 ul XbaI (10 Einheiten/ul) und 185 ul H&sub2;O werden zu den 250 ul Wasser gegeben, die etwa 25 ug von Plasmid pL110 enthalten. Der Verdau läuft bei 37ºC für 1 Stunde. Das XbaI-verdaute pL110 wird dann mit Phenol extrahiert, 1/10 Volumen 3 M CH&sub3;COO-Na wird zugegeben, 3 Volumina Ethanol werden zugegeben und das Gemisch wird auf einem Trockeneis-Ethanolbad für 5 Minuten inkubiert und dann zentrifugiert. Die präzipitierte DNA wird in 50 ul H&sub2;O resuspendiert.
Das XbaI verdaute Plasmid pL110 wird mit BamHI folgendermaßen verdaut. 0,2 ul BamHI (10 Einheiten/ul), 10 ul BamHI Puffer (100 mm Tris-HCl, 50 mM MgCl&sub2;, 1 M NaCl und 10 mM 2-Mercaptoethanol pH 8,0 [bei 37ºC] und 90 ul H&sub2;O werden zu 50 ul des XbaI- verdauten pL110 gegeben, das oben erhalten wurde. Der Verdau läuft für 5 Minuten bei 37ºC. Das verdaute pL110 wird mit Phenol extrahiert, 1/10 Volumen CH&sub3;COO-Na&spplus; wird zugegeben, wonach eine Zugabe von 3 Volumina Ethanol erfolgt. Die gefällte DNA wird in 50 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 Puffer resuspendiert.
Das XbaI und BamHI verdaute pL110 wird dann auf ein Agarosegel aufgetragen und die DNA Bande bei etwa 5,8 kb wird isoliert. Das Plasmid pCZR125 wird durch Ligation des 5,8 kb Fragments von pL110 mit einem XbaI-Ndel Linker und einem synthetischen Gen, das das EK-Rinderwachstumshormon kodiert hergestellt, das eine NdeI Schnittstelle an seinem 5'-Ende und eine BamHI Schnittstelle an seinem 3'-Ende aufweist. Die XbaI-Ndel Sequenz wird mittels Standardoligonukleotidsequenztechnik hergestellt und besteht aus der folgenden Sequenz:
Die obige Sequenz wird durch chemische Synthese beider Stränge und einem anschließenden Mischen konstruiert, das die Hybridisierung erlaubt. Das das EK-bGH kodierende Gen wird aus 16 chemisch syntlietisierten Stücken einzelsträngiger DNA konstruiert, die jeweils 71 bis 83 Nukleotide lang sind und zusammen beide komplementären Stränge des gesamten Gens umfassen. Die Synthese wurde von Batelle mittels einer Applied Biosystems (ABS) Maschine ausgeführt und besteht aus der folgenden Sequenz:
Die Konstruktion von Plasmid pCZR125 wird durch Ligation der folgenden Einzelbestandteile ausgeführt: 0,28 ug des von Plasmid pL110 nach einem Totalverdau von XbaI und einem Partialverdau mit BamHI erhaltenen 5,8 kb Fragments in einem Gesamtvolumen von 2 ul, 0,18 ug des synthetischen Gens, das ein Derivat des Rinderwachstumsfaktors kodiert, dessen 5'-Enden einer XbaI Schnittstelle entsprechen und dessen 3'-Enden einer BamHI Schnittstelle entsprechen, in einem Gesamtvolumen von 2,5 ul, 8,75 Picomol des chemisch synthetisierten XbaI-NdeI Linkers in 1 ul. Die Plasmidkomponenten werden zu 6 ul 5fach Ligationspuffer gegeben: 250 mm Tris-HCl, 50 mM MgCl&sub2;, 5 mM ATP, 5 mM DTT, 25 % V/V Polyethylenglykol 8000, pH 7,6, 2 ul Ligase und 16,5 ul H&sub2;O. Das Ligationsgemisch wird über Nacht bei 16ºC inkubiert. Das zirkularisierte Plasmid pCZR125 wird zur Transformation von E. coli RV308 Zellen im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 8 verwendet.

Claims

1. Verfahren zur Kontrolle einer anormalen Replikation eines Expressionsvektors, gekennzeichnet durch die Zugabe zumindest einer bakteriostatischen Konzentration eines Antibiotikums zu einem Fermentationsgemisch etwa zu dem Zeitpunkt, zu dem die Produktexpression induziert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin dieses Antibiotikum aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Hemmstoffen der DNA-Synthese, Hemmstoffen der Zellwandsynthese, Enzymhemmstoffen und Vitaminanaloga besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin dieses Antibiotikum ein Hemmstoff der DNA-Synthese ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin dieser Heinrnstoff der DNA-Synthese aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Nitrofuran, Cinoxacin, Acrosaxacin, Novobiocin, Oxolinsäure, Pipemidinsäure, Piromidinsäure, Norfloxacin, Anthramycin und Bleomycin besteht.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin dieser Hemmstoff der DNA-Synthese Cinoxacin oder Novobiocin ist.

6. Verfahren nach Anspruch 2, worin dieses Antibiotikum ein Hemmstoff der Zellwandsynthese ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin dieser Hemmstoff der Zellwandsynthese aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Penicillinen, Cephalosporinen, Vancomycin, Cycloserin, Alafosfolin, Fosfomycin, Clavulansäure, Bacitracin, Moenomycin und Ristocetin besteht.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin dieser Hemmstoff der Zellwandsynthese Ampicillin ist.

9. Verfahren nach Anspruch 2, worin dieses Antibiotikum ein Enzymhemmstoff ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin dieser Enzymhemmstoff Clavulansäure ist.