HUT54415A - Process for controlling accumulation of aberrant expressing vectors with fermentation processes - Google Patents
Process for controlling accumulation of aberrant expressing vectors with fermentation processes Download PDFInfo
- Publication number
- HUT54415A HUT54415A HU903975A HU397590A HUT54415A HU T54415 A HUT54415 A HU T54415A HU 903975 A HU903975 A HU 903975A HU 397590 A HU397590 A HU 397590A HU T54415 A HUT54415 A HU T54415A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- expression
- antibiotic
- restriction
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 37
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 title abstract description 10
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 title abstract description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 30
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 37
- VDUWPHTZYNWKRN-UHFFFAOYSA-N cinoxacin Chemical compound C1=C2N(CC)N=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC2=C1OCO2 VDUWPHTZYNWKRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 229960004621 cinoxacin Drugs 0.000 claims description 20
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 claims description 15
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 13
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical group C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 13
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims description 6
- YJQPYGGHQPGBLI-UHFFFAOYSA-N Novobiocin Natural products O1C(C)(C)C(OC)C(OC(N)=O)C(O)C1OC1=CC=C(C(O)=C(NC(=O)C=2C=C(CC=C(C)C)C(O)=CC=2)C(=O)O2)C2=C1C YJQPYGGHQPGBLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 229960002950 novobiocin Drugs 0.000 claims description 5
- YJQPYGGHQPGBLI-KGSXXDOSSA-N novobiocin Chemical compound O1C(C)(C)[C@H](OC)[C@@H](OC(N)=O)[C@@H](O)[C@@H]1OC1=CC=C(C(O)=C(NC(=O)C=2C=C(CC=C(C)C)C(O)=CC=2)C(=O)O2)C2=C1C YJQPYGGHQPGBLI-KGSXXDOSSA-N 0.000 claims description 5
- HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N Clavulanic acid Natural products OC(=O)C1C(=CCO)OC2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 claims description 4
- 229960003324 clavulanic acid Drugs 0.000 claims description 4
- HZZVJAQRINQKSD-PBFISZAISA-N clavulanic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1C(=C/CO)/O[C@@H]2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-PBFISZAISA-N 0.000 claims description 4
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 4
- 108010001478 Bacitracin Proteins 0.000 claims description 2
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 claims description 2
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 claims description 2
- DYDCUQKUCUHJBH-UWTATZPHSA-N D-Cycloserine Chemical compound N[C@@H]1CONC1=O DYDCUQKUCUHJBH-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 2
- DYDCUQKUCUHJBH-UHFFFAOYSA-N D-Cycloserine Natural products NC1CONC1=O DYDCUQKUCUHJBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KYGZCKSPAKDVKC-UHFFFAOYSA-N Oxolinic acid Chemical compound C1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC2=C1OCO2 KYGZCKSPAKDVKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 2
- 108010081391 Ristocetin Proteins 0.000 claims description 2
- VGQOVCHZGQWAOI-UHFFFAOYSA-N UNPD55612 Natural products N1C(O)C2CC(C=CC(N)=O)=CN2C(=O)C2=CC=C(C)C(O)=C12 VGQOVCHZGQWAOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 claims description 2
- VGQOVCHZGQWAOI-HYUHUPJXSA-N anthramycin Chemical compound N1[C@@H](O)[C@@H]2CC(\C=C\C(N)=O)=CN2C(=O)C2=CC=C(C)C(O)=C12 VGQOVCHZGQWAOI-HYUHUPJXSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003071 bacitracin Drugs 0.000 claims description 2
- 229930184125 bacitracin Natural products 0.000 claims description 2
- CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N bacitracin A Chemical compound C1SC([C@@H](N)[C@@H](C)CC)=N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@H](CCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2N=CNC=2)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCCCC1 CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N 0.000 claims description 2
- PERZMHJGZKHNGU-JGYWJTCASA-N bambermycin Chemical compound O([C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O1)CO[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@H]1NC(C)=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)C(=O)NC=1C(CCC=1O)=O)O)C)[C@H]1[C@@H](OP(O)(=O)OC[C@@H](OC\C=C(/C)CC\C=C\C(C)(C)CCC(=C)C\C=C(/C)CCC=C(C)C)C(O)=O)O[C@H](C(O)=O)[C@@](C)(O)[C@@H]1OC(N)=O PERZMHJGZKHNGU-JGYWJTCASA-N 0.000 claims description 2
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 claims description 2
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 claims description 2
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 claims description 2
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 claims description 2
- BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N chembl1095986 Chemical compound C1[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]1C(N[C@H](C2=CC(O)=CC(O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C2C=2C(O)=CC=C(C=2)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3C=4C=C(C(=C(O)C=4)C)OC=4C(O)=CC=C(C=4)[C@@H](N)C(=O)N[C@@H](C(=O)N3)[C@H](O)C=3C=CC(O4)=CC=3)C(=O)N1)C(O)=O)=O)C(C=C1)=CC=C1OC1=C(O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]5[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O5)O)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)C4=CC2=C1 BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003077 cycloserine Drugs 0.000 claims description 2
- OGJPXUAPXNRGGI-UHFFFAOYSA-N norfloxacin Chemical compound C1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC(F)=C1N1CCNCC1 OGJPXUAPXNRGGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960001180 norfloxacin Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000321 oxolinic acid Drugs 0.000 claims description 2
- RCIMBBZXSXFZBV-UHFFFAOYSA-N piromidic acid Chemical compound N1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CN=C1N1CCCC1 RCIMBBZXSXFZBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960004444 piromidic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 229950004257 ristocetin Drugs 0.000 claims description 2
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 claims description 2
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940122029 DNA synthesis inhibitor Drugs 0.000 claims 3
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 claims 3
- 229940123982 Cell wall synthesis inhibitor Drugs 0.000 claims 2
- 230000004260 plant-type cell wall biogenesis Effects 0.000 claims 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims 1
- -1 alafosolin Chemical compound 0.000 claims 1
- 229960000308 fosfomycin Drugs 0.000 claims 1
- YMDXZJFXQJVXBF-STHAYSLISA-N fosfomycin Chemical compound C[C@@H]1O[C@@H]1P(O)(O)=O YMDXZJFXQJVXBF-STHAYSLISA-N 0.000 claims 1
- IAIWVQXQOWNYOU-FPYGCLRLSA-N nitrofural Chemical group NC(=O)N\N=C\C1=CC=C([N+]([O-])=O)O1 IAIWVQXQOWNYOU-FPYGCLRLSA-N 0.000 claims 1
- 229960001907 nitrofurazone Drugs 0.000 claims 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims 1
- JOHZPMXAZQZXHR-UHFFFAOYSA-N pipemidic acid Chemical compound N1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CN=C1N1CCNCC1 JOHZPMXAZQZXHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960001732 pipemidic acid Drugs 0.000 claims 1
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 claims 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 24
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 158
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 74
- 239000000047 product Substances 0.000 description 57
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 40
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 35
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 14
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 13
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 12
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 9
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 9
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 9
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 9
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 9
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 8
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 7
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 6
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 5
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 5
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 239000003111 growth hormone derivative Substances 0.000 description 5
- 229940121366 growth hormone derivative Drugs 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 3
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;ethanol Chemical compound CCO.O=C=O OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- SPFMQWBKVUQXJV-BTVCFUMJSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;hydrate Chemical compound O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O SPFMQWBKVUQXJV-BTVCFUMJSA-N 0.000 description 1
- HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(4-chlorophenyl)-2-(4-methylphenyl)sulfonylbutane-1,4-dione Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)C(C(=O)C=1C=CC(Cl)=CC=1)CC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUBFWTUFPGFHOJ-UHFFFAOYSA-N 2-nitrofuran Chemical class [O-][N+](=O)C1=CC=CO1 FUBFWTUFPGFHOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HETSDWRDICBRSQ-UHFFFAOYSA-N 3h-quinolin-4-one Chemical class C1=CC=C2C(=O)CC=NC2=C1 HETSDWRDICBRSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010072454 CTGCAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101500025354 Homo sapiens Insulin B chain Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical class CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000004353 Polyethylene glycol 8000 Substances 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000003570 biosynthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940111685 dibasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229960002017 echothiophate Drugs 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H iron(3+) sulfate Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229910000360 iron(III) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229940111688 monobasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004957 nitroimidazoles Chemical class 0.000 description 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 229940085678 polyethylene glycol 8000 Drugs 0.000 description 1
- 235000019446 polyethylene glycol 8000 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 229940072176 sulfonamides and trimethoprim antibacterials for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical class [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-L thiosulfate(2-) Chemical compound [O-]S([S-])(=O)=O DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O vancomycin(1+) Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C([O-])=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)[NH2+]C)[C@H]1C[C@](C)([NH3+])[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 150000002266 vitamin A derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Alcoholic Beverages (AREA)
- Fertilizers (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK
A fermentációs eljárásokat évtizedek óta használják antibiotikumok előállítására, és az itt felhalmozódott ismeret hasznos a fehérjék génsebészeti utón való előállításában is. A szokványos fermentációs eljárásoktól eltérően, amelyek során a természetből izolált mikroorga-
• · · · nizmusokat tenyésztik, amelyek a fontos molekulát termelik és gyakran szekretálják, a genetikailag megváltozott sejtek gyakran alkalmatlanok az expressziós vektor msgtartására, valamint ezt követően a kívánt termék előállítására.
Az extrakromoszómális elemek, például a plazmidok és más expressziós vektorok gyakran elvesznek, ha nem jelentenek növekedési vagy túlélési előnyt a gazdaszervezet számára. A fermentációs eljárások során azok a gazdasejtek, amelyek kiejtették az extrakromoszómális elemeket, a továbbiakban nem szenvednek attól a metabolikus elszívástól, amit ezeknek az expreesziós vektoroknak fenntartása jslent, ezért nem gátlódik a növekedési sebességük, Rövid idő alatt azok a gazdasejtek, amelyek nem tartalmazzák ezeket az extrakromoszómális elemeket, túlnövik azokat a gazdasejteket, amelyeknek a növekedését gátolja az értékes termék expressziója és felhalmozása. Ezt az előnytelen genetikai anyag szelekciójához vezető folyamatot évek óta dokumentálják gyógyszerrezisztens baktériumoknál. Az jól ismert, hogy annak az antibiotikumnak az eltávolítása, amelye való rezisztenciát egy plazmidon kódolt gén szolgáltatja, olyan baktérium-populációt eredményez, amelyben a gyógyszerrezisztenciát adó plazmid csak a baktériumok kis százalékában marad fenn.
Az antibiotikum rezisztencia géneket gyakran beépítik expressziós vektorokba, hogy ezzel lehetővé te• · ·
- 3 gyék a transzformánsok és transzfektánsok szelektálását, valamint szelekciós nyomást biztosítsanak az expreszsziós rendszer megtartásához az ismételt tenyésztés során. Az antibiotikum által kifejtett szelekciós nyomás biztosítja a gyógyszerrezisztens fenotipus fennmaradását, de nem zárja ki olyan plazmidok megjelenését, amelyek antibiotikum rezisztenciát szolgáltatnak, viszont hiányzik belőlük az a rész, amely biztosítja a kívánt termék keletkezését.
Egy idegen fehérje előállítása metabolikus elszívást jelent azoknak a sejteknek a számára, amelyek a kívánt terméket expresszálják és felhalmozzák, és szelekciós nyomást fejt ki a terméket többé nem termelő sejtek felé,
A jelen találmány tárgya olyan eljárás, amely során antibiotikumot vagy antibiotikumok kombinációját adjuk bakteriosztatikus vagy baktericid koncentrációban a fermentációs elegyhez abban a pillanatban, amikor a termék expresszióját indukáljuk. Egy antibiotikum bakteriosztatikus vagy baktericid koncentrációban való hozzáadása az elegyhez a termék indükálásának pillanatában az összes Sejtet érinti; azonban a terméket előállító sejtek már késésben vannak a sejtosztódásban, ezért az antibiotikum hozzáadása úgy működik, hogy megakadályozza az abnormális expreszsziós rendszerek elszaporodását.
Az antibiotikumok felhasználását a jelen találmány szerinti célokra még nem irták le, A korábbi publikációkban már közölték, hogy az antibiotikumokat gyakran használják plazmidok és más extrakromoszómális elemeknek a gazdasejtből való eliminálására, Michel -Briand és munkatársai CO. Antimicrob, Chemother, , 18., 667-674 (1986)] néhány 4-kinolon származék használatát írják le, beleértve a cinoxacint és novobiocint, azzal a céllal, hogy az Entsrobacteriacae családba tartozó sejtekből különböző gyógyszerrezisztencia plazmidokat irtsanak ki. Számos más cikkben [Trevors, FEMS Microbiol, Rév,, 32., 149-157 (1986); VVolfson et al, , □, Bacteriol,, 152, 338-344 (1982); VVeissner and
Wiedemann, □, Antimicrob. Chemother*, 18, 574-584 (1987)] is közlik antibiotikumok alkalmazását plazmidok kiirtására, A jelen találmány alapvetően különbözik attól, amit a korábbiakban az antibitotikumok használatáról írtak le az expressziós vektorok eliminálására; valójában a jelen találmány célja ezzel pont ellentétes,
A jelen találmányig nem volt ismert módszer arra, hogy biztosítsuk azt, hogy a fermentációs eljárás során azok a sejtek, amelyek elvesztették termék-előállító képességüket és ezzel növekedésük meggyorsult, ne nőjék túl a terméket bioszintetizáló sejteket,
A jelen találmány leírása és igénypontjainak meghatározása során a következő szakkifejezéseket használjuk:
Gazdasejt - olyan sejt, amely egy expressziós vektorral transzformálható vagy transzfektálható.
• · • · · · · ···· · · · · ··· ·♦·
- 5 Expressziós rendszer - a kívánt terméket bioszintetizáló gazdasejt és expressziós vektor kombinációja.
Indukció - olyan fermentációs körülmények, amelyek alkalmasak a kivánt polipeptid termék megnövekedett expressziójának előidézésére.
Expresszió - a kívánt termék transzkripciója és transzlációja.
Fermentáció - a mikroorganizmusok növesztésére alkalmas aerob vagy anaerob kürölmények.
Bakteriosztatikus - egy antibiotikumnak az a koncentrációja, amely megakadályozza a mikrobiális 9ej tosztódást,
Baktericid - egy antibiotikumnak az a koncentrációja, amely elpusztítja az aktivan növekedő mikrobiális sejteket.
Abnormális expressziós vektor - egy olyan expreszsziós vektor, amely szabályozó vagy kódoló szakaszainak deléciója miatt tovább nem expresszálja a kivánt terméket.
Abnormális expressziós rendszer - aberráns expressziós vektort tartalmazó gazdasejt.
Fidelitás - egy expressziós vektornak az a képessége, hogy fenntartja-e a termék expresszióját.
♦ · — 6 —
Szarvasmarha növekedési hormon származék egy olyan polipeptid termék, amely a szarvasmarha növekedési hormonhoz hasonló biológiai aktivitással rendelkezik.
Expressziós vektor - bármely ágens, amely önálló replikációra vagy genomiális integrációra képes, beleértve a plazmidokat de nem korlátozódva rájuk, amely olyan DNS molekula, amelybe egy vagy több transzkripciós és transzlációs szabályozó szekvenciát, valamint a kívánt polipeptidet kódoló gént építünk be olymódon, hogy a kívánt polipeptidet kódoló gén expresszióját lehetővé tegyük,
A következő ábrákat a találmány megértésének elősegítése céljából adjuk meg.
1. ábra - A pL32 plazmid készítését leiró folyamat- ábra.
2. ábra - A pNM 789 plazmid restrikciós és funkciós térképe.
3. ábra - A 120 plazmid készítését leiró folyamat- ábra.
4. ábra - A pLl10 plazmid készítését leiró folya- matábra.
5. ábra - A pCZRl25 plazmid restrikciós és funk- ciós térképe.
6. ábra - Bemutatja az EK-bGH termék-expesszió indukciója és a termelés közötti kapcsolatot.Cinoxacint körülbelül a hatodik órában adunk a rendszerhez.
• · • · · · · ···· · ··· ··· ·· ·
- 7 A jelen találmány tárgya eljárás az expressziós vektor fidelitásának biztosítására rekombináns expressziós vektorokat alkalmazó fermentációs eljárásokban. Ha expreszsziós rendszereket indukálunk termék expresszálása céljából, akkor negatív szelekciós nyomást fejtünk ki mindegyik sejtre, amelyik idegen fehérjét termel. A termék sxpreszszálásának hiánya felé való szelekciós nyomás gyakran dsléciós expressziós vektorok felhalmozódását eredményezi.
A jelen találmány tárgya egy antibiotikum vagy antibiotikumok kombinációjának hozzáadása a fsrmentléhez bakteriosztatikus vagy baktericid koncentrációban a termék expresszálása indukciójának pillanatában. Egy antibiotikum bakteriosztatikus vagy baktericid koncentrációban való hozzáadása az elegyhez a termék indukálásának pillanatában az összes sejtet érinti} azonban a terméket előállító sejtek már késésben vannak a sejtosztódásban, ezért az antibiotikum hozzáadása úgy működik, hogy megakadályozza az abnormális expressziós rendszerek elszaporodását.
Egy antibiotikum rezisztencia gén alkalmazása egy expressziós rendszerben ismert a szakirodalomban és kívánatos, annyiban, amennyiben a megfelelő rezisztencia gén szelekciós nyomást jelent az expressziós vektor megtartására, Az 1«, 2, , 3, és 4, példák, miközben a jelen találmányt illusztrálják, leírják azt az antibiotikum-rezisztencia szelekciós rendszert, amely tetraciklint alkalmaz a *« ί·ν» ♦·<· V • · · · · ·· φ ·♦····· · • · · · · ···· · · · · ··· *· ·
- 8 fermentációs táptalajban, és tetraciklin rezisztencia gén található az expressziós vektoron. Fontos megjegyezni, hogy a szakterületen az antibiotikumok használatával korábban csak az antibiotikum rezisztencia fenotipus megtartását lehetett biztosítani.
A jelen találmány szerinti eljárás illusztrálására használt expressziós rendszer egy termoindukciós expressziós rendszer, amely magas szinten expresszál egy szarvasmarha növekedési hormon származékot (bGH). Az EK-bGH-t (a jelen találmány szerinti eljárás illusztrálásában használt bGH származék) kódoló pCZRl25 expressziós vektort számos, bárki számára hozzáférhető kiindulási anyagból állítottuk elő,
A pCZR125 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy először izoláljuk a pKC283 plazmidot E.coli K12 BEl20l/pKC283 törzsből. Ez a törzs hozzáférhető az NRRL-nél NRRL B-15830 sorszám alatt. A pl<C283 plazmid a lambda bakteriofágból származó hibrid lpp-pL promotert tartalmazza. Ezt a plazmidot az E.coli K12 BE1201 sejtekből lehet előállítani, mivel ezek a sejtek a celluláris DNS-be integrálódva egy hőmérséklet-érzékeny cl represszort tartalmaznak. A pKC283 plazmid felesleges lacZ részét eltávolítjuk, a plazmidot először PvuII restrikciós enzimmel emésztve. Az emésztett DNS-hez ezután specifikus DNS linkereket adunk, ezzel a PvuII helyet egyedüli Xhol restrikciós hellyé alakítjuk, igy állítjuk elő a pKC283PX plazmidot. A pKC283 és pKC283PX plazmidok izolálásának részletes leírását a 6. illetve a 7,példában adjuk meg. A pKC283 és pKC283PX plazmidok restrikciós és funkciós • · • · · • ··· · ·· * • · · térképét a mellékelt rajzok között az 1. ábrán adjuk meg.
Amint azt a 8, példában elmagyarázzuk, a pKC283PX plazmidot
E, coli K12 MO (lambda+) törzsbe transzformáljuk. Az E.coli
K12 MO (lambda+) törzs az NRRL-nél hozzáférhető NRRL B-15993 sorszám alatt,
A pKC283PX plazmidot ezután BglII és Xhol restrikciós enzimekkel emésztjük. Miután a vektort megtisztítottuk, BglII illetve Xhol végű DNS-linkereket ligálunk a vektorba, igy kapjuk a pKC283-L plazmidot, A BglII-XhoI linker tartalmaz egy Xbal helyet is. A pKC283-L plazmid Xhol helyét ezután BamHI hellyé alakítjuk át. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy a pKC283-L plazmidot teljesen megemésztjük Xhol restrikciós enzimmel, majd Klenow fragmenttel kezeljük, végül BamHI linkereket adunk hozzá, igy állítjuk elő a pl<C283-LB plazmidot.
A pKC283-L és pKC283-LB plazmidok készítésének részletes leírása a 9. illetve 10. példában található meg. A pKC283-L és pKC283-LB plazmidok restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt rajzok között az 1, ábrán mutatjuk be.
Az idegen E. coli DNS-t ezután kihasítjuk a pKC283PX plazmidból, olymódon, hogy először teljesen megemésztjük Sáli restrikciós enzimmel, majd a kapott kb. 4,0 kb méretű vektort Klenow fragmenttel kezeljük, végül EcoRI linkért adunk hozzá, Ljgálással recirkulárizálj uk, igy kapjuk a pKC283PRS plazmidot, A pKC283PRS plazmidot ezután PstI és Sphl restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a kapott kb, 0,85 kb méretű • ·· • · ·· • · · • * • · · ·«·
- 10 Pstl-Sphl restrikciós fragmentet izoláljuk. Analóg módon a pKC283-LB plazmidot PstI és Sphl restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a kb, 3,0 kb méretű fragmentet izoláljuk. A pKC283PRS vektor kb, 0,85 kb méretű Pstl-Sphl fragmentjét ezután a pKC283-LB vektor kb. 3,0 kb méretű Pstl-Sphl fragmentjébe ligáljuk,igy kapjuk a pL32 plazmidot, A pKC283PRS és pL32 plazmidok készítésének részletes leírását a 11, példában adjuk meg, A pKC283PRS és pL32 plazmidok restrikciós és funkciós térképét a mellékelt rajzok között az 1. ábrán adjuk meg.
Ezután a pNM789 plazmidot állítjuk elő az NRRL
B-18216 sorszám alatt hozzáférhető E.coli K12 RV308/pNM789 törzsből, A pNM789 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt rajzok között a 2, ábrán adjuk meg, A pNM789 plazmidot részlegesen emésztjük PvuII restrikciós enzimmel, majd teljesen megemésztjük BamHI restrikciós enzimmel, végül alkalikus foszfatázzal kezeljük. Ezután PvuII-BamHI linkért ligálunk az emésztett, foszfatázozott pNM789 vektorba, igy kapjuk a 120 plazmidot, A 120 plazmidot ezután teljesen megemésztjük Xbal és BamHI restrikciós enzimekkel, és a kb, 0,6 kb méretű, az EK-bGH-t kódoló Xbal-BamHI restrikciós fragmentet izoláljuk, A pL32 plazmidot is emésztjük Xbal illetve BamHI restrikciós enzimmel, és a kb, 3,9 kb méretű vektorfragmentet izoláljuk, A 120 plazmid kb, 0,6 kb méretű Xbal-BamHI fragmentjét ezután a pL32 plazmid kb 3,9 kb méretű vektorfragmentjébe klónozzuk, igy kapjuk a pL47 plazmidot, A 120 és pL47 plazmidok készítésének részletes leírását a 11. illetve 12, példában közöljük.
«** ·<*♦ ··♦· • *···«·· * • · < * * ···· · ··· · *· **·
- 11 A 120 és pL47 plazmidok restrikciós és funkciós térképét a mellékelt rajzok között a 3. illetve 4, ábrán mutatjuk be.
A pPRl2 plazmid tartalmazza a cI857 hőmérséklet-érzékeny pL represszor gént és a pBR322 plazmid tetraciklin rezisztencia génjét. A pPR12 plazmidot az 1984 március 13-i 4 436 815 sorszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban Írják le és teszik szabadalmi oltalom tárgyává.
A pPRl2 plazmid restrikciós és funkciós térképét a mellékelt rajzok között a 4, ábrán mutatjuk be. Az EcoRI hasítási helyet olymódon távolitjuk el a pPRl2 plazmidból, hogy a plazmidot először teljesen megemésztjük az EcoRI restrikciós enzimmel, majd Klenow enzimmel kezeljük. A plazmidot ezután ligálással recirkularizáljuk igy jön létre a pPR1R1 plazmid, A pPR1R1 plazmidot ezután Aval restrikciós enzimmel emésztjük, majd Klenow enzimmel kezeljük. Az Aval enzimmel emésztett, Klenow enzimmel kezelt pPRIRi plazmidot ezután EcoRI linkerekhez ligáljuk, EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, majd ligálással recirkulárizálva kapjuk a pPRl2ARi plazmidot, A pPRl2AR1 plazmid készítésének részletes leírását a 13. példában adjuk meg. A pPRi2ARl plazmid restrikciós és funkciós térképét a mellékelt rajzok között a 4, ábrán mutatjuk be,
A pPRl2ARl plazmid kb, 2*9 kb. méretű Pstl-EcoRI restrikciós fragmentjét PstI és EcoRI restrikciós enzimekkel való emésztés után izoláljuk. A pL47 plazmidot PstI és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a kb, 2*7 kb méretű Pstl-BamHI restrikciós fragmentet izoláljuk. Egy külön reak• 9 · · · · « • »·««·« « • · · · * ···· · »·’ ···
- 12 cióban a pL47 plazmidot EcoRI és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a kb, 1,03 kb méretű EcoRI-BamHI restrikciós fragmentet izoláljuk, A pL47 plazmid kb, 2,7 kb méretű Pstl-BamHI fragmentjét és kb, 1,03 kb méretű EcoRI-BamHI restrikciós fragmentjét a pPRl2ARi plazmid kb, 2,9 kb méretű Pstl-EcoRI restrikciós fragmentjéhez ligáljuk, igy kapjuk a pL110 plazmidot. A pL110 plazmid készítésének részletes leírását a 14, ábrán mutatjuk be, A pLH0 plazmid restrikciós és funkciós térképét a mellékelt rajzok között, a 4, ábrán mutatjuk be,
A pL11Ű plazmidot Xbal és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a kb, 5,8 kb méretű fragmentet izoláljuk, A pL1lO plazmid kb, 5,8 kb méretű fragmentjét ezután egy szintetikus DNS szekvenciához ligáljuk, a 15, példában levő leírás szerint. Az első cisztron jelenléte a met-EK-bGH termék magasabb szintű expresszióját segíti elő, A pCZRl25 plazmid restrikciós és funkciós térképét a mellékelt rajzok között az 5, ábrán mutatjuk be.
Az E.coli RV308 törzset NRRL B-15624 sorszám alatt, liofilezett formában kaphatjuk meg a Northern Régiónál Research Laboratories-tól, Az E.coli RV308 gazdasejteket pCZRl25 plazmiddal transzformálva kapjuk a jelen leírás során végig használt expressziós rendszert, amellyel a jelen találmány különböző megvalósítási módjait mutatjuk be.
Az E.coli K12 RV308/pCZR125 expressziós rendszert előnyösen körülbelül 33 °C-on tartjuk a fermentációs eljárás • ···
- 13 korai lépéseiben, amelyekben az expressziós rendszer egyszerűen csak szaporodik, abból a célból, hogy az optimális termék expresszióhoz elegendő sejtsürüséget érjünk el. Ha elegendő számú sejt van jelen, akkor a hőmérsékletet megemeljük, ezzel indukáljuk az EK-bGH expresszióját, A 6. ábrán látható az EK-bGH termelésének indukciója. A 0-8 órás időtartam azt az időtartamot jelenti, amely során az expreszsziós rendszert hagyjuk csak szaporodni, hogy az optimális fermentációs termeléshez elegendő számú sejtet kapjunk, Körübelül a hatórás időpontban a hőmérsékletet megemeljük, ezzel inaktiváljuk a hőmérséklet érzékeny represszort. A represszor inaktiválásával magas szintű termék expresszió veszi kezdetét.
Ha hővel indukálható expressziós rendszereket használunk, akkor a jelen találmány céljából antibiotikumokat körülbelül akkor adunk a rendszerhez, amikor a fermentációs elegy hőmérsékletét megemeljük. A gyakorlott szakemberek, miközben felismerik a jelen találmány széles alkalmazhatóságát, felismerik azt is, hogy ha az illusztráció céljára bemutatottnál eltérő rendszert használnak a jelen találmány céljaira, akkor szükség van az expressziós vektor replikádójának és termék expressziójának kinetikai analízisére. A jelen találmány megmutatja, hogy ha körülbelül abban az időpontban amikor a termék expresszióját indukáljuk .antibiotikumot adunk a rendszerhez bakteriosztatikus vagy baktericid koncentrációban, akkor az abnormális expressziós rendszerek ··· • «4 · • * «·· ···
- 14 felhalmozódása megakadályozható.
Egy hővel indukálható expressziós rendszert alkalmazunk, csupán a jelen találmány illusztrálására, A jelen találmány oltalmi köre semmi módon nem korlátozódik az ilyen tipusu expressziós rendszernek a használatára, amelynek a részleteit csupán azért adtuk meg,hogy elősegítsük a találmány megértését. Bármely expressziós rendszer, amely expreszszál és felhalmoz egy rekombináns termékt, szelektiv hátrányban van egy fermentációs eljárásban, ennélfogva hasznot húzhat a jelen találmány alkalmazásából, így azt meg kell jegyezni, hogy a jelen találmány nem korlátozódik a hővel indukálható rendszerekre. Azok az expressziós rendszerek, amelyekben a termék expresszióját indukálható promoterek vezérlik, például a trp, lac és tac promoterek, jó példái azoknak a promotereknek amelyek a jelen találmány további megvalósítási módjait jelentik, A termék expressziójának indukciója olyan expressziós vektorok használata esetén, amelyek az említett promotereket használják, derepresszorok hozzáadását követően történik meg, azaz olyan anyagok hozzáadásával, amelyek semlegesítik a represzszor fehérjék haíását. Például a 3-indolil-ecetsav hozzáadása azokhoz a rendszerekhez, amelyek a trp promotert használják, azt eredményezi, hogy a promoter derepresszálódik és ezt követően a kívánt terméket kódoló gén expresszálódik, A lac vagy tac promotert használó rendszerek hasonlóképpen derepresszálódnak izopropil-13-D-tio-galaktozid hozzáadására. A jelen találmány alkalmazása ezekben az expressziós rendszerekben azt • · · · ·· • · ··· ··· · • · · · · ··»· · ··· ··· ···
- 15 jelenti, hogy körülbelül abban az időpontban amikor a termék expresszióját indukáljuk a megfelelő derepresszor hozzáadásával, antibiotikumot adunk a rendszerhez bakteriosztatikus vagy baktericid koncentrációban.
A gyakorlott szakemberek tudják, hogy számos represszornak léteznek hőmérséklet-érzékeny mutánsai. Az ezeket a hőmérséklet-érzékeny szabályozó rendszereket használó rendszerekben a termék expressziójának indukciója akkor történik meg, ha a tenyészet hőmérsékletét megemeljük, Maniatis et al, EMolecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, NY (1S82)] különböző expressziós rendszereket Írnak le és ismertetik indukciójuk mechanizmusát, A jelen találmány alkalmazása bármely olyan expressziós rendszerre, amely egy expressziós vektorral transzformált vagy transzfektéit prokarióta gazdasejtet alkalmaz, csak azt igényli, hogy egy antibiotikumot bakteriosztatikus vagy baktericid koncentrációban adjunk a rendszerhez körülbeül akkor, amikor a termék expresszióját indukáljuk,
A körülbelül abban az időben kifejezés jelentése az a rövid időtartam, amely megelőzi vagy követi a termék expressziójának indukcióját. A termék expressziójának indukálása előtt van egy időszak, amikor az expressziós rendszert csak hagyjuk szaporodni, A fermentációs gyakorlatban gyakori, hogy a fermentációs eljárást az optimálisnál kevesebb expressziós rendszerrel oltják be. így például a jelen találmány szempontjából legalább egy antibiotikum hozzáadása bakteriosztatikus vagy baktericid koncentrációban • ·
- 16 akkor történik meg, amikor már elegendő számú expressziós vektor van jelen, és röviden megelőzi a termék expressziójának indukcióját. Hasonlóképpen, legalább egy antibiotikum bakteriosztatikus vagy baktericid koncentrációban való hozzáadása történhet a termék indukcióját követően. Legalább egy antibiotikum bakteriosztatikus vagy baktericid koncentrációban való hozzáadása is beleértendő a körülbelül abban az időben kifejezésbe, ha az antibiotikumot a termék indukcióját követő rövid időtartam alatt adjuk a rendszerhez. Az a rövid időtartam, amely a termék expressziójának indukcióját követi, és amely alatt legalább egy antibiotikum bakteriosztatikus vagy baktericid koncentrációban való hozzáadását megtesszük a jelen találmány alkalmazása céljából, megelőzi azt az időpontot a fermentációs eljárásban, amikor a kívánt termék felhalmozódása a terméket expresszáló sejtekben előnytelen helyzetbe hozza azokat a sejtosztódás szempontjából, és segíti azoknak a sejteknek a tulnövését, amelyek nem expresszálják a terméket. Általában az antibiotikum hozzáadását a jelen találmány gyakorlása céljából a termék expresszálásának indukálása után két órán belül kell megtenni, előnyösen a termék expressziójának indukálását követő egy órán belül.
DNS szintézis inhibitorok, például a nitrofuránok, acrosaxacin, novobiocin, oxolinsav, pipemedinsav, piromidinsav, norfloxacin, anthramycin, bleomycin, nitroimidazolok és főleg a cinoxacin a legelőnyösebbek a jelen telálmány szempont17 jából, Más antibiotikumok, amelyek használhatók a jelen találmány céljaira, lehetnek sejtfal inhibitorok, azaz például: penicillinek, kefalosporinok, vankomicin, cikloszerin; alafosfolin, klavulánsav, bacitracin, moenomicin és risztocetin és főleg ampicillin, A vitamin analógok, például a szulfonamidok és a trimetoprim; enzim-inhibitorok, például a klavulánsav is alkalmas a jelen találmány céljaira, ezért az oltalmi körébe tartozik, A szakemberek számára nyilvánvaló, hogy az említett antibiotikumok csak példái a jelen találmány szempontjából alkalmas antibitotikumoknak és helyettesítésük lehetséges különböző más antibiotikumokkal anélkül, hogy meghaladnánk a jelen találmány oltalmi körét,
A jelen találmányt mind kémiailag meghatározott táptalajban mind komplex táptalajban kipróbáltuk. A jelen találmányban a komplex találmány alkalmazása előnyös. Az 1, és 3. példákban bemutatjuk a találmány szerinti eljárást kémiailag meghatározott összetételű táptalajban és komplex táptalajban, míg a 2,példa az 1, példa kontrolljaként szolgál, a 4. példa pedig a 3, példa kontrolljaként, A képzett szakember számára nyilvánvaló, hogy a fermentációs eljárásban használt táptalaj összetétele kritikus a termék expresszálásának maximalizálása szempontjából. A tápigény expressziós rendszerről expressziós rendszerre változik, és számos táptalaj, beleértve azt is például amelyet Maniatis és munkatársai írnak le a Molecular Cloning - A Laboratory • · · · · ·
- 18 Manual [Cold Spring Harbor, NY (1982)] cimü kézikönyvben, értékelhető abból a szempontból, hogy meghatározzuk a jelen találmány gyakorlatában adott expressziós rendszer számára legjobb táptalajt.
Az 1,, 2,| 3, és 4, példákban részletezett fermentációk eredményeit az 1,táblázatban foglaljuk össze, A deléciós vektorok adatait a fermentációk végén a fermentációs elegyből izolált expressziós vektorok restrikciós endonukleázos analízisével kapjuk, A restrikciós analízis alkalmazása az expressziós vektorok jellemzésére jól ismert módszer. Az expressziós vektorok restrikciós endonukleázos térképezésének és az adatok értelmezésének módszere jól ismert a szakterületen, Maniatis, Fritsch és Sambrook a Molecular Cloning - A Laboratory Manual” című kézikönyvben [Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)] jó összefoglalását adja ennek a témának.
1, táblázat
| Példa | Táptalaj | Cinoxacin (20 mcg/ml) | Sejt száraz súlya (g/L) | Relatív ha tékonyság (nem-dimen zionális) | Deléciósok |
| 1. | Definiált | igen | 9.50 | 0.649 | nem |
| 2. | Definiált | nem | 8.38 | 1.019 | igen |
| 3. | Komplex | igen | 13.52 | 0.904 | nem |
| 4. | Komplex | nem | 9.62 | 1.103 | igen |
Az 1, táblázat tisztán mutatja, hogy ha agy antibiotikumot a jelen találmány szerint alkalmazunk, akkor az megakadályozza a deléciós expressziós vektorok felhalmozódását a fermentációs eljárás során, akár komplex, akár definiált táptalajt használunk.
A relatív hatékonysági értékek a szarvasmarha növekedési faktor aktivitás indexei. A szarvasmarha növekedési hormon származék termelését kromatográfiás és bio-esszé módszerek kombinációjával követjük.
A bGH származék koncentrációját a fermentációs mintákban úgy határozzuk meg, hogy standard HPLC technikával össze hasonlítjuk a származékot a referencia EL-bGH-val. Az EK-bGH aktivitását a mintákban az 5. példában leirt bio-esszével határozzuk meg. A gyakorlott szakemberek számára nyilvánvaló, hogy egy bio-esszé lényeges bármely bio-molekula kezdeti meghatározásához. A biokémiai és immunokémiai módszerek hasznosak • · · ··«
- 20 a bGH összmennyis égének meghatározására; a bio-esszék azonban az aktiv anyag mennyiségére adnak információt, A bioesszék előnyösen használható módszerek a bGH meghatározására a mintákban. Ha a bioesszé módszerek következetesen megegyeznek a HPLC elemzés eredményeivel vagy például a radio-immunesszé vagy enzimmel kapcsolt immunszorbens esszé eredményeivel, akkor célszerű ezekre az olcsó és kevéssé időigényes módszerekre támaszkodni. Az 1, táblázatban és a 6, ábrán közölt relatív hatékonyság becslések olyan HPLC elemzésekből származnak, amelyekről azt találták, hogy jól korrelálnak a bio-esszé adataival,
A jelen találmányban a komplex táptalajokat lehet előnyösen alkalmazni, amint azt az 1, táblázat adatai mutatják, A szarvasmarha növekedési faktor termelődésének enyhe csökkenése észlelhető, ha a komplex táptalajt körülbelül a termék expressziójának kezdetekor cinoxacinnal egészítjük ki. Az ΕΚ-bGH termelődésének lényeges csökkenése figyelhető meg ha definiált táptalajt használunk. Az expressziós rendszerek növekedése definiált táptalajban és a definiált táptalaj kiegészítése olymódon hogy az komplex táptalajjá váljon körülbelül az antibiotikum hozzáadásakor és a termék indukálásának időpontjában szintén tárgyát képezi a jelen találmánynak és oltalmi körének részét képezi,
A cinoxacinnal kapott adatok csupán illusztrálják a találmányt és a szakterületen jártas szakemberek számára nyilvánvaló, hogy bármely antibiotikum, amely nem teszi
tönkre a kívánt rekombináns polipeptid termék expresszióját, alkalmas a találmány céljaira, és ezért a találmány oltalmi körébe tartozik.
A cinoxacin a jelen találmány céljaira egy előnyös antibiotikum. A szakemberek számára nyilvánvaló, hogy az antibiotikumok effektiv koncentráció-tartománya tartalmazza az adott antibiotikum vagy antibiotikumok bakteriosztatikus vagy baktericid koncentrációját. A hatékony antibiotikum koncentráció-tartományt könnyű meghatározni egy szakember·» nek, értéke függ az adott expressziós rendszertől, az expressziós rendszer sejtsürüségétől, a használt antibiotikumtól vagy antibiotikumoktól, valamint a fermentációs körülményektől.
Ha cinoxacint használunk a jelen telálmány kivitelezésére E, coli RV308/pCZR126 expressziós rendszert használó fermentációkban EK-bGH termelésre, akkor az előnyös cinoxacin koncentráció kb, 5/ug/ml - 50/ug/ml koncentrációtartományban van, különösen előnyös a kb. 10/ug/ml 20 /ug/ml. koncentrációtartomány. Az említett előnyös koncentrációk az EK-bGH-nak RV308/pCZR125 expressziós rendszerrel, fermentációval történő előállítására vonatkoznak, és csupán illusztrálják a jelen találmányt és nem korlátozzák oltalmi körét.
Abból a célból hogy tovább illusztráljuk a találmány szerinti módszert, E.coli RV308/pCZRl25 törzzsel fér mentációkat végeztünk ampicillin és novobiocin felhaszná22 lásával (mindegyik beszerezhető a Sigma Chemical Co.-tól, St, Louis, MO, 63178) EK-bGH előállítására. Ampicillint körülbelül 25 mcg/ml koncentrációban használtunk, mig a novociocint körülbelül 50 mcg/ml koncentrációban. Mindegyik említett antibiotikum, ha körülbelül a termék expresszió indukálásával egyidőben adjuk a fermentléhez , akkor hatékonyan megakadályozza a deléciós expressziós vektorok felhalmozódását, A használt antibiotikumok koncentrációját csak példaként adjuk meg, mivel a gyakorlott szakember számára nyilvánvaló, hogy bármely, a találmány céljaira használt antibiotikum koncentrációja azokra a koncentráció-tartományokra korlátozódik, amelyek az adott antibiotikum bakteriosztatikus vagy baktericid koncentrációját jelentik,
A számos, a találmány szempontjából alkalmas antibiotikum, a jelen találmány kompatibilitása számos különböző táptalajjal, valamint a tá.álmány szerinti módszer alkalmazhatósága számos gazda/exprsssziós vektor rendszerben azt jelzi, hogy a jelen találmány jelertős előrelépés a fermentáció tudományában,
A jelen találmány bemutatására használt gazdaszervezet az E.coli K12 RV308 törzs, és ez az előnyös törzs. Gyakorlott szakemberek számára nyilvánvaló, hogy más gazdasejtek, például más Enterobaktériumok, Bacillus fajok és Strsptomyces fajok is használhatók a jelen találmány szerinti eljárásban.
A jelen találmány illusztrálására leirt példák csak a jelen találmány szerinti eljárással előállítható jellemző polipeptid termékek. A szarvasmarha növekedési hormon származékot használjuk a találmány illusztrálására használt példákban, de a gyakorlott szakember számára nyilvánvaló, hogy más, expressziós vektorokon kódolt polipeptid termékek is alkalmasak a jelen találmányban való felhasználásra, például: £-galaktozidáz, humán pre-proinzulin, humán proinzulin, humán inzulin A-lánc, humán inzulin B-lánc, nem humán inzulin, humán növekedési hormon, inzulin-szerü növekedési hormon, szarvasmarha növekedési hormon, humán interferon, nem humán interferon, vírus antigének, urokináz, szöveti plazminogén aktivátor, 1-6 interleukinok, kolónia stimuláló faktorok, eritropoietin és hasonlók.
Az alábbiakban ismertetett példák csak a találmány jobb megértését segítik elő. Az éppen használt anyagok, fajok, és körülmények csak a jelen találmány jobb illusztrálását célozzák, és nem korlátozzák a találmány oltalmi körét.
1. példa
A jelen találmány szerinti eljárást cinoxacin felhasználásával illusztráljuk (kapható az Éli Lilly-től, Indianapolis, IN 46285), ami azt a célt szolgálja, hogy megakadályozza deléciós plazmidok detektálható mértékű megjelenését a szarvasmarha növekedési hormon származékának • · · · előállítását célozó fermentációs eljárásban.
A Domach és munkatársai által leirt táptalaj-összetételt [Biotechnology and Bioengineering , XXVI,
2203-206 (1984)1 használtuk a találmány bemutatására, az említett találmány összetétele;
Technikai minőségű ammónium-szulfát, 0.125 % VanWaters and Rogers, 745 E,30th St. Indianapolis, IN 46219)
Egybázisu kálium-foszfát, 0.150 % (Ulrich Chemical Inc., 311 North Post Rd, , Indianapolis, IN 46226)
Nátrium-klorid 0,001 %
Central Indiana Suppjy Co, , P.O, Box 762, Indianapolis, IN 46206)
Kétbázisu kálium-foszfát 0,3 % (Ulrich Chemical Inc., Tarra Hauta, IN 47808)
Vas (Ill)-szulfát 0.1 % (Mays Chemical Co, , Inc. , Indianapolis
IN 46226)
EDTA nátrium-só 0,00372 % (Sigma Chemical Co, , St. Louis, MO 63178)
Magnézium-szulfát 0, 01
VanWaters and Rogers, 745 E, 30th St, Indianapolis, IN 46219)
Glükóz (80 %) 0,85 %.
Kiegészítésként tiamint (0.0005 %, SST Corporation, Dlifton, NO 07012) és tetraciklint (0,0015 %, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178) adunk kiegészítésként a Domach féle táptalajhoz tápigény kielégítése és szelekciós szempontok kielégítése céljából.
A transzformált mikroorganizmusokat olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek alkalmasak a növekedésre, egész addig, amig a termék optimális expresszálásához megfelelő számú sejt keletkezik. A rekombináns polipeptid termék expresszióját indukáljuk, és körülbelül ezzel egyidőben sterilre szűrt cinoxacint adunk a fermentléhez 20 mcg/ml végkoncentrációban. A cinoxacin jelenlétében folytatott fermentációt és a rekombináns polipeptid termék expresszióját úgy követjük, hogy mintát veszünk a fermentléből és vizsgáljuk a szarvasmarha növekedési hormon aktivitását. Egy jellemző fermentációt mutatunk be az 1, ábrán.
2, példa
Egy másik fermentációt is végzünk, lényegében az
1. példában leirt eljárás szerint. Ebben az eljárásban cinoxacint nem adunk a rendszerhez, ennélfogva kontroll csoportként szolgál, és lehetővé teszi annak meghatározását, hogy a cinoxacin milyen mértékben akadályozza meg a deléciós vektorok felhalmozódását.
a
A jelen találmány szerinti eljárás tovább illusztáljuk olyan komplex táptalaj alkalmazásával, amelyet úgy kapunk, hogy 0.5 % autolizált élesztőt (gyártja és forgalmazza a Difco Laboratories, Inc,, Detroit, MI 49232) adunk az 1. példában leirt táptalajhoz, A sejteket olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek megfelelnek ahhoz, hogy megfelelő magas sejtszámot érjünk el. A termék expresszióját indukáljuk, és • · • · ·
- 26 ezzel körülbelül egyidőben cinoxacint adunk a rendszerhez 20 mcg/ml végkoncentrációban. A fermentációt hagyjuk cinoxacin jelenlétében lejátszódni.
4. példa
Egy másik fermentációt is végzünk, lényegében a
3. példában leirt eljárás szerint. Ebben az eljárásban cinoxacint nem adunk a rendszerhez, ennélfogva kontroll csoportként szolgál, és lehetővé teszi annak meghatározását, hogy a cinoxacin milyen mértékben akadályozza meg a deléciós vektorok felhalmozódását.
5. példa
A szarvasmarha növekedési hormon biológiai aktivitásának meghatározása
A szarvasmarha növekedési hormon aktivitását a következő Tibia esszé-vel határozzuk meg.
Nőstény patkányokat hipofizektomizálunk 25 napos korukban, majd a patkány táp mellé 5 %-os glükóz tartalmú vizet adunk tetszés szerinti mennyiségben a hipofizektómiát követő első 48 órában, majd normál csapvizet adunk az állatoknak. A hipofizektómiát követő hetediknapon (32 napos korban) azokat az állatokat, amelyek nyilvánvalóan betegek vagy gyengék, azokat elimináljuk. Az összes megmaradó patkánynak megjelelöljük a fülét és megmérjük a súlyát. A hipofizektómiát követő 14 napon (39 napos korban) a patkányoknak ismét megmérjük a súlyát. Azokat a patkányokat elimináljuk, amelyeknek a súlya több mint 10 grammal nőtt a hétnapos periódus során, vala• «
- 27 mint azokat amelyeknek a testsúlya meghaladja a 120 gramot.
A vizsgált vegyületet minimum 0,01 mólos NaHC03 oldatban oldjuk (pH=8.0), majd a végtérfogatot a kivánt értékre állítjuk be fiziológiás sóoldattal (0,1 normál NaCl) vagy desztillált vízzel.
A hipofizektómiát követő 14. napon (39 napos korban) az állatokat kontroll és kezelt állatok csoportjára osztjuk. Az egyik csoport szolgál kontrollként, és csak hordozóanyagot kap. Az összes kezelés napi egyszeri, 0,1 ml-es szubkután injekcióval történik, 4 napon át. Az egyes testsúlyokat a vizsgálat elején feljegyezzük. A negyedik injekciót követő 18-24. órában a testsúlyokat ismét megmérjük, és a patkányokat széndioxidban megfullasztjuk. Minden egyes patkánynak a töröknyergét vizuálisan megvizsgáljuk, hogy te|jes-e a hipofizektómia. Minden egyes patkánynak a jobb sipcsontját eltávolítjuk, a lágy szöveteket eltávolítjuk, a közé-szagittális síkban elhasitjuk egy szikével, hogy a proximális epifizeális porclemez keresztmetszete látható legyen.
Az igy eltávolított és elhasitott sipcsontokat a következő hisztológiai előkészítésnek vetjük alá. A c®nt-feleket (1) 10 %-os semleges formaiinban fixáljuk legalább órán át.
(2) Alaposan mossuk ionmentesitett vizben egy órán át.
(3) Egy órára acetonba merítjük.
(4) Ismét ionmentesitett vízzel mossuk egy órán át.
··« · · · ···« • · · · • ··· · ·· ·· · (5) 2 %-os ezüstnitrátba merítjük pontosan 2 percre, majd azonnal ionmentes vízbe tesszük, miközben hat percre erős fénynek tesszük ki (a kalcifikálódott részek sötétbarna színben jelennek meg), (6) Gyorsan kivesszük a vízből, majd azonnal 10 %-os tioszulfát oldatba merítjük, igy fixáljuk körülbelül 30 másodpercig.
(7) Alaposan mossuk ionmentes vízzel 30 percig,majd a leolvasásig ionmentes vízben tartjuk.
A leolvasást követően a csontokat sötétben, 80 %-os etanolban tároljuk,
A nem kalcifikálódott epifizeális porc szélességét meghatározzuk, A porclemez szélességének meghatározására egy binokuláris boncoló mikroszkópot használunk 10X szemlencsével (terikuláris mikrométer szemlencse 0,1 mm-es beosztásokkal), és egy 4X objektivvel. Az egyes leolvasásokat az epifizeális lemezen keresztül végezzük és adatlapra rögzítjük, A fenti lencse-konfigurációval rendelkező mikroszkópot használva az epifizeális lemez szélességét úgy határozzuk meg, hogy minden egyes értéket 25-tel szorzunk (ennél a lencse-konfigurációnál 1 mm a vonalzón 40 kis osztásnak felel meg a lencsén, ennélfogva egy osztás egyenlő 25 mikronnal). Minden egyes csont ra mind a tiz leolvasásnak kiszámítjuk a számtani átlagát.
A kezelt csoportban mindegyik csontnak kiszámítjuk az átlagát.
A fenti módszer alkalmazásával a következő táb···· · lázatban szereplő eredményeket kapjuk. A szarvasmarha növekedési hormont a hordozóhoz hasonlítjuk mint kontrolihoz, valamint hipofízis eredetű standard növekedési hormonhoz, amelyet a National Pituitary Agency-től szerzünk be (II. vegyület).
A pKC283 plazmid izolálása
Az E.coli K12 BEl201/pl<C283 törzs liofilezstt tenyészete a Northern Régiónál Research Laboratory-tól (Peoria, Illinois 61604) szerezhető be, NRRL letéti sorszám alatt, A liofilezett tenyészetet 10 ml LB táptalajt tartalmazó csövekbe tesszük (az LB összetétele 10 g Bacto trypton, 5 g Bacto yeast extract és 10 g MaCl/liter; pH=7.5), majd két órán át 32 °C-on tartjuk, majd a tenyészetben 50/ug/ml ampicillin koncentrációt állítunk be és éjszakán át 32 °C-on inkubáljuk. Az E.coli K12 BEl201/pKC283 sejteket 32 °C~on tenyésztjük, mivel a sejtek a kromoszomális DNS-be integrálódva egy cl represszor gént tartalmaznak. Ha olyan sejteket használunk ebben, a következő példákban ismertetett plazmid izo? lálási eljárásban, melyek vad tipusu lambda pL represszor gént tartalmaznak, vagy nem tartalaznak lamdba pL promotert, akkor az inkubálás hőmérséklete 37 °C.
Az éjszakán át növesztett tenyészet kis részét olyan LB agar lemezre tesszük (LB táptalaj 15 g/1 Bacto agarral
kiegészítve), amely 50 ^ug/ml ampicillint tartalmaz, olymódon, hogy E.coli K12 BEl201/pKC283 sejtek különálló telepekből álló tenyészetét kapjuk. A kapott különálló telepet 10 ml olyan LB táptalajba oltjuk, amely 50/ug/ml ampicillint tartalmaz, majd éjszakán át 32 °C-on inkubáljuk erős rázatás közben. A 10 ml éjszakán át növesztett tenyészetet 500 ml, 50/ug/ml ampcillint tartalmazó LB táptalajba oltjuk, majd addig inkubáljuk, erős rázatás közben 32 °C-on, amig a tenyészet a stancionsr fázist el nem éri.
A következő eljárást a Maniatis kézikönyvből adaptáltuk [Maniatis et al. , Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)].
A sejteket centrifugálással nyerjük ki (4000 g, 10 perc, 4 °C), majd a felüluszót elöntjük. A sejt-üledéket 100 ml jéghideg STE pufferben mossuk (összetétele: 0,1 mól NaCl, 10 mmól TRIS-HC1, ρΗ=8,7; és 1 mmól EDTA). A mosás után . a sejtüledéket 10 ml 1-es oldatban szuszpendáljuk (összetétele: 50 mmól glükóz, 25 mmól TRIS-HC1, pH=8z0, és 10 mmól EDTA), amely 5 mg/ml lizozimet tartalmaz, és szobahőmérsékleten hagyjuk állni 10 percig. Ezután 20 ml 2-es oldatot (összetétele: 0*2 normál NaOH és 1 % SOS) adunk a lizozimmsl kezelt sejtekhez, és az oldatot óvatosan megkeverjük. Az elegyet 10 percig jégen tartjuk.
Tizenöt ml jéghideg 5 mólos kálium-acstátot (pH=
4.8) adunk a lizált sejt keverékhez, majd az elegyet óvatosan megkeverjük. Az oldatot 10 percig jégen tartjuk. Az 5 mólos • «· β kálium-acetát oldatot úgy állítjuk elő, hogy 11,5 ml jégecetet adunk 28,5 ml vízhez és 60 ml 5 mólos kálium-acetáthoz; a kapott oldat 3 mólos káliumra és 5 mólos acetátra.
A lizált sejtkeveréket Beckman SW27 rotorban (vagy ennek megfelelő rotorban) centrifugáljuk 20 percig 4 °C-on 20000/perc fordulatszámmal. A kromoszómális DNS és a törmelék csapadékot képez a cső alján. Körülbelül 36 ml felüluszót nyerünk ki, ehhez 0,6 térfogatnyi izopropanolt adunk, összekeverjük, és a kapott oldatot 15 percig hagyjuk szobahőmérsékleten állni, A plazmid DNS-t centrifugálással kinyerjük (12 000 g, 30 perc szobahőmérséklet). A felüluszót elöntjük, és a DNS csapadékot 70 %-os etanollal mossuk szobahőmérsékleten. Az etanolt leöntjük, és a DNS csapadékot vákuum exszikkátorban szárítjuk. A csapadékot ezután 8 ml TE pufferben szuszpendáljuk (összetétele: 10 mmól TRIS-HC1, pH=8.0 és 1 mmól EDTA).
Nyolc gram CsCl-ot adunk a DNS oldathoz. Körülbelül 0,8 ml 10 mg/ml koncentrációjú vizes etidium-bromid oldatot adunk minden egyes 10 ml CsCl-DNS oldathoz. Az oldat végső sűrűsége körülbelül 1,55 g/ml, és az etidium-bromid koncent ráció körübelül 600/ug/ml, Az oldatot Beckman centrifuga csőbe tesszük, a cső tetejét parafinolajjal töltjük meg, lepecsételjük, majd 20 °C-on 45 000/perc fordulatszámmal !
centrifugáljuk 24 órán át. A centrifugálás után két DNS ·«· • a·
- 32 esik látható normál fényben. Miután a sapkát eltávolitottuk a csőről, az alsó DNS csikót 21-es injekciós tűvel eltávolítjuk, úgy hogy a tüt a centrifuga cső oldalába szúrjuk.
Az stidium-bromidot többszöri, vízzel telített 1-butanollal való extrakcióval távolitjuk el. A CsCl-t TE pufferrel szembeni extrakcióval távolitjuk el. Puffereit fenollal majd kloroformmal végzett extrakció után a DNS-t kicsapjuk, mossuk 70 %-os etanollal és szárítjuk. Körülbelül 1 mg pKC283 plazmidot kapunk, ezt 4 °C-on TE pufferben tároljuk körülbelül 1/ug/ml koncentrációban. A pKC283 plazmid restrikciós és funkciós térképe a mellékelt rajzok között az 1. ábrán látható.
7, példa
A pKC283PX plazmid előállítása
Körülbelül 10/ul, az előző példában előállított pKC283 plazmid DNS-t, 20/ul 10 X közepes sókoncentrációju restrikciós puffért (500 mmól NaCl, 100 mmól TRIS-HC1, pH=7,5, 100 mmól MgClg és 10 mmól DTT), 20/ul 1 mg/ml BSA-t, 5^ul PvuII restrikciós enzimet (kb. 50 egység a Bethesda Research Laboratories (BRL) meghatározása szerint, akitől az öszes, a jelen találmányban alkalmazott restrikciós enzim származik) és 145/ul vizet összekeverünk és a kapott reakcióelegyet 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A restrikciós enzimes reakciókat rutinszerűen fenol és kloroformos extrakcióval állítjuk le, ezt köxetően kicsapjuk a DNS-t, etanollal mossuk, majd • · a DNS-t TE pufferben oldjuk. Az említett PvuII emésztés leállítása után a PvuII-vel emésztett pKC283 DNS-t kicsapjuk, majd 5/ul TE pufferben szuszpendáljuk.
Körülbelül 600 pikomol Xhol liríert (5*-CCTCGAGG-3') kinázolunk a következő összetételű pufferben: 10/ul 5 X kináz puffer (300 mmól TRIS-HC1, pH=7,8, 50 mmól MgClg, mmol DTT), 5/ul 5 mmol ATP, 24/ul HgO, 0,5/ul T4 polinukleotid kináz (körülbelül 2,5 egység a P-L Biochemicals meghatározása szerint)
spermidinj az elegyet 30 percig 37 °C-on és 5/ul 10 mmól inkubáljuk.
A kinázoSt Xhol linkerből körülbelül 12f5/ul-t adunk 5/ul PvuII restrikciós enzimmel emésztett pl<C283 plazmidhoz, majd 2,5^ul 10 X ligáz puffért (300 mmól TRIS-HC1 pH=7,6, 100 mmól MgClg és 50 mmól DTT), 2,5/ul 1 mg/ml koncentrációjú BSA-t, 7/ul 5 mmólos ATP-t, 2f5^ul (a P-L Biochemicals meghatározása szerint 2,5/ul 10 mmólos spermidint és 3/ul vizet adunk a DNS-hez, A kapott ligáló elegyet éjszakán át 4 °C-on tartjuk. A ligálás után a reakcióelegy össze tételét magas sótartalmú puffernek megfelelően állítjuk be (0,1 mól NaCl, 0,05 mól TRIS-HC1 pH=7,5, 10 mmól MgCl2 és 1 mmól DTT). Körülbelül lO^ul (100 egység) Xhol restrikciós enzimet adunk az elegyhez és a reakciót 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk.
A reakciót leállítjuk, az Xhol restrikciós enzimmel emésztett DNS-t kicsapjuk, beoldjuk és a fentiek szerint ligáljuk, azzal az eltéréssel, hogy nem adunk Xhol linkereket
a ligáló elegyhez. A ligáit DNS a kivánt pKC283PX plazmid, A pKC283PX plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt rajzok között az 1. ábrán mutatjuk be.
8. példa
Az E.coli K12 MO (lambda*)/pKC283PX törzs készítése Az E.coli K12 MO (lambda+) törzs a Northern Régiónál Research Laboratories-től szerezhető be liofilezett formában, letéti sorszáma NRRL B-15993. Az E.coli K12 MO (lambda+) tartalmazza a vad tipusu lambda pL cl represszor gént, tehát a jelen találmány szerinti hibrid pL-lpp promoterről nem történik transzkripció az E.coli K12 MO(lambda+) sejtekben. A liofilezett sejteket felélesztjük, az MO(lambda+)_ból egyedi telepeket izolálunk és 10 ml-es éjszakán át növesztett tenyészetet készítünk az MO(lambda+) sejtekből, lényegében a 6. példában leirt eljárás szerint, azzal a különbséggel, hogy az inkubálás hőmérséklete 37 °C és ampicillint nem teszünk a növesztő táptalajba.
Az éjszakán át növesztett tenyészetből
50/ul-t használunk 5 ml LB táptalaj beoltására, amely 10 mmól MgSO^-et és 10 mmól MgCl2-t tartalmaz. A tenyészetet éjszakán át 37 °C on inkubáljuk erőteljes rázás közben. Másnap reggel a tenyésze tet 200 m LB-vel hígítjuk, amely 10 mmöl MgSO^-et és 10 mmól MgClg-t tartalmaz. A higitott tenyészetet 37 °C-on inkubáljuk erőteljes rázatás közben addig, amíg a tenyészet 550 nm-es abszorbanciája (A55Q) a körübelül 0.5-ös értéket eléri, amely
- 35 θ körülbelül 1 χ 10 sejt/ml sejtsűrüséget jelent, A tenyészetet tiz percig jeges vízben tartjuk, majd a sejteket centrifugálással elkülönítjük (4000 g, 10 perc, 4 °C), A sejtüledéket 100 ml hideg 10 mmólos MgSO^-ben szuszpendáljuk, majd ismét ülepítjük centrifugálással, A sejtüledékét 100 ml mmólos CaClg-ben szuszpendáljuk, majd ismét jégen inkubáljuk 20 percig.
A sejteket ismét centrifugálissal nyerjük ki és 10 ml mmólos CaClg-ben szuszpendáljuk. A sejtekből egy fél milliliteres alikvot részt adunk a 7. példában előállított ligáit DNS-hez; a DNS-t 30 mmólos CaClg oldatban oldjuk fel.
A sejt-DNS elegyet jégen inkubáljuk egy órán át, hővel sokkoljuk 42 °C-on 90 másodpercig, majd jégbehütjük körülbelül két percre, A sejt-DNS keveréket 10 ml, 125 ml-es lobmikban lévő LB táptalajban higitjuk, majd egy órán át 37 °C-on inkubál juk, 100/ul-es alikvot részeket szélesztünk ampicillint talmazó LB agarlemezekre, és addig inkubáljuk 37 °C-on, tárámig telepek jelennek meg,
A telepeket elkülönítve szaporítjuk, majd az egyes telepekből származó DNS-t restrikciós enzimes analízissel és gélelektroforézissel vizsgáljuk, A plazmid DNS izolálást kisebb mennyiségben a 6. példában leirt módszerrel végezzük, de a CsCl gradiens lépést egészen addig kihagyjuk amig a kívánt E.coli K12 M0(lambda+)/pKC283PX transzformánsokat azonosítjuk. A pKC283PX plazmid restrikciós és funkciós térképét a mellékelt rajzok között a 2. ábrán közöljük.
9, példa
Az E.coli K12 M0(lambda+)/pKC233-L törzs készítése
A 6. példa szerinti eljárással előállított pKC283PX plazmidból lO^ug-ot 20/ul 10 X magas sótartalmú pufferben oldunk, majd 200/ul 1 mg/ml BSA-t, 5/ul (kb, 50 egység) BglII restrikciós enzimet, 5/ul (kb, 50 egység) Xhol restrikciós enzimet és 150/ul vizet adunk hozzá, majd a kapott reakcióelegyet két órán 37 °C-on inkubáljuk, A reakciót leállítjuk, majd a BglII-XhoI restrikciós enzimekkel emésztett DNS kicsapása után a DNS-t 5/ul TE pufferben oldjuk,
A BglII és Xhol restrikciós enzimeknek megfelelő egyszálu végekkel rendelkező DNS linkért szintetizálunk és kinázolunk, A linkért lényegében a 7, példában leirt eljárás szerint kinázoljuk, A DNS linker szerkezete a következő:
'-GATCTATTAACTCAATCTAGAC-3 * llllllllllllllllll '-ATAATTG^GTTAGATCTG^GCT-S *
A fentiekben leirt linkért egyszálu dezoxioligonukleotidokból szintetizáljuk, a szakmában jól ismert eljárással, Az egyszálu dezoxi-oligonukleotidokat kereskedelmi forgalomban lévő berendezésekkel szintetizáljuk, például az Applied Biosystems (850 Lincoln Centr Drive, Foster City, CA 94404) által forgalmazott 380A DNS szintetizátorral, amely foszforamidit kémiát alkalmaz, A DNS szintézisére más módszerek is ismertek az irodalomban. Az egyszálu DNS szintézisére ismert konvencionális módosított foszfotriészter mód • · ♦ • · · · · • · · szert Itakura és munkatársai írják le [Science, 198, 1056 (1977)], valamint Crea és munkatársai IProc. Natl. Acad, Sci. USA, 75, 5765 (1978)]. Emellett egy különösen előnyös módszert írnak le DNS szintézisére Hsiung és munkatársai ENucleic Acids Research, 11 , 3227 (1983)] valamint Narang és munkatársai [Methods in Enzymology, 68, 90 (1980)].
A linkért és a BglII-XhoI· restrikciós enzimekkel emésztett pKC283PX plazmidot lényegében a 7. példában leirt módézerrel ligáljuk. A ligáit DNS a keresett pKC283-L plazmid. A pKC283-L plazmid restrikciós és funkciós térképét a mellékelt rajzok között az 1. ábrán mutatjuk be, A pKC283-L plazmid DNS-t használjuk E.coli K12 MO(lambda+) törzs transzformálására, és a kapott E.coli K12 MO(lambda+)/pl<C283-L transzformánsokat lényegében a 8, példában leirt módszerrel azonosítjuk.
10. példa
Az E.coli K12 MOflambda*)/pKC283-LB törzs előállítására
Az 1. példában előállított pKC283-L plazmid DNS-ből körülbelül W^ug-ot oldunk 20^ul 10X magas sótartalmú pufferben, majd 20/ul 1 mg/ml BSA-t, 5^ul (kb, 50 egység) Xhol restrikciós enzimet és 155/ul vizet adunk hozzá, és a kapott reakcióelegyet két órán át 37 °C-on ínkubáljuk. Az Xhol restrikciós enzimmel emésztett pKC283-L plazmid DNS_t ezután kicsapjuk a reakcióelegyből, három térfogat 95 %-os etanol és 1/10 térfogat 3 mólos nátrium-acetátotadva az elegyhez, majd • · ««·· ···« ·♦· · • · · ♦ · • « ·· · ··· • · · · ···· · ··♦ ··· etanol-szárazjég fürdőben inkubáljuk öt percig és lecentrifugáljuk. A kapott DNS csapadékot 70 %-os etanollal mossuk, szárítjuk, majd 2^ul 10X nick-transzláciÓ9 pufferbn oldjuk (0,5 mól TRIS-HC1 pH=7,2, 0,1 mól MgS04 és 1 mmól DTT) , hozzáadunk minden egyes dezoxinukleotid trifoszfát 2 mmólos oldatból 1/ul-t, 15 ^ul vizet, 1/ul (kb. 6 egység, a P-L Biochemicals meghatározása szerint) Klenow enzimet, ami az E.coli DNS polimeráz nagy fragmentje, és 1/ul 1 mg/ml BSA-t. A kapott reakcióelegyet 30 percig 25 °C-on inkubáljuk; a reakciót úgy állítjuk le, hogy az elegyet öt percig 70 °C-on inkubáljuk.
BarnHI linkereket (5*-CGGGATCCCG-3*) kinázolunk és ligálunk az Xhol restrikciós enzimmel emésztett, Klenow-val kezelt pKC283-L plazmid DNS-hez, lényegében a 7, példában leirt eljárás szerint. A ligálási reakció után a DNS-t körülbelül 100 egység BarnHI restrikciós enzimmel emésztjük körülbelül két órán át 37 °C-on magas sótartalmú pufferben. A BarnHI enzimes emésztés után a DNS ligáláshoz készítjük elő, lényegében a 2. példában leirt eljárás alapján,
A kb, 5,9 kb méretű BarnHI restrikciós fragmentet ligálással cirkulárizáljuk és E.coli K12 M0(lambda+) törzsbe transzformáljuk lényegében a 7, és 8. példákban leirt eljárások alapján. Az E.coli K12 M0(lambda+) pl<C283-LB transzformánsokat azonosítjuk, majd a pKC283-LB plazmid DNS-t lényegében a 6, példában leirt eljárás szerint izoláljuk, A • » • ·· ·· pKC283-LB plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt rajzok között az 1, ábrán mutatjuk be.
11. példa
Az E.coli K12 M0(lambda+)/pL32 törzs előállítása
Körülbelül lO^ug pKC283PX plazmid DNS-t Sáli restrikciós enzimmel emésztünk magas sótartalmú pufferben, Klenow fragmenttel kezeljük, najd EcoRI linkerhez ligáljuk (5*-GAGGAATTCCTC-3·) lényegében a 10, példában leirt eljárás szerint, azzal az eltéréssel, hogy a kiindulási plazmid, a restrikciós enzimek és a linken más. EcoRI restrikciós enzimmel való emésztés után, amelynek eredménye egy kb, 2,1 kb méretű DNS kihasitása,a kapott kb. 4,0 kb méretű EcoRI restrikciós fragmentet ligálással cirkularizáljuk, igy kapjuk a pKC283PRS plazmidot. A ligáit DNS-t használjuk E.coli K12 M0(lambda+) törzs transzformálására, lényegében a 8. példában leirt eljárás szerint. Miután az E.coli K12 M0(lambda+)/pl<C283PRS transzformánsokat azonosítottuk a pKC283PRS plazmid DNS-t lényegében a 6. példában leirt eljárás szerint izoláljuk, A pKC283PRS plazmid restrikciós és funkciós térképét a mellékelt rajzok között a 2, ábrán mutatjuk be.
Körülbelül 10.ug pKC283PRS plazmidot emésztünk
200. .ut.magas sótartalmú pufferben körülbelül 50-50 egység
PstI illetve Sphl restrikciós enzimmel. Miután a reakcióelegyet körülbelül 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk, elektroforetizáljuk 0,6 %.os alacsony olvadáspontu agaróz (FMC Corporation, Marina Colloids Division, Rockland, Maine 04841 ) • · gélen 2-3 órán át, kb. 130 volttal és kb. 75 mA-rel TRIS-acetát pufferben.
A gélt hig etidium-bromid oldattal festjük, majd a kb. 0,85 kb méretű Pstl-Sphl restrikciós fragmentet tartalmazó DNS csikót, amelyet hosszuhullámu UV fénnyel teszünk láthatóvá, egy kis géldarabban kivágjuk a gélből, A géldarab térfogatát meghatározzuk a súlya és sűrűsége alapján, majd azonos térfogatú 10 mmól TRIS-HC1 puffért (pH=7,6) adunk a géldarabot tartalmazó csőhöz. A géldarabot ezután 72°Cos inkubálással megolvasztjuk. Körülbelül 100/ul térfogatkb méretű Pstl-Sphl fragmentből. Analóg módon a pKC283-LB plazmidot Pstl és Sphl restrikciós enzimmel emésztjük, és a kapott kb. 3,0 kb méretű restrikciós fragmentet agaróz gélelektroforézissel izoláljuk, majd előkészítjük ligáláshoz.
A pKC283PRS plazmid kb. 0,85 kb méretű Pstl restrikciós fragmentjét a pKC283-LB plazmid kb, 3,0 kb méretű Pstl-Sphl restrikciós fragmentjéhez ligáljuk, lényegében a 7. példában leirt eljárás szerint. A ligáit DNS a keresett pL32 plazmid. A pL32 plazmid restrikciós és funkciós térképét a mellékelt rajzok között az 1, ábrán mutatjuk be, A pL32 plazmidot E.coli K12 M0(lambda+) sejtekbe taranszformáljuk a 8. példában ismertetett eljárás szerint. A pL32 plazmid DNS-t az E.coli K12 M0(lambda+)/pL32 transzformánsokból izoláljuk lényegében a 6, példában leírtak szerint, A pL32 plaz• · ·
- 41 mid DNS analízise azt mutatja, hogy egynél több EcoRI linker kapcsolódott a Klenow fragmenttel kezelt, Sáli végű pKC283PX plazmidhoz, Az egynél több EcoRI linker jelenléte nem érinti a pL32 plazmid vagy származékai használhatóságát, és egy Xhol restrikciós hely jelenlétével lehet detektálni, amely akkor keletkezik, ha két EcoRI linkért összeligálunk, Egy másik módszer szerint a pL32 plazmidot úgy állíthatjuk elő, hogy Sall-EcoRI emésztéssel kihasítunk egy darabot, majd ennek a példának az első bekezdése szerint ligáljuk a pKC283-LB plazmidot,
12, példa
Az E.coli K12 M0(lambda*)/pL47 törzs előállítása
Az E.coli K12 RV308/pNM789 törzset a Northern Régiónál Research Laboratories-tól lehet beszerezni liofilezett formában, NRRL B-18216 letéti sorszám alatt. A pNM789 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt rajzok között a 3. ábrán mutatjuk be, A plazmid DNS-t lényegében a 6. példában leirtak szerint nyerjük ki a tenyészetből, azzal az eltéréssel, hogy az inkubálás hőmérséklete 37 °C, Tiz mikrogram pNM789 plazmid DNS-t szuszpendálunk 2OO/ul PvuII pufferben (50 mmól TRIS-HC1 pH=7,5. 60 mmól NaCl és 5 mmól MgClg). Egy egység PvuII restrikciós enzimet adunk a reakcióelegyhez, majd 5 percig 37 °C-on inkubáljuk. Az enzimet hővel inaktiváljuk olymódon, hogy az elegyet 5 percig 65 °C-on inkubáljuk, 30/ul 10 X BamHI puffért (200 mmól TRIS-HC1 pH=8.0), 1 mól NaCl és 70 mmól MgCl2) t 70/ul vizet és 10 egység BamHI restrikciós enzimet adunk a reakcióelegyhez, és 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk, Ezt követően 5 egység alkalikus foszfatázt adunk az elegyhez és 1 órán át 65 °C-on inkubáljuk. A DNS f ragment e,J<e t 1 százalékos agaróz gélen választjuk el, majd azt a fragmentet izoláljuk (4. ábra) és tisztítjuk, amelynek mérete megfelel az egyszeresen hasított molekulának.
Egy tompa végű, illetve BamHI végű DNS linkért szintetizálunk lényegében a 9, példában leírtak szerint. Ennek a linkérnek a szerkezete (4, ábra) a következő:
'-CTGTGCCTTCTAG-3 '
3‘-G^CACGGA4GATCCTAG-5' .
A linkért kinázoljuk és BamHI-PvuII restrikciós enzimekkel emésztett pNM789 plazmidba ligáljuk, lényegében a 9, példában leírtak szerint. Ezt a ligáló elegyet haszóáljuk E.coli K12 RV308 sejtek transzformálására, és ezekből a transzformánsokból plazmidot izolálunk lényegében a 8. példában leírtak szerint. Számos plazmidot szelektálunk, amelyek tartalmazzák a megfelelő méretű PvuII fragmentet (494 bp) és Xbal-BamHI fragmentet (628 bp). Ezek közül legalább kettőnek szekvenálással meghatározzuk a nukleotid sorrendjét a BamHI helytől az egyetlen Smal helyig, és egy, a megfelelő nukleotid szekvenciával rendelkező kiónt izolálunk. Ez a közbenső plazmid a 120-as plazmid. Ennek az eljárásnak a sémáját, valamint a 120 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt rajzok között a 4.ábrán mutatjuk be.
Az EK-bGH-t kódoló DNS izolálása céljából lO^ug
120 plazmidot emésztünk 200/ul magas sótartalmú pufferben, amely 50-50 egység Xbal illetve BamHI enzimet tartalmaz. Az emésztési termékeket agaróz gélelektroforézissel választjuk el, és a kb. 0y6 kb méretű Xbal-BamHI restrikciós fragmentet, amely az EK-BGH-t kódolja, izoláljuk, majd ligáláshoz előkészítjük a 11. példában leírtak szerint.
A pL32 plazmidot szintén megemésztjük Xbal és BamHI restrikciós enzimekkel, majd a pL32 plazmid kb. 3,9 bp méretű Xbal-BamHI restrikciós fragmentjét a 120 plazmid kb. 0^6 kb méretű Xbal-BamHI restrikciós fragmentjéhez ligáljuk, lényegében a 7, példában leírtak szerint, igy kapjuk a pL47 plazmidot, A pL47 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt rajzok között, az 5. ábrán mutatjuk be, A pL47 plazmidot E.coli K12 M0(lambda+) törzsbe transzformáljuk, lényegében a
8. példában közölt leírás szerint, majd az E.coli Κ12 M0(lambda+) /pL47 transzformánsokat azonosítjuk. A pL47 plazmid DNS„t a transzformánsokból lényegében a 6, példában közölt eljárással izoláljuk.
13. példa
Az E.coli K12 RV308/PPR12AR1 törzs előállítása
A pPRl2 plazmid a cI857 pL represszor gént és a pBR322 plazmid tetraciklin rezisztencia génjét tartalmazza. A pPR12 plazmidot a 4 436 815 sorszámú, 1984 március 13-án kibocsátott Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban közlik és helyezik szabadalmi védelem alá. A pPR12 plazmid • · • · · restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt rajzok között az 5. ábrán mutatjuk be.
egység EcoRI restrikciós enzimmel 200.ul magas sótartalmú pufferben 37 °C-on két órán át. Az EcoRI restrikciós enzimmel emésztett pPR12 plazmid DNS-t kicsapjuk, majd Klenow fragmenttel kezeljük, lényegében a 10, példában leírtak; szerint, A Klenow reakció után az EcoRI restrikciós enzimmel.emésztett pPR12 plazmid DNS_t ligálással racirkularizáljuk, lényagében a 7, példában közölt eljárás, szerint, A ligáit DNS-t, amely a kivánt pPR1R1 plazmid, használjuk E.coli K12 RV303 törzs transzformálására, lényegében a 8, példában leírtak szerint, azzal az eltéréssel, hogy a szelekciót tetraciklin (5 ^ug/ml) rezisztencia alapján és nem Ampicillin rezisztencia alapján végezzük. Az E.coli K12 RV308 törzs NRRL B-15624 letéti sorszám alatt elérhető az NRRL-nél. Miután az E.coli K12 RV308/pPR1R1 transzformánsokat azonosítottuk, a pPR1R1 plazmidot a 6. példában leirt eljárást követve állítjuk elő a transzformánsokból.
Körülbelül 10.ug pPR1R1 plazmid DNS-t emésztünk körül-
talmu pufferben 37 °C-on két órán át. Az Aval restrikciós enzimmel emésztett pPR1R1 plazmid DNS-t kicsapjuk, majd Klenow fragmenttel kezeljük, lényegében a 10. példában közölt eljárás szerint. A Klenow reakció után az Aval restrikciós enzimmel emésztett, Klenow fragmenttel kezelt pPR1R1 plazmid DNS-t EcoRI linkerhez ligáljuk (5'-GAGGAATTCCTC-3*), lényegében a 7.példában • ·· közölt eljárás szerint. A linker ligálása után a DNS-t kicsapjuk,majd körülbelül 200^ul magas sótartalmú puffer bsn oldjuk, amely körülbelül 50 egység EcoRi restrikciós enzimet tartalmaz. A kapott reakcióelegyet körülbelül két órán át 37 °C-on inkubáljuk. Az EcoRi emésztés után a reakcióelegyet agaróz gélre visszük, majd a kb. 5,1 kb méretű EcoRi restrikciós fragmentet lényegében a 11, példában közölt eljárással tisztítjuk. A kb. 5,1 kb méretű EcoRi restrikciós fragmentet ligálással recirkularizáljuk, lényegében a 2, példában közölt eljárás szerint. A ligáit DNS a keresett pPR12AR1 plazmid. A pPRl2AR1 plazmid DNS-t E.coli K12 RV308 törzsbe transzformáljuk, lényegében a 8. példában közölt eljárás szerint, azzal a különbséggel, hogy a szelekciót tetraciklin rezisztencia alapján és nem ampicillin rezisztencia alapján végezzük. Az E.coli K12 RV3O8/pPRl2AR1. transzformánsok azonosítása után a pPR12Ai plazmid DNS-t lényegében a 6. példában közölt leírás áLapján izoláljuk. A pPR12A1 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt rajzok között az 5. ábrán mutatjuk be.
14, példa
Az E.coli K12 RV308/PL110 törzs előállítása
Körülbelül 10,ug pPR12ARl plazmid DNS-t oldunk körül-
Pstl és EcoRi restrikciós enzimet tartalmaz, majd az emésztési reakcióelegyet körülbelül két órán át 37 °C-on inkubáljuk,
A reakcióelegyet ezután agaróz gélre visszük,majd a pPR12A1 plazmid kb, 2,9 kb méretű Pstl-EcoRI restrikciós fragmentjét izoláljuk és ligáláshoz előkészítjük, lényegében a 11, példában közölt eljárás szerint.
Körülbelül 1O/ug pL47 plazmid DNS-t emésztünk
PstI és BamHI restrikciós enzimekkel körülbelül két órán át magas sótartalmú pufferben, A Pstl-BamHI restrikciós enzimekkel emésztett plazmid DNS-t agaróz gélre visszük, majd a kb.
2,7 kb méretű Pstl-BamHI restrikciós fragmentet, amely a replikációs origót és az ampicillin rezisztencia gén egy részét tartalmazza, lényegében a 11. példában leirt eljárás szerint izoláljuk és készítjük elő ligáláshoz. Egy külön reakcióban körülbelül
10/ug pL47 plazmid DNS-t restrikciós enzimekkel
emésztünk EcoRI és BamHI sótartalmú pufferben 37 °Cont két órán át, majd izoláljuk és ligáláshoz készítjük elő a kb, 1,03 kb méretű EcoRI-BamHI fragmentet, amely az uj transzkripciós és transzlációs aktiváló szekvenciát, valamint az
EK-bGH kódoló szekvenciát tartalmazza. Erre a célra, a 11, példában közölt eljárást alkalmazzuk, A kapott kb, 2/ug kb, 1,03 kb méretű EcoRI-BamHI restrikciós fragmentet használjuk a pL110 plazmid előállítására,
A pL47 plazmid kb, 2,7 kb méretű Pstl-BamHI és kb, 1,03 kb méretű EcoRI-BamHI restrikciós fragmentjét a pPRl2AR1 plazmid kb, 2,9 kb méretű Pstl-EcoRI fragmentjéhez ligáljuk • ·· • ·· ···· • · • ······ a pL110 plazmid előállítására, majd a ligáit DNS-t használjuk E.coli K12 RV308 plazmid transzformálására, lényegében a 7, és 3. példában közölt eljárást alkalmazva, azzal az eltéréssel, hogy a transzformánsok szelektálására a tetraciklin rezisztenciát, nem az ampicillin rezisztenciát használjuk.
Két PstI restrikciós enzim felismerési hely található az EK-bGH kódoló régióban, amelyeket nem ábrázoltunk a mellékelt rajzok között közölt restrikciós és funkcionális térképeken. A pL11O plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt rajzok között az 5, ábrán mutatjuk be.
| 15. példa A PCZR125 plazmid előállítása Körülbelül 26^ug pL1lO plazmid DNS-t emésztünk | |
| Xbal | enzimmel az alábbiak szerint. A 10X Xbal puffer össze |
tétele 600 mmól TRIS-HC1, 100 mmól MgClg, 1 mól NaCl és 10 mmól 2-merkapto-etanol pH=7#5 (37 °C-on). SO^ul 10X Xbal puffért, 15/ul Xbal restrikciós enzimet (10 egység/ml) és
185 /ul vizet adunk a 25^ug pL110 plazmid DNS~t tartalmazó
250/ul vizes °C-on. Az oldathoz. Az emésztést egy órán át végezzük
Xbal restrikciós enzimmel emésztett pL110 plazmid DNS-t fenollal extraháljuk, 1/10 térfogatú 3 mólos
CHjCOO-Na-t adunk hozzá, majd 3 térfogat etanoltj az elegyet etanol-szárazjég fürdőben inkubáljuk 5 percig, majd centrifugáljuk. A kicsapott DNS-t 50/ul vizben oldjuk.
• * · ·
Az Xbal restrikciós enzimmel emésztett pL110 plazmid DNS-t BamHl restrikciós enzimmel emésztjük az alábbiak szerint. 0,2/ul BamHl restrikciós enzimet (10 egység/ml), 10/ul BamHl puffért (100 mmól TRIS-HC1, 50 mmól MgClg» 1 mól NaCl és 10 mmól 2-merkapto-etanol, pH=8.0 37 °C-on), majd
50/ul a fentiekben előállított Xbal restrikciós enzimmel emész tett pL1lO plazmidot adunk hozzá. Az emésztést 5 percig végez zük 37 °C-on. Az emésztett pL110 plazmidot fenollal extrahál juk, 1/10 térfogat CH^COONa-t adunk hozzá, majd 3 térfogat etanolt. A kicsapott DNS-t 50/ul 10 TE pufferben (10 mmól TRIS , 1 mmól EDTA, pH=8,0) oldjuk.
Az Xbal és BamHl restrikciós enzimekkel emésztett pLH0 plazmid DNS-t ezután agaróz gélre visszük, majd a kb,
5.8 kb méretű DNS csikót izoláljuk, A pCZRl25 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pLUO plazmid kb, 5,8 kb méretű fragmentjét egy Xbal és egy Ndel linkerhez és egy olyan EK-szarvasmarha növekedési hormonhoz kapcsoljuk, amely az 5‘ végén Ndel hasítási helyet, a 3’ végén BamHl hasítási helyet tartabiaz. Az Xbal-Ndel szekvenciát standard oligonukleotid szekvencia módszerrel állítjuk elő, ennek szerkezete a következő:
5'
A fenti szekvenciát mindkét szál kémiai szintézisével állítjuk elő, valamint ezeknek összekeverésével és hibridizálásával. Az EK bGH-t kódoló gént 16 kémiailag szintetizált egyszálu DNS darabból állítjuk össze, amelyeknek mérete 71-83 között változik, és együtt a teljes génnek mindkét komplementer szálát kiadják. A szintézist Battelle-lel végeztük. Applied Biosystems berendezésen, szekvenciája a következő;
5' TATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAGTTCCCAGCCATGTCCTT lllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll ACAAGGGTAACCTACTACTACTATTCAAGGGTCGGTACAGGAA
GTCCGGCCTGTTTGCCAACGCTGTGCTCCGGGCTCAGCACCTGCATCAGCTGGCTGCTGA llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll CAGGCCGGACAAACGGTTGCGACACGAGGCCCGAGTCGTGGACGTAGTCGACCGACGACT
CACCTTCAAAGAGTTTGAGCGCACCTACATCCCGGAGGGACAGAGATACTCCATCCAGAA
II11II11II11111111111111111111II11111111111111II11111II11111
GTGGAAGTTTCTCAAACTCGCGTGGATGTAGGGCCTCCCTGTCTCTATGAGGTAGGTCTT
CACCCAGGTTGCCTTCTGCTTCTCTGAAACCATCCCGGCCCCCACGGGCAAGAATGAGGC llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll
GTGGGTCCAACGGAAGACGAAGAGACTTTGGTAGGGCCGGGGGTGCCCGTTCTTACTCCG
CCAGCAGAAATCAGACTTGGAGCTGCTTCGCATCTCACTGCTCCTCATCCAGTCGTGGCT llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll GGTCGTCTTTAGTCTGAACCTCGACGAAGCGTAGAGTGACGAGGAGTAGGTCAGCACCGA
TGGGCCCCTGCAGTTCCTCAGCAGAGTCTTCACCAACAGCTTGGTGTTTGGCACCTCGGA llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll ACCCGGGGACGTCAAGGAGTCGTCTCAGAAGTGGTTGTCGAACCACAAACCGTGGAGCCT
CCGTGTCTATGAGAAGCTGAAGGACCTGGAGGAAGGCATCCTGGCCCTGATGCGGGAGCT Hllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll GGCACAGATACTCTTCGACTTCCTGGACCTCCTTCCGTAGGACCGGGACTACGCCCTCGA
GGAAGATGGCACCCCCCGGGCTGGGCAGATCCTCAAGCAGACCTATGACAAATTTGACAC hiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii CCTTCTACCGTGGGGGGCCCGACCCGTCTAGGAGTTCGTCTGGATACTGTTTAAACTGTG
AAACATGCGCAGTGACGACGCGCTGCTCAAGAACTACGGTCTGCTCTCCTGCTTCCGGAA llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll TTTGTACGCGTCACTGCTGCGCGACGAGTTCTTGATGCCAGACGAGAGGACGAAGGCCTT •••τ Σ’·* ···’ · « ··· *·· ·»··
GGACCTGCATAAGACGGAGACGTACCTGAGGGTCATGAAGTGCCGCCGCTTCGGGGAGGC
...........................................................
CCTGGACGTATTCTGCCTCTGCATGGACTCCCAGTACTTCACGGCGGCGAAGCCCCTCCG
CAGCTGTGCCTTCTAG 3' ιιιιιιιιιιιιιιιι
GTCGACACGGAAGATCCTAG 5'
A pCZR125 plazmidot a következő komponensek összeligálásával készítjük el: kb. 0,28/ug a pl_110 plazmid teljes Xbal-es és részleges BamHI-es emésztéséből származó 5.8 kb méretű fragmentje marha növekedési faktor származékát kódoló szintetikus génből, amely az 5’ végen az Xbal restrikciós felismerési helyet tartalmazó szakaszt, a 3* végen a BamHI restrikciós felismerési helyet tartalmazó szakaszt tartalmaz, 2,5 és 8.75 pikomolt a kémiailag szintetizált
6/ul 5 X ligáló pufidul térfogatban. A plazmid komponenseket ferhez adjuk, melynek összetétele: 250 mmól TRIS-HCL, 50 mmól
MgClg, 5 mmól ATP, 5 mmól DTT, 25 tf% polietilén-glikol 8000 pH=7.6, 2/ul ligáz és 16.5/ul viz, A ligáló elegyet éjszakán át 16 °C-on inkubáljuk. A cirkularizált pCZR125 plazmidot használ juk E.coli RV308 sejtek transzformálására, lényegében a 8. példában leirt eljárás szerint.
Claims (10)
1. Eljárás abnormális expressziós vektor replikációjának szabályozására, azzal jellemezve , hogy egy antibiotikumot legalább bakteriosztatikus koncentrációban adunk egy fermentléhez a termék expresszió indukálásával körülbelül egyidőben,
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett antibiotikum DNS szintézis inhibitor, sejtfal-szintézis inhibitor, enzim-inhibitor és · vitamin analóg lehet.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett antibiotikum DNS-szintézis inhibitor.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett DNS-szintézis inhibitor nitrofurán, cinoxacin, acrosaxacin, novobiocin, oxolinsav, pipemidinsav, piromidinsav, norfl_oxacin, antramicin és bleomicin lehet.
5. A 4, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett DNS-szintézis inhibitor cinoxacin vagy novobiocin.
6. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett antibiotikum sejtfal-szintézis inhibitor.
• <
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett sejtfal-szintézis inhibitor penicillin, kefalosporin, vankomicin, cikloszerin, alafosíolin, foszfomicin, klavulánsav, bacitracin, moenomicin és risztocetin lehet.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett sejtfal-szintézis inhibitor ampicillin.
9. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az emlitett antibiotikum egy enzim-inhibitor.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, zzal jellemezve, hogy az enzim-inhibitor klavulánsav.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US37157989A | 1989-06-26 | 1989-06-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU903975D0 HU903975D0 (en) | 1990-11-28 |
| HUT54415A true HUT54415A (en) | 1991-02-28 |
Family
ID=23464539
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU903975A HUT54415A (en) | 1989-06-26 | 1990-06-25 | Process for controlling accumulation of aberrant expressing vectors with fermentation processes |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5824496A (hu) |
| EP (1) | EP0405858B1 (hu) |
| JP (1) | JPH0347081A (hu) |
| AT (1) | ATE125300T1 (hu) |
| AU (1) | AU617057B2 (hu) |
| CA (1) | CA2019696A1 (hu) |
| DE (1) | DE69020968T2 (hu) |
| DK (1) | DK0405858T3 (hu) |
| ES (1) | ES2076318T3 (hu) |
| GR (1) | GR3017703T3 (hu) |
| HU (1) | HUT54415A (hu) |
| IE (1) | IE67799B1 (hu) |
| IL (1) | IL94847A0 (hu) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5395761A (en) * | 1991-11-27 | 1995-03-07 | Eli Lilly And Company | Plasmid pHKY334, an expression vector for EK-BGH and host cells transformed therewith |
| US6406855B1 (en) | 1994-02-17 | 2002-06-18 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
| US6335160B1 (en) | 1995-02-17 | 2002-01-01 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55127986A (en) * | 1979-03-26 | 1980-10-03 | Agency Of Ind Science & Technol | Bacteria pretreatment with antibiotic inhibiting synthesis of cell wall |
| US4529695A (en) * | 1981-06-18 | 1985-07-16 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Recombinant cloning vector, host for the vector, and method for using same |
| JPS5998685A (ja) * | 1982-08-06 | 1984-06-07 | ザ・ボ−ド・オブ・トラステイ−ズ・オブ・ザ・リ−ランド・スタンフオ−ド・ジユニア・ユニバ−シテイ | 休止細胞を使用する生物的生成物の製造 |
| JPS6158595A (ja) * | 1984-08-28 | 1986-03-25 | ジェネックス・コーポレイション | 徴生物によるタンパク質規模生産方法 |
-
1990
- 1990-06-22 CA CA002019696A patent/CA2019696A1/en not_active Abandoned
- 1990-06-22 AT AT90306853T patent/ATE125300T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-06-22 AU AU57805/90A patent/AU617057B2/en not_active Ceased
- 1990-06-22 ES ES90306853T patent/ES2076318T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-22 DK DK90306853.4T patent/DK0405858T3/da active
- 1990-06-22 EP EP90306853A patent/EP0405858B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-22 IL IL94847A patent/IL94847A0/xx unknown
- 1990-06-22 DE DE69020968T patent/DE69020968T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-06-25 JP JP2166529A patent/JPH0347081A/ja active Pending
- 1990-06-25 IE IE228990A patent/IE67799B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-06-25 HU HU903975A patent/HUT54415A/hu unknown
-
1995
- 1995-08-10 US US08/513,598 patent/US5824496A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-10-11 GR GR950402812T patent/GR3017703T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU5780590A (en) | 1991-01-03 |
| GR3017703T3 (en) | 1996-01-31 |
| JPH0347081A (ja) | 1991-02-28 |
| US5824496A (en) | 1998-10-20 |
| EP0405858B1 (en) | 1995-07-19 |
| CA2019696A1 (en) | 1990-12-26 |
| DE69020968D1 (de) | 1995-08-24 |
| EP0405858A2 (en) | 1991-01-02 |
| HU903975D0 (en) | 1990-11-28 |
| IE67799B1 (en) | 1996-05-01 |
| DK0405858T3 (da) | 1995-09-04 |
| ATE125300T1 (de) | 1995-08-15 |
| ES2076318T3 (es) | 1995-11-01 |
| IE902289L (en) | 1990-12-26 |
| AU617057B2 (en) | 1991-11-14 |
| DE69020968T2 (de) | 1995-12-21 |
| EP0405858A3 (en) | 1992-04-29 |
| IL94847A0 (en) | 1991-04-15 |
| IE902289A1 (en) | 1991-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4727028A (en) | Recombinant DNA cloning vectors and the eukaryotic and prokaryotic transformants thereof | |
| Norgard et al. | Factors affecting the transformation of Escherichia coli strain χ1776 by pBR322 plasmid DNA | |
| EP0068740A2 (en) | Recombinant DNA cloning vectors and the eukaryotic and prokaryotic transformants thereof | |
| Files et al. | A Pichia pastoris fermentation process for producing high-levels of recombinant human cystatin-C | |
| HU208552B (en) | Process for producing polypeptides and for place-specific modification of genom ofpichia yeasts | |
| HU204097B (en) | Process for producing cloning system relating to kluyveromyces species | |
| KR20210041903A (ko) | 락테이트 대사 및 알코올 생성이 억제된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법 | |
| Garcia-Junceda et al. | A new strategy for the cloning, overexpression and one step purification of three DHAP-dependent aldolases: Rhamnulose-1-phosphate aldolase, fuculose-1-phosphate aldolase and tagatose-1, 6-diphosphate aldolase1 | |
| KR100218853B1 (ko) | 인체 혈청 알부민의 제조방법 | |
| RU1780542C (ru) | Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК pPS 20, кодирующей изопенициллин-N-синтетазу, способ получени штамма СернаLоSроRIUм асRемоNIUм, обладающего активностью изопенициллин-N-синтетазы | |
| HUT54415A (en) | Process for controlling accumulation of aberrant expressing vectors with fermentation processes | |
| US9012179B2 (en) | Method for mass-producing antifreeze protein derived from polar yeast | |
| JPH06197759A (ja) | ジクチオステリウムのジペプチジルアミノペプチダーゼ | |
| JP3681982B2 (ja) | 酵母からラクトフェリンポリペプチドを大量生産する方法及びそれに有用な微生物菌株 | |
| WO2014187269A1 (zh) | 发酵生产二聚体化融合蛋白的方法 | |
| JP3794760B2 (ja) | フィターゼ生産酵母 | |
| WO2008096368A2 (en) | A novel process for production of recombinant human g-csf | |
| CN114933644B (zh) | 一种泥鳅抗菌肽Ma-sHep及其应用 | |
| AU653178B2 (en) | Method of improving the yield of heterologous proteins produced by streptomyces lividans | |
| CN118307657A (zh) | 提高ri可溶性表达的方法 | |
| Oudega et al. | Effect of glucose fermentation of the functioning of protein H in the excretion of cloacin DF13 by Escherichia coli | |
| KR100468596B1 (ko) | 메탄올자화효모인 피치아 패스토리스를 이용하여 인간락토페린을 생산하는 방법, 이 방법에 의해 제조된 인간락토페린 및 피치아 패스토리스 균주 | |
| KR20020008530A (ko) | 훼리틴 유전자 발현을 위한 형질전환된 재조합 효모균주및 이를 이용한 재조합 훼리틴 생산방법 | |
| RU1770359C (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК pJDB (MSIL), обеспечивающа синтез интерлейкина-2 человека в клетках дрожжей SасснаRомUсеS ceReUISIaL, способ ее получени и штамм дрожжей SасснаRомYсеS ceReUISIaL - продуцент интерлейкина-2 человека | |
| JPS63133999A (ja) | 誘導発現による蛋白質の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFC4 | Cancellation of temporary protection due to refusal |