DE69019573T2 - Luciferinderivate. - Google Patents

Luciferinderivate.

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DE69019573T2
DE69019573T2 DE69019573T DE69019573T DE69019573T2 DE 69019573 T2 DE69019573 T2 DE 69019573T2 DE 69019573 T DE69019573 T DE 69019573T DE 69019573 T DE69019573 T DE 69019573T DE 69019573 T2 DE69019573 T2 DE 69019573T2
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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
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    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Derivate von Luziferinanalogen und Salze davon, welche verwendbar sind als Chemilumineszenz-Reagenzien und neuartige Zwischenprodukte, die für deren Zubereitung verwendbar sind.
  • In den letzten Jahren wurden Chemilumineszenz-Mikroanalysen von Substanzen in einem lebenden Körper oft benützt und viele Chemilumineszenz-Reagenzien wie Luminol-Derivate und Oxalester wurden entwickelt und benützt. Nachdem Chemilumineszenz-Eigenschaften bei Luziferinen entdeckt worden waren, welche als Biolumineszenz-Substanzen bekannt geworden sind, wurden verschiedene Arten von Chemilumineszenz-Verbindungen synthetisiert, die spezifisch sind für den Nachweis von aktivem Sauerstoff und Ähnlichem. Beim Nachweisen von aktivem Sauerstoff in lebenden Organismen erschwert allerdings Interferenz durch kontaminierende Substanzen, die Absorbtion oder Fluoreszenz im sichtbaren Bereich aufweisen, oft eine Analyse. Es ist deshalb ein Objekt der Erfindung, Chemilumineszenz-Reagenzien zu liefern, die bei längeren als konventionellen Wellenlängen emittieren.
  • Es ist ein weiteres Objekt der Erfindung, Zwischenprodukte und Salze davon zu liefern welche verwendbar sind für die Herstellung von solchen Chemilumineszenz-Reagenzien.
  • In FEBS Letters, Band 239, Nr. 2 (November 1988), Seiten 347 - 350 wurde eine Lumineszenz-Methode für die Bestimmung von Sauerstoff-Bildung in aktivierten Leukozyten-Systemen beschrieben, die 2-Methyl-6-phenyl-3,7-dihydroimidazo[1,2-a] pyrazin-3-on verwendet.
  • Gemäss eines Aspekts der Erfindung werden Verbindungen gemäss der folgenden Formel (I) geliefert:
  • wobei X Wasserstoff, eine Aminoschutzgruppe vom in Peptidsynthesen verwendeten Typ,
  • R-, R-CO-, R-SO&sub2;-, R-NHCO-, oder R-NHCS-; R eine fluoreszierende Gruppe wie
  • 5- oder 6-Carboxyfluoreszein-succinimidester,
  • 5- oder 6-Carboxyfluoreszein-amidocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester,
  • Fluoreszein-5-isocyanat,
  • Fluoreszein-5-isothiocyanat,
  • 5-(4,6-Dichlorotriazin-2-yl)amino-fluoreszein dihydrochlorid,
  • 4-Dimethylamino-azobenzyl-4'-sulfonylchlorid,
  • 4-Dimethylamino-azobenzyl-4'-isothiocyanat,
  • 4-Chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol, und
  • 4-Fluoro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol,
  • und n eine Ziffer von 1 bis 4, oder Salze davon bedeutet.
  • Die oberen neuartigen Verbindungen beinhalten beide Chemilumineszenz-Reagenzien und Zwischenprodukte zu deren Herstellung. Die Erfindung beinhaltet also ein Chemilumineszenz-Reagenz, das eine wie oben definierte Verbindung ist, wobei X in Formel (I) R-, R-CO-, R-SO&sub2;-, R-NHCO-, oder R-NHCS-; und R eine besagte fluoreszierende Gruppe, oder ein Salz davon bedeutet.
  • Die fluoreszierende Gruppe R in obiger Formel (I) zeigt bevorzugt ein angeregtes Wellenlängenspektrum, das dasjenige von 3,7-Dihydro-6-(4-methoxyphenyl)-2-methylimidazo[1,2-a]pyrazin-3-on wesentlich überlagert. Weiter sollte sie eine Emissionswellenlänge von 400 bis 530 nm oder mehr, bevorzugterweise von 470 bis 510 nm aufweisen. R kann zum Beispiel von Fluoreszein, 4-Dimethylaminophenylazobenzol oder 4-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol abgeleitet sein.
  • Die Erfindung schliesst die Verwendung eines wie oben definierten Chemilumineszenz- Reagenzes zur Bestimmung von aktivem Sauerstoff in lebenden Organismen ein.
  • Die Erfindung beinhaltet ebenso ein Zwischenprodukt für die Produktion eines wie oben definierten Chemilumineszenz-Reagenzes, welches eine Verbindung gemäss der Erfindung ist, wobei X Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe vom in Peptidsynthesen verwendeten Typ bedeutet wie z.B.:
  • Benzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, p-Chlorobenzyloxycarbonyl,
  • p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Phenylazobenzyloxycarbonyl,
  • p-Methoxyphenylazobenzyloxycarbonyl, t-Butyloxycarbonyl,
  • t-Amyloxycarbonyl, p-Biphenylisopropyloxycarbonyl, Diisopropylmethyloxycarbonyl und Formyl.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung beinhalten Salze der Verbindungen der obigen Formel (I), zum Beispiel Salze mit Alkalimetall wie Natrium, Kalium oder Lithium, Salze mit Erdalkalimetallen wie Magnesium, Kalzium oder Barium, Salze mit anderen Metallen wie Aluminium oder Säureadditionssalze mit einer Säure wie Salzsäure Schwefelsäure, Salpetersäure, Phoshorsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Zitronensäure Milchsäure, Bromwasserstoffsäure oder Trifluoressigsäure, oder Salze mit Basen wie Ammoniak oder organischen Aminen.
  • Diese Salze können von freien Derivaten der Formel (I) auf übliche Art und Weise hergestellt werden oder können untereinander ausgetauscht werden.
  • Die verschiedenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung können wie folgt hergestellt werden.
  • Verbindungen der Formel (II):
  • wobei X' eine Aminoschutzgruppe und n eine Ziffer von 1 bis 4 bedeutet, werden mit 2- Aminoacetamidin in einer wässrigen Kaliumhydroxidlösung kondensiert, um die beschriebenen Glyoxal-Verbindungen in Pyrazin-Derivate umzuwandeln. Die resultierenden Produkte werden in Methanol mit einer wässrigen Lösung von Methylglyoxal umgesetzt, um 3,7-Dihydro[1,2-a]pyrazin-3-on-Derivate gemäss den vorliegenden Verbindungen der Formel (I) zu erhalten, wobei X eine Aminoschutzgruppe darstellt.
  • Aminoschutzgruppen können von aminogeschützten 3,7-Dihydro[1,2-a]pyrazin-3-on- Derivaten entfernt werden, um die Verbindungen der vorliegenden Erfindung der Formel (I) zu erhalten, wobei X Wasserstoff bedeutet. Zum Beispiel, im Fall dass Benzyloxycarbonyl als Aminoschutzgruppe benützt wird, kann die Schutzgruppe durch eine konventionelle Methode wie eine katalytischen Reduktion oder eine Behandlung mit Bromwasserstoffsäure-Essigsäure entfernt werden.
  • Verschiedene Arten von Substituenten können in die Aminoposition der beschriebenen Verbindungen eingeführt werden, von welchen die Schutzgruppe entfernt ist. Deshalb sind die Verbindungen sehr nützlich als Ausgangsmaterial, um eine fluoreszierende Gruppe in eine Luziferin analoge Struktur einzuführen.
  • Darauf kann ein fluoreszierender Reaktand, der eine funktionelle Gruppe enthält, welche mit Aminen kombinieren kann, mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung der Formel (I) kondensiert werden, wobei X Wasserstoff bedeutet, um die Chemilumineszenz- Substanzen der vorliegenden Erfindung der Formel (I) zu erhalten, wobei X R-, R-CO-, R- SO&sub2;-, R-NHCO- oder R-NHCS- bedeutet (R stellt einen fluoreszierenden Reaktanden dar). Als Kondensationsmethode mit Aminen kann eine Substitutionsreaktion einer Abgangsgruppe wie Halogen, eine Kondensationsreaktion zwischen Säurehalogenide und Aktivester, die üblicherweise bei Petidsynthesen verwendet wird, eine Reaktion mit Isocyanat oder Isothiocyanat und Ähnlichem angewendet werden. Die Kondensations- Reaktionen können gemäss den Reaktionsbedingungen ausgeführt werden, die auf dem Gebiet der Peptidsynthese und Fluoreszenzmarkierung von Aminen konventionellerweise angewandt werden. Die Fluoreszenz-Reaktanden, die eine funktionelle Gruppe enthalten welche mit Aminen kombinieren können, zum Beispiel 5- oder 6-Carboxyfluoreszeinsuccinimidester, 5- oder 6-Carboxyfluoreszein-amidocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester, Fluoreszein-5-isocyanat, Fluoreszein-5-isothiocyanat, 5-(4,6- Dichlorotriazin-2-yl)amino-fluoreszeindihydrochlorid, 4-Dimethylamino-azobenzyl-4'- sulfonylchlorid, 4-Dimethylaminoazobenzyl-4'-isothiocyanat, 4-Chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3- diazol, 4-Fluoro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol, und Ähnliche können verwendet werden.
  • Die resultierenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung können durch nach dem Stand der Technik bekannte Methoden wie Destillation, Chromatographie und Umkristallisation gereinigt werden. Die Charakterisierung wird unter anderem durch Schmelzpunkt, Elementaranalyse, IR, NMR, UV, Massenspektrum etc. gewährleistet.
  • Die Erfindung wird nun mit Hinweis auf die folgenden Beispiele illustriert.
    • Beispiel 1
  • (1) Zu einer eiskalten Lösung von 2-Aminoethanol (2.1 mol) in 50% Ethanol (800 ml) wurden langsam 100 ml Benzylchloroformat zugegeben. Nach zweistündigem Umrühren bei derselben Temperatur wurde die Mischung auf das halbe Volumen konzentriert. Der Rückstand wurde mit 1N Schwefelsäure angesäuert (pH 2) und dreimal mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zu einem Oel eingedampft, welches aus Ethanol kristallisiert wurde, um 115 g 2-(N Benzyloxycarbonylamino)ethanol als farblose Nadeln zu erhalten.
  • Smp: 55 - 57 ºC
  • IR (KBr): 3330, 1692, 1540, 1275, 1210, 1143, 1032, 993, 742, 695cm&supmin;¹
  • MS (El, 20eV): m/z 195 (M+)
  • NMR (CDCI&sub3;): δ = 2.87 (1H, br.s), 3.25 - 3.35 (2H,m), 3.66 (2H,t, J = 4.6 Hz),
  • 5.08 (2H, s), 5.42 (1H,br), 7.25 - 7.40 (5H, m)
  • (2) Zu einer Lösung des resultierenden Produkts (28 g) in Pyridin (200 ml) wurden 25 g p- Toluolsulfonylchlorid zugegeben. Die Mischung wurde bei 0 ºC während 1 Std. umgerührt, in Eiswasser gegossen, mit 6 N HCl angesäuert und mit Essigester extrahiert. Die Extrakte wurden mit Wasser und Sole gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um 43 g 2-(N-Benzyloxycarbonylamino)ethyl- p-toluolsulfonat als ein Oel zu erhalten.
  • IR(pur): 3350, 1730, 1498, 1455, 1215, 1160, 1121, 1080, 1035, 1021, 816, 738, 685 cm&supmin;¹
  • NMR (CDCI&sub3;): δ = 2.43 (3H, s), 3.44 (2H, dt, J = 5.0, 5.3 Hz), 4.08 (2H, t, J = 5.0 Hz),
  • 5.05 (2H, s), 5.17 (1H, br.t), 7.25 - 7.45 (5H, m), 7.32 (2H, d, J = 9.0 Hz),
  • 7.77 (2H, d, J = 9.0 Hz)
  • (3) Eine Mischung von 35 g 2-(N-Benzyloxycarbonylamino)ethyl-p-toluolsulfonat, 13 g 4'- Hydroxyacetophenon und 55 g wasserfreies Kaliumcarbonat in 450 ml trockenem Aceton wurde unter Umühren unter Argon für 24 Std. rückflussiert. Nach dem Abkühlen wurde das unlösliche Material durch Filtration entfernt und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde mit Essigester verdünnt, mit Wasser, 1% NaOH und Sole gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und unter reduziertem Druck eingedampft, um einen Festkörper zu erhalten, welcher aus Hexan/Benzol um kristallisiert wurde, um 26.5 g 4'-(-2-(N-Benzyloxycarbonylamino)ethoxy)-acetophenon als farblose Nadeln zu erhalten.
  • Smp:80 - 81 ºC
  • IR (KBr): 3310, 1690, 1666, 1600, 1560, 1356, 1273, 1257, 1165, 1112, 1055, 837, 826, 750, 698 cm&supmin;¹
  • MS (El, 20eV): m/z 313 (M+)
  • NMR (CDCI&sub3;): 8 = 2.55 (3H, s), 3.63 (2H, dt, J = 5.0, 5.3 Hz), 4.10 (2H, t, J = 5.0 Hz), 5.11(2H, s), 5.27(1H, br.t), 6.90(2H, d, J = 8.7 Hz), 7.27-7.42(5H, m), 7.92 (2H, d, J = 8.7 Hz)
  • (4) Eine Mischung von 21 g des resultierenden Produkts, 7.44 g Selendioxid, 1.35 ml Wasser und 34 ml Dioxan wurden während 20 Std. rückflussiert. Nach der Entfernung des Selens wurde das Losungsmittel abgedampf, um ein zähflüssiges Oel zu erhalten welches mit 300 ml Wasser bei 100 ºC während dreistündigem Umrühren behandelt wurde. Die Lösung wurde aufkonzentriert, um 23 g 4-(2-(N-Benzyloxycarbonylamino)ethoxy)phenylglyoxal Hydrat als ein Oel zu erhalten, welches in der nächsten Reaktion ohne weitere Reinigung eingesetzt wurde.
  • (5) Zu einer Lösung von 4-(2-(N-Benzyloxycarbonyl-amino)ethoxy)phenylglyoxal Hydrat (16 g) in Methanol (60 ml) und 1,4-Dioxan (60 ml) wurde eine Lösung von 2- Aminoacetamidin-dihydrobromid (11 g) in Wasser bei -15 ºC zugegeben. Eine 20% KOH-Lösung (32 ml) wurde dazugegeben und die Mischung bei -15 ºC während 1 Std. und bei Raumtemperatur 1 Std. umgerührt. Das Solvens wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rückstand getrocknet, um einen rohen Festkörper zu erhalten, der mit 2-Propanol verrührt wurde. Der unlösliche Festkörper wurde durch Filtration gesammelt, mit kaltem 2-Propanol gewaschen und getrocknet, um 5.9 g 2-Amino-5-(4-(2-(N- Benzyloxycarbonylamino)ethoxy)phenyl)pyrazin als blassgelbe Kristalle zu erhalten.
  • Smp: 128 - 130 ºC
  • IR (KBr): 3380, 3175, 1686, 1601, 1522, 1504, 1478, 1458, 1259, 1250, 1193, 1140, 1010, 820, 696 cm&supmin;¹
  • MS (El, 20eV): m/z 364 (M+)
  • NMR (CDCI&sub3;): δ = 3.63 (2H, dt, J = 5.0, 5.2 Hz), 4.08 (2H, t, J = 5.0 Hz), 4.61(2H, br.s), 5.13 (2H, s), 5.35 (1H, br.t), 6.94 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.26 - 7.42 (5H, m), 7.78 (2H, d, J = 8.7 Hz), 8.02 (1H, d, J = 1.4 Hz), 8.36(1H, d, J = 1.4 Hz)
  • (6) Das resultierende Produkt (1.0 g) und Methylgyoxal (5.55 mmol) wurden in 23 ml Methanol gelöst und 0.55 ml konz. Salzsäure bei Raumtemperatur unter Argon dazugegeben. Die Mischung wurde bei 70 ºC während 4 Std. umgerührt und zu einem rohen Pulver kondensiert, das mit Wasser verrührt wurde. Der ausgefallene Festkörper wurde abfiltriert, mit Wasser und Ether gewaschen und getrocknet, um 1.2 g 6-(4-(2-(N- Benzyloxycarbonylamino)ethoxy)phenyl)-3,7-dihydro-2-methylimidazo[1,2-a]pyrazin-3- on Hydrochlorid als gelbe Kristalle zu erhalten.
  • Smp: 152 - 155 ºC
  • IR (KBr): 3350, 3100 - 2000, 1700, 1652, 1598, 1500, 1241, 830 cm&supmin;¹
  • MS (SIMS): m/z 419 (M+)
  • NMR (CDCI&sub3;): 3 = 2.56 (3H, s), 3.54 (2H, t, J = 5.6 Hz), 4.11 (2H, t, J = 5.6 Hz), 5.09 (2H, s), 7.08 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.22 - 7.40 (5H, m), 7.89 (2H, d, J = 8.6 Hz), 8.53 (1H, d, J = 1.1 Hz), 9.04 (1H, d, J = 1.1 Hz)
  • (7) Eine Mischung des resultierenden Produkts (500 mg) und wasserfreie Bromwasserstoffsäure in Essigsäure (30% Lösung, 1.2 ml) wurde bei Raumtemperatur während 10 min. umgerührt. Ether wurde der Mischung zugegeben und der ausgefallene Festkorper abfiltriert, mit Ether gewaschen, gefolgt von Chloroform und getrocknet, um 490 mg 6-(4-(2-Aminoethoxy)phenyl)-3,7-dihydro-2-methylimidazo[1,2-a] pyrazin-3-on Dihydrobromid as hydroskopes Pulver zu erhalten.
  • MS (SIMS): m/z 285 (M+)
  • NMR (CDCI&sub3;): 8 = 2.58 (3H, s), 3.44 (2H, t, J = 4.9 Hz), 4.36 (2H, t, J = 4.9 Hz), 7.21 (2H, d, J = 8.7 Hz), 8.01 (2H, d, J = 8.7 Hz), 8.65 (1H, br.s), 9.16 (1H, br.s)
  • (8) Das resultierende Produkt (525 mg) wurde in 10 ml Wasser gelöst und 5% Natriumhydrogencarbonatlösung dazugegeben bis zum pH 9. 460 mg Fluoreszeinisothiocyanat in Aceton wurde zugegeben und die Mischung während 2 Std. umgerührt. Die Reaktion wurde durch Ansäuern mit Essigsäure auf pH 4.5 gestoppt und der ausgefallene Festkörper durch Filtration gesammelt, mit Wasser, Aceton, Methanol gefolgt von Ether gewaschen, um 450 mg 3,7-Dihydro-6-(4-(N'-fluoreszeinyl)- thioureido)ethoxy)phenyl)-2-methylimidazo[1,2-a]pyrazin-3-on (Verbindung 1) als gelbe Kristalle zu erhalten.
  • Smp: 226 - 228 ºC (Zersetzung)
  • IR (KBr): 3700 - 2000, 1602, 1580, 1505, 1461, 1245, 1175, 1106, 835 cm&supmin;¹
  • MS (SIMS): m/z 674 (M+)
  • UV: λmax = 284, 355, 452 nm (in MeOH)
  • λmax = 253, 265, 440 nm (in MeOH-HCI)
  • λmax = 240, 265, 495 nm (in MeOH-NaOH)
  • NMR (CDCI&sub3;/CD&sub3;OD = 1/1): δ = 2.50 (3H, s), 4.14 (2H, t, J = 5.6 Hz),
  • 4.32 (2H, t, J = 5.6 Hz), 6.55 (2H, dd, J = 2.4, 8.6 Hz),
  • 6.70 (2H, d, J = 2.5 Hz), 6.72 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.10 (2H, d, J = 10.9 Hz),
  • 7.15 (1H, d, J = 8.3 Hz), 7.58 (2H, d, J = 10.9 Hz), 7.59 (1H, br.s),
  • 7.73(1H, br.s), 7.87(1H, dd, J = 2.1, 8.3 Hz), 8.11(1H, d, J = 2.1 Hz)
    • Beispiel 2
  • Verbindung 1 (1.8 g) wurde in Methanol suspendiert und 225 mg Natriumhydrogencarbonat in Wasser (90 ml) wurde bei Raumtemperatur dazugegeben. Nach dem Umühren bei Raumtemperatur während 30 Min. wurde die Lösung erwärmt bis sie transparent wurde und bei reduziertem Druck kondensiert. Zu diesem Rückstand wurden 20 ml Methanol und 100 ml Ether zugegeben. Der ausgefallene Festkörper wurde durch Filtration gesammelt, mit Ether gewaschen und getrocknet, um 1.71 g Natriumsalz der Verbindung 1 zu erhalten.
  • Smp: 228 - 232 ºC (Zersetzung)
  • IR (KBr): 3700-2000, 1630, 1582, 1510, 1470, 1382, 1320, 1250, 1210, 1108, 850 cm&supmin;¹
  • MS (SIMS): m/z 674 (M+), 697 (M+Na+1), 719 (M+2Na)
  • UV: λmax = 455, 485 nm (in Wasser)
  • λmax =492 nm (in Wasser-HCI)
  • λmax = 443 nm (in Wasser-NaOH)
  • NMR (CDCI&sub3;/CD&sub3;OD = 1/1): δ = 2.50 (3H, s), 4.13 (2H, t, J = 5.2 Hz),
  • 4.13 (2H, t, J = 5.2 Hz), 4.33 (2H, t, J = 5.2 Hz),
  • 6.78 (2H, dd, J = 2.2, 8.9 Hz), 6.93 (2H, d, J = 2.2 Hz),
  • 7.01(2H, d, J = 8.9 Hz), 7.12 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.20 (1H, d, J = 8.3 Hz),
  • 7.63 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.70 (1H, br.s), 7.29 (1H, br.s),
  • 8.00 (1H, dd, J = 2.0, 8.3 Hz), 8.34 (1H, d, J = 2.0 Hz)
    • Messung des Chemilumineszenz-Spektrums
  • 3 ml 0.01 M Cetyltrimethylammoniumbromid in 0.1 M Phosphat-Buffer (pH 7.0) wurde in einer Quarzglaszelle vorgelegt. Ungefähr 10 g der Verbindung 1 der vorliegenden Erfindung wurde dazugegeben und gelöst, und dann sofort das Chemilumineszenz-Spektrum mit einem Lumineszenz-Spekrometer gemessen. Das Resultat ist ist Fig. 1 gezeigt.
  • Fig. 1 zeigt das Emissions-Spektrum der Verbindung 1 der vorliegenden Erfindung im Chemilumineszenz-System.
  • Wie durch das Resultat der Messung des Chemilumineszenz-Spektrums in Fig. 1 gezeigt wird, wurde das Fluoreszenzmaximum, das durch Verbindung 1 emittiert wurde, bei 532 nm im Chemilumineszenz-System gemessen. Im Vergleich zur Fluoreszenzmaximum- Wellenlänge (380 nm) von 2-Methyl-6-phenyl-3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-3-on, welches oft als Chemilumineszenz-Reagens benützt wird, hat Verbindung 1 der vorliegenden Erfindung eine um 150 nm höhere Wellenlänge des Fluoreszenzmaximums. Deshalb ist es vorteilhafterweise möglich, die emittierte Chemilumineszenz durch Benützung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu messen, mit wenig Interferenz mit Komponenten des lebenden Organismus, die Absorbtion oder Fluoreszenz im sichtbaren Bereich zeigen.
  • Die Luziferin-Derivate der vorliegenden Erfindung, welche durch kovalente Kombination eines fluoreszierenden Reaktanden mit einer Luziferin-Verbindung hergestellt werden, sind neuartige Verbindungen, die es ermöglichen, aktiven Sauerstoff durch charakteristische Lumineszenz nachzuweisen, welche eine höhere Wellenlänge aufweist, als üblich ist. Verglichen mit konventionellen Chemilumineszenz-Substanzen, emittieren die Verbindungen dieser Erfindung eine Lumineszenz von höherer Wellenlänge, so dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sehr nützlich sind als Chemilumineszenz- Reagenzien für emissions-spektrochemische Analysen, zum Beispiel die Bestimmung von aktivem Sauerstoff in Proben lebender Körper, die viele störende Substanzen enthalten oder die Analysen von verschiedenen Substanzen von Teilen lebender Körper in Kombination mit einem in vivo System, das aktiven Sauerstoff produziert und/oder ein enzymatisches System, das verknüpft ist mit der Produktion von aktivem Sauerstoff.

Claims (12)

1. Verbindungen der folgenden Formel (I):
wobei X Wasserstoff, eine Aminoschutzgruppe vom in Peptidsynthesen verwendeten Typ, R-, R-CO-, R-SO&sub2;-, R-NHCO-, oder R-NHCS-; R eine fluorenszierende Gruppe wie
5- oder 6-Carboxyfluoreszein-succinimidester,
5- oder 6-Carboxyfluoreszein-amidocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester,
Fluoreszein-5-isocyanat,
Fluoreszein-5-isothiocyanat,
5-(4,6-Dichlorotriazin-2-yl)amino-fluoreszein dihydrochlorid,
4-Dimethylamino-azobenzyl-4'-sulfonylchlorid,
4-Dimethylamino-azobenzyl-4'-isothiocyanat,
4-Chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol, und
4-Fluoro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol, und n ist eine Ziffer von 1 bis 4, oder Salze davon bedeutet.
2. Chemiluminiszenz-Reagens, welche eine Verbindung gemäss Anspruch 1 ist, worin X in Formel (I) R-, R-CO-, R-SO&sub2;-, R-NHCO-, oder R-NHCS- ist, und R eine besagte fluoreszierende Gruppe, oder ein Salz davon bedeutet.
3. Chemiluminiszenz-Reagens gemäss Anspruch 2 welche 3,7-Dihydro-6-(4-(2-(N'-(5- Fluoreszeinyl)-thioureido)ethoxy)-phenyl)-2-methylimidazo [1,2-a]pyrazin-3-on, oder ein Salz davon ist.
4. Chemiluminiszenz-Reagens gemäss Anspruch 3 welches das Natrium Salz ist.
5. Verwendung eines Chemiluminiszenz-Reagenzes gemäss eines der Ansprüche 2 bis 4 zur Bestimmung von aktivem Sauerstoff in lebenden Organismen.
6. Zwischenprodukt für die Herstellung von Chemiluminiszenz-Reagenzien gemäss Anspruch 2, welches eine Verbindung gemäss Anspruch 1 ist, wobei X Wasserstoff bedeutet.
7. Zwischenprodukt für die Herstellung von Chemiluminiszenz-Reagenzien gemäss Anspruch 2, welches eine Verbindung gemäss Anspruch 1 ist, wobei X eine Aminoschutzgruppe vom in Peptidsynthesen verwendeten Typ bedeutet.
8. Zwischenprodukt für die Herstellung von Chemiluminiszenz-Reagenzien gemäss Anspruch 2, welche eine Verbindung gemäss Anspruch 1 ist, wobei X eine Aminoschutzgruppe wie:
Benzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, p-Chlorobenzyloxycarbonyl,
p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Phenylazobenzyloxycarbonyl,
p-Methoxyphenyl-azobenzyloxycarbonyl, t-Butyloxycarbonyl,
t-Amyloxycarbonyl, p-Biphenylisopropyloxycarbonyl, Diisopropylmethyloxycarbonyl und Formyl bedeutet.
9. Verwendung eines Zwischenproduktes gemäss eines der Ansprüche 6 bis 8 für die Herstellung eines Chemiluminiszenz-Reagenzes.
10. Verfahren für die Herstellung eines Zwischenproduktes gemäss Anspruch 7 oder Anspruch 8, das die Kondensation einer Verbindung der Formel (II):
wobei X' eine Aminoschutzgruppe, wie in Anspruch 7 oder 8 definiert, und n eine Ziffer von 1 bis 4 bedeutet,
mit 2-Aminoacetamidin beinhaltet, um ein Pyrazin Derivat zu bilden und das resultierende Produkt mit Methylglyoxal umzusetzen, um ein entsprechendes 3,7- Dihydro[1,2-a]pyrazin-3-on gemäss Formel (I) zu erhalten, wobei X eine beschriebene Aminoschutzgruppe ist.
11. Verfahren zur Herstellung eines Zwischenproduktes gemäss Anspruch 6, das die Entfernung einer Aminosäureschutzgruppe einer Verbindung gemäss Anspruch 7 oder 8 beinhaltet
12. Verfahren zur Herstellung eines Chemiluminiszenz-Reagenzes gemäss Anspruch 2, in dem eine Verbindung gemäss Anspruch 6 mit einem fluoreszierenden Reaktanden R-Y, R-CO-Y, R-SO&sub2;-Y, R-NHCO-Y, oder R-NHCS-Y umgesetzt wird, wobei R eine wie in Anspruch 1 definierte fluoreszierende Gruppe und Y eine aminoreaktive funktionale Gruppe bedeutet.
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