DE69013512T2

DE69013512T2 - Rindcoronavirus-polypeptide sowie impfstoffe.

Info

Publication number: DE69013512T2
Application number: DE69013512T
Authority: DE
Inventors: Lorne Babiuk; Graham Cox; Michael Parker
Original assignee: Veterinary Infectious Disease Organization
Current assignee: Veterinary Infectious Disease Organization
Priority date: 1989-08-22
Filing date: 1990-08-10
Publication date: 1995-02-23
Anticipated expiration: 2010-08-11
Also published as: DE69013512D1; EP0489033B1; US5369026A; EP0489033A1; WO1991002752A1; CA2065365A1; CA2065365C

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Impfstoffe zum Schutz gegen Coronavirus-Infektionen mit besonderer Nützlichkeit für den Schutz von Vieh gegen das Rinder-Coronavirus ("BCV"). Die vorliegende Erfindung betrifft auch Materialien und Methoden zur Erzeugung von Coronavirus-Impfstoffen sowie Methoden zum Einsatz der Impfstoffe.

Hintergrund der Erfindung

Coronaviren wurden ursprüglich als eine einzigartige Gruppe erkannt beruhend auf ihrer unverwechselbaren Morphologie. Die Virione besitzen bei negativer Anfärbung große blütenblattförmige Glykoprotein-Ausläufer bzw. -Stacheln oder "Peplomere". Diese Stacheln ragen aus der Umhüllung der Virione heraus. Die Bezeichnung "Coronavirus" wurde aufgrund der Ähnlichkeit des Virus mit der "Corona spinarium" oder der Krone aus Dornen, welche die Häupter von Figuren in der mitteralterlichen religiösen Kunst umgab, vorgeschlägen. Oder aber das Auftreten der vorstehenden Proteine des Virions wurde mit dem Sonnenkranz verglichen.
Die Coronaviren verursachen bei Mensch ebenso wie auch bei Haus- und Labortieren Krankheiten. Viele dieser Krankheiten sind von großer wirtschaftlicher Bedeutung, da sie oft schwere enterale oder respiratorische Infektionen bei Tieren verursachen. In charakteristischen Weise verursachen Coronaviren, die bei adulten Tieren enterale Infektionen hervorrufen, nur milde oder nicht offensichtliche Infektionen, lösen aber bei Neugeborenen oder Jungtieren schwere Durchfallerkrankungen aus.
Das Coronavirus besitzt mehrere strukrurelle Komponenten. Seine genomische RNA besteht aus einem Plus-Strang, den 16 bis 21 kb lang ist. Die Coronaviren sind RNA-Viren mit einer Hülle. Daher liegt das Nukleokapsid innerhalb einer Umhüllung aus Lipoprotein. Diese Hülle stammt entweder vom rauhen endoplasmatischen Retikulum oder von dem Golgi-Apparat der infizierten Zelle ab. Innerhalb der Lipiddoppelschicht der Umhüllung gibt es noch andere virale Glykoproteine.
Die Coronaviren umfassen niindestens vier antigene Gruppen. Diese Gruppen wurden auf der Grundlage von enzymgekoppelten Immuntests (ELISA), senologischen Untersuchungen mit Immunfluoreszenz-Prülverfahren, Virus-Neutnalisierungstests und Immun-Elektronenmikroskopie charakterisiert. Innerhalb jeder Gruppe zeigen die Viren partielle antigene Kreuzreaktivität; sie sind allerdings bereits durch ihre Wirtsspezifität und die klinischen Krankhuitsbilden unterschieden.
Coronaviren besitzen gewöhnlich drei einzigartige bedeutende strukturelle Proteine: N, E1 und E2. Zusätzlich besitzen einige Coronaviren, wie das Rinder-Coronavirus ein viertes strukrurelles Protein, welches mit E3 bezeichnet wird.
Das N- oder Nukleokapsid-Protein ist ein basisches Phosphoprotein mit 50 bis 60 K. Viele Kopien des N-Proteins fügen sich mit der genomischen RNA zusammen, um ein langes, fluxibles Nukleokapsid mit helikaler Symmetrie zu bilden. Das N-Protein ist das am häufigsten vonkommendu Protein im Viriong Die N-Proteine des von Schweinen übertragenen Gastroenteritis-Virus (TGEV), des Maus-Hepatitis-Virus (MHV) und des infektiösen Vogel- Bronchitis-Virus (IBV) zeigen nur ungefähr 27 % Homologie im Vergleich untereinander.
Das transmembrane Protein oder Matrix-Protein, das mit E1 bezeichnet wird (oder manchmal auch mit M) ist oftmals eine Gruppe von unterschiedlich glykosylierten Proteinen, die auch eine nicht glykosylierte Vorstufe mit einschließt. Das E1-Protein dient dazu, das Nukleokapsid an die virale Hülle zu binden, während das Virus Knospen in das endoplasmatische Retikulum und die Membranen des Golgi-Apparat austreibt. E1 kann bevonzugt an Serin- oder Threonin- Resten phosphoryliert werden, im Vergleich zu Aspanagin-Resten, wie bei den meisten anderen viralen Glykopnoteinen. Antikörpen gegen E1 benötigen die Gegenwart von Komplementfaktonen, um die virale Infektiösität zu neutralisieren.
Das Peplomen-Protein, oft als E2 bezeichnet, ist ein Glykoprotein, welches die großen "blütenblattförmigen" Oberflächen-Ausläufen des Virus ausbildet. Eine kurze Verankerung des Proteins ist in den Membran eingebettet, wobei der größte Anteil des Moleküls außerhalb der Lipiddoppelschicht liegt. E2 besitzt ein scheinbares Molekulargewicht von 180 bis 200 K. Das E2-Glykoprotein ist an der Anheftung des Virus, den Fusion mit der Zullmembran und an den Produktion von Virus-neutralisiurendem Antikörper beteiligt.
Die E2-Proteine von FIPV und das eng verwandte TGEV unterscheiden sich von dem E2- Protein des MHV und IBV in zwei wichtigen Beziehungen. Enstens, proteolytische Spaltung von E2 ist fün die Aktivierung nicht nötig; FIPV ist wirkungsvoll in der Herbeiführung der Zellfusion. Zweitens, die E2-Proteine von FIPV und TGEV sind größer (210 K gegenüber 180 K, mit einer proteolytischen Spaltung in zwei Produkte von 80 bis 90 K, die für die Fähigkeit zun Zellfusion bei MHV benötigt werden). Zusätzlich berichten du Groot et al., (1987) Adv. Exp. Med. Biol. Band 218: Seite 31 - 38, daß die Klonierung und Sequenzierung der E2-Gene von IBV M41, MHV A59 und FIPV 79-1146 offenbart, daß die E2-Proteine im großen und ganzen eine geringe Homologie der Aminosäuren aulweisen (ohne Angabe des zahlenmäßigen Prozentanteils: Regionen wurden als hoch homolog eingeschätzt, wenn zwei Sequenzen mindestens zu 30 % identisch waren).

Infektiöser Bronchitis-Virus (IBV) von Vögeln:

Der avikuläre infektiöse Bronchitis-Virus ist ein respiratorischer Krankheitserreger bei Hühnern und daher von großer ökonomischer Wichtigkeit in der Geflügelindustrie. Die Hintergrundinformation der IBV (M41)-E2-Charakterisierung kann bei Cavanagh (1983), J. Gen. Virology, Band 64: Seiten 2577 - 2583 nachgelesen werden.
Cavanagh et al., (1984) Avian Pathology Band 13: Seiten 573 - 583, berichteten über die Impfung von Hühnern mit über Saccharose-Gradienten gereinigten IBV-Proteinen und über eine anschließende Exposition (challenging) der geimpften Vögel mit IBV. Obwohl E2 (im Cavanagh Labon mit "S" für Stachel bezeichnet) eine Antikörperbildung hervorrief, zeigte es sich nicht wirksam in der Vermittlung von IBV-Schutzwirkung /Resistenz für die geimpften Hühner was durch deren Empfänglichkeit für die charakteristische IBV-vermittelte respiratorische Infektion bewiesen wurde.
Mockett et al. (1984), Jg Gen. Virology Band 65: Seiten 2281-2286, haben monoklonale Anti- E2-Antikörper (MAbs) hergestellt, die nur eine Angt von IBV (M41) in vitro neutralisierung
Tomley et al. (1987), J. Gen. Virology, Band 68: Seiten 2291-2298, haben einen cDNA-Klon von LBV-E2 hergestellt und diesen in einen Vaccinia-Virus eingeschleust. Das exprimiente rekombinante E2-Protein wurde durch Anti-E2-Antiseren erkannt. Mäuse wurden mit dem rekombinanten Virus geimpft. Die neutralisierenden Titen der geimpften Mäuse waren, obwohl sie höher waren als in den Kontrollen, trozdem niedrig. (7 Wochen nach der Impfung hatten Mäuse welche eine Injektion mit rekombinantem Virus erhalten hatten, einen neutralisierenden Titen von 1 : 25 gegen den Teststamm, verglichen mit 1 : 10 für. Seren von Mäusen, die mit dem Kontroll-Virus (Wild-Typ Vaccinia) geimpft wurden.)
Gemäß einer Quelle, sind "hervorragende Impfstoffe für LBV verfügbar", aber "die Krankheit ist immer noch weitverbreitet aufgrund des Auftretens von neuen Varianten." Niesters et al., (1986) Virus Research Band 5: Seiten 253-263, auf Seite 261. Die Authoren synthetisierten daher cDNA-Klone, schrieben einen Bericht über die IBV-M41-Nukleotidsequenz und verglichen die vorhergesagten Aminosäure-Sequenzen von zwei IBV-Stämmen (M41 und M42), die unterschiedliche neutralisierende Epitope besitzen, um den Versuch zu unternehmen, die IBV-neutralisienenden Epitope zu lokalisieren. Niestens et al., (1986), siehe oben, auf Seite 257, Fig. 2. Die Autoren erklärten, daß "soweit bekannt ist, nur Antikörper, die gegen die S1 (Komponente) des Peplomer-Proteins gerichtet sind, fähig sind, die Virus-Infektiosität zu neutralisieren." Niestens et al, siehe oben, auf Suite 261. Tonnley et al., siehe oben, wiederholten, daß keine anderen viralen Proteine Ziele für Antikörper-vermittelte Virus- Neutralisierung sind. "Trotz diesen (Kenntnis), konnten bei Vögeln, die mit gereinigten "Stachel"-Protein geimpft wurden, keine schützenden Immunantwonten erreicht werden." Tomley et al., auf Seite 2292.

Vom Schwein übertragbare Gastroenteritis (TGEV)

Die vom Schwein übertragbare Gastroenteritis (TGEV) verursacht neonatale virale Enteritis. Die Infektion ist oft tödlich für Ferkel mit einem Alter unten zwei Wochen. TGEV besitzt, ebenso wie die murinen und avikulären Coronaviren, drei Polypeptide, N, E1 und E2. Monoklonale Anti-E2-Antikörpen wurden hergestellt (durch Verwendung einer konzentrienten unaufgereinigten Suspension des Purdue-Virus) und für in vitro-Neutralisationsassays eingesetzt. Laude et al., (1986), J. Gen. Virology Band 67: Seiten 119 - 130.

Maus-Hepatitis-Virus (MHV)

Das Maus-Hepatitis-Virus ist ein neurotropher Virus, der relativ ausführlich untersucht wurde; da es Demyelinisierung hervorruft, ist MHV ein mögliches Modell für solche Erkrankungen wie Multiple Sklerose. Sturman et al. (1985) J. Virology Band 56: Seiten 904 - 911 berichten, daß die Infektion mit Coronaviren häufig in einer Zellfusion, sowohi in vivo, als auch in vitro rusultiert. In vitro lösen sich die Synzytien von dem Substrat ab und sterben. Es wurde gezeigt, daß monospezifisches Serum gegen E2, das 2 - 4 Stunden nach den Animpfung zu den Zellkulturen zugegeben wurde, die Zellfusion "beträchtlich hemmt". Weiterhin wurde berichtet, daß die proteolytische Spaltung von E2 nötig sein könnte, um die zellfusionierende Fähigkeit des Proteins einzuleiten und zu aktivieren.
Vom MHV-4, JHM Stamm wird ebenfalls berichtet, daß er drei Haupt-Strukturproteine, N, E1 und E2, beinhaltet. Dalziel et al. (1986), J. Virology Band 59: Seiten 463 - 471, auf Seite 463. Dalziel et al. stellten Anti-E2-MAbs her und untersuchten den Einfluß von Mutationen auf die Virulenz. Die Virus-Neutralisierung durch die MAbs wurde in vitro ausgewertet. Frühere Arbeiten in diesem Labor, berichtet von Talbot et al., (1984), Virology, Band 132: Seiten 250- 260, identizierten vier Epitope auf E2, zwei davon vermittelten Virus-Neutralisation in vitro. Anti-E2-Mabs schützten Mäuse passiv von der letalen Exposition einer intrazerebralen Animpfung mit MHV-4 in vivo, obwohl sie immer noch an Demyelinisierung litten. Bachmeier et al. (1984), Virology Band 132: Seiten 261-270. Die Untersuchungen von Buchmeier et al. zeigen auf, daß die in vitro-Neutralisierung und die in vivo-Schutzwirkung nicht miteinander korrelieren. Buchmeier et al., siehe oben, auf Seite 268, Spalte 1. Die Infektion des Zentralen Nervensystems durch MHV wurden nicht durch die Mabs verhindert, welche als "protektiv" bezeichnet wurden. Schutzwirkung wurde offensichtlich durch die Verlangsamung der viralen Replikation, ohne sie aufzuhaften, vermittelt (ebenda). Außerdem verhinderten "protektive" Antikörper, die gegen letale Gehirnhautentzündung schützten, nicht die Demyelinisierung durch eine temperatur-sensitive MHV-4-Mutante (ebenda, auf Seite 269, Spalte 1).
Wege et al. (1984), J. Gen Virology. Band 65: Seiten 1931 - 1942, untersuchten ebenfalls die Kapazität von Anti-E2-Mabs, Ratten vor akuter Encephalomyelitis zu schützen (Tabelle 3, auf Suite 1939). Wege et al. entwickelten und analysierten monoklonale Antikörper gegen verschiedene Epitope des MHV E2-Proteins. Einige den Antikörper, die die Zellfusion in vitro verhinderten, waren fähig, das Fortschreiten den venheerenden Encephalomyelitis bei Ratten zu verhindern, obwohl die Demyelinisierung nicht ausgeschaftet sondern nur vermindert wurde. Wieder bestätigte sich, daß die passive Immunität gegen eine letale Exposition, durch den Einsatz von MAbs gegen MHV-E2 eine beschränkte Schutzwirkung im murinen System bereitstellt, wie durch Dalziel et al., siehe oben, und die Wege-Forschungsgruppe gezeigt wurde.
Schmidt et al., (1987) J. Gen.Virology Band 68: Seiten 47 - 56 haben E2 sequenziert und die Aminosäurusequenz daraus abgeleitet. Von der S2-Untereinheit des E2s wird angenommen, daß sie anschließend an die proteolytische Spaltung /zellfüsionierende Aktivierung membrangebunden bleibt. Dies ist ziemlich ähnlich für die S2 Untereinheit von IBV. Aber siehe auch Makino et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. Band 84: Seiten 6567 - 6571, die berichten, daß das canboxyterminale 1/3 von E2 zumindestens teilweise für die MHV-Neuropathogenität und die Neutnalisierung verantwortlich ist. Makino et al. postulieren, daß die Spaltung des 180-K- E2-Protein in 90-K-Untereinheiten, welche die Zullfusion aktiviert, die Carboxyl-Hälfte von E2 exponienen könnte.
Das Fachgebiet der Cononavirus-Forschung wurde in erster Linie auf das murine Virus-System ausgerichtet entsprechend dem Potential, Krankheiten des Nervensystems zu verstehen. Außerdem wan die Forschung auf dem Gebiet den Vogel-IBV und der Schweine-TGEV von großem Interesse für die Geflügel- beziehungsweise für die Schweine-Industrie. In diesen Nicht-BCV-Coronavirus-Systemen scheint die Entwicklung von Impfstoffen auf die Guflügelindustrie begrenzt gewesen zu sein; bedingt durch die Entstehung neuer Varianten, ist die IBV Enkrankung immer noch weitverbreitet; Niesters et al., siehe oben. Frühe Studien vurden üben die Auslösung passiven Schutzmechanismen gegen MHV unternommen.
Den Rinder-Coronavirus (BCV) ist ein bedeutender Virus in den Rinderwirtschaft. Die BCV Forschungsarbeit wurde auf die Entwicklung von Zellinien zur Herstellung und Isolierung von BCV aus Zellkulturen ausgerichtet. Dea et al. (1980), Am. J. Vet. Res. Band 41: Seiten 30-38. Zusätzlich verwendete eine Forschungsgruppe das ganze Virus zur Herstellung von Antiseren, was zur Identifizierung mehreren Glykoproteine führte. King et aL (1982), J. Virology Band 42: Seiten 700-707; Hogue et al. (1984), J. Virology Band 51: Seiten 384-388; King et al. (1985), Virus Research Band 2:53-59. Diese Gruppe hat auch für die Gene der BCV Mubus Species die für N und E1 ("M" genannt für Matrix) codieren, eine Genkarte angelegt. Lapps et al., (1987) Virology Band 157: Seiten 47-57. Hogue et aL, (1984), siehe oben, verwendeten Immunoblots zur Identifizierung eines gp 140 (Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 140 K), das aus, durch Disulfidbrücken verbundenen 65-K-Untereinheiter besteht. King et al., (1985), siehe oben, haben auch üben ein 140-K-Glykoprotein, welches ein Disulfid-verknüpftes Dimer aus zwei 65-K-Glykoproteinen ist, berichtet, von dem sie annehmen, daß es das hämagglutinierende Protein von BCV ist. Abgesehen von seiner Funktion als Hämagglutinin, wird seine Rolle in den BCV-Replikation und -Pathogenese als unbekannt angegeben. Die Glykoproteine, die durch diese Gruppe identifiziert wurden, wurden nicht durch andere Gruppen bestätigt oder reproduziert. Die identifizierten Proteine könnten Fragmente oder Artefakte von den verschiedenen nativen BCV-Proteinen darstellen. Über die Entwicklung von BCV-Impfstoffen wurde nicht berichtet.
Das BCV-E2-Glykoprotein hat ein apparentes Molekulargewicht von 190 K, das vermutlich in zwei zusammen wandernde 100-K-Proteine gespalten werden kann. Der Vorläufer für E2 ist ein 170-K-Glykoprotein. Dieser 170-K-Vorläufer scheint nochmals glykosyliert zu werden, um das 190-K-E2 hervorzubringen (Deregt, D. und Babiuk, L. (1987) Virology Band 161: Seiten 410 - 420). Neutralisierende Epitope von Fragmenten des BCV E2-Proteins, durch Proteolyse von Antigen-Antikörper-Komplexen enzeugt, wurden kartiert (Deregt et al. (1989), J. Gen. Virol., Band 70: Seiten 647 - 658).
E3 ist einzigartig für bestimmte Coronaviren. Diese umfassen das bovine Coronavirus, den hämagglutinienenden Encephalomyelitis-Virus (HEV) von Schweinen und den humanen respiratorischen Cononavirus (HCV-OC43). Siehe z. B. Parker et al. (1989) J. Gen.Virol. Band 70: Seiten 155-64.
Ein idealer BCV-Impfstoff hätte die Fähigkeit, Schutzwirkung zu entfalten oden die Pathogenese zu verbessern, ohne das Risiko einer Infektion, ein Risiko, das mit einem lebenden oder einem vollständigen Virus als Impfstoff verbunden ist.
Es wurde henausgefünden, daß BCV, zusätzlich zum E2-Protein, ein Protein besitzt, das mit "E3" bezeichnet wird. Rekombinante BCV-Polypeptide wurden von klonierten E2- und E3- Genen hergestellt. Die E2- und E3-Gene wurden sequenziert und die Aminosäuresequenz der primären Translationsprodukte dieser Gene wurde abgeleitet. Die BCV-E2- und E3- Glykoproteine besonders die rekombinante Form von diesen Proteinen, wurden als wichtige immunologische Ziele identifiziert und sind daher als Bestandteile eines Impfstoffes, den auf die Verhütung den BCV-Infektion bei bovinen Populationen ausgerichtet ist, nützlich. Das rekombinante E2 und E3 den vorliegenden Erfindung sind sehr wirkungsvolle Untereinheiten- Antigene für eine Impfstoff-Zusammensetzung. Weiterhin wurden Klone, die das ganze BCV- Genom repräsentieren, hergestellt, und die E2 und E3 Gensequenzen wurden identifiziert.
Die vorliegende Erfindung hat daher viele Ausführugsformen. Im besonderen ist die Erfindung auf ein DNA-Molekül ausgerichtet, daß eine codierende Sequenz für das BCV-E2- Protein oder denen antigene Fragmente einschließt, wobei das BCV-Protein mindestens zu 80 % homolog zu dem Protein der Sequenz ID Nr. 1 ist, und das DNA-Molekül mindestens zu 80 % homolog zu den DNA-Sequenz der Sequenz ID Nr. 1 ist; mit der Maßgabe, daß das DNA- Molekül nicht für das BCV-E3-Protein codiert. Die Identifizierung antigener Fragmente ist dem Stand den Technik entsprechend aus den Sicht der hier vorliegenden Bekanntgabe und umfaßt zum Beispiel die Herstellung von Trypsin-Fragmenten, kurzen Oligopeptiden etc. und die Anwendung von Standardmethoden, urn die hergestellten Fragmente auf Antigenizität und andere Aktivitäten zu überprüfen. Das DNA-Molekül kann auch eine Expressions-Kasette beinhalten, welche die oben genannte codierende Sequenz und Kontrollsequenzen umfaßt, welche funktionell mit der codierenden Sequenz verbunden sind, wodurch die codierende Sequenz in einer Wirtszelle transkribiert und translatiert werden kann, wobei mindestens eine den Kontrollsequenzen heterolog zu den codierenden Sequenz ist. Die codierende Sequenz kann im wesentlichen für ein vollständiges BCV-Protein, wie E2, oder antigenische Fragmente von E2 codieren.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf Wittszellen, die dieses DNA-Molekül enthalten, ebenso wie auf Methoden zur Produktion rekombinanter Polypeptide, die antigene BCV E2-Sequenzen umfassen.
In einer anderen Ausführungsform erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf eine Impfstoffzusammensetzung zum Gebrauch in einem Verfahren, welches eine Immunantwort in einem Säuger als Wirt gegen BCV-Infektion auslöst, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff und eine wirksame Menge an antigenischem BCV-E2-Polypeptid, wobei das Polypeptid mindestens zu 80 % homolog zu der Proteinseqzenz der Seq. ID. Nr. 1 ist.
In einen weitenen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft sie eine Impfstoffzusammensetzung, wie oben festgelegt.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, die im wesentlichen reines Rinder-Coronavirus (BCV)-Polypeptid enthält, wobei das BCV- Protein das E2 ist, wekghes die Aminosäuresequenz, die in Seq. ID. Nr. 1 gezeigt wird, besitzt.
Die anschließende Beschreibung wird diese und andere Ausführungsformen jenen offenlegen, die mit dem Stand den Technik vertraut sind.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische genetische Karte der strukturellen BCV-Protein-Gene. Ungefähr 10 000 Nukleotide des viralen Genoms sind in der Figur repräsentiert. Die Länge des Luserahmens ist für jedes Gen in Nukleotiden angegeben, wobei die Zahl der Nukleotide unter dem Namen für jedes Gen erscheint. Die Lange des BCV-N-Gens und die nicht codierende 3'- Region sind von Lapps et al. übernommen. Es wird auch die pCVA12-Sonde gezeigt, die homolog zum 3'-Ende des viralen Genoms ist, wobei der 5'-Anteil von pCVA12 zur Identifiziurung von Klonen verwendet wurde, die sich in das E2-Gen hinein erstrecken.
Fig. 2 zeigt eine Northern-Blot-Analyse der BCV-RNA.
Fig. 3 zeigt die Nukleotidsequenz des BCV-E2-Gens und die abgeleitete Aminosäuresequenz für das E2-Vorläuferprotein. Referenzzahlen für die Polynukleotide stehen oberhalb der Sequenz mit Sternchen, um die genaue Positionierung der Nukleotide zur korrespondierenden Referrenznummer anzugeben. Referenzzahlen für die Aminosäuresequenz erscheinen auf der rechten Seite am Ende jeder Zeile. Die konservierte intergenische Sequenz ist von einem Rechteck umgeben; die aminoterminale Signalsequenz ist mit einer durchgezogenen Linie unterstrichen; die carboxyterminale transmembnane Domäne ist mit einer unterbrochenen Linie unterstrichen; ein Pfeil zeigt eine wahrscheinliche Schrittstelle für das Vorläufermolekül an, und mögliche an N-gekoppulte Glykosylierungsstellen sind durch gefüllte Kreise angezeigt.
Fig.4 zeigt die Nukleotidsequenz des BCV-E3-Gens und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz des primären Translationsproduktes. Referenzzahlen für die Polynukleotide stehen oberhalb der Sequenz mit Sternchen, verwendet, um die genaue Position der Nukluotide, die mit den Referenzzahl korrespondieren, anzugeben. Referenhzahlen für die Aminosäuresequenz erscheinen auf den rechten Seite am Ende jeder Zeile. Die konservierte intergenische Sequenz ist von einem Rechteck umgeben; die aminoturminale Signalsequenz ist mit einen durchgezogenen Linie unterstrichen; die carboxyterminale transmembrane Domäne ist mit einen durchgezogenen Linie dunch offene Kreise unterstrichen, und potentielle an N-gekoppelte Glykosylierungsstellen sind durch gefüllte Kreise angezeigt.
Fig. 5 ist eine Photographie von einem SDS-PAGE-Gel, auf dem durch in vitro-Translation hergestellte Proteine analysiert wurden, die von der mRNA der BCV-E2- und E3-Gene nach Subklonierung in ein Plasmid (pTZ 19R) produziert wurden. Unterhalb der Photographie sind die Spurnummern, auf den rechten Seite sind Ziffern, die das Molekulargewicht angeben. Spur 1: E2-Genprodukt; Spur 2: Marker des Molekulargewichts; Spur 3: E3-Genprodukte; Spur 4: E3-Genprodukte, die in Anwesenheit von pankreatischen Mikrosomen synthetisiert wurden. MW: molekulares Gewicht x 10&supmin;³.
Fig. 6 ist eine Photographie von einem PAGE-Gel, das die Expression des BCV-E3- Polypeptids in AcNPV-infizierten Insektenellen zeigt. Die Spuren sind durch Großbuchstaben quen über dem oberen Rand beschriftet; Molekulargewichte (x 10&supmin;³) sind vertikal entlang der linken Seite der Figur angegeben.
Fig. 7 ist eine Photographie von einem PAGE-Gel, das die Synthese des BCV-E2-Polypeptids durch einen rekombinanten Bakulovirus in S. frugiperda-Zellen zeigt. Die Spuren sind quer über dem oberen Bildrand durch Numern beschriftet; Felder sind unterhalb durch Großbuchstaben beschriftet. Molekulargewichte (x 10&supmin;³) sind links von der Figur angeben.
Fig. 8 zeigt einen Vergleich der Aminosäure-Sequenzhomologie zwischen den E2- Glykoproteinen des Rinder-Coronavirus und der murinen Hepatitis-Virusstämme JHM und A59. (JHM von Schmidt et al. (1987) J. General Virology 68: Seiten 47 - 56; A59 ist von deGroot et al. (1987) Adv. Exp. Med. Biol. 218: Seiten 31 - 38)

Wege der Ausführung der Erfindung

Die Anwendung der vorliegenden Erfindung wird, wenn es nicht anders zum Ausdruck gebnacht wird konventionelle Techniken der Mikrobiologie, Virologie, Molekularbiologie und Techniken mit rekombinanter DNA, die dem Stand der Technik entsprechen, in Anspruch nehmen. Diese Techniken werden ausführlich in der Literatur erklärt. Siehe z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach Band I & II (D. Glover, Ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, Ed. (1984)); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, Eds. (1985)); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds. (1984)): Animal Cell Culture (R. Freshney, Ed. (1986)); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).

A. Definitionen

Bei der Beschreibung den vorliegenden Erfindung wird die folgende Terminologie, wie sie nachfolgend definiert wird, verwendet.
Ein "Replikon" ist irgendein genetisches Element (z. B. ein Plasmid, Chromosom, Virus) das als eine autonome Einheit der DNA-Replikation in vivo funktioniert; d. h. es ist unten seiner eigenen Kontrolle zur Replikation fähig.
Ein "Vektor" ist ein Replikon, wie beispielsweise ein Plasmid, ein Phage oder ein Cosmid, an das ein anderes DNA-Segment angehängt wenden kann, so daß die Replikation des angehängten Segments herbeigeführt wird.
Der Ausdruck "doppelsträngiges DNA-Molekül " bezieht sich auf die polymere Form den Dusoxyribonukleotide (Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin) in der normalen, doppelsträngigen Helix. Dieser Fachbegriff bezieht sich nur auf die Primär- und Sekundärstrukrur des Moleküls und schränkt es, im Bezug auf irgendeine besondere tertiäre Form, nicht ein. Daher umfaßt dieser Begriff doppelsträngige DNA, die u.a. in linearen DNA-Molekülen (z. B. Restriktionsfragmenten), Viren, Plasmide und Chromosomen gefunden wurde. Bei den Enörterung der Strutur von bestimmten doppelsträngigen DNA-Molekülen können Sequenzen hier entsprechend der normalen Übereinkunft beschrieben werden, bei den die Sequenz nur in den 5'- nach 3'-Richtung am nicht transkribierten Strang der DNA angesehen wird (d. h. der Strang, der die homologe Sequenz zur mRNA hat)
Eine DNA-"codierunde Sequenz" ist eine DNA-Sequenz, die in vivo transkribiert und in ein Polypeptid translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle einer geeigneten regulatorischen Sequenz gestellt wird. Die Grenzen den codierenden Sequenz werden durch ein Startcodon am 5'-(Amino-)Terminus und einem Stoppcodon für die Translation am 3' (Carboxy-) Terminus bestimmt. Eine codierende Sequenz kann prokaryotische Sequenzen, cDNA von eukaryontischer mRNA; genomische DNA-Sequenzen von eukaryontischer (z. B. von Säugern) DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt. Ein Signal für die Polyadenylierung und eine Sequenz für die Termination der Transkription wenden gewöhnlich am 3'-Ende der codierenden Sequenz lokalisiert sein.
Eine "Promoton -Sequenz" ist eine regulatorische Region der DNA, die fähig ist, die RNA- Polymerase in einer Zelle zu binden und die Transkription an einer weiter unten gelegenen (3'- Richtung) codierenden Sequenz zu iniitieren. Zum Zweck der Definition der vorliegenden Erfindung ist die Promotor-Sequenz am 3'-Terminus durch das Startcodon für die Translation (ATG) einen codierenden Sequenz gebunden und erstreckt sich auf stromaufwärts liegende Sequenzen (5'-Richtung), um eine minimale Arzahl an Basen oder Elementen einzuschließen, die für die Initiation den Transkription auf einem über dem Hintergrund liegenden Niveau notwendig ist. Innerhalb der Promotor-Sequenz wird eine Initiationsstelle für die Transkription (gewöhnlich durch die Kartierung mit den Nuclease S1 bestimmt) vorhanden sein, ebenso wie Bindungsdomänen für Proteine (Konsensussequenzen), die für die Bindung den RNA- Polymerase venantwortlich sind. Eukaryontische Promotoren werden oft, aber nicht immen, "TATA"-Boxen und "CAT"-Boxen beinhalten. Prokaryotische Promotoren besitzen zusätzlich zu den -10- und -35 - Konsensussequenzen Shine-Dalgarno-Sequenzen.
DNA-"Kontrollsequenzen" beziehen sich kollektiv auf Promotor-Sequenzen, Bindungsstellen für Ribosomen, Signale für die Polyadenylierung, Sequenzen für die Termination der Transkription stromaufwärts liegende regulatorische Domänen, Verstärker und dergleichen, die insgesamt für die Transkription und Translation einer codierenden Sequenz in einer Wirtszelle zur Verfügung stehen.
In einen Zelle ist eine codierende Sequenz "funktionell gebunden" oder "unten der Kontrolle" von kontrollierenden Sequenzen, wenn die RNA-Polymerase die Promotor-Sequenz bindet und die codierende Sequenz in nnRNA umschreibt, die anschließend in ein Polypeptid, das durch die codierende Sequenz codiert wird, translatiert wird.
Eine "Wirtszelle" ist eine Zelle, die transformiert wurde oder zur Transformation durch eine exogene DNA-Sequenz bereit ist.
Eine Zelle wurde durch exogene DNA "transformiert", wenn ein exogene DNA in den Innenraum der Zellmembran umguschleust wurde. Exogene DNA kann, aber muß nicht in chromosomale DNA integriert (kovalent verbunden) werden, die das Genom der Zelle darstellt. Bei Prokaryonten und Hefen, zum Beispiel, kann die exogene DNA als episomales Element, wie beispielsweise ein Plasmid, beibehalten wenden. Eine stabil transformierte Zelle ist eine Zelle, in den die exogene DNA ins Chromosom integriert wurde, so daß diese auf Tochterzellen durch Chromosomen-Replikation vererbt wird. Bei Säugerzellen wird diese Stabilität ensichtlich durch die Fähigkeit den Zelle, Zellinien oder Klone zu etablieren, die aus einen Population von Tochtenzellen bestehen, die die exogene DNA enthalten.
Ein "Klon" ist eine Population von Tochterzellen, die von einen einzelnen Zelle oder einem gemeinsamen Verfahren abstammen. Eine "Zellinie" ist ein Klon einer primären Zelle, die für viele Generationen in vitro zu stabilem Wachstum fähig ist.
Zwei Polypeptidsequenzen sind "im wesentlichen homolog", wenn mindestens etwa 80 % (bevorzugt mindestens etwa 90 %, und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 %) der Aminosäuren über eine definierte Strecke des Moleküls gut übereinstimmen.
Zwei DNA-Sequenzen sind "im wesentlichen homolog" wenn sie identisch sind oder sich in nicht mehr als 40 % den Nukleotide, besser etwa in 20 % der Nukleotide und am besten in etwa 10 % den Nukluotide unterscheiden.
DNA-Sequenzen, die im wesentlichen homolog sind, können in einem Southern- Hybridisierungs-Experiment unter zum Beispiel stringenten Bedingungen, wie sie für dieses bestimmte System definiert sind, identifiziert wenden. Die Definition der geeigneten Bedingungen für eine Hybridisierung entsprechen dabei dem Stand der Technik. Siehe z. B. Maniatis et al., siehe weiter oben; DNA Cloning, Band I & II, siehe oben; Nucleic Acid Hybridisation, siehe oben.
Eine "heterologe" Region eines DNA-Konstrukts ist ein identifizierbarer Abschnitt der DNA, der innerhalb oder an ein anderes DNA-Molekül angeheftet ist, daß unten natürlichen Bedingungen nicht in Verbindung mit dem anderen Molekül gefunden wurde. Daher wird, wenn die heterologe Region ein viralus Gen codiert, das Gen gewöhnlicherweise durch DNA flankiert wurden, die das virale Gen im Genom des ursprünglichen Virus oder der virusinzierten Zelle nicht flankiert hat. Ein anderes Beispiel für eine heterologe codierende Sequenz ist ein Konstrukt, wenn die codierende Sequenz selbst nicht in der Natur vorkommt (z. B. synthetische Sequenzen, die Codone besitzen, die vom nativen Gen abweichen). Allelische Variation oder natürlicherweise auftretende verändernde Ereignisse erzeugen keine heterologe DNA Region, wie es hien definiert ist.
"Boviner Wirt" bezieht sich auf(Rind)Vieh jeden Zuchtrasse.
Den Begriff "Protein" oden "Glykoprotein" wird hier zur Beschreibung eines Polypeptides oder beziehungsweise eines glykosylierten Polypeptids verwendet. Der Begriff "Polypeptid" ist in seinem weitesten Sinn verwendet, d. h. jedes beliebige Polymer aus Aminosäuren (Dipeptid oder größer), die durch Peptidbindungen verbunden sind. Daher umfaßt der Begriff "Polypeptid" Proteine, Oligopeptide, Proteinfragmente, Analoga, mutierte Proteine, Fusionsproteine und dergleichen.
"Fusionsprotein" wird gewöhnlich als das Expressionsprodukt eines Gens definiert, das eine erste Region, die für eine Leitsequenz oder ein stabilisierendes Polypeptid codiert, und eine zweite Region, die für ein heterologes Protein codiert, umfaßt. Es beinhaltet ein Polypeptid, das ein antigenes Proteinfragment oder eine BCV-Proteinsequenz in ganzer Länge umfaßt, ebenso auch eine oder mehrere hetenologe Sequenzen, typischerweise eine funktionelle Luftsequenz für ein intrazellulär exprimiertes Polypeptid für die Sekretion in einem rekombinanten Wirt, oder eine N-terminale Sequenz, die das Protein von Proteasen der Wirtszelle schützt solche wie die SOD. Ein antigenes Proteinfragment hat gewöhnlich eine Lange von etwa 5 - 7 Aminosäuren.
"Native" Proteine oder Polypeptide beziehen sich auf Proteine oder Polypeptide, die von BCV- oder BCV-infizierten Zellen gewonnen wenden. Daher wird der Fachbegriff "natives BCV- Polypeptid" natürlicherweise vorkommende BCV-Proteine und Fragmente davon beinhalten. "Nicht-native" Polypeptide beziehen sich auf Polypeptide, die durch rekombinante DNA- Methoden oder durch direkte Synthese hergestellt worden sind. "Rekombinante" Polypeptide bezieht sich auf Polypeptide, die durch rekombinante DNA-Techniken erzeugt wurden; d. h., die von Zellen hergestellt wurden, die durch ein exogeunes DNA-Konstrukt, welches für das gewünschte Polypeptid codiert, transformiert wurden.
"BCV-Protein" bezeichnet ein Polypeptid, daß eine Sequenz besitzt, die im wesentlichen homolog zu einem nativen BCV-Protein ist.
Ein "im wesentlichen reines" BCV-Protein ist frei von anderen BCV-Proteinen und ist vorzugsweise mindestens zu 10 % homogen, stärker bevorzugt zu 60 % homogen und am meisten bevorzugt zu 95 % homogen.
Ein "Antigen von einer Untereinheit" ist ein von einem ganzen Virus oder einer Virusinfizierten Zelle gesondertes Antigen. Zum Beispiel kann ein Antigen einer Untereinheit ein rekombinantes Protein sein und kann in der bevorzugten Ausführungsform auch ein natürlich vorkommendes Antigen beinhalten, das von einem ganzen Virus, einem Virus-Lysat oder von infizierten Zellen isoliert wurde.

B. Allgemeine Methoden

Der Rinder-Coronavirus (BCV) ist ein bekanntes Virus und besitzt ein einzelsträngiges, nicht- segmentiertes, polyadenyliertes RNA-Genom von ungefähr 20 kb (Lapps et al., (1987) Virology 157: Seiten 47 - 57). BCV setzt sich aus den Proteinen N, E1 und E2 zusammen. Darüber hinaus wurde herausgefunden, daß BCV ein viertes strukrurelles Protein besitzt, bezeichnet mit E3, das jetzt kloniert und charakterisiert wurde. Besonders wichtig für die vorliegende Erfindung sind die Gene E2 und E3 und die Proteine, die von diesen Genen codiert werden.
Das E3-Glykoprotein ist ein über eine Disulfidbrücke verbundenes Dimer, das ein apparentes Molekulargewicht von 124 K besitzt. Die Vorläufer von E3 sind primär ein 59-K-Glykoprotein Monomen, das eine schnelle Dimerisierung durchläuft, was zu einem 1 18-K-Dimer führt. Das 118-K-Glykoprotein durchläuft weitere Glykosylierungen, wodurch das 124-K-E3 erzeugt wird (Denegt, D. und Babiuk, L., siehe oben).
Den Leserahmen des E2-Gens ist 4089 Nukleotide lang und codiert für ein Polypeptid mit 1363 Aminosäuren. Das E3-Gen ist unmittelbar in 5' vom E2-Gen im viralen Genom, besitzt einen offenen Leserahmen von 1272 Nukleotiden und codiert für ein Polypeptid mit 424 Aminosäuren. Das E3-Gen endet 14 Nukleotide stromaufwärts vom E2-Polypeptid- Initiationscodon. Die Nukleotidsequenz und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen von E2 und E3 sind in den Fig. 3 bzw. 4 gezeigt.
Die vorliegende Erfindung stellt u.a. ein Untereinheiten-Antigen bereit, daß für die Herstellung von BCV-Impfstoffen von Nutzen ist.
BCV-Polypeptide von E2 und/oder E3 sind Untereinheiten-Antigene in den vorliegenden Erfindung. Polypeptid-Antigene aus einer Untereinheit sind im allgemeinen etwa mindestens 5 Aminosäuren lang, so daß sie ein Epitop codieren, sind aber vorzugsweise mindestens ungefähr 10 - 15 Aminosäuren lang. Typischerweise sind die Antigene in etwa 20 oder mehr Aminosäuren lang. Man glaubt, daß keine obere Beschränkung für die Länge eines Untereinheiten- Antigens existiert. Daher kann ein Untereinheiten-Antigen eine ganze virale Proteinsequenz oder sogar ein Fusionsprotein, das die Sequenzen von zwei oder mehreren viralen Glykoproteinen enthält, beinhalten.
Die Unteneinheiten-Antigene der vorliegenden Erfindung können sowohl native E2- oder E3- Glykoproteine, Fragmente davon oder rekombinante E2- oder E3-Polypeptide sein. Die rekombinanten Untereinheiten könne partielle Glykoproteinsequenzen oder sogar Fusionsproteine sein (z. B. geeignete Leitsequenzen für einen rekombinanten Wirt besitzen, oder eine zusätzliche Antigensequenz einen Untereinheit von BCV oder eines anderen Pathogens). Obwohl das Untereinheiten-Antigen Epitope besitzt, die von Glykoproteinen abstammen, muß es nicht glykosyliert sein.
Die bevorzugten Untereinheit-Glykoproteine in der vorliegenden Erfindung beinhalten vollständige (oder fast vollständige) Sequenzen von E2 oder E3. Alternativ können kürzere Sequenzen, die antigen sind (d. h., daß sie ein oder mehrere Epitope codieren) verwendet wurden. Die kürzere Sequenz kann für ein "neutralisierendes Epitop" codieren, daß als Epitop definiert ist, welches wiederum fähig ist, Antikörper hervorzubringen, die die Virus- Infektiosität in einem in vitro-Testverfahren neutralisieren. Vorzugsweise sollte das Peptid ein "schützendes Epitop" enthalten, welches in dem Wirt eine "Immunantwort" erzeugen kann; d.h. sowohl eine Antikörper- als auch Zell-vermittelte Antwort, die einen immunisierten Wirt vor einen Infektion schützt oden den Verlauf einen Erkrankung abschwächt.
Die Untereinheiten-Antigene den vorliegenden Erfindung, besonders wenn diese kurze Polypeptide umschließen, können an einen Träger für einen Impfstoff gebunden werden. Trägen von Impfstoffen sind im Fachbereich gut bekannt: zum Beispiel Rinderserumalbumin (BSA), Albumin aus Humanserum (HSA) und Hämocyanin von einen Napfschnecke (KLH). Ein bevorzugtes Trägerprotein, Rotavirus VP6, wird in der EPO Pub. Nr. 0259149 offengelegt, wobei die Offenlegung hier als Referenz eingeschlossen ist.
Die Polypeptide, weiche BCV-Epitope den vorliegenden Erfindung beinhalten, können ebenso innerhalb von partikelbildenden viralen Polypeptiden als ein Fusionsprotein eingeschlossen wenden, wie es in dem U.S. Pat. Nr. 4722840 und in den EPO Pub. Nr. 174759 beschrieben ist. Alternativ können die BCV Untereinheiten-Antigene der vorliegenden Erfindung in ein fremdes Virus (d.h. Vaccinia oder Adenovirus) eingebettet werden, wie es im Fachbereich bekannt ist.
Ebenso entspricht es dem Stand den Technik das (die) Untereinheiten-Antigen(e) mit oder ohne Trägenstoff in eine Impfstoff-Rezeptur einzubringen, die einen pharmazeutisch annehmbaren Trägenstoff, und fälls gewünscht ein Adjuvans, einschließen. Diese Rezepturen sind bevozugt für intramuskukläre Injektionen gestaltet, da eine intravenöse Injektion mit hochdosierten Impfstoffen üblicherweise bei Haustieren nicht anwendbar ist.
Für eine parentenale Injektion gebräuchliche Trägenstoffe sind üblicherweise nicht giftig und nicht thurapeutisch wirksam. Solche Trägerstoffe schließen Wasser, salzhaltige Lösung, Ringer's Lösung, Dextrose-Lösung und Hank's Lösung ein. Nichtwäßrige Trägerstoffe, wie nichtflüssige bzw. fette Öle, Sesamöl, Ethyloleat oder Triglyzeride, können ebenfalls eingesetzt wenden. Suspensionen, die Viskositäts-erhöhende Agenzien enthalten, solche wie Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol oder Dextran, können auch benutzt wenden. Darüberhinaus werden die Trägerstoffe üblicherweise Zusatzstoffe enthalten, um z.B. die Isotonizität und chemische Stabilität zu erhöhen. Gebräuchliche Puffer umfassen Phosphatpuffer, Bicarbonatpuffen, und TRIS-Puffer. Konservierungsstoffe können Thimerosal, m- oder o-Kresol, Formalin und Benzylalkohol einschließen. Standardrezepturen sind im allgemeinen flüssige Injektionslösungen oder Festsubstanzen, die in Lösung gebracht oder in einer entsprechenden Flüssigkeit vor den Injektion suspendiert wurden können. In einen nicht flüssigen Zubereitungsform kann den Trägerstoff deshalb Dextrose, Albumin aus Rinderserum, Konservierungsmittel usw. beinhalten, zu welchen steriles Wasser oder Salzlösung von den Verabreichung zugegeben wird.
Ebenso sind Adjuvantien im Fachgebiet bekannt, die nützlich bei der Impfstoff-Zubereitung den vorliegenden Erfindung sind. Die Auswahl des geeigneten Adjuvants und die Ermittlung den passenden Konzentration in der Impfstoff-Zusammensetzung(en) der vorliegenden Erfindung entspricht ebenfalls dem Stand den Technik. Adjuvantien können Freund's, Aluminiumsalze [Al(OH)&sub3;, AlPO&sub4;, Al&sub2;(SO&sub4;)&sub8;], Ca&sub3;(PO&sub4;)&sub2;, Muramyldipeptide und -tripeptide, Saponin, DDA, Pluronik, Emulsionen von Öl in Wasser (welche z.B. Dextransulfat oder Vitamin E) und Emulsionen von Wasser in Öl (welche z. B. Polysonbat 80 enthalten) einschließen.
Die Impfstoffe können auch oral verabreicht werden, wobei die Untereinheiten in einem geeigneten oralen Trägerstoff sind. Orale Zubereitungsformen beinhalten normalerweise zugesetzte Arzneimittelträger, wie zum Beispiel Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharincellulose, Magnesiumcarbonat und dergleichen in pharmazeutischem Reinheitsgrad. Orale Impfstoffzusammensetzungen können in der Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Zubereitungsformen mit verzögerten Freisetzung oder Puder eingenommen wurden, die von etwa 10 % bis zu etwa 95 % des aktiven Inhaltsstoffes enthalten, oder vorzugsweise etwa 25 % bis etwa 70 %. Ein oraler BCV-Impfstoff könnte zur Erzeugung einer mukosalen Immunität in Kombination mit systemischer Immunität, ausgelöst durch die intramuskuläre Verabreichung des Impfstoffes, bevorzugt sein.
Außerdem kann den Impfstoff in Zäpfchenform dargereicht werden. Bei Zäpfchen kann die Impfstoff-Zusammensetzung traditionelle Bindemittel und Trägerstoffe wie polyalkalische Glycole oder Triglyzeride beinhalten. Derartige Suppositorien können aus Mixturen geformt wenden, die die aktiven Inhaltsstoffe im Bereich von etwa 0,5 % bis zu etwa 10 % (w/w), vorzugsweise etwa 1 % bis zu etwa 2 % enthalten.
Protokolle zur Verabreichung den Impfstoff-Zusammensetzung(en) den vorliegenden Erfindung an Tieren entsprechen dem Stand der Technik im Hinblick auf die vorliegende Beschreibung. Diejenigen, die sich im derzeitigen Wissensstand auskennen, können eine Konzentration an Untereinheiten-Antigen(en) in der Impfstoff-Zusammensetzung in einer Dosis, die wirkungsvoll in der Auslösung einer Antikörper- und/oder T-Zell-Antwort gegenüber dem antigenen Fragment ist, auswählen. Innerhalb weiter Grenzen scheint die Dosierung nicht kritisch zu sein. Typischerweise wird die Impfstoff-Zusammensetzung in einer Art und Weise verabreicht, so daß zwischen ca. 1 bis etwa 1 000 Mikrogramm des Untereinheiten-Antigens aus einem verträglichen Volumen des Trägerstoffes freigesetzt werden, z. B. etwa 1 - 10 ml. Vorzugsweise wird die Dosierung einer einzelnen Immunisierung etwa 1 bis etwa 500 Mikrogramm des Untereinheiten-Antigens, weiten bevorzugt 5 - 10 bis etwa 100 - 200 Mikrogramm (z. B. 5 - 200 Mikrogramm) freisetzen.
Die zeitliche Abstimmung den Anwendung kann auch von Bedeutung sein. Zum Beispiel sollte einen Erstimpfung vorzugsweise eine spätere Auffrischungsimpfungen folgen. Es kann auch von Vorteil sein, obwobl es nicht zwingend ist, dem Tier eine zweite Auffrischung der Immunisierung viele Wochen bis zu mehreren Monaten nach der anfänglichen Immunisierung zu verabreichen. Um einen anhaltend hohes Niveau an Schutzwirkung gegen die Krankheit zu gewährleisten, kann es hilfreich sein, eine Auffrischungsimpfung den Tieren wiederholt in rugelmäßingen Abständen zu verabreichen, so zum Beispiel einmal alle paar Jahre. Alternativ kann eine initiale Dosis oral angewendet wenden, die von späteren Impfungen gefolgt wird, oder umgekehrt. Bessere Protokolle zur Impfung können durch Experimente mit regelmäßigen Impfprotokollen etabliert wenden.
Das Untereinheiten-Antigen kann aus dem Protein, das vom Virus oden virus-infizierten Zellen gewonnen wird, hergestellt wurden. Zum Beispiel können aufgereinigte Viruspartikel oder Virus-infizierte Zellen zerstört oden lysiert und einen immunadsorbierenden Chromatographie zur Aufreinigung von E1 oder E2 unterzogen werden. Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern entspricht dem Stand der Technik. Kurz gesagt, ein Säugetier, wie eine Maus, wird entweder mit gereinigtem Virus oder dem aufgereinigten viralen Glykoprotein von Bedeutung (z. B. über SDS-PAGE aufgereinigt) immunisiert, und die Antikörper produzierenden B-Zellen wenden wiedergewonnen. Typischerweise werden diese B-Zellen dann mit einen kontinuierlichen Zellinie zur Herstellung einer immortalisierten bzw. unsterblichen Antikörper-produzierenden Zellinie verschmolzen; d. h. ein Hybridom, Triom usw. Immortalisierte Antikörper produzierende Zellinien können auch durch andere Techniken als Fusion geschaffen wenden, wie durch direkte Transformation von B-Lymphozyten mit onkogener DNA, oder durch Transfektion mit dem Epstein-Barr-Virus. Siehe z. B. Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et al., Monoklonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (1981); Kennett et aL, Monoklonal Antibodies (1980); siehe auch U.S. Pat. Nn. 4 341 761; 4 399 121; 4 427 783; 4 444 887;4 451 570; 4 466 917; 4 472 500; 4 491 632; 4 493 890. Native BCV- Proteine, die immungereinigt sind, können im Genzen als Untereinheiten-Antigen eingesetzt wenden, oder Fragmente der ganzen Proteine, die die neutralisierenden Epitope enthalten, können als Untereinheiten-Antigene eingesetzt werden.
Nicht native BCV-Polypeptide können mit einer Vielzahl an Methoden hergestellt werden. Zum Beispiel können Oligopeptide, die die neutralisierenden Epitope enthalten, synthetisch durch gängige Techniken hergestellt werden. Siehe z. B. U.S. Pat. Nr. 4 735 896. Dennoch zieht man es vor die nicht-nativen Untereinheiten-Antigene aus Polypeptiden durch rekombinante DNA-Methoden herzustellen.
Rekombinante Polypeptid-Untereinheiten-Antigene werden gemäß der vorliegenden Erfindung durch die Konstruktion einer Expressionskasette und Transformation einer Wirtszelle mit diesem Material hergestellt, um eine Zellinie oder eine Kultur bereitzustellen, die in der Lage ist, das Untereinheiten-Antigen, welches in den Expressionskassette codiert wird, zu exprimieren. Der erste Schrift bei der Konstruktion einen Expressionskassette ist es eine codienende Sequenz für das Glykoprotein oder die interessierenden Epitope des Glykoproteins zu enlangen. Die codierenden Sequenzen für E2 und E3 werden in den Fig. 3 und 4 gezeigt. Demzufolge können codierende Sequenzen entweder direkt durch synthetische Methoden, die auf der beigefügten Sequenz basieren (oder equivalente Sequenzen, die für die gleichen Aminosäuren codieren) hergestellt wenden oder durch die Verwendung der beigefügten Sequenz zum Entwurf von Oligonukleotidsonden, um die codierenden Sequenzen, durch Einsatz bekannter Techniken, zu klonieren. Die codienende Sequenz kann ausschließlich aus BCV-Sequenzen bestehen, die für Glykoprotein codieren, oder solche Glykoprotein- Sequenzen können mit einen anderen Sequenz (z. B. einen Leitsequenz) verbunden werden, so daß ein Fusionsprotein codiert wird. Siehe z. B. U.S. Pat. Nos. 4 431 739; 4 425 437; 4 338 397. Synthetische codierende Sequenzen wenden auch eine günstige Konstruktion von codienenden Sequenzen ermöglichen, die BCV-Glykoprotein-Analoga oder "Muteine" exprimieren. Alternativ können codierende Sequenzen für Muteine durch ortsgerichtete Mutagenese nativer BCV-Nukleotidsequenzen hergestellt wenden. Die Techniken den ortsgerichteten Mutagenese sind derzeitig im Fachgebiet allgemein bekannt.
Nachdem einmal eine geeignete codierende Sequenz für das Untereinheiten-Antigen präpariert oden isoliert worden ist, kann es in irgendeinem geeigneten Vektor oder Replikon kloniert wenden. Viele Vektoren zur Klonierung oder Replikone sind dem Fachmann bekannt, und die Auswahl eines geeigneten Klonierungsvektons ist eine Angelegenheit der Wahl. Beispiele für rekombinante DNA-Vektoren zur Klonierung sowie Wirtszellen, die transformiert werden können, umfassen verschiedene Bakteriophagen Lambda-Vektoren (E. Coli), pBR322 (E. Coli), pACYC171 (E. Coli), pKT230 (gram-negative Bakterien), pGV1106 (gram-negative Bakterien), pLAFR1 (gram-negative Bakterien), pME290 (gram-negative Nicht-E. Coli- Bakterien), pHV14 (E. Coli und Bacillus subtilus), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyceten), pUC6 (Streptomyceten), Aktinophage dC31 (Streptomyceten), Yip5 (Saccharomyceten), YCp 19 (Saccharomyceten), 2-Mikron-Plasmid (Saccharomyceten) und Rinder-Papillomvirus (Säugerzellen). Siehe im allgemeinen, DNA Cloning, Vol. I & II, siehe oben; Maniatis et al., siehe oben; Perbal, siehe oben.
Um die Konstruktion von Expressionskassetten fertigzustellen, wurde dann die codierende Sequenz für die Untereinheiten-Antigene, wie weiter oben beschrieben, funktionell mit Kontrollsequenzen verbunden (z. B. einem Promotor usw.), so daß die DNA-Sequenz, welche für das Untereinheiten-Antigen codiert, in der durch die Expressionskassette transformierte Wirtszelle in mRNA transkribiert wird. Im allgemeinen wird die codierende Sequenz stromabwärts von der Promotor-Sequenz und jeden die Expression regulierenden Regionen, wie Enhancer oder Operator-Sequenzen liegen. Wenn die für das Untereinheiten-Antigen codierende Sequenz mit einer heterologen codierenden Sequenz oder einem Startcodon verknüpft ist, dann ist es von Bedeutung, die für das Untereinheiten-Antigen codierende Sequenz so zu setzen, daß sie im Leserahmen mit letzterem ist. Wenn den vorgesehene Wirt für die Expression prokaryotisch ist, dann wird es auch nötig sein, eine Ribosomen-Bindungsstelle innerhalb der stromaufwärts gelegenen Kontrollsequenzen einzufügen. Funktionell verknüpfte Kontrollsequenzen, die stromabwärts liegen werden gewölhnlich eine Sequenz für die Termination der Transkription und ein Signal für die Polyadenylierung (für Säugen als Wirte der Expression) mit einschließen.
Wenn der vorgesehene Wirt für die Expression prokaryotisch oder eine Hefezelle ist, wenden den Promoton und andere Kontrollsequenzen notwendigerweise heterolog zu den Sequenz sein, die für das Untereinheiten-Antigen codiert. Wenn die für die Expression ausgewählte Wirtszelle eine Säugetierzelle ist, können die Kontrollsequenzen homolog zu den BCV- Sequenzen, oder noch bessen hetenolog zu Kontrollsequenzen von Säugetieren sein. Die Expnessionskassette kann zum Beispiel als eine eigenständige molekulare Einheit, die durch gebräuchliche Restriktionsschnittstellen flankiert wird, erstellt wenden, oder sie kann durch die Einfügung der codierenden Sequenz in einen vorher konstruierten Expressionsvektor mit einer geeigneten Stelle zum Einbau hergestellt wurden.
Eine Anzahl von prokaryotischen Expressionsvektoren sind bekannt. Siehe z. B. U.S. Pat. Nr. 4440 859; 4436 815; 4 431 740; 4 431 739; 4 428 941; 4 425 437; 4 418 149; 4 411 994; 4 366 246; 4 342 832; siehe auch GB-Publikation Nr. GB 2 008 123; GB 2 007 675 und Europäische Publikation Nr. 103 395. Die bevorzugten prokaryotischen Vektoren zur Expression sind die für E. coli. Andere bevorzugte Vektonen zur Expression sind solche, die sich in eukaryotischen Systemen einsetzen lassen. Expressionsvektoren für Hefe sind ebenfalls bekannt. Siehe z.B. U.S. Pat. Nr. 4 446 235; 4 443 539; 4 430 428; siehe auch Europäische Publikation Nr. 103 409; 100 561; 96 491.
Bevorzugte Wirte für die Expression der vorliegenden Erfindung sind Zellen von Säugetieren. Verschiedene Zellinien und Vektoren für die Expression sind Stand der Technik. Beispiele für geeignete Säugetier-Expressionswirte umfassen Zellinien von Nieren (z. B. die Madin Darby Rinderniere- und CV-1-Affennieren-Zellinie), Fibroblasten Zellinien (z. B. humane-, murineoder vom Huhn erhaltene embryonale Fibroblasten-Zellinie), Ovar-Zellen (CHO) vom Chinesischen Hamster, HeLa-Zellen, NIH / 3T3 und /oder LMTK&supmin;-Zellen von der Maus. Es ist ebenfalls bekannt, heterologe Proteine in Myelom-Zellinien, die Immunglobulin-Promotoren besitzen, zu exprimieren. Siehe z. B. Banerji et aL (1983), Cell, Band 33: Seiten 729 - 740; U.S. Pat. Nr. 4 663 281. Die Auswahl einen Säugetier-Zellinie ist nicht kritisch. Verschiedenste Expressionsvektoren für Säugetiere, die virale Promotoren (z.B. SV-40-Promotor der frühen Region, Rous-Sankoma-Virus, LTR-Promotor usw.) einsetzen, sind auch Stand der Technik. Siehe z. B. Gorman et al. (1982), Proc. Natl. Sci. USA, Band 79: Seiten 6777 - 6781; Southern et al. (1982), J. Mol. App. Genet. Band 1: Seiten 327 - 341; PCT Publikation Nr. W087 /02062. Bevorzugte eukaryotische Vektoren zur Expression sind jene, die den Vaccinia Virus, den SV-40-Virus oder den Rous-Sarkoma-Virus in Anspruch nehmen. Siehe z. B. Mackett et al. (1984), J. Virol. Band 49: Seite 857; DNA Cloning, Band II, Seiten 191 - 211, siehe oben; PCT Publikation Nr. W086 /07593; Chakrabarty et al. (1985), Mol.Cell. Biol.. Band 5: Seite 3403.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Expression von rekombinantem BCV-Polypeptiden in Insektenzellen durch die Verwendung von viralen Vektoren, wie das Bakulovirus. Zum Beispiel wurde ein hohes Niveau an Expression mit Vektoren, die auf dem nukleären Polyhedrosis-Virus Autographa californica (AcNPV) beruhen, in Spodoptera frugiperda-Zellen erreicht. Siehe z. B. Smith et al. (1983), J. Virol. Band 46: Seiten 584 - 593; EPO Pub. Nn. 0259149, siehe oben.
Im allgemeinen wird eine Wirtszelle, die durch eine Expressionskassette für ein Untereinheiten- Antigen stabil transformiert wurde, ausgewählt, um das rekombinante Polypeptid herzustellen. Ein stabil transformierter Wirt ist einer, bei dem die Expressionskassette stabil in ein Chromoson der Wirtszelle integriert wurde. Alternativ, im Fall von Bakterien oder Hefe als Expressionswirt, kann es von Vorteil sein, Expressionswirte auszuwählen, die die Expressionskassette nicht integrieten, sondern die Kassette als nicht-integrierendes episomales Element, wie ein Plasmid, beibehalten. Das Untereinheiten-Antigen wird durch wachsende Wirtszellen, die durch die Expressionskassette transformiert wurden, unter Bedingungen hergestellt, die die Expression von biologisch aktivem Polypeptid für ein Untereinheiten-Antigen hervorrufen. Die passenden Bedingungen zur Veranlassung den Expression sind Stand der Technik und wurden in ersten Linie von Expressions-System und dem ausgewählten Wirt abhängen. Das Polypeptid für das Untereinheiten-Antigen kann von den Wirtszellen isoliert und aufgereinigt werden. Wenn das Expressions-System das Untereinheiten-Antigen sekretiert, kann das Polypeptid direkt aus dern Wachstumsmedium gereinigt wurden. Wenn das Untereinheiten-Antigen nicht sekretiert wird, kann es allerdings nötig sein, die Wirtszelle aufzubrechen und das Polypeptid für das Untereinheiten-Antigen aus dem zellulären Lysat aufzureinigen. Verschiedenste Techniken zur Aufreinigung wie SDS-PAGE, HPLC und Immunoaffinitäts-Chromatographie sind bekannt und die Auswahl der geeigneten Reinigungs- und Rückgewinnungsmethode ist für den Durchschnittsfachmann zu bewerkstelligen.
Unten sind Beispiele für die vorliegende Erfindung beschrieben. Diese Beispiele sind nur zu enleuternden Zwecken dargestellt und beabsichtigen nicht, den Umfang der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken. Im Licht der vorliegenden Beschreibung werden zahlreiche Ausführungsformen im Umfang den Ansprüche dem Durchschnittsfachmann offensichtlich sein. Der Inhalt der zitierten Referenzen in der Beschreibung sind durch den Bezug darauf einbezogen.

C. Beispiele

Molekulane Klonierung des BCV-Genoms

Das Quebec Isolat des Rinder-Cononavirus (Dea et al., (1980) Amer. J. Vet. Res., Band 41: Seiten 30 - 38) wurde in Madin-Danby Zellen aus Rinderniene (MDBK) vermehrt und durch Präzipitätion mit Polyethylenglykol und Zentrifugation im Saccharosegradienten, wie früher beschrieben wurde (Deregt et al., (1987) J. Gen. Virol., Band 68: Seiten 2863-2877) gereinigt. Die genomische RNA wurde durch Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (50 : 48 : 2) Extraktion und Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Die durch Oligo-dT initiierte Synthese den doppelsträngigen cDNA wurde nach Standardmethoden durchgeführt (Gubler et al., siehe oben und Maniatis et al., siehe oben). Nach den Zugabe von BamHIL-Linkern, wurde die doppelsträngige cDNA durch Elektrophorese in 1 % igen, mit Tris und Bonat gepufferten Agarosegulen fraktioniert und cDNA mit einen Größe von üben 3000 Nukleotid-Basenpaaren wurde in das mit BamHI geschnittene multifunktionelle Plasmid pTZ 19R (Pharmacia) eingefügt. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation des E. coli-Stammes DH verwendet. Rekombinante Kolonien wurden durch in situ Hybridisierung mit radioaktiv markierter cDNA, die durch "ramdom priming" den reversen Transkription den genomischen RNA des Virions oder durch "ramdom priming"-cDNA-Syuthese mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase 1, unten Verwendung von denaturierten Restriktionsfragmenten als Matrize, hergestellt.

Northern Blotting

Die gesamte zelluläre RNA wurde aus BCV-infizierten MDBK-Zellen 18 Stunden nach der Infektion extrahiert. Die infizierten Zellen wurden in 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM KCl, 5 mM MgCl&sub2;, das 1 % NP-40 und 0,5 % Natriumdesoxycholat enthielt, lysiert. Nach kurzem vortexen und Zentrifugation bei 12 000 x g für 1 Minute, wurde der Überstand mit Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Poly A+ RNA wurde durch Chromatographie mittels oligo-dT-Cellulose-Chromatographie (Aviv et al., (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., Band 69: Seite 1408) selektiv gewonnen. Die RNA wurde in 1 % Formaldehyd-Agarosegelen (Lehrach et aL, (1977) Biochemistry Band 16: Seiten 4743 - 4748) den Elektrophorese unterzogen und elektrisch auf eine Zeta-Sonden-Membran (Biorad) übertragen. Radioaktiv mankierte Sonden wurden wie oben beschrieben hergestellt, und die Hybridisierung wurde nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

DNA-Sequenzierung

Die cDNA-Klone, welche die E2- und E3-Gene des BCV im Plasmid pTZ 19R repräsentieren, wurden nach der Methode der Didesoxy-Kettenterminationsreaktion (Sanger et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci., Band 74: Seiten 5463 - 5467) im Anschluß an die Herstellung einen ausgedehnten Serie von übenlappenden Deletionen (Henikoff et al, (1984) Gene Band 28: Seiten 351-359) sequenziert.

In Vitro-Transkription und -Translation

Die Expressions-Konstrukte des BCV-E2-Gens wurden durch Verdau mit der Exonuklease III hergestellt, um flankierende cDNA-Sequenzen zu entfernen (Henikoff et al., siehe oben). Die BCV-E2-Sequenzen, die sich von dem Nukleotid 6 bis 4129 erstreckten- und die E3- Sequenzen von dem Nukleotid 10 bis 1305 wurden in die BamHI-Schnittstelle von pTZ 19R subkloniert. Nach dem Verdau mit Eco RI wurden mit den T7-RNA-Polymerase (Melton et al., (1984) Nucl. Acid. Res. Band 12: Seiten 7035 - 7056) m7GpppA-geschützte Transkripte synthetisiert und in Kaninchen-Retikulozyten-Extrakten, die 600 uCi /ml ³&sup5;S-Methionin (Amershann, > 800 Ci / mMol) enthielten, translatiert. Die Produkte wurden mit gepoolten monoklonalen Antikörpern wie bei Deregt et al., (1987) Virology Band 161: Seiten 410 - 420 beschrieben immunpräzipitiert, in 13 % Acrylamid: DATD (30 : 1,4)-Gelen nach Laemmli (1970) Nature (London) Band 227: Seiten 680 - 685) den Elektrophorese unterzogen und fluorographiert.

Konstruktion der E2- und E3-Klone und Expression in Insektenzellen durch Rekombinanten des Autographa californica-Bakulovirus

Da die Klone pCVA12H und pCVA12I partiell überlappende Segmente des E2-Gens beinhalteten, wurde ein einzelner Klon, der das vollständige E2-Gen enthieft, durch die Fusion des 5'-BamHI-PstI-Fragment von pCVA12H mit dem 3'-PstI-BamHI-Fragment von pCVA121 konstruiert. Nicht codierende Sequenzen wurden vom 5'-Ende des Konstrukts durch Verdau mit Exonuklease 1 entfernt, und es wurde ein BamHI-Linker angefügt. Nicht codierende Sequenzen wurden vom 3'-Ende des Gens durch partiellen Verdau mit TaqI entfernt und ein BamHI-Verbindungsstück angefügt. Die daraus nesultierende Sequenz ist in Fig. 3 gezeigt.
Das Expressionskonstrukt von E3 wurde durch Behandlung des 3'-Endes von pCVA12H mit Exonuklease III, bis zu einem Punkt 51 Nukleotide stromabwärts von dem Initiationscodon des E2-Gens, konstruiert. Das 5' Ende von pCVA12H wurde mit MboII verdaut und BamIH- Linkur wurden angefügt. Daher beginnt das endgültige Genkonstrukt 8 Nukleotide stromaufwärts vom E3-Initiationscodon und endet 5 l Nukleotide weit im E2-Gen.
Die Konstrukte der Gene wurden dann in den Transfervektor für das Bakulovirus pVL941 subkloniert und in das Genom des Bakulovirus A. californica durch homologe Rekombination eingebaut. Rekombinante Viren wurden durch Plaque-Hybridisierung und viele Zyklen der Plaque-Reinigung identifiziert.
Monolayer von Spodoptera frugiperda-Zellen (SF9) wurden mit den rekombinanten Bakuloviren infiziert und bei 28 ºC ihkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde das Medium mit Methionin-freiem Grace's Medium, das 50 uCi /ml ³&sup5;S-Methionin enthielt, zwei Stunden lang ersetzt. Die Zellen wurden gesammelt und in RIPA-Puffer lysiert. Die radioaktiv markierten Produkte wurden mit monoklonalem Antikörper immunpräzipitiert und auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel analysiert.

Expression des BCV-Genoms

Expressionskonstrukte des BCV-E2-Gens wurden durch Verdau, um flankierende cDNA- Sequenzen zu entfernen, mit Exonuklease in (Heinikoff siehe oben) vorbereitet. BCV-E2- Sequenzen, die sich von dem Nukleotid 6 bis 4129 erstreckten, und E3-Sequenzen, die sich von dem Nukleotid 10 bis 1305 erstreckten, wurden in Bakulovirus-Transfervektor PYMI bzw. pVL941 subkloniert (Matsura, Y., et al. (1987) J. Gen. Virol. Band 68: Seiten 1233- 1250 und Summers, M.D. und G.E.Smith (1987) Texas Agricultural Experiment Station Bulletin 1555). Die Gene wurden dann in das Genom des Bakulovirus Autographa californica durch homologe Rekombination eingebaut. Rekombinanten Viren wurden durch Plaque-Hybridisierung identifiziert und Serien der Plaque-Reinigung unterzogen. Spodoptena frugiperda- Zellen wurden mit Plaque-aufgereinigten rekombinanten Viren infiziert und 36 Stunden lang bei 28ºC inkubiert. Das Medium wurde entfernt und durch Grace's Medium ohne Methionin, das 50 uCi /ml ³&sup5;S-Methionin (Amersham, > 800 Ci / mMol) enthielt, ersetzt und weitere 2 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden in Phosphat-gepufferter Salzlösung abgelöst und bei 1000 x g eine Minute lang sedimentiert und mit RIPA-Puffer, der 1 % NP-40 und 1 % Natriumdeoxycholat enthielt, lysiert. Die Zellkerne und die unlöslichen Bestandteile wurden durch Zentrifugation bei 15 000 x g während 5 Minuten entfernt, und die rekombinanten Polypeptide wurden mit monoklonalen Antikörpern immunpräzipitiert. Die präzipitierten Produkte wurden durch Elektrophorese auf 10 % Polyacrylamid-Gelen (Laemmli (1970) Nature (London) Band 227: Seiten 680 - 685) analysiert und fluorographiert.

Charakterisierung den Polypeptidprodukte der BCV-E2- und E3-Gene

Um zu zeigen, daß die klonierten Sequenzen die Gene für die BCV-E2- und E3-Gene repräsentieren, wurden die in Fig. 3 und 4 gezeigten Sequenzen in den Bakulovirus Autographa californica subkloniert und in Insektenzellen exprimiert.
Expression des BCV-E3-Gens in Insektenzellun ergab ein Polypeptid von ungefähr 120 Kg wenn es in Abwesenheit von 2-Mercaptoethanol analysiert wurde. Die Zugabe von 2- Mencaptoethanol zu dem immunpräzipitierten Produkt vor der Elektrophorese dissoziierte das 120-K-Produkt in ein monomeres 56-K-Polypeptid. Die Fähigkeit von E3-spezifischen monoklonalen Antikörpern, das Produkt spezifisch zu präzipitieren, und die elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit in den An- und Abwesenheit von 2-Mercaptoethanol beweisen, daß die klonierte Sequenz dem Gen für das BCV-E3-Polypeptid entspricht.
Die Expression des BCV-E2-Gens in Insektenzellen und die Immunpräzipitation mit E2- spezifischen monoklonalen Antikörpern ergab ein Produkt von etwa 200 K Ein ähnliches 200- K-Polypeptid, das die ungeschnittene Form des E2-Polypeptids repräsentiert, wird auch in BCV-infizierten Säugetier-Zellinien entdeckt. Die Trypsin-Behandlung der Insektenzellen, die das BCV-E2-Gen exprimieren, führt auch zur Zellfusion, eine charakteristische Eigenschaft von Zellen, die das BCV-E2-Protein exprimieren.

Ergebnisse

Isolation von cDNA-Sequenzen, die das BCV-E2-Gon repräsentieren

Die Kartierung von klonierten cDNA-Inserts mittels Restriktion ergab zu Beginn eine lineare Karte, die ungefähr 4 000 Nukleotide des BCV-Genoms repräsentierte, wie für den Klon pCVA12 (Fig. 1) gezeigt wurde. Um die Nähe dieser Sequenzen zum 3'-Ende des Genoms des Virions zu bestimmen wurden elektrophoretisch aufgetrennte Poly (A)+ RNA-Präparationen von BCV-infizierten MDBK-Zellen mit Sequenzen vom 3'-Ende des pCVA12 (gefülltes Rechteck in Fig. 1) untersucht. Da mRNAs von Coronaviren eine 3'-eingebettete Gruppe bilden (Sterns und Kennedy, 1980), hybridisiert eine Sonde, die homolog zum 3'-Ende des viralen Genoms ist mit allen viralen mRNAs, die mit mit einen repräsentativen Sonde für das ganze Genom entdeckt wenden können. Zur Herstellung des Northern Blot in Fig. 2 wurde die gesamte intrazelluläre RNA von BCV-infizierten MDBK-Zellen 18 Stunden nach der Infektion extrahiert. Die RNA des viralen Genoms wurde aus dem gereinigten Virus extrahiert. Die RNA wunde in 1 % Formaldehyd-Agarosegelen der Elektrophorese unterzogen und elektrisch auf Zeta-Sonden-Membnan übertragen. Die Hybridisierung wurde in 50 % Formamid, 5 x SSC bei 42 ºC durchgeführt. Spuren 1, 3: intrazelluläre BCV-infizierte MDBK-RNA; Spur 3: virale genomische RNA. Sonden: Spuren 1 und 2: 3'-Anteil von pCVA12, wie in Figur 1 angezeigt; Spur 3: Klon pVCA12H. Wie in Figur 2, Spur 1 gezeigt hybridisiert die radioaktiv markierte cDNA; die das 3' Ende des Klons pCVA12 darstellt, an 8 Spezies intrazellulärer RNA, mit RNA 1 bis 8 nummeriert, die mit einer cDNA-Sonde, repräsentativ für das ganze virale Genom, entdeckt wurden. Der Ursprung der vielen kleinen RNA-Spezies ist unbekannt, sie könnten aber Zwischenprodukte der Transkription oder Replikation darstellen, wie es bei MHV-infizierten Zellen beschrieben wird (Baric et al., (1987) Virology Band 156: Seiten 342- 354). RNA 1, die die Synthese nicht struktureller (Polymerase?) Polypeptide regeln kann, entspricht der RNA des viralen Genoms (Fig.2, Spur 2). Die RNAs 5 bis 8 regeln die Synthese von 14-K-NS, von 190-K-NS, der Matrix (E1) bzw. die des Nukleokapsid-Proteins (N) (Lapps et al., (1987) Virology Band 157: Seiten 47 - 57). Zusätzliche Restriktionskartierung von pCVA12 und der Vergleich mit den Sequenzen am 3'-Ende des viralen Genoms, wie kürzlich berichtet (Lapps et al., siehe oben), zeigten, daß den Klon pCVA12-Sequenzen am oden sehr nahe am 3'-Ende des Genoms vertritt und sich auf ungefähr 4000 Nukleotide in stromaufwärts liegender Richtung erstreckt (Fig. 1).
Basierend auf dem Molekulargewicht des BCV-E2-Vorläufers mit etwa 190 K (Deregt et al., siehe oben) wurde vorausgesagt, daß RNA 4 die einzige mRNA war, die wahrscheinlich ausreichend viele einzigartige Sequenzen enthält, um das BCV-E2-Ploypeptid zu codieren. Zu dem Zweck, Klone zu identifizieren, die nur an die mRNA 1-4 hybridisieren und dadurch möglicherweise das E2-Gen repräsentieren, wurden etwa 25 000 Kolonien mit dem 5'-Ende des Klons pVCA12 (schraffiert in Fig. 1) untersucht. Wie in Fig. 2, Spur 3, gezeigt wird. hybridisierte eine Reihe von Klonen, die durch pCVA12H repräsentiert wurden, nur an die mRNA 1 bis 4. Die Sequenzierung des cDNA-Inserts von pCVA12H und des überlappenden 5'-Anteils von pCVA121 identifizierte einen einzigen offenen Leserahmen von 4089 Nukleotiden. Basierend auf einem Vergleich mit der Sequenz von dem E2-Gen von HMV- JHM (Schmidt et al., (1987) J. Gen. Virol., Band 68: Seiten 47 - 56) und einen hydropathischen Analyse (Kyte et al., (1982) J.Mol. Biol. Band 157: Seiten 105 - 132) des abgeleiteten Genprodukts, repräsentiert die in Fig. 3 gezeigte Nukleotid-Sequenz die vollständige Sequenz für das BCV-E2-Gen.
Die Sequenz, die in Fig. 3 gezeigt wird, erstreckt sich 14 Nukleotide stromaufwärts vom Initiationscodon und grenzt an das Terminationscodon für einen anderen weiter stromaufwärts gelegenen offenen Leserahmen (siehe unten). Unmittelbar vor dem ATG von E2 befindet sich die konservierte, sieben Nukleotide lange Sequenz TCTAAAC, die den zwischen den Genen gelegenen Regionen stromaulwärts der BCV-M- und N-Gene ähnlich ist, mit der Ausnahme, daß die konservierten Sequenzen 10 und 14 Nukleotide stromaufwärts von dem M- bzw. N- Genen beginnen (Lapps et al., siehe oben).
Das abgeleitete Polypeptid-Produkt des BCV-E2-Gens ist 1363 Aminosäuren lang und hat ein Molekulargewicht von 150 K, exklusive den Glykosylierung. Es gibt 21 mögliche N-gebundene Glykosylierungsstellen, 11 in den vorgeschlägenen S1-Untereinheit und 10 in der S2- Untereinheit, jedoch ist es nicht bekannt, wie viele dieser Stellen glykosyliert sind.
Unmittelbar dem Initiationscodon nachfolgend, kann eine äußerst hydrophobe Strecke von 15 Aminosäuren als Signalsequenz fimgieren, um den Transport des entstehenden E2-Polypeptids durch die Membran des rauhen endoplasmatischen Retikulums zu steuern. Eine andere Region mit extremen Hydrophobizität ist in den Nähe des Carboxy-Terminus von S2, die dazu dienen könnte das S1/S2 Dimer des großen Peplomers in der Umhüllung des Virions zu verankern.

Charakterisierung des E3-Gens

Das Rinder-Cononavirus besitzt ein zweites Oberflächenglykoprotein, E3, das einzigartig für Säugetier-Coronaviren ist, das hämagglutinierende Aktivität zeigt. Basierend auf dem Molekulargewicht von 59 K für das reife Polypeptid (Deregt et at., siehe oben), erbrachte die Überprüfung des Northern Blots in Fig. 2, Spur 1, daß es 3 mRNAs in Coronavirus-infizierten Zellen gibt, denen kein Polypeptid-Produkt zugewiesen werden konnte. RNA 1 in der Fig. 1 ist identisch mit dem Genom des Virion und scheint eine einzigartige Sequenz mit übermäßiger Größe zu besitzen, gegenüber dem was nötig wäre, das E3-Protein zu codieren, und unten der Annahme, daß sich E3 nicht von einem Vorläufer mit höherem Molekulargewicht durch Spaltung ableitet. Von einem solchen Vorläufer wurde nicht berichtet. RNA-Spezies 2 und 3 schienen entsprechende einzigartige Sequenzen zu haben, so daß jede den zwei RNA-Spezies die Synthese von E3 regeln könnte. Die natürliche Verschrankung der Coronavirus-mRNA deutete darauf hin, daß die Sequenzen, die einzigartig für die mRNA 3 sind, unmittelbar in 5' zum Gen fün E2 im Klon pCVA12M liegen. Die Sequenz der 1500 Nukleotide am 5' Ende von pCVA12H wurde bestimmt, und es wurde gefunden, daß sie einen offenen Leserahmen von 1272 Nukleotiden umfaßt, den 14 Nukleotide stromaufwärts des Initiationscodons von E2 endet und für ein Polypeptid von 424 Aminosäuren codiert (Fig.4). Wie für die anderen Gene von BCV gezeigt wird, geht dem Gen ebenfalls das charakteristische Heptanukleotid ACTAAAC voraus, welches 16 Nukleotide stromaufwärts des wahrscheinlichen Initiationscodons beginnt.
Analysen der Hydnophobizität des abgeleiteten Polypeptid-Produkts den einzigartigen Sequenzen den mRNA 3 zeigten, daß das Polypeptid die Charakteristika eines Membran- Glykoproteins besitzt. Unmittelbar dem Initiationscodon nachfolgend gibt es eine Strecke von 15 hydrophoben Aminosäuren, die ein Signal für die Translokation des Glykoproteins durch die Membranen des rauhen endoplasmatischen Retikulums sein könnten. Der Vergleich dieser Aminosäuresequenz mit den vorausgesagten bzw. abgeleiteten Amino-terminalen Sequenz von E2 zeigt, daß 5 der ersten 6 Aminosäuren identisch sind. Frühere Experimente haben gezeigt, daß das E3 von BCV durch einen Tunicamycin-sensitiven Mechanismus (Deregt et al., siehe oben) glykosyliert wird, und daß das abgeleitete Polypeptid 9 potentielle Stellen für die Anheftung von N-gekoppelten Oligosacchariden besitzt. Den Carboxy-Terminus des Peptids besitzt auch eine extrem hydrophobe Sequenz, die dazu dienen könnte, das Polypeptid in der Hülle des Virions zu verankern.

Charakterisierung der Polypeptid-Produkte, die von den klonierten BCV-E2- und E3-Genen produziert werden

Plasmid

Um direkt zu zeigen, daß die klonierte E2-Sequenz und das Gen, das unmittelbar in 5' an das E2-Gen angrezzt, die Gene für die Polypeptide des Peplomers und die E3s sind, wurden die in den Figuren 3 und 4 gezeigten Sequenzen in das Plasmid pTZ 19 R subkloniert und in vitno transkribiert. Zur Enzeugung der Ergebnisse, die anhand des SDS-PAGE-Gels in Fig. 5 gezeigt werden, wurden die BCV-E2- und E3-cDNA-Klone in vitno transkribiert und mit Kaninchen- Retikulozyten-Lysaten translatiert. Nach der Immunopräzipitation mit monoklonalen Antikörpern wurden die Produkte durch SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese in 13 % Acrylamid : DATD-Gelen analysiert.
Die in vitno-Translation des Transkriptes vom E2-Gen ergab vier Polypeptide mit 29 K, 44 K, 50 K und 55 Kg die mit E2-spezifischen monoklonalen Antikörpern immunopräzipitiert wurden (Figur 5, Spur 1). Die Produkte sind denen ähnlich, die durch in vitro-Translation den Poly A+ mRNA von BCV-infizierten Zellen (nicht gezeigt) erhalten wurden, und zeigen an, daß die niedrigen Molekulargewichte vermutlich auf Schwierigkeiten bei der Translation der großen E2-mRNA in vitro beruhen.
In vitro Translation der Transkripte des klonierten E3-Gens und Immunpräzipitation mit E3- speztfischen monoklonalen Antikörpern ergab ein Polypeptid von 45 K (Figur 5, Spur 3), wie anhand der Nukleotidsequenz des in Figur 4 gezeigten cDNA-Klons vonherbestimmt werden konnte.

Bakulovirus

Um direkt zu zeigen, daß die klonierten Sequenzen die Gene für die BCV-Polypeptide E2 und E3 repräsentienen, wurden die in den Figuren 3 und 4 gezeigten Sequenzen auch in das Genom des Bakulovirus A. californica subkloniert und in Insektenzellen exprimiert.
Um das in Fig. 6 gezeigte Ergebnis zu erhalten, wurden rekombinante AcNPV-infizierte Zellen wie angegeben radioaktiv markiert und mit E3-spezifkchen monoklonalen Antikörpern von der Elektrophorese auf 10 % SDS-Polyacrylamid-Gelen immunpräzipitiert. Die Spuren A - C zeigen nicht reduzierte Formen von E3, hergestellt in BCV-infizierten MDBK-Zellen, BLV- E3-infizierten Sf9-Zellen bzw. BAE3S-infizierten Sf9-Zellen. Die Spuren D - F zeigen Formen wie in A - C nach den Reduktion mit 2-Mercaptoethanol. Fig. 6 zeigt auch die Puls-Chase- Analyse von Sf9-Zellen, die das rekombinante E3-Polypeptid produzieren. Spur G zeigt die E3-Polypeptide nach 2stündigen Markierung. Spur H zeigt die Zell-assoziierten BVL-E3 Produkte nach 12stündigem "Chase". Spur I zeigt Immunpräzipitation vom Medium von BVL- E3-infizierten Zellen nach 12stündigem Chase. Spur J zeigt Zell-assoziierte Produkte von BAE3S-infizierten Sf9-Zellen nach 2stündigem Chase. Spur K zeigt Zell-assoziierte Produkte von BAE3S-infizierten S19-Zellen nach 12stündigem Chase. Spur L zeigt die Immunpnäzipitation des Mediums von BAE3S-infizierten Sf9 Zellen nach 12stündigem Chase. Die Spuren M und N zeigen dimere Formen von BAE3S-infizierten Zellen bzw. Medien nach 12stündigem Chase.
Zur Erbringung den in Fig. 7 gezeigten Ergebnisse wurden mit rekombinanten Formen des Bakulovirus infizierte Zellen mit einem Vielfachen von 5 infiziert. Zu dem Zeitpunkt 40 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen eine Stunde lang mit 100 uCi / ml ³&sup5;S- Methionin radioaktiv markiert. Die Zellen wurden geerntet und in RIPA-Puffer lysiert, und die gesamten Zellextrakte wurden durch Elektrophorese auf 7,5 % Polyacrylamid Gelen analysiert. Serie A präsentiert eine Analyse den Gesamt-Zellysate. Spur 1 zeigt nicht infizierte Zellen. Spur 2 zeigt A. califonnica-infizierte Zellen. Die Spuren 3 - 6 zeigen Zellen, die mit den rekombinanten Formen AcE2A, -B, -C bzw. -D infizert wurden. Serie B präsentiert immunpräzipitierte Produkte, wie in Serie A. Pfeile zeigen die Position des 180-kDa-E2 und des 145-kDa-E2c- Polypeptids (c = Kernstück, oden nicht glykosyliert).
Die Expression des BCV-E3-Gens in Insektenzellen ergab ein Polypeptid von ungefähr 56 K, das mit E3-spezifischen monoklonalen Antikörpern immunpräzipitiert wurde, wie in Fig. 6 gezeigt wird. Das Polypeptid wandert geringfügig schneller als das authentische Protein, daß aus BCV-Virionen aufgereinigt wurde. Die Fähigkeit monoklonaler Antikörper, die Polypeptide spezifisch immunpräzipitieren zu lassen, beweist die Übereinstimmung den Polypeptide und zeigt daß das rekombinante Protein immunologisch identisch mit dem nativen viralen Protein ist.
Die Expression des E2-Polypeptids in Insektenzellen, wie in Fig. 7 gezeigt wird, ergibt zwei Polypeptide von ungefähr 180 K und 145 K, die durch monoklonale Antikörper, die spezifisch für das E2-Polypeptid des Rinder-Coronavirus sind, immunpräzipitiert werden. Die Behandlung den Insektenzellen mit Tunicamycin resultiert in einen Abnahme des 180-K- Produkts gekoppelt mit einen Zunahme des 145-K-Produkts, was veranschaulicht, daß das 145-K-Polypeptid eine nicht-glykosylierte Form des E2-Polypeptides darstellt.
Auf dem Niveau der Aminosäuresequenz gibt es einige Ähnlichkeiten zwischen Stämmen des Maus-Hepatitis-Virus JHM, A59, und den E2-Glykoproteinen des Rinder-Coronavirus (Schmidt et al. (1987); du Groot et al. (1987); und eigene unveröffentlichte Daten). Die Aminosäuresequenzen den E2-Glykoproteine des Rinder-Coronavirus und dem Maus- Hepatitis-Virus und unsere Berechnungen zum Homologiegrad sind so, wie in Fig. 8 gezeigt. Die Sequenzen sind unteneinander linear ausgerichtet worden, um das Maximum an Homologie zu zeigen. Die Buchstaben am oberen Rand verweisen auf einen konservierten Rest an diesen spezifischen Position. Jeder Bindestrich "-" bedeutet, daß eine Lücke von einem Rest eingefügt wurde, um die Homologie zu maximienen. In jedem Fall stellt die obere Zeile die BCV- Sequenz dan. Die Ziffern für die Aminosäuren am Beginn jeder Zeile sind am linken Rand notiert.
Wie im Bild gezeigt, werden konservative Veränderungen als nicht homolog betrachtet. Unter strengen Bedingungen ist MHV-JHM zu 69,1 % homolog mit BCV und A59 ist es zu 67,7 %. Unten weniger strengen Gesichtspunkten, bei der die folgenden Austausche als konservativ angesehen wenden, S = T, K = R, F = L M = I = V, H = Y = W, A = C, steigern sich die Homologien auf 75,5 % bzw. 73,9 %.
Diese Werte ignorieren die Tatsache völlig, daß BCV zusätzliche Sequenzen beinhaltet, die nicht in den zwei anderen Viren vonhanden sind. Wenn die zusätzliche Sequenz von BCV in dem Vergleich berücksichtigt wird, sinken die Werte auf 62,7 und 67,7 % bei einen hohen Stringenz des Vergleichs und auf 68,4 und 71,8 % unten Vorraussetzungen, bei denen die konservativen Austausche als homolog angesehen wenden.

Hintenlegung des biologischen Materials

Das folgende Material wurde bei den American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A. Hinterlegt. Diese Hinterlegungen werden unten den Bedingungen des Budapesten Vertrags zur Hinterlegung von Mikroonganismen aufbewahrt wenden. Die Nukleotidsequenzen des hintenlegten Materials sind hien durch den Bezug danauf einbezogen wie auch die Sequenzen den dadurch codierter Polypeptide. Im Fall irgendeinen Diskrepanz zwischen der Sequenz, die hier ausdrücklich beschrieben wird, und den niedergelegten Sequenz, hat die hintenlegte Sequenz Regulationsfunktion. Die Hinterlegung eines derartigen Materials oder seine Verfügbarkeit ist nicht die Bewilligung einen Lizenz irgendetwas den hinterlegten Materialien herzustellen, zu verwenden oder zu verkaufen. Material ATCC-Zugangsnummer Hinterlegungsdatum E. coli Juni
Wenngleich die vorliegende Erfindung obenstehend durch bestimmte spezifische Ausführungsformen dangelegt wurde, sollen die spezifischen Beispiele den Umfang den Erfindung, wie er in den angefügten Patentansprüchen beschrieben ist, nicht einschränken.

SEQUENZ-AUFLISTUNG

(1) Allgemeine Information:

(i) Anmelder: Veterinary Infectious Disease Organisation
(ii) Titel der Erfindung: Rindcoronavirus-Polypeptide sowie Impfstoffe
(iii) Anzahl der Sequenzen: 7
(iv) Korrespondenz-Adresse
(A) Adressat: J A Kemp & Co
(B) Straße: 14 South Square, Gray's Inn
(C) Stadt: London
(E) Land: Großbritannien
(F) Postleitzahl: WC1R 5EU
(vi) Allgemeine Anmeldungsdaten
(A) Anmeldungsnummer: EP 90911 509.9
(B) Einreichungsdatum: 10. August 1990
(viii) Stellvertreter-/Vermittler-Information
(A) Name: Goldin, Douglas Michael
(ix) Telekommunikationsinformation
(A) Telephon: +44 71 405 3292
(B) Telefax: +44 71 242 8932
(C) Telex: 23676

(2) Information über SEQ ID Nr. 1:

(i) Sequenzcharakteristiken:
(A) Länge: 4355 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüsselbegriff: CDS
(B) Lokation: 14..4102 (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 1:

(2) Information über SEQ ID Nr. 2:

(i) Sequenzcharakteristiken:
(A) Länge: 1363 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein (xi) Sequenz-Beschreibung SEQ ID Nr. 2:

(2) Information über SEQ ID Nr. 3:

(i) Sequenzcharakteristiken:
(A) Länge: 1305 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüsselbegriff: CDS
(B) Lokation: 17..1288 (xi) Sequenz-Beschreibung SEQ ID Nr. 3:

(2) Information über SEQ ID Nr. 4:

(i) Sequenzcharakteristiken:
(A) Länge: 424 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein (xi) Sequenz-Beschreibung SEQ ID Nr. 4:

(2) Information über SEQ ID Nr. 5:

(i) Sequenzcharakteristiken:
(A) Länge: 1363 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear (xi) Sequenz-Beschreibung SEQ ID Nr. 5:

(2) Information über SEQ ID Nr. 6:

(i) Sequenzcharakteristiken
(A) Länge: 1235 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear (xi) Sequenz-Beschreibung SEQ ID Nr. 6:

(2) Information über SEQ ID Nr. 7:

(i) Sequenzcharakteristiken:
(A) Länge: 1324 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear (xi) Sequenz-Beschreibung SEQ ID Nr. 7:

Claims

1. DNA-Molekül, umfassend eine codierende Sequenz für das Rindercoronavirus (BCV)-E2-Protein oder antigene Fragmente davon, wobei das BCV-Protein mindestens zu 80% zu der Proteinsequenz von Seq. ID. Nr. 1 homolog ist, wobei das DNA-Molekül mindestens zu 80 % zu der DNA-Sequenz von Seq. ID. Nr. 1 homolog ist; mit der Maßgabe, daß das DNA-Molekül nicht das BCV-E3-Protein kodiert.

2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, das ein Replikon umfaßt.

3. DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, umfassend eine Expressionskassette, die die codierende Sequenz und mit der codierenden Sequenz operabel verknüpfte Kontrollsequenzen umfaßt, wobei die codierende Sequenz in einer Wirtszelle transkribiert und translatiert werden kann, worin mindestens eine der Kontrollsequenzen heterolog zu der codierenden Sequenz ist.

4. DNA-Molekül nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die codierende Sequenz für das gesamte E2-Protein ist.

5. DNA-Molekül nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die codierende Sequenz für ein antigenes Fragment des E2-Proteins ist

6. DNA-Molekül nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das BCV-E2- Protein von der Seq. ID. Nr. 1 ist.

7. Wirtszelle, die ein DNA-Molekül nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 umfaßt.

8. Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei die Zelle prokaryotisch ist.

9. Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei die Zelle eukaryotisch ist

10. Wirtszelle nach Anspruch 9, wobei die Zelle eine Säugetierzelle ist.

11. Wirtszelle nach Anspruch 9, wobei die Zelle eine Hefezelle ist.

12. Wirtszelle nach Anspruch 9, wobei die Zelle eine Insektenzelle ist.

13. Wirtszelle nach Anspruch 12, wobei die Insektenzelle eine Spodoptera frugiperda- Zelle ist.

14. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids, umfassend eine antigene Aminosäuresequenz von BCV, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

(a) Kultivieren einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 7 bis 13; und

(b) Gewinnen des rekombinanten Polypeptides.

15. Impfstoffzusammensetzung für Rindercoronavirus (BCV), umfassend ein pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine wirksame Menge eines antigenen BCV-E2-Polypeptides, wobei das Polypeptid mindestens zu 80 % zu der Proteinsequenz von Seq. ID. Nr. 1 homolog ist; mit der Maßgabe, daß das Polypeptid nicht BCVE-E3 ist.

16. Zusammensetzung, umfassend im wesentlichen reines Rindercoronavirus (BCV)- E2-Peptid, worin das BCV-E2-Polypeptid mindestens zu 80 % zu der Proteinsequenz von Seq. ID. Nr. 1 homolog ist; mit der Maßgabe, daß das Polypeptid nicht BCV-E3 ist.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin das E2-Protein die in Seq. ID. Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt.

18. Zusammensetzung nach Anspruch 16 oder 17, worin das E2-Protein glykosyliert ist.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 16 oder 17, worin das E2-Protein nicht glykosyliert ist.

20. Impfstoft nach Anspruch 15 oder Zusammensetzung nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 19 zu Anwendung bei einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.