DE69013216T2

DE69013216T2 - Herstellung von Stearidonsäure.

Info

Publication number: DE69013216T2
Application number: DE69013216T
Authority: DE
Inventors: Michel Lagarde; Helmut Traitler; Hans-Juergen Wille
Original assignee: Nestle SA
Current assignee: Nestle SA
Priority date: 1989-05-22
Filing date: 1990-05-19
Publication date: 1995-03-02
Anticipated expiration: 2010-05-20
Also published as: CH678181A5; US5130449A; ES2063858T3; AU626082B2; EP0399417A2; DE69013216D1; AU5474890A; EP0399417B1; DK0399417T3; EP0399417A3; ATE112760T1; ZA903455B

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Stearidonsäure aus einer Mischung von Fettsäuren, die diese als Nebenbestandteil enthält.
Bekanntlich führen die essentiellen Fettsäuren der Reihe n-3 (Bezeichnung aufgrund der Stellung der ersten Doppelbindung nach der Methylgruppe) durch eine Reaktionskette zu den Prostaglandinen der Reihe 3, die eine hemmende Wirkung für die Blutplättchenaggregation haben.
Das erster Element dieser Kette ist die alpha-Linolensäure (ALA, C 18:3Δ9, 12, 15), deren Umwandlung in Stearidonsäure (SA, C 18: 4Δ6, 9, 12, 15) auf die Aktivität des Enzyms Δ6 Desaturase angewiesen ist, die bekanntlich mit dem Altern und in der Folge von gewissen Krankheiten abnimmt. Die Synthese der Prostaglandine der Reihe 3 wird dadurch beeinträchtigt. Um dieser Schwäche des Organismus abzuhelfen, wird vorgeschlagen, Stearidonsäure direkt in den Körper einzuführen.
Die japanische Patentanmeldung Nr. 86050752 betrifft ein Verfahren zum Trennen von Stearidonsäure von Fischöl, das darin besteht, daß die sie enthaltenden Fettsäuren in ihre Ethylester umgewandelt werden, die Ethylester durch Molekular-Destillation behandelt werden und die Kopffraktion gewonnen wird, diese dann init Harnstoff in Methanol umgesetzt wird, die Fraktion, die nicht reagiert hat, gewonnen wird und schließlich eine bezüglich Ethylester der Stearidonsäure angereicherte Fraktion durch zwei aufeinanderfolgende Arbeitsgänge der Umkehrphasen-Verteilungs-Chromatographie abgetrennt wird.
Man würde auf diese Weise eine Reinheit von 85 Gew.-% mit einer Ausbeute von 1,8 % bezüglich des verwendeten Öls erreichen, was eine Gewinnung von 48 % der im Rohstoff vorhandenen Stearidonsäure darstellt.
Das europäische Patent Nr. 178.442 betrifft ferner die Anreicherung des Öls von Kernen der schwarzen Johannisbeere bezüglich gamma-Linolensäure (GLA, C 18:3 Δ 6, 9, 12) durch zweifacheKomplexbildung einer von der Verseifung des Öls der schwarzen Johannisbeere stammenden Fettsäurenmischung mit Harnstoff, auf welche eine Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie folgt. Nach diesem Patent scheint die Abtrennung besonders schwierig zu sein, wobei die Anreicherung der Mischung nur hinsichtlich ihres Hauptbestandteils, der gamma-Linolensäure, möglich erscheint.
Wir haben gefunden, daß man eine bezüglich Stearidonsäure angereicherte Fraktion mit einer Reinheit von über 90 Gew.-% aus einer diese enthaltenden Fettsäuremischung ohne Zuhilfenahme der Molekulardestillation der Ethylester und in einem einzigen Chromatographiedurchgang herstellen kann.
Die Erfindung betrifft deshalb ein Verfahren zur Herstellung von Stearidonsäure, bei welchem man eine diese Säure enthaltende Fettsäurenmischung mit Harnstoff umsetzt und eine bezüglich mehrfach ungesättigter Fettsäuren angereicherte Fraktion gewinnt, dann die angereicherte Fraktion in eine Säule für die Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie injiziert und die Säule eluiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Elutionsmittel eine Mischung von 75 bis 95 Gew.-% Methanol und 25 - 5 Gew.-% Wasser verwendet und man die Fettsäuren in Form einer 25 bis 35 Gew.-%igen Lösung in die Säule injiziert.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet man vorzugsweise ein Ausgangsöl, das einen beträchtlichen Prozentsatz an Stearidonsäure von etwa 2 bis 4 % enthält. Fischöl und insbesondere Öl von Kernen der schwarzen Johannisbeere (Ribes nigrum) sind diesbezüglich geeignet.
Fischöl enthält in beachtlichen Anteilen Stearidonsäure, Eicosapentaensäure (EPA, C 20:5 Δ5, 8, 11, 14, 17) und Docosahexaensäure (DHA, C 22:6 Δ 4, 7, 10, 13, 16, 19), während das Öl von Kernen der schwarzen Johannisbeere eine wichtige Quelle für gamma-Linolensäure und Stearidonsäure bildet.
Man raffiniert zunächst die beispielsweise durch Lösungsmittel oder durch Druck extrahierten Rohöle, indem man auf bekannte Weise ihre Degummierung beispielsweise mit Hilfe von Phosphorsäure, die Neutralisierung der freien Fettsäuren beispielsweise mit Soda, ihre Entfärbung beispielsweise mit Hilfe einer Mischung aus Aktivkohle und aktiviertem Aluminiumsilikat, ihre Desodorierung unter Vakuum bei einer Temperatur von etwa 200ºC im Falle von Öl von Kernen der schwarzen Johannisbeere und dann ggf. ihre Winterisierung vornimmt, indem man beispielsweise etwa 24 h bei etwa 4ºC kühlt, was im Fall des Öls von Kernen der schwarzen Johannisbeere die Entfernung der meinten Restwachse gestattet.
Die Raffinierung des Fischöls geht wie bei dem Öl von Kernen der schwarzen Johannisbeere vor sich, die Desodorierung findet jedoch vorzugsweise bei einer Temperatur von ≤180ºC statt, um die Zersetzung der mehrfach ungesättigten Fettsäuren zu vermeiden. Man erhält die Ausgangsmischung von freien Fettsäuren durch Verseifung der raffinierten oder halbraffinierten Öle und anschließender Ansäuerung der erhaltenen Fettsäuresalze oder auch durch Hydrolyse der raffinierten oder halbraffinierten Öle. Die Halbraffinierung umfaßt die Degummierung und anschließende Neutralisierung der Rohöle.
Man behandelt anschließend die Fettsäuremischung xnit Harnstoff in einem Gewichtsverhältnis von Fettsäuren zu Harnstoff von 1:3 bis 1:6, vorzugsweise 1:3 bis 1:4, in Gegenwart von Methanol in einem Gewichtsverhältnis von Harnstoff zu Methanol von 1:1,5 bis 1:3 und vorzugsweise 1:2,1, indem man die Mischung bis zum Sieden erhitzt. Man kühlt die Reaktionsmischung bis zu einer Temperatur von -5 bis 20ºC und vorzugsweise von 0 bis 15ºC und läßt die gekühlte Mischung dann bei der endgültigen Temperatur höchstens 15 h und vorzugsweise 1 bis 7 h stehen. Anschließend filtert man den gebildeten Niederschlag kalt und gewinnt die flüssige Phase, von der man die bezüglich mehrfach ungesättigter Fettsäuren angereicherte Fettsäurenmischung beispielsweise in einem salzsauren Medium in Gegenwart von Hexan extrahiert, aus dem anschließend das Hexan entfernt wird.
Der folgende Schritt ist die Fraktionierung der bezüglich mehrfach ungesättigter Fettsäuren angereicherten Fettsäurenmischung durch Umkehrphase-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie. Dieser präparative Chromatographietyp besteht darin, daß die Fettsäuren in Form von Proben in die Vorrichtung injiziert werden, daß sie durch ihren hydrophoben Teil auf einer Säule adsorbiert werden, die die stationäre Phase bildet und aus mit einer Schicht von gesättigten Kohlenwasserstoffen dotierten porösen Kieselerde besteht, und dann selektiv durch eine bewegliche Phase gesteuerter Polarität desorbiert werden, in der die polaren Teile der Proben gelöst sind und die das Elutionsmittel bildet.
Im vorliegenden Fall besteht das Elutionsmittel aus einer Wasser-Methanol-Mischung, die vorzugsweise 85 bis 90 Gew.-% Methanol auf 15 bis 10 Gew.-% Wasser enthält Die bewegliche Phase stellt 1 bis 3 g/l Adsorptionsmittel in der Säule und vorzugsweise 1,5 bis 2 g/l dar. Die Fettsäuren liegen in der Injektionsprobe vorzugsweise in Form einer Lösung in einem guten Lösungsmittel für diese, beispielsweise in Methanol, vor. Die Konzentration der Fettsäuren in der Injektionsprobe ist ein bestimmende Faktor für den Erfolg der Trennung. Sie beträgt vorzugsweise etwa 30 Gew.-% bei etwa 70 Gew.-% Methanol. Es hat sich nämlich herausgestellt, daß die Abtrennung der Stearidonsäure mit einer Lösung mit einer höheren Konzentration an Fettsäuren als im Fall der Trennungen durch Chromatographie gemäß des Stands der Technik ergiebiger ist. Der Einfluß der Konzentration in dieser Richtung ist insofern unerwartet, als zu erwarten gewesen wäre, daß die Trennung durch eine Verdünnung erleichtert wird. Das bemerkenswerte Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahrens ist hauptsächlich auf die geeignete Wahl der Zusammensetzung des Elutionsmittels und der Fettsäurenkonzentration der beweglichen Phase zurückzuführen.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der in dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Stearidonsäure zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gegen kardiovaskuläre und thrombembolische Erkrankungen- die mit einer Blutplättchenaggregation assoziiert sind.
Eine solche pharmazeutische Zusammensetzung kann verschiedene Aufmachungen besitzen, die an die Art der Verabreichung beispielsweise auf oralem, enteralem, rektalem oder parenteralem Weg angepaßt sind. Man kann beispielsweise Kapseln, Gelantinekapseln, Suppositorien oder Sirups herstellen. Im Fall einer enteralen oder parenteralen Verabreichung liegen die Zusammensetzungen in Form von chemisch und physikalisch stabilisierten, apyrogenen und sterilen Emulsionen oder Lösungen vor.
Die Stearidonsäure kann vorteilhafterweise durch ein geeignetes Antioxidans gegen Oxidation geschützt sein, und zwar beispielsweise Ascorbylpalmitat, Tocopherole, eine Mischung solcher Antioxidanzien oder eine Mischung aus Ascorbinsäure, Tocopherol und Lecithin.
Die verabreichte Dose hängt von Typ und Schwere der zu behandelnden Erkrankung ab. Sie kann 0,1 bis 1 g Stearidonsäure täglich in einer Einzelgabe oder vorzugsweise in zwei bis drei getrennten Gaben betragen.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. In ihnen beziehen sich die Anteile und Prozentsätze, sofern nichts anderes angegeben wird, auf das Gewicht.
In diesen Beispielen wird die Analyse der Fettsäuren durch Gaschromatographie ihrer Methylester vorgenommen.

Beispiel 1

1.1. 100 Teilen raffiniertem Öl von Kernen der schwarzen Johannisbeere wird eine Lösung aus 30,5 Teilen Natriumhydroxid in einer Mischung von 101,5 Teilen Wasser und 80,5 Teilen Ethanol unter gutem Rühren beigegeben, und die Mischung wird 30 min lang bis zum Sieden erhitzt (etwa 80ºC) Man kühlt anschließend die Mischung auf 30 bis 40ºC und gibt ihr langsam 100 Teile 32 %iger Salzsäure (pH 1) und 166,7 Teile Hexan unter kräftigem Rühren während 30 min bei. Man läßt die Mischung anschließend dekantieren. Es bilden sich zwei Phasen. Man entnimmt die obere Phase, von der das Heran bei 40ºC unter Vakuum abgedampft wird und die Ausgangsmischung der Fett säuren bildet. Diese Mischung besteht aus folgenden Fettsäuren:
1.2 Man versetzt 150 g der vorhergehenden Mischung von Fettsäuren mit 450 g Harnstoff und 945 g Methanol und erhitzt die Mischung dann bis zum Sieden, wobei sie durchsichtig wird. Man läßt sie nun bis zur Raumtemperatur abkühlen und setzt sie dann 5 h in ein Wasserbad mit 0ºC. Es bildet sich ein Niederschlag. Man gewinnt anschließend die flüssige Phase durch Büchner-Vakuumfiltration mit vorhergehender Abkühlung auf 0ºC und extrahiert daraus die bezüglich mehrfach ungesättigter Fettsäuren angereicherten Fettsäuren mit Hilfe von 0,2 Teilen Salzsäure, 0,6 Teilen Wasser und 0,25 Teilen Hexan auf einem Teil flüssige Phase. Anschließend dampft man das Hexan bei 40ºC unter Vakuum ab und sammelt ein Gemisch von Fettsäuren mit der nachstehenden Zusammensetzung:
1.3 Die Chromatographie wird mit Hilfe von zwei in Reihe angeordneten Säulen mit einem Innendurchmesser von 5,7 cm und einer Länge von 30 cm durchgeführt, die mit poröser Kieselerde gefüllt ist, die mit gesättigten C&sub1;&sub8;-Kohlenwasserstoffen dotiert ist und die stationäre Phase bildet Die Säulen stehen unter Stickstoffdruck von 30 bar (radialer Druck) und sind mit einem Brechzahlbezugsdetektor versehen, der die quantitative Bestimmung der Fraktionen gestattet. Die bewegliche Phase besteht aus einer Mischung aus Methanol und Wasser mit etwa 12 % Wasser mit einer Dichte von 0,821 bis 0,824. Man injiziert Proben von 10 ml einer 30 %igen Lösung der Fettsäurenmischung in 70 % Methanol, so daß sie auf der Säule adsorbiert werden. Man eluiert anschließend die verschiedenen Fraktionen, indem man die bewegliche Phase über die Säule mit einem Durchsatz von 100 ml/min leitet. Man gewinnt mehrere Fraktionen und behält diejenige, auf die sich der erste Peak bezieht. Diese entspricht 10 % der in die Vorrichtung eingeführte Fettsäurenmischung und enthält 92 % Stearidonsäure. Die Ausbeute an Stearidonsäure mit der Reinheit von 92 % steigt somit auf 1,5 % der Ausgangsfettsäuren mischung, was 56 % der im Rohstoff enthaltenen Stearidonsäure entspricht.

Beispiel 2

Man reinjiziert die in Beispiel 1 erhaltene Fraktion in Form einer 30 %igen Lösung in Methanol als Probe von 10 ml unter denselben Bedingungen Man gewinnt die sich auf den ersten Peak beziehende Fraktion, die 60 % der reinjizierten Fettsäurenmischung entspricht, die 98 % Stearidonsäure enthält.

Beispiel 3

Man geht wie in Beispiel 1 von einer mit Harnstoff fraktionierten Mischung von Fischölfettsäuren unter denselben Bedingungen vor, und zwar abgesehen von der Endtemperatur des Ruhens der komplexen Mischung mit Harnstoff/flüssige Phase, die 10ºC beträgt. Die Fettsäurenmischung hat die folgende Zusammensetzung: Andere
Man führt die Chromatographie hinsichtlich der Zusammensetzung der beweglichen Phase und des Elutionsdurchsatzes wie in Beispiel 1 durch. Lediglich die spezifische Charge init Ausgangsfettsäuren von 1,75 g/l Adsorptionsmittel in der Säule ändert sich. Man gewinnt mehrere Fraktionen und behält diejenige, die sich auf den zweiten Peak bezieht und die die folgende Fettsäurenzusammensetzung hat: Andere
Diese Fraktion stellt 0,9 % der Ausgangsfettsäurenmischung dar, was 35 % der im Rohstoff enthaltenen Stearidonsäure entspricht.

Beispiel 4

Es ist bekannt, daß kardiovaskuläre und thrombembolische Erkrankungen häufig mit einer Hyperaktivität der Blutplättchen assoziiert sind. Die mehrfach ungesättigten Fettsäuren der Reihe n-3 werden als Präventionsfaktoren für thrombembolische Erkrankungen angesehen.
Man untersucht die Wirkung der gemäß Beispiel 2 erhaltenen Stearidonsäure auf die Blutplättchenaggregation im Vergleich zu denjenigen der gamma-Linolensäure, alpha-Linolensäure, Eicosapentaensäure sowie der gemäß Beispiel 2 des Patents EP 178.442 erhaltenen Fettsäuremischung (im nachstehenden Konzentrat).
4.1 Man gewinnt das Blut von gesunden Spendern mit einem mittleren Alter von 36 Jahren, gibt ihm ein koagulationshemmendes Mittel bei und isoliert davon die Blutplättchen. Anschließend bringt man die Blutplättchen in einer Lösung Tyrode HEPES mit pH 7,35 in Suspension, die 16 h bei 37ºC in geschlossenen Gläsern unter Stickstoff gehalten wird und folgende Zusammensetzung hat:
50 uM von Lipiden befreites meschliches Albumin,
50 uM Linolsäure (LA, C 18:2 Δ 9, 12)
5 uM Arachidonsäure (AA, C 20:4 Δ5, 8, 11, 14)
und 5 uM der getesteten Fettsäure.
Man inkubiert die Blutplättchen in dieser Lösung 2 h bei 37ºC, dann isoliert man sie wieder und nimmt sie in einer Lösung Tyrode HEPES auf, der 0,1 % Gelantine beigegeben ist. Bei jedem Test wird eine als Vergleich dienende Blutplätt chensuspensionsgruppe derselben Behandlung unterzogen, mit der Ausnahme, daß die Suspension nur Linolsäure und Arachidonsäure enthält, deren Beigabe die Blutplättchenfunktionen nicht verändert. Bei manchen Tests gibt man noch zusätzlich zu den verschiedenen Fettsäuren 10 uM alpha-Tocopherol bei, um die durch die mehrfach ungesättigten Fettsäuren induzierte Verringerung dieser Verbindung auszugleichen. Die auf diese Weise angereicherten Blutplättchen befinden sich unter ähnlichen Bedingungen, wie sie im Blutplasma herrschen.
4.2 Die Blutplättchenaggregation wird nach der turbidimetrischen Methode von Born gemessen (J. Physiol. 209:487, 1973).
Die Konzentration des Aggregationsmittels wird so bestimmt, daß man bei den als Vergleich betrachteten Blutplättchen 4 min nach Beigabe des Aggregationsmittels etwa 60 % Aggregation erhält.
4.3 Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 in Prozent der Aggregation angegeben und stellen jedes Mal parallel mit der Vergleichzusammensetzung einen Mittelwert ± der Standardabweichung dar. TABELLE 1 Beigegebene Fettsäure Aggregationsmittel Kollagen Arachidonsäure Thrombin-Analogon von PGH2 (U46619) Vergleich Konzentrat Legende: - = nicht getestet
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß SA die durch Kollagen, Arachidonsäure, das Analogon von PGH2 oder Thrombin induzierte Blutplättchenaggregation hemmt. Verglichen mit GLA, ALA und EPA hemmt SA spezifischer die Stimmulation durch Thrombin. Im übrigen hat man festgestellt, daß das Vorhandensein von 10 uM alpha-Tocopherol die Blutplättchenaggregation nicht ändert.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Stearidonsäure, bei dem man eine Fettsäuremischung, die diese Säure enthält, mit Marnstoff umsetzt und eine Fraktion gewinnt, die bezüglich mehrfach ungesättigter Fettsäuren angereichert ist, dann die angereicherte Fraktion in eine Säule für die Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie injiziert und die Säule eluiert, dadurch gekennzeichnet, daß man als Elutionsmittel eine Mischung von 75 bis 95 Gew.-% Methanol und 25 bis 5 Gew.-% Wasser verwendet und man die Fettsäuren in Form einer 25 bis 35 Gew.-%igen Lösung in die Säule injiziert.

2. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangsmischung der Fettsäuren aus dem Öl von Kernen der schwarzen Johannisbeere (Ribes niger) stammt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangsmischung der Fettsäuren aus Fischöl stammt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man pro Liter des Adsorptionsmittels, das die stationäre Phase der Säule bildet, 1 bis 3 g mobile Phase verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die bezüglich der Stearidonsäure angereicherte Fraktion in die Säule reinjiziert und die Stearidonsäure in praktisch reiner Form gewinnt.

6. Verwendung der nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 erhaltenen Stearidonsäure zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gegen kardiovaskuläre und thrombembolische Erkrankungen, die mit einer Blutplättchenaggregation assoziiert sind.

7. Verwendung nach Anspruch 6 in einer für die orale, rektale, enterale oder parenterale Verabreichung geeigneten Form.

8. Verwendung nach Anspruch 6 in einer Form für die Zufuhr einer Tagesdosis von 0,1 bis 1 g Stearidonsäure.