DE68927048T2

DE68927048T2 - Medizinische Verwendung von neuropeptid Antagonist G

Info

Publication number: DE68927048T2
Application number: DE68927048T
Authority: DE
Inventors: Enrique Rozengurt; Penella Woll
Original assignee: Imperial Cancer Research Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Horizons Ltd
Priority date: 1988-03-21
Filing date: 1989-03-21
Publication date: 1997-04-03
Anticipated expiration: 2009-03-22
Also published as: JPH1171298A; EP0406297A1; EP0406297B1; ATE141798T1; DE68927048D1; JP2818679B2; GB8806644D0; WO1989009232A1; JPH04501556A

Description

Die Erfindung betrifft einen Antagonisten gegen verschiedene Neuropeptidrezeptoren, insbesondere Antagonist G und dessen Verwendung bei der Behandlung von kleinzelligem Lungenkrebs.
Neuropeptide sind in zunehmendem Maße an der Kontrolle der Zellproliferation¹ beteiligt. Das Amphibientetradecapeptidbombesin und dessen Säugerhomologes, das Gastrin-Releasing Peptid (GRP) sind potente Mitogene für Mausfibroblasten² und kännen als autokrine Wachstumsfaktoren für kleinzelligen Lungenkrebs³ wirken.
In der internationalen Patentanmeldung WO88/07551 der Anmelder sind bestimmte neue Peptide beschrieben, die Rezeptoren für bestimmte Peptide der Bombesinfamilie sind. Beschrieben sind auch Antagonisten für die Bombesinrezeptoren einschließlich zweier bekannter Verbindungen, von denen gefunden wurde, daß sie als Bombesinrezeptorantagonisten besonders wertvoll sind. Diese Antagonisten sind Analoga eines 11-meren Neuropeptids mit der Bezeichnung Substanz P, das für Untersuchungen zur Schmerzübertragung von Interesse ist. Substanz P besitzt die Formel:
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH&sub2;
Ein im Handel verfügbares Analogon von Substanz P, das als Antagonist A hier bezeichnet wird, besitzt die Formel:
D-Arg-D-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Leu-NH&sub2;
Eine weitere kommerziell verfügbare strukturelle Variante von Substanz P, die die Anmelder in der vorstehend genannten
Patentanmeldung beschrieben haben, ist Antagonist D, der die Formel:
D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Leu-NH&sub2;
besitzt.
In der vorstehend genannten Patentanmeldung der Anmelder wurde beschrieben, wie die Arbeit mit Antagonist A und Antagonist D die Aufmerksamkeit auf die Bedeutung von Position 5 der Aminosäuresequenz von Antagonist A und Antagonist D geleitet hat, und es wird auf weitere wertvolle Antagonisten Bezug genommen, die Varianten in der Aminosäureposition 5 von Antagonist A und Antagonist D sind, worin die Position 5 eine D-Trp, D-Tyr oder Me-Phe-Gruppe enthält.
In der in der vorstehend genannten Patentanmeldung beschriebenen Arbeit wird vorgeschlagen, daß die verschiedenen Antagonisten, die beschrieben wurden, als Antagonisten wirkten, indem sie an die Ligandenbindungsstelle auf dem Rezeptor binden und daß dadurch diese Verbindungen von me0dizinischem Interesse dahingehend sind, daß sie die Zellproliferation beeinflussen können, die unter dem Einfluß von Neuropeptid/Rezeptor-Wechselwirkungen eintritt.
Die weitere Forschungsarbeit der Erfinder führte zu der Schlußfolgerung, daß, während die verschiedenen Antagonisten, die in der vorstehend genannten Patentanmeldung beschrieben sind, in der Tat an den Rezeptor binden und daher aus dem genannten Grund von medizinischem Interesse sind, die Bindung nicht an der Ligandenbindungsstelle erfolgt, sondern an einer anderen Bindungsstelle auf dem Rezeptor. Diese Schlußfolgerung wurde aus weiteren Forschungen der Erfinder gezogen, die anzeigen, daß die Antagonisten nicht nur an den Bombesinrezeptoren des in der vorstehend genannten Patentanmeldung beschriebenen Typs binden, sondern auch an andere Neuropeptidrezeptoren binden, die gemeinsam mit dem Bombesinrezeptoren den Inositsignalübertragungsweg verwenden. Es gibt mindestens zwei weitere derartige Rezeptoren, den Bradykininrezeptor und den Vasopressinrezeptor, und es wurde gefunden, daß die Antagonisten A und D an diese Rezeptoren binden können. Diese spezielle Eigenschaft der Antagonisten A und D steht in völligem Gegensatz zu den Eigenschaften von Bombesin selbst, das definitionsgemäß an die Bombesinrezeptoren bindet, aber nicht an die Vasopressin- oder Bradykininrezeptoren bindet. Dies zeigt, daß die Bindungsstelle von Antagonist A und D auf dem Bombesinrezeptor nicht die Ligandenbindungsstelle ist, sondern in der Tat wahrscheinlich eine separate konservierte Domäne, die auch auf anderen Rezeptoren, die den Inositsignalübertragungsweg verwenden, gefunden werden kann.
Die allerjüngste Entdeckung der Erfinder erhöht daher die medizinische Bedeutung nicht nur der Antagonisten A und D, sondern auch von Analoga davon, wie Antagonist G dahingehend, daß sie nicht nur die Zellproliferation, die unter dem Einfluß von bombesinartigen Peptiden eintritt, sondern auch die Zellproliferation, die unter dem Einfluß einer viel breiteren Reihe von mitogenen Neuropeptiden eintritt, beeinflussen können.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung Antagonist G zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere in einem Verfahren zur Beeinflussung der Zellproliferation, die durch Neuropeptide, die normalerweise an Rezeptoren, die den Inositsignalübertragungsweg verwenden, binden, beeinflußt wird. Antagonist G ist bei einem Verfahren zur Behandlung des kleinzelligen Lungenkrebses von besonderem Nutzen.
Antagonist G besitzt die Formel:
Arg.D-Trp.MePhe.D-Trp-Leu-Met-NH&sub2;.
Zusätzlich ist Antagonist G bei der Verzögerung oder der Beseitigung des Wachstums des kleinzelligen Lungenkrebses und bei Markierung bei der in vitro- oder in vivo-Diagnose des kleinzelligen Lungenkrebses von Interesse. Eine solche Markierung kann direkt auf dem Antagonistmolekül oder indirekt durch ein Molekül, das an den Antagonisten bindet, erfolgen.
Die Erfindung umfaßt auch Antagonist G zur Verwendung zur Produktion eines Medikaments zur Beeinflussung der Zellproliferation, die durch Neuropeptide beeinflußt wird, die normalerweise an Rezeptoren binden, die den Inositsignalübertragungsweg verwenden und insbesondere Antagonist G zur Verwendung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Diagnose von kleinzelligem Lungenkrebs. Dazu kann Antagonist G parenteral in einer effektiven Dosis an einen Wirt, der eine solche Behandlung oder Diagnose benötigt, verabreicht werden.

Beschreibung der Figuren

Die Fig. 1 und 2 erläutern die Ergebnisse von in dem Vergleichsbeispiel beschriebenen Versuchen.
Die Fig. 3 bis 5 erläutern die Ergebnisse der Hemmwirkung der Antagonisten A, D und G auf kleinzellige Lungenkrebszelllinien, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.

Vergleichsbeispiel

Swiss-3T3-Zellen sind weithin für experimentelle Zwecke verfügbar und können von der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, USA, unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC-CCL92 erhalten werden.
Das Pseudopeptid [Leu¹³-ψ(CH&sub2;NH)Leu¹&sup4;]-Bombesin wurde während einer systematischen Untersuchung zu Modifikationen des Peptidgrundgerüsts in Bombesinanaloga&sup5; synthetisiert. Es wurde gezeigt, daß es eine 50%ige Hemmung (IC&sub5;&sub0;) der Bombesinstimulierten Amylase-Freisetzung aus Meerschweinchenpankreas-Acini in einer Konzentration von 35 nM verursachte. Die Erfinder charakterisierten nun den Wirkmodus davon in Swiss-3T3-Zellen. Die DNA-Synthese, gemessen durch den [³H]- Thymidineinbau in ruhende Zellen&sup6; in Anwesenheit von 1 µg/ml Insulin und variierenden Konzentrationen von GRP wurde durch [Leu¹³-ψ(CH&sub2;NH)Leu¹&sup4;]-Bombesin mit einer Wirkung von einer Konzentration von 1 µM, die der von 20 µM [DArg¹,DPhe&sup5;,DTrp7,9,Leu¹¹]-Substanz P, d.h. Substanz D, äquivalent ist, stark gehemmt (Fig. 1A) Der IC&sub5;&sub0;-Wert für [Leu¹³-ψ(CH&sub2;NH)Leu¹&sup4;]-Bombesin war in Anwesenheit von 3,6 nM GRP 455 nM (Fig. 1B). Zusätzlich blockierte [Leu¹³-ψ- (CH&sub2;NH)Leu¹&sup4;]-Bombesin die frühesten zellulären durch GRP&sup7; hervorgerufenen Ereignisse einschließlich der Ca²&spplus;-Mobilisierung (5 sek) und der Transmodulation des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGF) (1 min), die von der Proteinkinase C-Aktivierung abhängig ist. [Leu¹³-ψ(CH&sub2;NH)Leu¹&sup4;]-Bombesin hemmte die spezifische Bindung von [¹²&sup5;I]GRP an die Zellen (Fig. 1C und D) und blockierte die Verknüpfung von [¹²&sup5;I]GRP mit der Glycoproteinkomponente mit einem Molekulargewicht von 75.000 bis 85.000 des Rezeptors (Fig. 1D, eingefügtes Bild)8,9. So ist [Leu¹³-ψ(CH&sub2;NH)Leu¹&sup4;]-Bombesin ein potenter Bombesinantagonist bei Swiss-3T3-Zellen, der auf Rezeptorebene wirkt.
Die Tachykininsubstanz P besitzt eine minimale Aminosäuresequenzhomologie mit Bombesin und hemmt weder die Bindung von [¹²&sup5;I]GRP noch stimuliert sie die DNA-Synthese in Swiss-3T3-Zellen2,10. Die früher genannte Patentanmeldung der Erfinder und die Literaturstellen 10, 11 beschreiben, wie der Antagonist A ein Bombesinantagonist ist, und daß der Antagonist D 5- bis 10fach wirksamer bzw. potenter ist als der Antagonist A. Beide hemmen auch die Vasopressin-stimulierte DNA-Synthese und die [³H]-Vasopressinbindung in Swiss-3T3- Zellen4,12,13. Deshalb wurden die neuen Bombesin- antagonisten rigoros getestet, um ihre Spezifität gegen Mitogene, die über verschiedene Signalübertragungswege wirken, zu ermitteln (Fig. 2A). Wie erwartet, waren sowohl Antagonist D als auch [Leu¹³-ψ(CH&sub2;NH)Leu¹&sup4;]-Bombesin gegen verschiedene Bombesin-artige Peptide effektiv. Keine Verbindung davon hemmte die durch die Polypeptidwachstumsfaktoren EGF und plättchenabgeleitetem Wachstumsfaktor (PDGF), dem Proteinkinase C-Aktivator-Phorboldibutyrat oder die Substanzen, die cAMP erhöhen, Choleratoxin und 8-Brom- cAMP stimulierte Mitogenese. Obwohl der Antagonist D ein potenter Inhibitor der Vasopressin-induzierten DNA-Synthese war, besaß [Leu¹³-ψ(CH&sub2;NH)Leu¹&sup4;]-Bombesin keine Wirkung in Konzentrationen, die die GRP-induzierte Mitogenese stark hemmten (Fig. 2B). Dieser dramatische Unterschied in der Spezifität stimulierte die Erfinder, die Wirkungen von Antagonist D und [Leu¹³-ψ(CH&sub2;NH)Leu¹&sup4;]-Bombesin auf andere mitogene Neuropeptide zu vergleichen.
Bradykinin stimuliert wie Bombesin und Vasopressin die Calciummobilisierung und den Inositphosphatumsatz in mehreren Zelltypen¹&sup4;&supmin;¹&sup7;. Es wurde gefunden, daß in mit dem fluoreszierenden Ca²&spplus;-Indikator Fura-2 geladenen Swiss-3T3-Zellen die Zugabe von Bradykinin eine rasche und vorübergehende Zunahme der cytosolischen Ca²&spplus;-Konzentration mit Kinetiken verursachte, die denjenigen ähnlich sind, die mit Bombesin und Vasopressin erhalten wurden, sich aber von denjenigen von PDGF¹&sup8; unterscheiden. Bradykinin hemmte weder die Bindung von [³H]-Vasopressin noch von [¹²&sup5;I] GRP an Swiss-3T3- Zellen, was anzeigt, daß ihre Rezeptoren unterschiedlich sind. In Anwesenheit von Insulin verursachte Bradykinin eine maximale Stimulierung der DNA-Synthese in diesen Zellen (Fig. 2C und D) im Gegensatz zu dessen schwacher mitogener Wirkung in menschlichen Fibroblasten19,20. So ergab Bradykinin ein neues Mitogen, mit dem die neuen Antagonisten getestet werden können. Die durch 9,4 nM Bradykinin induzierte Mitogenese wurde durch den Antagonisten A und den Antagonisten D (Fig. 2C und D) mit IC&sub5;&sub0;-Werten von 90 µM bzw. 8,3 µM gehemmt, was die gleiche relative Potenz ist, wie sie mit GRP&sup4; und Vasopressin erhalten wird (Daten nicht gezeigt). In beachtlicher Weise besitzt [Leu¹³-ψ(CH&sub2;NH)Leu¹&sup4;]-Bombesin keine Wirkung auf die Bradykinin-stimulierte DNA-Synthese (Fig. 2C). Während Bombesin, Bradykinin und Vasopressin den Inositphosphatsignalübertragungsweg aktivieren, ist das vasoaktive intestinale Peptid (VIP) ein Neuropeptid, das die DNA-Synthese über cAMP²¹ stimuliert. Weder der Antagonist D noch [Leu¹³-ψ(CH&sub2;NH)Leu¹&sup4;]-Bombesin hemmten die durch VIP stimulierte Mitogenese (Fig. 2A).
Der beachtliche Unterschied in der Spezifität zwischen [Leu¹³-ψ(CH&sub2;NH)Leu¹&sup4;]-Bombesin und den Substanz P-Antagonisten, der dargelegt wurde, besitzt wichtige Folgen. Die Substanz P-Antagonisten blockieren die mitogenen Antworten, die durch drei verschiedene Rezeptoren hervorgerufen werden, Bombesin/GRP, Bradykinin und Vasopressin. Sie blockieren nicht diejenigen, die durch andere Mitogene hervorgerufen werden, die über andere Transmembransignalübertragungswege einschließlich cAMP und Proteinkinase C-Aktivierung wirken. Die Substitution der zwei Aminosäuren, die den Antagonist D von dem Antagonist A unterscheiden, verursacht eine konsistente 5- bis 10fache Erhöhung der Potenz gegen jedes Mitogen, was nahelegt, daß diese Antagonisten eine gemeinsame Stelle in ihren unterschiedlichen Rezeptoren erkennen. Da die Bombesin-, Bradykinin-, Vasopressin- und Substanz P- Antagonisten strukturell nicht verwandt sind, kann diese vermutliche Bindungsstelle nicht die Ligandenerkennungsstelle sein. So wird angenommen, daß der Antagonist D und der Antagonist A eine konservierte Domäne auf jedem der Rezeptoren erkennen. Da eine gemeinsame Funktion dieser Rezeptoren die Induktion der Inositpolyphosphatbildung und der Ca²&spplus;-Mobilisierung ist, wird angenommen, daß die Substanz P- Antagonisten an eine Region auf jedem Rezeptor binden können, die für die Kopplung mit an der Ca²&spplus;-Signalübertragung²² beteiligten Genproteine essentiell ist. Die Theorien der Erfinder setzen voraus, daß ein Antagonist, der strukturell mit einem dieser Mitogene verwandt ist, an dessen getrennte Ligandenerkennungsstelle binden sollte, wodurch die spezifische Hemmung von dessen biologischen Wirkungen, aber nicht die der anderen mitogenen Neuropeptide verursacht wird. Die Ergebnisse der Erfinder zeigen, daß der Pseudopeptidantagonist [Leu¹³-(CH&sub2;NH)Leu¹&sup4;]-Bombesin diese Kriterien erfüllt.

Beispiel 1

Die Fähigkeit der Antagonisten A, D und G, das in vitro- Wachstum einer kleinzelligen Lungenkrebszellinie (SCLC) zu hemmen, wurde getestet. Die verwendeten Zellinien waren
a) H69 und H128 von der ATCC in Maryland, USA;
b) H209, H345 und H510A, erhalten von Dr. A. Gazdar in NCI, NIH, Maryland, USA;
c) UCH25 von Dr. P. Beverley, University College, London, England.
Es wurde gefunden, daß beim Test der Antagonist A effektiv das Wachstum von SCLC in Konzentrationen von 50 bis 150 µM in 5 der 5 getesteten Zellinien hemmte: H69, H82, H128, H417 und UCH25.
Es wurde gefunden, daß der Antagonist D konsistent 5- bis 10fach potenter war als der Antagonist A bezüglich der Hemmung des Wachstums von SCLC, vgl. Fig. 3 und 4. Der Antagonist D verhindert das Zellwachstum in Konzentrationen von 40 bis 50 µM und ist in 6 von 6 getesteten Zellinien aktiv: H69, H128, H209, H345, H510A und UCH25.
Antagonist G wurde als ebenso potent wie Antagonist D als ein Antagonist des Vasopressin-induzierten Zellwachstums in Swiss-3T3-Zellen, aber weniger potent als ein Antagonist des durch entweder Bradykinin oder GRP induzierten Wachstums befunden. In SCLC-Zellen ist der Antagonist G gleich potent wie der Antagonist D hinsichtlich der Hemmung des Wachstums, vgl. Fig. 5. Diese Aktivität wurde an 4 von 4 getesteten Zellinien gezeigt: H69, H209, H345 und H510A.
In Calciummobilisierungstests wurde eine vorübergehende Erhöhung der intrazellulären [Ca²&spplus;-]-Konzentration an mehreren SCLC-Zellinien als Antwort auf Bradykinin, GRP und Vasopressin nachgewiesen. Diese Antworten können durch 20 µM Antagonist D in 3 von 3 getesteten Zellinien (H69, H345, H510A) und durch 20 µM Antagonist G in H510A blockiert werden.

Literaturangaben

1. Zachary, I., Woll, P.J. & Rozengurt, E. Devel. Biol. 124, 295-308 (1987).
2. Rozengurt, E. & Sinnett-Smith, J. Proc. natn. Acad. Sci. USA, 80, 2936-2940 (1983).
3. Cuttitta, F. et al., Nature 316, 823-826 (1985).
4. Woll, P.J. & Rozengurt, E. Proc. natn. Acad. Sci. USA in press.
5. Coy, D.H. et al., J. Biol. Chem. 263, 5056-5060 (1988).
6. Dicker, P. & Rozengurt, E., Nature 287, 607-612 (1980).
7. Rozengurt, E., Science 234, 161-166 (1986).
8. Zachary, I. & Rozengurt, E., J. Biol. Chem. 262, 3947- 3950 (1987).
9. Sinnett-Smith, J., Zachary, I. & Rozengurt, E., J. Cell. Biochem. 38, 237-249 (1988).
10. Zachary, I. & Rozengurt, E., Proc. natn. Acad. Sci. USA, 82, 7616-7620 (1985).
11. Jensen, R.T., Jones, S.W., Folkers, K. & Gardner, J.D. Nature 309, 61-63 (1984).
12. Corps, A.N., Rees, L.H. & Brown, K.D., Biochem. J. 231, 781-784 (1985).
13. Zachary, I. & Rozengurt, E., Biochem. Biophys. Res. Commun. 137, 135-141 (1986).
14. Burch, R.M. & Axelrod, J., Proc. natn. Acad. Sci. USA, 84, 6374-6378 (1987).
15. Jackson, T.R., Hallam, T.J., Downes, C.P. & Hanley, M.R., EMBO J. 6, 49-54 (1987).
16. Osugi, T., Imaizumi, T., Mizushima, A., Uchida, S. & Yoshida, H., J. Pharamacol. Exp. Ther. 240, 617-622 (1987).
17. Tilly, B.C. et al., Biochem. J. 244, 129-135 (1987).
18. Lopez-Rivas, A., Mendoza, S.A., Nanberg, E., Sinnett- Smith, J., & Rozengurt, E., Proc. natn. Acad. Sci. USA, 84, 5768-5772 (1987).
19. Owen, N.E. & Villereal, ML., Cell 32, 979-985 (1983).
20. Coughlin, S.R., Lee, W.M.F., Williams, P.W., Giels, G.M. und Williams, L.T., Cell 43, 243-251 (1985).
21. Zurier, R.B., Kozma, M., Sinnett-Smith, J. & Rozengurt, E., Exp. Cell Res. in press.
22. Stryer, L. & Bourne, H.R., Ann. Rev. Cell Biol. 2, 391-419 (1986).

Legende zu den Figuren

Fig. 1: Wirkung von [Leu¹³-ψ(CH&sub2;NH)Leu¹&sup4;]-Bombesin (LψLB) auf murine Swiss-3T3-Zellen.
A. Dosis-Antwort-Kurven für die GRP-induzierte DNA-Synthese mit 1 µCi/ml (1 µm) [³H]-Thymidin ([³H]-Tdr) und 1 µg/ml Insulin allein (o) oder mit 500 mM ( ) oder 1 µM (U) LψLB oder 20 µM Antagonist D (Δ) . Die Werte sind als Prozentsatz des mit 10%igem fötalen Kälberserum erhaltenen [³H]-Tdr- Einbaus ausgedrückt.
B. Dosis-Antwort-Kurven für eine durch 2,4 nM ( ) und 3,6 nM ( ) GRP induzierte LψLB-Hemmung der DNA-Synthese durch 1 µg/ml Insulin und 1 µCi/ml [³H]-Tdr.
C. Konzentrationsabhängigkeit der [¹²&sup5;I]-GRP-Bindung an Swiss-3T3-Zellen bei 37ºC. Die spezifische zellassoziierte Bindung ist in Abwesenheit (o) oder Anwesenheit ( ) von 500 nM LψLB gezeigt.
D. Hemmung der spezifischen [¹²&sup5;I]-GRP-Bindung an Swiss-3T3- Zellen durch LψLB ( ), ausgedrückt als Prozentsatz der mit 1 nM [¹²&sup5;I]-GRP erhaltenen Bindung in Abwesenheit von Antagonist (o).
Einsatz: Wirkung von LψILB auf die Affinitätsmarkierung des Bombesinrezeptor-assoziierten Proteins mit einem Molekulargewicht von 75 bis 85.000.
Verfahren: Swiss-3T3-Zellen wurden in Kultur gehalten und Assays auf die DNA-Synthese wurden, wie vorstehend beschrieben 2,4,6, durchgeführt. In allen Figuren stellen die gezeigten Werte den Mittelwert von mindestens zwei Bestimmungen dar. Für [¹²&sup5;I]-GRP-Bindungsstudien wurden konfluente und ruhende Zellen zweimal mit Dulbeccos-modifiziertem Eagle-Medium gewaschen, dann bei 37ºC in 0,75 ml Bindungsmedium¹&sup0;, enthaltend die angegebene Konzentration von [¹²&sup5;I]- GRP und LψLB, inkubiert. Die zellassozuerte [¹²&sup5;I]-GRP- Bindung wurde nach 30 min gemessen. Die nichtspezifische Bindung wurde durch die Zugabe eines 500fachen Überschusses an unmarkiertem GRP gemessen. Für Vernetzungsstudien wurden konfluente und ruhende Zellen zweimal mit Bindungsmedium&sup8; gewaschen, dann bei 24ºC in 1 ml Bindungsmedium (pH 7,0), enthaltend 1 nM [¹²&sup5;I]-GRP und verschiedene Konzentrationen an LψLB, inkubiert. Nach 10 min wurden sie zweimal mit Bindungsmedium gewaschen, dann bei 24ºC in 1 ml, enthaltend 6 mM Ethylenglykol-bis(succinimidylsuccinat) bei pH 7,4, inkubiert. Nach 10 min wurden sie zweimal mit kaltem Bindungsmedium gewaschen und in 100 µl Probenpuffer&sup8; solubilisiert, dann sofort 5 min lang gekocht und auf einem 10%igen Polyacrylamidgel elektrophoretisch untersucht.
Fig. 2. Spezifität der Bombesinantagonisten.
A. DNA-Synthese mit einer Vielzahl von Mitogenen, gemessen (wie in Fig. 1) in Anwesenheit von 1 µCi/ml [³HTdr] und 1 µg/ml Insulin allein ( ) oder mit 20 µM Antagonist D oder 1 µm LψLB ( ). Die Mitogene wurden in den folgenden Konzentrationen verwendet: GRP, 3,6 nM; Bombesin (BN), 1,2 nM; Litorin (LT), 1,8 nM, Vasopressin (VP), 9,2 nM; Bradykinin (BK), 9,4 nM; PDGF, 1 nM; EGF, 0,4 nM; Phorbol-12,13-dibutyrat (PBt&sub2;), 50 ng/ml; Choleratoxin (CT), 100 ng/ml mit Isobutylmethylxanthin (IBMX), 10 µM; 8-Brom-cAMP (8Bc), 2,5 mM; Prostaglandin E&sub1; (PGE&sub1;), 100 ng/ml mit IBMX, 10 µM; Prostaglandin E&sub2; (PGE&sub2;), 200 ng/ml mit IBMX, 10 µM; VIP, 3,0 nM mit 4-(3-Butoxy-4-methoxybenzyl)-2-imidozolidin, 5 µM. Die Werte sind als Prozentsatz des [³H]-Tdr-Einbaus, erhalten mit 10%igem fötalem Kälberserum, ausgedrückt.
B. Dosis-Antwort-Kurven für die Vasopressin-induzierte DNA- Synthese mit 1 µCi/ml [³H]-Tdr und 1 µg/ml Insulin allein (o) oder mit 1 µM LψLB ( ) oder mit 20 µM Antagonist D ( ).
C. Hemmung der durch 9,4 nM Bradykinin mit 1 µCi/ml [³H]-Tdr und 1 µg/ml Insulin stimulierten DNA-Synthese durch verschiedene Konzentrationen an Antagonist D (Δ) oder Antagonist A (o).
D. Dosis-Antwort-Kurven für die Bradykinin-induzierte DNA- Synthese mit 1 µCi/ml [³H]-Tdr und 1 µg/ml Insulin allein (o) oder mit 1 µM LψLB ( ) oder mit 20 µM Antagonist D (Δ).

Fußnote 1: Liste der Abkürzungen

PBS - Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
BSA - Rinderserumalbumin
GRP - Gastrin-Releasing Peptid
EGS - Ethylenglykol-bis(succinimidylsuccinat)
DSS - Disuccinimidylsuberat
EGTA - Ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraessigsäure
Hepes - 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure
SDS-PAGE - Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
VIP - vasoaktives intestinales Peptid
PDGF - Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor
FGF - Fibroblastenwachstumsfaktor
EGF - epidermaler Wachstumsfaktor

Claims

1. Antagonist G (Arg-DTrp-MePhe-DTrp-Leu-Met-NH&sub2;) zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.

2. Verwendung von Antagonist G (Arg-DTrp-MePhe-DTrp-Leu- Met-NH&sub2;) für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder zur Diagnose von kleinzelligem Lungenkrebs.