JPH1171298A - ニューロペプチド拮抗体を含有する医薬・診断組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ニューロペプチド拮抗体の利用法を提供す
る。 【解決手段】 １）〜６）の特徴を有するポリペプチ
ド。 １）マンノース側鎖に富む一本鎖グリコポリペプチド。 ２）ボンベシル型のポリペプチドと選択的に結合。 ３）分子量７５〜８５キロダルトン。 ４）等電点６．４〜６．９。 ５）フラボバクテリウム・メニンゴセプチクムからのエ
ンド−β−Ｎ−グルコサミニダーゼを用いて得たコアタ
ンパク質の分子量約４２Ｋｄ。 ６）３〜１５ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭのＭｇ^＋＋
を含有する水性媒体中でスイス３Ｔ３細胞を破壊して得
た膜調製物を用いて、１５℃での平衡解離定数が速度論
的分析により１．９×１０^−１０Ｍ、スカッチャード分
析（平衡結合）により２．１×１０^−１０Ｍである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はニューロペプチドの
種々の受容体に対する拮抗体、特に特異的なマイトジェ
ン性ニューロペプチドリガンドの非構造類似体である拮
抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】ニューロペプチドは細胞増殖の制御にお
いてますます注目されている^１。両生類テトラデカペプ
チドボンベシンおよびその哺乳類類似体であるガストリ
ン放出性ペプチド（ＧＲＰ）はマウス繊維芽細胞の強力
なマイトジェンであり^２そして小細胞肺癌のオートクリ
ン増殖因子として作用する^３。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題および解決するための手
段】我々の国際特許出願ＷＯ８８／０７５５１号におい
て、我々はボンベシン群のある種のペプチドの受容体で
ある特定の新しいペプチドを記載している。我々はま
た、ボンベシン受容体拮抗体として特に価値あることが
判明した２種類の知られた化合物を含む、ボンベシン受
容体に対する拮抗体も記載している。これらの拮抗体は
痛感伝達の研究対象となっている、物質Ｐと呼ばれる１
１量体ニューロペプチドの類似体である。物質Ｐは以下
の式を有する。

【０００４】Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ
−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−
ＮＨ_２ 我々が拮抗体Ａと呼ぶ物質Ｐの市販の類似体は以下の式
を有する。 Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｎ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−ＮＨ_２ 我々が上記特許出願において記載している物質Ｐの別の
市販の構造変種は以下の式を有する拮抗体Ｄである。

【０００５】Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ
−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＮＨ_２ 前記特許出願において、我々は、拮抗体ＡおよびＤに関
する我々の研究がいかにして我々を拮抗体ＡおよびＤの
アミノ酸配列の５位の重要性に注目させたかを記載し、
そして、５−位でＤ−Ｔｒｐ．Ｄ−ＴｙｒまたはＭｅ−
Ｐｈｅ基を含有する拮抗体ＡおよびＤのアミノ酸５位変
種である有用な別の拮抗体について言及している。

【０００６】前記特許出願に記載される研究において、
我々は我々が記載した種々の拮抗体が受容体のリガンド
結合部位に結合することにより拮抗体として作用し、そ
してそのように作用することによりこれら化合物がニュ
ーロペプチド／受容体相互作用の影響下に起こる細胞増
殖に影響を与えうる点で医学上価値があることを示唆し
た。

【０００７】更に研究を進めることにより、我々が前記
出願に記載した種々の拮抗体はたしかに受容体に結合す
るため、上記した理由により医学的な利点を有するが、
その結合はリガンド結合部位ではなく、受容体の異なる
結合部位であるという結論に達した。我々の拮抗体は前
記出願に記載した種類のボンベシン受容体と結合するの
みならず、ボンベシン受容体と同様にイノシトールシグ
ナル経路を用いる他のニューロペプチド受容体とも結合
するであろうことを示す別の研究からこの結論に達した
のである。かかる受容体には少なくとも更に２種、即ち
ブラジキニン受容体およびバソプレッシン受容体があ
り、そして拮抗体ＡおよびＤはこれらの受容体と結合可
能であることが判明した。拮抗体ＡおよびＤのこの特別
の性質は、ボンベシンそのものの性質とは完全に対照的
であり、ボンベシンは、その定義によれば、ボンベシン
受容体には結合するがバソプレッシンやブラジキニン受
容体には結合しないであろう。このことは、ボンベシン
受容体上の拮抗体ＡおよびＤの結合部位は、リガンド結
合部位ではなく、実際は、恐らくイノシトールシグナル
経路を用いる別の受容体においても見出されるはずの別
の保存ドメインであることを示している。

【０００８】従って我々の最も最近の知見により、拮抗
体ＡおよびＤのみならず拮抗体Ｇのようなその類似体も
また、これらがボンベジン様ペプチドの影響下に起こる
細胞増殖のみならずはるかに広範囲のマイトジェン性ニ
ューロペプチドの影響下に起こる細胞増殖にも影響を与
えることができる点において、これらの医学上の重要性
が高められた。

【０００９】従って、本発明はイノシトールシグナル経
路を用いる受容体に通常結合するニューロペプチドによ
り影響されるヒトまたは動物の体細胞増殖に影響を与え
る方法に使用するため、そして特に小細胞肺癌の治療法
において使用するための拮抗体Ｇを提供するものであ
る。拮抗体Ｇは以下の式を有する。

【００１０】Ａｒｇ．Ｄ−Ｔｒｐ．ＭｅＰｈｅ．Ｄ−Ｔ
ｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ_２．本発明はまた、以下の
特徴を有するポリペプチドにも関する、すなわち （１）マンノース側鎖に富む一本鎖グリコポリペプチド
である。 （２）ボンベシン型のポリペプチドと選択的に結合す
る。 （３）分子量７５〜８５キロダルトン（Ｋｄ）を有す
る。 （４）等電点６．４〜６．９を有する。 （５）フラボバクテリウム・メニンゴセプチクム（Ｆｌ
ａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉ
ｃｕｍ）からのエンド−β−Ｎ−グルコサミニダーゼを
用いて得られたそのコアタンパク質が約４２Ｋｄの分子
量を有する。 （６）１５℃の平衡解離定数Ｋｄが、速度論的分析によ
れば１．９×１０^−１０Ｍであり、スカッチャード分析
によれば２．１×１０^−１０Ｍである。

【００１１】前記した我々の特許出願において、我々は
ボンベシン受容体分子の無傷のスイス（Ｓｗｉｓｓ）３
Ｔ３細胞からの単離を記載している。受容体は３Ｔ３細
胞のホモジネートから単離される。今回我々は、細胞破
壊の間にＭｇ^＋＋イオンが存在することが、膜調製物か
らボンベシンの哺乳類同族体である少なくともガストリ
ン放出性であるペプチド（ＧＲＰ）への結合活性を有す
る受容体を単離するのに重要であることを発見した。３
Ｔ３細胞破壊の間の水性媒体中のＭｇ^＋＋のモル濃度は
３〜１５ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭでなければなら
ない。Ｍｇ^＋＋の存在下に３Ｔ３細胞から得られた受容
体へのＧＲＰの結合は可逆的である。

【００１２】本発明はまた、本発明のニューロペプチド
受容体の推定保存ドメインに対する抗体、特にモノクロ
ーナル抗体をも包含する。かかる抗体は、宿主動物に免
疫原を注射し、このものから、抗体含有血清を回収する
か、または不死化できてモノクローナル抗体産生性細胞
を生じうる抗体産生細胞を回収することにより取得でき
る。免疫原は本発明の保存ドメインポリペプチド、そし
て特にＭｇ^＋＋の存在下にホモジナイズされたスイス３
Ｔ３細胞の膜調製物から得られた保存ドメインポリペプ
チドであることができる。本発明の抗体はイノシトール
シグナル経路を使用するニューロペプチドの障害に関わ
る癌または他の疾患の診断または治療に有用である。診
断剤として使用する場合には、抗体は検知可能な標識、
例えば放射性物質、酵素、蛍光物質等を担持でき、そし
て／または固形支持体上に固定化することもできる。診
断試験キットは、１成分として、本発明の精製された保
存ドメインまたは抗体を包含しうる。治療剤として使用
する場合は、本発明の抗体は細胞毒性物質とのコンジュ
ゲートにすることができる。

【００１３】更に拮抗体Ｇは小細胞肺癌の増殖の遅延ま
たは消滅において重要であり、そして、標識された場合
は、小細胞肺癌のインビトロまたはインビボ診断に重要
である。かかる標識化は拮抗体分子に直接行なってもよ
く、また、拮抗体に結合する分子を介して間接的に行な
ってもよい。本発明の保存ドメインまたは抗体は、イノ
シトールシグナル経路を用いるニューロペプチドの障害
に関連する癌やその他の疾患の診断または治療に重要で
ある場所に、標識または細胞毒成分に結合させて非経口
で投与できるように、慣用の非経口担体を用いて製剤化
できる。

【００１４】本発明の範囲には、イノシトールシグナル
経路を用いて受容体に通常結合するニューロペプチドに
より影響を受ける細胞増殖に影響を与えるための医薬の
製造に使用するための拮抗体Ｇ、そして特に小細胞肺癌
の治療または診断のための医薬の製造に使用するための
拮抗体Ｇが包含される。この目的のためには、拮抗体Ｇ
はかかる治療または診断を必要とする宿主に非経口的に
有効量で投与できる。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下の実施例は本発明を説明する
ために示す。

【００１６】

【実施例】

実施例１ スイス３Ｔ３細胞は実験用に広く入手可能であり、また
受託番号ＡＴＣＣ−ＣＣＬ９２の下に、Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，米国）から
入手可能である。

【００１７】シュードペプチド［Ｌｅｕ^１３−ψ（ＣＨ
_２ＮＨ）Ｌｅｕ^１４］ボンベシンは、ボンベシン類似体
におけるペプチド主幹鎖改変の系統的研究の間に合成し
た^５。このものは、３５ｍＭでモルモット膵臓腺房から
のボンベシン−刺激アミラーゼ放出を５０％阻害（ＩＣ
_５０）することが示された。ここでスイス３Ｔ３細胞に
おける作用様式の特性を調べた。インシュリン１μｇ／
ｍｌの存在下、ＧＲＰの濃度を変化させながら静止期の
細胞への［^３Ｈ］チミジンのとり込みにより測定したＤ
ＮＡ合成は^６、［Ｌｅｕ^１３−ψ（ＣＨ_２ＮＨ）Ｌｅｕ
^１４］ボンベシンにより強力に阻害され、そしてその作
用は１μＭで、［ＤＡｒｇ^１，Ｄｐｈｅ^５，ＤＴｒｐ
^７，９，Ｌｅｕ^１１］物質Ｐ、即ち物質Ｄの２０μＭに
等しかった（第１Ａ図）。［Ｌｅｕ^１３−ψ（ＣＨ_２Ｎ
Ｈ）Ｌｅｕ^１４］ボンベシンのＩＣ_５０は３．６ｎＭＧ
ＲＰの存在下で４５５ｎＭであった。さらに［Ｌｅｕ
^１３−ψ（ＣＨ_２ＮＨ）Ｌｅｕ^１４］ボンベシンはＧＲ
Ｐにより惹起された最も初期の細胞事象、例えばＣａ
^２＋流動化（５秒）および表皮成長因子（ＥＧＦ）受容
体トランスモジュレーション（１分）をブロックした
が、これはプロテインキナーゼＣ活性化に依存してい
る。［Ｌｅｕ^１３−ψ（ＣＨ_２ＮＨ）Ｌｅｕ^１４］ボン
ベシンは細胞への［^１２５Ｉ］ＧＲＰの特異的結合を阻
害し（第１Ｃ図およびＤ図）、そして、受容体のＭｒ７
５，０００〜８５，０００糖タンパク成分への［^１２５
Ｉ］ＧＲＰの交叉結合をブロックした（第１Ｄ図、はめ
込み）^８，９。即ち［Ｌｅｕ^１３−ψ（ＣＨ_２ＮＨ）−
Ｌｅｕ^１４］ボンベシンは受容体レベルで作用する、ス
イス３Ｔ３細胞における強力なボンベシン拮抗体であ
る。

【００１８】タチキニン（ｔａｃｈｙｋｉｎｉｎ）物質
Ｐはボンベシンとは最小限のアミノ酸配列相同性しか有
さず、そして［^１２５Ｉ］ＧＲＰの結合を阻害せず、ま
たスイス３Ｔ３細胞におけるＤＮＡ合成も刺激しない
^２，１０。前記した我々の特許出願および参考文献１
０，１１には、拮抗体Ａがどのようにしてボンベシン拮
抗体であり得るか、および拮抗体Ｄが拮抗体Ａより５〜
１０倍強力であることが記載されている。両方ともスイ
ス３Ｔ３細胞におけるバソプレッシン−刺激ＤＮＡ合成
および［^３Ｈ］バソプレッシン結合を阻害する
^{４，１２，１３}。このため、我々は新しいボンベシン拮
抗体を検査して、異なるシグナル変換経路を介して作用
するマイトジェンに対するその特異性を大ざっぱに確立
した（第２Ａ図）。予測した通り、拮抗体Ｄおよび［Ｌ
ｅｕ^１３−ψ（ＣＨ_２ＮＨ）Ｌｅｕ^１４］ボンベシンは
ともに種々のボンベシン様ペプチドに対して有効であっ
た。これらのいずれも、ポリペプチド増殖因子ＥＧＦお
よび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、プロテインキナ
ーゼＣ活性化剤ホルボールジブチレートまたはｃＡＭＰ
上昇剤コレラトキシンおよび８−ブロモ−ｃＡＭＰによ
り誘発された有糸分裂誘発を阻害しなかった。拮抗体Ｄ
はバソプレッシン誘導ＤＮＡ合成の強力な阻害剤である
が、［Ｌｅｕ^１３−ψ（ＣＨ_２ＮＨ）Ｌｅｕ^１４］ボン
ベシンはＧＲＰ誘導有糸分裂誘発を強力に阻害する濃度
で何の作用も示さなかった（第２Ｂ図）。特異性のこの
劇的な差のため、我々は他のマイトジェンニューロペプ
チドに及ぼす拮抗体Ｄおよび［Ｌｅｕ^１３−ψ（ＣＨ_２
ＮＨ）Ｌｅｕ^１４］ボンベシンの作用を比較した。

【００１９】ブラジキニンは、ボンベシンおよびバソプ
レッシンと同様、いくつかの細胞系において、カルシウ
ムの流動化およびリン酸イノシトールの回転を刺激する
^{１４〜１７}。我々は、蛍光性Ｃａ^２＋指示物質Ｆｕｒａ
−２を負荷されたスイス３Ｔ３細胞において、ブラジキ
ニンの添加が、ボンベシンおよびバソプレッシンで観察
される速度論的特徴と同様であるがＰＤＧＦの場合とは
異なる速度でシトソルＣａ^２＋濃度の急速な一過性の上
昇をもたらすことを見出した^１８。ブラジキニンは［^３
Ｈ］バソプレッシンおよび［^１２５Ｉ］ＧＲＰのスイス
３Ｔ３細胞への結合をいずれも阻害せず、このことはそ
れらの受容体が異なることを示している。インシュリン
の存在下では、ブラジキニンはヒト繊維芽細胞における
マイトジェン作用が弱いこと^{１９，２０}とは対照的に、
これらの細胞でＤＮＡ合成を最大に刺激した（第２Ｃ図
およびＤ図）。即ち、ブラジキニンは新しい拮抗体を試
験するための新規マイトジェンを提供する。９．４ｎＭ
のブラジキニンにより誘導された有糸分裂誘発はそれぞ
れＩＣ_５０９０μＭおよび８．３μＭで拮抗体Ａおよび
Ｄにより阻害され（第２Ｃ図およびＤ図）、これらはＧ
ＲＰ^４およびバソプレッシンで得られる相対的効力と同
じである（データは示さず）。明らかに［Ｌｅｕ^１３−
ψ（ＣＨ_２ＮＨ）Ｌｅｕ^１４］ボンベシンはブラジキニ
ン−刺激ＤＮＡ合成に何ら作用しなかった（第２Ｃ
図）。ボンベシン、ブラジキニンおよびバソプレッシン
はリン酸イノシトールシグナル経路を活性化するが、血
管活性腸内ペプチド（ＶＩＰ）はｃＡＭＰを介してＤＮ
Ａ合成を刺激するニューロペプチドである^２１。拮抗体
Ｄも［Ｌｅｕ^１３−ψ（ＣＨ_２ＮＨ）Ｌｅｕ^１４］ボン
ベシンもＶＩＰにより刺激される有糸分裂誘発を阻害し
なかった（第２Ａ図）。

【００２０】ここに示される［Ｌｅｕ^１３−ψ（ＣＨ_２
ＮＨ）Ｌｅｕ^１４］ボンベシンと物質Ｐ拮抗体との間の
特異性の顕著な差は重要な意味を有する。物質Ｐ拮抗体
は３種の異なる受容体、ボンベシン／ＧＲＰ、ブラジキ
ニンおよびバソプレッシンを介して惹起されるマイトジ
ェン応答をブロックする。これらは、ｃＡＭＰおよびプ
ロテインキナーゼＣ活性化を含む異なるトランスメンブ
レンシグナル経路を介して作用する他のマイトジェンに
より惹起される応答はブロックしない。拮抗体ＤをＡと
区別している２つのアミノ酸置換により、各マイトジェ
ンに対する効力が一貫して５〜１０倍増大し、このこと
はこれらの拮抗体がこれらの異なる受容体における共通
の部位を認識することを示唆している。ボンベシン、ブ
ラジキニン、バソプレッシンおよび物質Ｐ拮抗体は構造
的に関連が無いため、この推定結合物位はリガンド認識
部位ではあり得ない。即ち、拮抗体Ｄおよび拮抗体Ａは
受容体の各々上の保存ドメインを認識すると考えられ
る。これらの受容体の共通の機能はポリリン酸イノシト
ールの形成およびＣａ^２＋流動化の誘導であるため、物
質Ｐ拮抗体はＣａ^２＋シグナル化に関与するＧタンパク
質との結合に不可欠な各受容体上の領域と結合できると
考えられる^２２。我々の理論に必要な点は、これらのマ
イトジンの１つに構造的に関連のある拮抗体が個々のリ
ガンド認識部位に結合して生物学的作用の特異的阻害を
惹起するが他のマイトジェンニューロペプチドのそれに
は結合すべきでないことである。我々の結果によれば、
シュードペプチド拮抗体［Ｌｅｕ^１３−ψ（ＣＨ_２Ｎ
Ｈ）Ｌｅｕ^１４］ボンベシンはこの基準を満足してい
る。 実施例２ 小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞系の増殖をインビトロで阻
害する能力に関し、拮抗体Ａ，ＤおよびＧについて調べ
た。使用した細胞系は以下の通りである。 ａ）米国メリーランド州ＡＴＣＣからのＨ６９およびＨ
１２８； ｂ）米国メリーランド州ＮＩＨ，ＮＣＩのＤｒ．Ａ．Ｇ
ａｚｄａｒからのＨ２０９，Ｈ３４５およびＨ５１０
Ａ； ｃ）英国ロンドンＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇ
ｅの Ｄｒ．Ｐ．ＢｅｖｅｒｌｅｙからのＵＣＨ２５。

【００２１】拮抗体Ａは、試験によれば、使用細胞５系
統：Ｈ６９，Ｈ８２，Ｈ１２８，Ｈ４１７およびＵＣＨ
２５全てにおいて５０〜１５０ μＭの濃度でＳＣＬＣ
の増殖を阻害するのに有効であることが判明した。拮抗
体Ｄは、第３および４図に示すとおり、ＳＣＬＣの増殖
阻害において拮抗体Ａよりも一貫して５〜１０倍強力で
あることが解った。拮抗体Ｄは４０〜５０μＭで細胞増
殖を停止させそして使用細胞６系統：Ｈ６９，Ｈ１２
８，Ｈ２０９，Ｈ３４５，Ｈ５１０ＡおよびＵＣＨ２５
の全てに対して活性である。

【００２２】拮抗体Ｇはスイス３Ｔ３細胞においてバソ
プレッシン−誘導細胞増殖の拮抗体として拮抗体Ｄと同
程度に効力があるが、ブラジキニンまたはＧＲＰにより
誘導された増殖の拮抗体としては効力が劣ることが判明
した。ＳＣＬＣ細胞においては、拮抗体Ｇは、第５図に
示すとおり増殖阻害の面では拮抗体Ｄと等しい効力を有
する。この活性は使用細胞４系統：Ｈ６９，Ｈ２０９，
Ｈ３４５およびＨ５１０Ａの全てにおいて示されてい
る。

【００２３】カルシウム流動化試験において、ブラジキ
ニン、ＧＲＰおよびバソプレッシンへの応答として、い
くつかのＳＣＬＣ細胞系で細胞内［Ｃａ^２＋］の一過性
の上昇が示されている。これらの応答は使用した細胞３
系統（Ｈ６９，Ｈ３４５，Ｈ５１０Ａ）の全てにおいて
２０μＭの拮抗体Ｄにより、そして、Ｈ５１０Ａにおい
て２０μＭの拮抗体Ｇによりブロックできる。 参考文献

【００２４】

【００２５】

【００２６】図面の説明 第１図：マウススイス３Ｔ３細胞における［Ｌｅｕ^１３
−ψ（ＣＨ_２ＮＨ）Ｌｅｕ^１４］ボンベシン（ＬψＬ
Ｂ）の作用。 Ａ．ＧＲＰ誘導ＤＮＡ合成の用量応答曲線、１μＣｉ／
ｍｌ（１μＭ）［^３Ｈ］チミジン（［^３Ｈ］Ｔｄｒ）お
よび１μｇ／ｍｌインシュリンのみ（○）、または５０
０ｍＭ（□）または１μＭ（▲黒四角▼）のＬ（ψ）Ｌ
Ｂ添加、または２０μＭ拮抗体Ｄ添加（△）。数値は１
０％ウシ胎児血清を用いて得られた［^３Ｈ］Ｔｄｒ取り
込みのパーセントとして表示。 Ｂ．２．４ｎＭ（□）および３．６ｎＭ（▲黒四角▼）
のＧＲＰにより誘導されたＤＮＡ合成のＬψＬＢ阻害の
用量応答曲線、１μｇ／ｍｌインシュリン＋１μＣｉ／
ｍｌ［^３Ｈ］Ｔｄｒ添加。 Ｃ．３７℃におけるスイス３Ｔ３細胞への［^１２５Ｉ］
ＧＲＰ結合の濃度依存性。特異的細胞会合結合は５００
ｎＭ ＬψＬＢ非存在下（○）または存在下（●）で示
した。 Ｄ．拮抗体非存在下（○）の１ｎＭ［^１２５Ｉ］ＧＲＰ
を用いて得られた結合のパーセントとして表わしたＬψ
ＬＢによるスイス３Ｔ３細胞への特異的［^１２５Ｉ］Ｇ
ＲＰ結合の阻害（▲黒四角▼）。Ｍｒ７５〜８５０００
ボンベシン受容体に会合したタンパク質のアフィニティ
標識に及ぼすＬψＬＢの作用。 方法：スイス３Ｔ３細胞を培地中に維持しそしてＤＮＡ
合成のアッセイを前に記載されるとおり行なった
^{２，４，６}。全ての図において、値は少なくとも２回の
測定の平均値で示した。［^１２５Ｉ］ＧＲＰ結合試験に
は、集密および静止期の細胞をダルベッコ改変イーグル
培地で２回洗浄し、次に記載の濃度の［^１２５Ｉ］ＧＲ
ＰおよびＬψＬＢを含有する結合培地^１００．７５ｍｌ
中３７℃でインキュベートした。細胞会合［^１２５Ｉ］
ＧＲＰ結合を３０分後に測定した。非特異的結合は未標
識ＧＲＰの５００倍過剰の添加により測定した。交叉結
合試験には集密および静止期の細胞を結合培地^８で２回
洗浄し、次に１ｎＭ［^１２５Ｉ］ＧＲＰおよび種々の濃
度のＬψＬＢを含有する結合培地（ｐＨ７．０）１ｍｌ
中２４℃でインキュベートした。１０分後、これを結合
培地で２回洗浄し、次に６ｍＭエチレングリコールビス
（スクシンイミジルスクシネート）を含有する培地１ｍ
ｌ中、ｐＨ７．４および２４℃でインキュベートした。
１０分後冷結合培地で２回洗浄し、試料緩衝液^８１００
μｌ中で可溶化し、直ちに５分間煮沸しそして１０％ポ
リアクリルアミドゲル上の電気泳動に付した。 第２図：ボンベシン拮抗体の特異性 Ａ．種々のマイトジェンを用いた場合のＤＮＡ合成の測
定（第１図参照）、１μＣｉ／ｍｌ［^３ＨＴｄｒ］およ
び１μｇ／ｍｌインシュリンのみの存在下（▲黒四角
▼）、２０μＭ拮抗体Ｄ添加または１μｍ ＬψＬＢ添
加（□）。マイトジェンは以下の濃度で用いた。ＧＲ
Ｐ，３．６ｎＭ；ボンベシン（ＢＮ），１．２ｎＭ；リ
トリン（ＬＴ），１．８ｎＭ，バソプレッシン（Ｖ
Ｐ），９．２ｎＭ；ブラジキニン（ＢＫ），９．４ｎ
Ｍ；ＰＤＧＦ，１ｎＭ；ＥＧＦ，０．４ｎＭ；ホルボー
ル１２，１３−ジブチレート （ＰＢｔ_２），５０ｎｇ
／ｍｌ；コレラトキシン（ＣＴ），１００ｎｇ／ｍｌ＋
イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ），１０μＭ；
８−ブロモ−ｃＡＭＰ（８Ｂｃ），２．５ｍＭ；プロス
タグランジンＥ_１（ＰＧＥ_１），１００ｎｇ／ｍｌ＋Ｉ
ＢＭＸ，１０μＭ；プロスタグランジンＥ_２（ＰＧ
Ｅ_２），２００ｎｇ／ｍｌ＋ＩＢＭＸ，１０μＭ；ＶＩ
Ｐ，３．０ｎＭ＋４−（３−ブトキシ−４−メトキシベ
ンジル）−２−イミドゾリジン，５μＭ。値は１０％ウ
シ胎児血清を用いて得た［^３Ｈ］Ｔｄｒ取り込みのパー
セントとして表示した。 Ｂ．バソプレッシン誘導ＤＮＡ合成の用量応答曲線、１
μＣｉ／ｍｌ［^３Ｈ］Ｔｄｒおよび１μｇ／ｍｌインシ
ュリンのみ（○）、１μＭ ＬψＬＢ添加（▲黒四角
▼）、２０μＭ拮抗体Ｄ添加（□）。 Ｃ．９．４ｎＭブラジキニン＋１μＣｉ／ｍｌ［^３Ｈ］
Ｔｄｒ＋１μｇ／ｍｌインシュリンにより刺激されたＤ
ＮＡ合成の、種々の濃度の拮抗体Ｄ（△）または拮抗体
Ａ（○）による阻害。 Ｄ．ブラジキニン誘導ＤＮＡ合成の用量応答曲線、１μ
Ｃｉ／ｍｌ［^３Ｈ］Ｔｄｒおよび１μｇ／ｍｌインシュ
リンのみ（○）、１μＭ ＬψＬＢ添加（▲黒四角
▼）、２０μＭ拮抗体Ｄ添加（△）。 実施例３ 本実験の目的はスイス３Ｔ３細胞由来の膜調製物への
^１２５Ｉ−ＧＲＰの結合を調べ、それにより受容体内在
化およびリガンド分解の非存在下における結合反応の速
度論的特性および平衡特性を判定することである。これ
らの実験の過程において、細胞ホモジナイズ化および結
合アッセイ期間中のＭｇ^２＋の存在が、得られる膜調製
物における^１２５Ｉ−ＧＲＰ結合活性の温存にとって決
定的に重要であることが判明した。これらの観察結果か
ら、ここでは^１２５Ｉ−ＧＲＰの結合が特異的、急速、
可逆的、飽和可能、そして濃度依存的様式で種々の非放
射性アゴニストおよび拮抗体で置き換えられることを示
す。さらに我々は、ホモ２官能性交叉結合剤ＥＧＳは、
Ｍｇ^２＋存在下に調製されたスイス３Ｔ３膜中の単一Ｍ
ｒ７５，０００〜８５，０００タンパク質に^１２５Ｉ−
ＧＲＰを共有結合させたことも報告する。この所見は、
このタンパク質が受容体であるか、またはマイトジェン
ボンベシン受容体の結合サブユニットであることを示し
ている。 実験方法 材料：ボンベシン，ＧＲＰ，リトリン，バソプレッシ
ン，ブラジキニン，ソマトスタチン，物質Ｋ，物質Ｐ，
血管活性腸内ペプチド（ＶＩＰ），表皮成長因子（ＥＧ
Ｆ），インシュリン，ホルボール１２，１３ジブチレー
ト（ＰＢｔ_２），ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），アプ
ロトニン，バシトラシン，大豆トリプシンインヒビタ
ー，フェニルメチルスルホニルフロリドおよびポリエチ
レンイミンをＳｉｇｍａから購入した。ＧＲＰ（１−１
６），ボンベシン（８−１４），ニューロメジンＢ［Ｄ
Ａｒｇ^１，ＤＰｒｏ^２，ＤＴｒｐ^７，９，Ｌｅｕ^１１］
物質Ｐおよび［ＤＡｒｇ^１，ＤＰｈｅ^５，ＤＴｒｐ
^７，９，Ｌｅｕ^１１］物質ＰはＢａｃｈｅｍ Ｆｉｎｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手した。エチレングリコー
ルビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ），
およびスベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）はＰｉ
ｅｒｃｅから入手した。組換え血小板由来増殖因子ｃ−
ｓｉｓ（ＰＤＧＦ），組換え繊維芽細胞増殖因子（ＦＧ
Ｆ）および^１２５Ｉ−ＧＲＰ（１８００〜２２００Ｃｉ
／ｍｍｏｌ）はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌから購入した。他の全ての試薬は入手可能な最
高等級のものを用いた。 細胞培養：スイス３Ｔ３細胞（３４）の培養物を、１０
％ウシ胎児血清、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌおよびスト
レプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するダルベ
ッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、９０ｍｍのＮｕ
ｎｃペトリ皿内で、１０％ＣＯ_２＋９０％空気の湿潤雰
囲気下で３７℃で維持した。膜調製物には、３×１０^６
個の細胞を同じ培地２００ｍｌの入った１８５０ｃｍ^２
Ｆａｌｃｏｎローラボトル内に植え継ぎ、これを培地を
交換せずに６〜７日間集密となるまで増殖させた。最終
細胞濃度は３×１０^７個／フラスコであった。 膜調製物：ローラボトル内の培養物を室温で、リン酸緩
衝食塩水（ＰＢＳ）（０．１４Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ
ＫＣｌ，０．０１Ｍ Ｎａ_２ＰＯ_４，１．８ｍＭＫＨ_２
ＰＯ_４； ｐＨ７．２）１５０ｍｌで２回洗浄した。次
に、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１ｍＭ［エチレンビス（オキ
シエチレンニトリロ）］テトラ酢酸（ＥＧＴＡ），１ｍ
ｇ／ｍｌバシトラシン，１０μｇ／ｍｌアプロトニン，
１ｍｇ／ｍｌ大豆トリプシンインヒビターおよび５０ｍ
Ｍフェニルメチルスルホニルフロリドを含有する氷冷Ｐ
ＢＳ中に掻き込むことにより、４℃で細胞を回収した。
以後の工程は全て４℃で行なった。細胞を７５０×ｇで
１０分間遠心分離することによりペレット化しそして５
０ｍＭ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン
エタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ），５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ_２，１ｍＭ ＥＧＴＡ，１ｍＭ／ｍｌバシトラシン，
１０μｇ／ｍｌアプロトニン，１ｍｇ／ｍｌ大豆トリプ
シンインヒビターおよび５０μＭフェニルメチルスルホ
ニルフロリドを含有し、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整し
た４℃の溶液Ａ中に５×１０^６／ｍｌに再懸濁した。次
に細胞をＤｏｕｎｃｅホモジナイザー（乳棒）７５スト
ロークを用いて破壊した。このホモジネートを５００×
ｇで１０分間遠心分離し、核物質と未破壊の細胞を除去
しそして上清を再び３００００×ｇで３０分間遠心分離
した。膜富化調製物である得られたペレットを溶液Ａ中
５〜１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で再懸濁しそして
液体窒素中に保存した。実験に際しては、膜を解凍しそ
して溶液Ａで１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。 受容体結合アッセイ：結合アッセイは特段の記載が無い
限り、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，５ｍＭＭｇＣｌ_２，１ｍ
ｇ／ｍｌバシトラシンおよび１％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）を含有し、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した
結合培地総容量１００μｌ中で行なった。アッセイに
は、膜タンパク質２５μｇ，^１２５Ｉ−ＧＲＰ（０．５
ｎＭ）８５，０００〜１２５，０００ｃｐｍ、および個
々の実験で特定する試薬類を用いた。非特異的（非飽和
性）結合は、ボンベシンまたはＧＲＰの１μＭの存在下
で測定し、総結合の５〜１０％であった。総結合から非
特異的結合を差し引いて特異的結合を得た。膜は指示に
従い３７℃で１０分間、または１５℃で３０分間インキ
ュベートした。これらの条件により平衡結合が得られ
た。

【００２７】結合反応は、特定された時間にＧＦ／Ｂガ
ラス繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎｎ，孔系１．０μ
ｍ）上で急速に濾過することにより停止させた。各フィ
ルターは、ミリポア濾過装置を用い、４℃で（計１５
分）１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ ５ｍｌで５回洗浄した。膜
の添加に先立ち、フィルターを５％ポリエチレンイミン
中に４℃で２４時間浸漬しそして使用直前に１％ＢＳＡ
含有ＰＢＳ ５ｍｌで洗浄した。ＭＳＥ微量遠沈器中１
４０００ｒｐｍで４℃、１分間遠心分離し、次に１．０
％ＢＳＡ含有ＰＢＳ １．０ｍｌで３回洗浄することに
よりアッセイを終了した場合にも同じ結果が得られた。
放射能をＢｅｃｋｍａｎｎγ−カウンターで測定した。
未破壊３Ｔ３細胞で測定した総部位のパーセントとして
表わした膜調製物中の測定可能な結合部位の回収率は約
５０％であった。特異的結合活性は、未破壊の細胞中に
おける２０４±３０ｆモル／ｍｇタンパク質から膜調製
物中における５６４±５０ｆモル／ｍｇタンパク質まで
増大した。 速度論的検討：^１２５Ｉ−ＧＲＰの結合の速度論的分析
は２分子反応として行なった。

【００２８】

【数１】

【００２９】会合の２次速度定数は以下の式を用いて得
た（Ｋ_２）（参考文献３５参照）。

【００３０】

【数２】

【００３１】ｌｎ［（Ｂｅｑ−Ｂｔ）／（ＢｏＬｏ−Ｂ
ｅｑＢｔ）］を時間の凾数としてプロットすると、ｋ_１
は、次の関係式： ｋ_１＝傾斜×［Ｂｅｑ／（Ｂｅｑ^２−ＢｏＬｏ）］（３
６）［式中ＢｏおよびＬｏはそれぞれ受容体およびリガ
ンドの当初濃度である］により、その傾斜から測定でき
る。Ｂｔは時間ｔにおける受容体−リガンド複合体の濃
度であり、Ｂｅｑは平衡時のその濃度である。式（１）
は結合反応中に起こる遊離リガンド濃度の低下を考慮し
たものである。

【００３２】解離の一次速度定数は時間の凾数としてｌ
ｎ（Ｂｔ／Ｂｅｑ）をプロットすることにより得られる
線の傾斜から測定された。 受容体への^１２５Ｉ−ＧＲＰの化学的交叉結合：前記し
たようにしてスイス３Ｔ３細胞から調製された膜タンパ
ク質（１５０μｇ）を０．５ｎＭ^１２５Ｉ−ＧＲＰおよ
び「結果」で特定する他の試薬を含有する交叉結合培地
（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，５ｍＭＭｇＣｌ_２，１ｍｇ／
ｍｌバシトラシン，ｐＨ７．４）５００μｌ中３０℃で
１０分間、または１５℃で３０分間でインキュベートし
た。交叉結合実験で用いた全ての溶液はＢＳＡを加えな
いものとした。インキュベーション終了時、室温でＭＳ
Ｅ微量遠沈器中、１分間１４０００ｒｐｍで膜を遠心分
離した。次に４ｍＭ交叉結合試薬（ＥＧＳ）を含有する
交叉結合培地にペレットを再懸濁し、３７℃で５分間、
または１５℃で１５分間インキュベートした。１分間遠
心分離し、交叉結合培地で１回洗浄しそして遠心分離す
ることにより反応を終了させた。試料を試料緩衝液
（０．２Ｍ トリス塩酸ｐＨ６．８，１０％（ｗ／ｖ）
グリセロール，６％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
（ｗ／ｖ），４％β−メルカプトエタノール（ｖ／
ｖ），および２ｍＭ ＥＤＴＡ）（×２）０．２０ｍｌ
中に可溶化し、直ちに１００℃で１０分間加熱しそして
１次元電気泳動により分析した。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動：分離ゲル中
８％アクリルアミド試料添加ゲル中４％アクリルアミド
および０．１％ＳＤＳを用いて、スラブゲル電気泳動を
行なった（３７）。電気泳動後、ゲルを染色し、脱色
し、紙上に移し取って乾燥させ、これをＦｕＪｉ Ｘ線
フィルムを用いるオートラジオグラフィーに付した。乾
燥したゲルを２〜４日間−７０℃で曝露させた。オート
ラジオグラムはＬＫＢウルトラスキャンＸＬ濃度計を用
いて走査しそしてＭｒ ７５，０００〜８５，０００バ
ンドに取り込まれた放射能をウルトラスキャンＸＬ内部
デジタル積分器で定量した。 結 果^１２５ Ｉ−ＧＲＰはスイス３Ｔ３細胞の膜フラクション
に特異的に結合する：Ｍｇ^２＋の必要性 初期の実験によれば、種々の方法（３８−４３）により
調製されたスイス３Ｔ３細胞の膜フラクションは^１２５
Ｉ−ＧＲＰの特異的結合を一貫して示すことができなか
った。しかしながら我々は、細胞の回収およびホモジナ
イズの間および結合アッセイの間にＭｇ^２＋を添加する
ことにより、膜への^１２５Ｉ−ＧＲＰの特異的結合を顕
著に増大させることができることを見出した（第６Ａ
図）。ＭｎＣｌ_２は２．５ｍＭで僅かに部分的にＭｇＣ
ｌ_２（最大結合の３０％）と置き換わったが、ＣａＣｌ
_２は何の作用を示さなかった。ＭｇＳＯ_４はＭｇＣｌ_２
と同程度に有効であった。２つの異なる方法、即ち濾過
および遠心分離によるアッセイにより膜結合部位をアッ
セイした際にも同様の結果が得られた。第６Ｂ図は濾過
アッセイを用いた膜濃度の凾数としての^１２５Ｉ−ＧＲ
Ｐの特異的結合を示すものである。５ｍＭＭｇ^２＋の存
在下で膜の調製およびアッセイを行なった場合には、結
合は５０μｇタンパク質まで直線的に増大した。

【００３３】^１２５Ｉ−ＧＲＰ特異的結合のＭｇ^２＋濃
度に対する依存性を第６図に示す。最大結合は、細胞ホ
モジナイズおよび結合アッセイの両方の段階においてＭ
ｇ^２＋が５ｍＭの濃度で存在する場合に得られた（第６
Ｂ図）。膜を種々のＭｇ^２＋濃度の存在下で調製したが
アッセイは５ｍＭ Ｍｇ^２＋で行なった場合にも同様の
用量応答関係が観察された（第６Ｂ図はめ込み）。これ
と対照的にＭｇ^２＋を種々の濃度で、このイオンの非存
在下に調製された膜を用いた結合培地に添加したとこ
ろ、最大特異的結合の僅か２５％までしか^１２５Ｉ−Ｇ
ＲＰの特異的結合を増大させなかった（第６Ｂ図はめ込
み）。結合を保存するためにＭｇ^２＋が必要な段階を確
認するために、このイオンを膜調製の種々の段階で添加
した。細胞ホモジナイズの直後またはその後のいずれの
段階で５ｍＭ Ｍｇ^２＋を添加しても膜への^１２５Ｉ−
ＧＲＰの最大結合を温存できなかった。このことは、Ｍ
ｇ^２＋がホモジナイズ段階の結合活性を安定化するのに
必要であることを示している。

【００３４】５ｍＭのＭｇ^２＋の存在下に調製されたス
イス３Ｔ３細胞の膜フラクションへの^１２５Ｉ−ＧＲＰ
（０．５ｎＭ）の特異的結合はボンベシンおよびＧＲＰ
に構造的に関連の無い培養繊維芽細胞に対する他のマイ
トジエンによっては阻害されなかった（第１表）。ニュ
ーロペプチド物質Ｐ、物質Ｋおよび血管作用性腸内ペプ
チドは、ＣＯＯＨ−末端においてＧＲＰと僅かな相同性
を有するが、これらもまた膜調製物への^１２５Ｉ−ＧＲ
Ｐの結合を阻害できなかった。これと対照的に、結合は
未標識ボンベシンまたはＧＲＰを１００ｍＭで添加する
ことにより顕著に低下した。これらの結果は、スイス３
Ｔ３細胞の膜調製物への^１２５Ｉ−ＧＲＰの結合が特異
的であることを示している。この結論は、^１２５Ｉ−Ｇ
ＲＰに結合せず（８）このペプチドにマイトジエン応答
を示さない（７）細胞系である３Ｔ６細胞から調製され
た膜フラクションが^１２５Ｉ−ＧＲＰに対する特異的結
合を何ら示さなかったという事実により強化される。従
って、５ｍＭのＭｇ^２＋を含有する溶液を用いて調製お
よびアッセイされたスイス３Ｔ３細胞の膜フラクション
を用いて^１２５Ｉ−ＧＲＰ結合の速度論的特性および平
衡特性を測定した。^１２５ Ｉ−ＧＲＰの会合および解離の経時的変化 スイス３Ｔ３細胞の膜フラクションへの^１２５Ｉ−ＧＲ
Ｐの結合速度を０．５ｎＭの^１２５Ｉ−ＧＲＰを用いて
１５℃で測定した（第７図）。これらの条件下では、
^１２５Ｉ−ＧＲＰの特異的結合は２．５分以内にその平
衡値の５０％に達しそして最大結合はインキュベーショ
ン１５分後に達成された。３７℃では、より速く（５分
内）最大結合が得られた。１５℃または３７℃で、最大
結合は４時間一定しており、このことはこの期間中にリ
ガンドの検出可能な分解が存在しないことを示してい
る。膜フラクションへの^１２５Ｉ−ＧＲＰ会合の速度論
は２分子反応として分析した（実験方法参照）。第７Ａ
図はめ込みに示される直線の傾斜から得られる２次速度
定数（ｋ_１）は０．３３×１０^９Ｍ^−１／分であった。

【００３５】膜調製物への^１２５Ｉ−ＧＲＰの結合は可
逆的であった。３０分間^１２５Ｉ−ＧＲＰとインキュベ
ートした膜フラクションへ未標識のボンベシン２０００
倍過剰量を添加したところ、標識リガンド−受容体複合
体の１次解離を促進した（第７Ｂ図）。^１２５Ｉ−ＧＲ
Ｐ結合の半最大損失は７．５分後に起こり、そして解離
速度定数ｋ_２の値は０．０６２／分であった。第７図か
ら得られた速度定数の値を用いると、平衡解離定数（ｋ
ｄ＝ｋ_２／ｋ_１）は１．９×１０^−１０Ｍと計算され
た。 ３Ｔ３細胞からの膜調製物への^１２５Ｉ−ＧＲＰの結合
の濃度依存性 放射性標識リガンドの漸増濃度の凾数としてのスイス３
Ｔ３細胞細胞膜調製物への^１２５Ｉ−ＧＲＰの結合を第
８図に示す。１５℃で平衡条件下に測定された^１２５Ｉ
−ＧＲＰの特異的結合は飽和可能であったが、非特異的
なＧＲＰの結合はリガンド濃度の増大に伴って直線的に
増大した（図示せず）。これらの平衡結合データをスカ
ッチャード分析（第８図はめ込み）したところ、ｋｄ＝
１０^−１０Ｍの高アフィニティ結合部位の均質な集団が
存在し、最大結合容量（Ｂｍａｘ）は５５０ｆモル／ｍ
ｇ細胞膜タンパクであることが示された。１５℃で行な
われた６つの独立した実験において、ｋｄおよびＢｍａ
ｘの値はそれぞれ、２．１±０．０３５ １０^−１０Ｍ
および５８０±５０ｆモル／ｍｇタンパクであった。３
７℃で行なわれた同様の試験でもやはり飽和可能な結合
がみとめられ、ｋｄ＝２．１９±０．０４ １０^−１０
Ｍ（ｎ＝４）の高アフィニティ部位の単一種類の存在お
よび最大結合容量６０４±４０ｆモル／ｍｇタンパクが
示された（第８図）。これらのｋｄ値は第７図に示され
るデータから得られた会合および解離の速度定数を基に
計算したｋｄ値と合致する。 ボンベシンアゴニストおよび拮抗体は膜調製物への
^１２５Ｉ−ＧＲＰの結合 ＧＲＰに構造的に関連するある範囲のペプチドが膜調製
物への^１２５Ｉ−ＧＲＰの特異的結合を阻害する能力を
第９図に示す。ボンベシン、未標識ＧＲＰ、ニューロメ
ジン（ｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎ）Ｂまたはボンベシンの
（８−１４）アミノ酸フラグメントを添加すると、濃度
依存的様式で膜調製物への^１２５Ｉ−ＧＲＰの特異的結
合が阻害された。半最大阻害（ＩＣ_５０）を生ずるボン
ベシン、ＧＲＰ、ニューロメジンＢおよびボンベシン
（８−１４）の濃度はそれぞれ、１．５，３．８，１８
０および４０００ｎＭであった。これと対照的に、ＧＲ
Ｐの生物学的に不活性なＮＨ_２末端フラグメント（ＧＲ
Ｐ１−１６）は１００μＭの濃度まで結合を阻害しなか
った。

【００３６】ニューロペプチド物質Ｐ（ＳＰ）は３Ｔ３
細胞への^１２５Ｉ−ＧＲＰの結合を阻害せず、また、こ
れらの細胞におけるＤＮＡ合成も刺激しなかった（７，
８）。しかしながら、ＳＰ拮抗体は３Ｔ３細胞における
強力なボンベシン拮抗体である（４４，４５）。第９図
はスイス３Ｔ３細胞膜調製物への^１２５Ｉ−ＧＲＰの特
異的結合に及ぼす［ＤＡｒｇ^１，ＤＰｒｏ^２，ＤＴｒｐ
^７，９，Ｌｅｕ^１１］ＳＰ（８，４４）および［ＤＡｒ
ｇ^１，ＤＰｈｅ^５，ＤＴｒｐ^７，９，Ｌｅｕ^１１］ＳＰ
（４５）の種々の濃度の作用を示している。これらの拮
抗体は濃度依存的様式で結合を低下させた。結合の５０
％阻害を生ずる［ＤＡｒｇ^１，ＤＰｒｏ^２，ＤＴｒｐ
^７，９，Ｌｅｕ^１１］ＳＰおよび［ＤＡｒｇ^１，ＤＰｈ
ｅ^５，ＤＴｒｐ^７，９，Ｌｅｕ^１１］ＳＰの濃度はそれ
ぞれ３８μＭおよび７μＭであった。

【００３７】膜への^１２５Ｉ−ＧＲＰの特異的結合を５
０％阻害するのに必要なアゴニストおよび拮抗体の濃度
（ＩＣ_５０）を第９図から求めた。スイス３Ｔ３全体へ
の^１２５Ｉ−ＧＲＰの結合の５０％阻害を惹起するこれ
らのペプチドの濃度を以前に刊行されたデータ（８，４
５）から求めた。第１０図によれば、膜を用いて得られ
たＩＣ_５０値は、未損傷の細胞への結合のＩＣ_５０値と
極めてよく相関していた（ｒ＝０．９８）。これらのペ
プチドの膜フラクションへの^１２５Ｉ−ＧＲＰ結合阻害
能力と未損傷細胞への^１２５Ｉ−ＧＲＰ結合阻害能力の
間には明確な平行性があることから、Ｍｇ^２＋存在下で
調製された膜フラクションがこの種のペプチドのマイト
ジエン作用を媒介するボンベシン／ＧＲＰ結合部位を保
有しているという我々の結論がかなり補強された。 膜調製物における^１２５Ｉ−ＧＲＰのその受容体への交
叉結合 我々は以前にスイス３Ｔ３細胞におけるボンベシン群の
ペプチドの受容体の主要成分である可能性のある見かけ
のＭｒ７５，０００−８５，０００を有する未損傷のこ
の細胞中の表面糖タンパク質を化学的交叉結合により同
定した（３０，３１）。同様の結果が別の研究室でも得
られている（３２，４６）、しかしながら、^１２５Ｉ−
ＧＲＰは全細胞中の他のタンパク質とも交叉するため
（３０−３２，４６）、^１２５Ｉ−ＧＲＰを特異的に認
識する膜フラクション中の成分を同定することが重要で
あった。

【００３８】５ｍＭ Ｍｇ^２＋の非存在下または存在下
に調製されたスイス３Ｔ３細胞の膜フラクションを
^１２５Ｉ−ＧＲＰとインキュベートし、次に、ホモ２官
能性ジスクシンイミジル交叉結合剤ＥＧＳで処理した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ついでオートラジオグラフィーによ
り分析したところ、Ｍｇ^２＋の存在下で調製された膜の
見かけのＭｒ７５，０００−８５，０００で移動する単
一バンドの存在が明らかになった（第１１図）。この交
叉結合複合体の形成は未標識ＧＲＰの１００倍過剰量を
添加することにより完全に消失した。Ｍｒ７５，０００
−８５，０００アフィニティ標識バンドは、交叉結合反
応をＭｇ^２＋非存在下に調製およびアッセイした膜フラ
クションで行なった場合には得られなかった。Ｍｇ^２＋
を用いずに調製した膜をこのイオンの存在下に^１２５Ｉ
−ＧＲＰとインキュベートしたところ、Ｍｒ７５，００
０−８５，０００バンドの標識は、Ｍｇ^２＋存在下に調
製およびインキュベートした膜で観察されたそれの僅か
３１％±４％であった（第１１図）。即ち、Ｍｒ７５，
０００−８５，０００交叉結合複合体の形成は、膜フラ
クションにおける^１２５Ｉ−ＧＲＰ特異的結合のレベル
と極めて良い相関を示した。Ｍｇ^２＋は特異的結合活性
およびアフィニティ標識化のいずれを温存するためにも
不可欠であった。

【００３９】ＥＧＳは濃度依存的様式でＭｒ７５，００
０−８５，０００への^１２５Ｉ−ＧＲＰの交叉結合を促
進した。最大作用はＥＧＳ濃度４ｍＭで観察され、半最
大作用は２．５ｍＭで観察された。Ｍｒ７５，０００−
８５，０００タンパク質への^１２５Ｉ−ＧＲＰの交叉結
合において交叉結合剤ＤＳＳは２ｍＭでＥＧＳと同様に
有効であった（結果は示さず）。Ｍｒ７５，０００−８
５，０００タンパク質のアフィニティ標識化は、スクロ
ース溶液を用いた遠心分離により調製した膜フラクショ
ンを用いた場合にも顕著であった（第１１図右）。

【００４０】^１２５Ｉ−ＧＲＰがＭｒ７５，０００−８
０，０００タンパクを認識するその特異性を評価するた
めに、種々のマイトジエンおよびニューロペプチドの非
存在下または存在下で、膜フラクションを^１２５Ｉ−Ｇ
ＲＰとインキュベートした。第ＩＩ表に示されるとお
り、スイス３Ｔ３細胞の膜フラクションへの^１２５Ｉ−
ＧＲＰの交叉結合はボンベシン、リトリンおよびニュー
ロメジンＢを含む、他のＧＲＰ構造関連ペプチドにより
顕著に阻害された。−方、ＧＲＰのアミノ末端フラグメ
ント（ＧＲＰ（１−１６））はＭｒ７５，０００−８
０，０００タンパク質のレベルを何ら低下させなかっ
た。更に、試験したその他のニューロペプチドおよび増
殖因子の何れも、Ｍｒ７５，０００−８０，０００バン
ドのアフィニティ標識化を低下させなかった。これらの
結果は、スイス３Ｔ３細胞の膜フラクションへの^１２５
Ｉ−ＧＲＰの特異的結合もこれらのマイトジエンによっ
て阻害されないという所見と合致している（第Ｉ表）。

【００４１】Ｍｒ７５，０００−８０，０００複合体が
ボンベシン族のペプチドの受容体と密接に関連するとい
う可能性は、種々の濃度の未標識のＧＲＰの存在下にス
イス３Ｔ３細胞の膜フラクションに^１２５Ｉ−ＧＲＰを
交叉結合させることにより実証された（第１２図上）。
オートラジオグラムの濃度分析によれば、未標識ＧＲＰ
濃度の増大に伴うＭｒ７５，０００−８０，０００レベ
ルの減少が、膜調製物への^１２５Ｉ−ＧＲＰの特異的結
合をＧＲＰが阻害する能力と緊密に平行することが示さ
れる（第１２図下）。 考 察 ボンベシン受容体の特性決定は、スイス３Ｔ３細胞培養
物における、ボンベシン群のニューロペプチドにより開
始された強力なマイトジェン応答を分子レベルで解明す
るための不可欠の段階である。細胞全体への^１２５Ｉ−
ＧＲＰの結合により種々の情報が提供された（８，３
０，３１，４５）が、^１２５Ｉ−ＧＲＰはリソゾーム経
路を介して未損傷のスイス３Ｔ３細胞により急速に内在
化された後に分解されることも示されている（３３）。
これらの代謝的変化は生理学的温度における結合反応の
速度論的特性および平衡特性の測定を非常に複雑なもの
にしている^２。特異的結合を保有する膜調製物にはこの
ような複雑さが伴わない。

【００４２】培養細胞および組織から膜を調製するため
の幾つかの方法（３８−４３）では、３Ｔ３細胞由来の
膜の^１２５Ｉ−ＧＲＰ結合活性を温存できなかった。こ
れらの実験の過程において我々は、膜フラクションの調
製および結合アッセイの間にＭｇ^２＋を添加することに
より^１２５Ｉ−ＧＲＰの特異的結合が劇的に増大するこ
とを見出した。その作用は選択的であり、Ｍｇ^２＋は部
分的にＭｎ^２＋で代替できたが、Ｃａ^２＋では代替不可
能であった。この作用はラット脳膜（４２）または下垂
体細胞から得た膜（４７）を用いたこれまでの研究では
認められておらず、これまでの研究では、ボンベシンは
細胞増殖よりむしろ短期の分泌を刺激している。我々の
研究では、スイス３Ｔ３細胞のホモジナイズの間にＭｇ
^２＋が存在することは^１２５Ｉ−ＧＲＰ結合活性を安定
化するのに不可欠であった。今回の研究において、我々
はこの新しい観察結果を利用して結合反応の速度論的特
性および平衡特性を決定し、そして結合成分の分子特性
の幾つかを測定した。

【００４３】スイス３Ｔ３細胞の膜調製物への^１２５Ｉ
−ＧＲＰの特異的結合は速くそして可逆的であった。会
合（ｋ_１）および解離（ｋ_２）の速度定数を用いて見か
けの平衡解離定数（ｋｄ）を計算したところ１．９×１
０^−１０Ｍであった。平衡結合データのスカッチャード
分析によればｋｄ＝２．１×１０^−１０であった。それ
ゆえ、速度論的に求めた平衡定数は平衡結合測定で得た
ｋｄと極めてよく合致した。これらｋｄ値は、未損傷の
３Ｔ３細胞で以前に測定された見かけのｋｄ（５−１０
×１０^−１０Ｍ）（８）と合理的に合致する。

【００４４】本研究で測定された結合部位の特異性は以
下の一連の証拠により裏付けられる。即ち、ａ）^１２５
Ｉ−ＧＲＰの特異的結合はスイス３Ｔ３細胞に対する一
群のマイトジエンおよびその他のニューロペプチドによ
っては阻害されない、ｂ）^１２５Ｉ−ＧＲＰに結合せ
ず、かつこのニューロペプチドにも応答しない（７，
８）３Ｔ６細胞からＭｇ^２＋存在下に調製された膜は何
ら特異的結合活性を示さない、ｃ）ボンベシン、リトリ
ン、ニューロメジンＢおよびボンベシンの８−１４フラ
グメントを含めたこのニューロペプチド群の高度に保存
されたＣＯＯＨ末端へプタペプチドを含有するＧＲＰ構
造類似ペプチドは濃度依存的様式で膜調製物への^１２５
Ｉ−ＧＲＰの特異的結合を阻害した、ｄ）ボンベシン拮
抗体として作用する２種の物質Ｐ誘導体（８，４４，４
５）もまた膜への^１２５Ｉ−ＧＲＰの結合を阻害した。
実際、種々の非放射性アゴニストおよび拮抗体が膜調製
物から^１２５Ｉ−ＧＲＰと置き代わる相対的応力は、こ
れらのペプチドが未損傷かつ静止期のスイス３Ｔ３細胞
への^１２５Ｉ−ＧＲＰの結合を阻害する相対的能力と極
めて良好に相関（ｒ＝０．８９）する（第１０図）。

【００４５】ボンベシンアゴニストが、Ｃａ^２＋流動化
（１９，２１）、ウアバイン感受性Ｒｂ^＋取り込み（２
１）、酸性Ｍｒ８０，０００基質のプロテインキナーゼ
Ｃ媒介リン酸化（２２，２５）、^１２５Ｉ−ＥＧＦ結合
の阻害（９，２２）、ｃＡＭＰ蓄積の増強（４８）、ｃ
−ｆｏｓおよびｃ−ｍｙｃ発現の誘導（２９）およびス
イス３Ｔ３細胞におけるＤＮＡ合成の刺激（８，９）を
惹起する相対的効力は、それらが３Ｔ３細胞由来の膜へ
の^１２５Ｉ−ＧＲＰの特異的結合を阻害する相対的能力
と同じである（第９図）。総括すると、これらの結果
は、本研究の期間中に膜調製物において測定された高ア
フィニティ結合部位がボンベシン群のペプチドのマイト
ジエン作用を媒介する受容体であることを示している。

【００４６】我々は以前に、化学的交叉結合により、ボ
ンベシン受容体の主成分である可能性のある見かけのＭ
ｒ７５，０００−８５，０００を有するスイス３Ｔ３細
胞の細胞表面糖タンパク質を同定している（３０，３
１）。他の実験室での研究でも、他のバンドも観察され
ているものの、同様の交叉結合複合体を認めた（３２，
４６）。さらに、スイス３Ｔ３細胞のＭｒ１１５，００
０タンパク質はボンベシンに応答してチロシンでリン酸
化され（４９）ることも報告されており、ボンベシン受
容体がこのキナーゼに関与している可能性もあげられて
いる。しかしながら、ボンベシンにより刺激されたチロ
シンキナーゼは他の研究室では検出されておらず（２
３）そしてチロシンリン酸化バンドのＭｒは細胞全体の
アフィニティ交叉結合により確認された推定受容体のそ
れとは一致しない（３０−３２）。これらの結果を考慮
すると、これらの膜調製物において^１２５Ｉ−ＧＲＰを
特異的に認識する成分を化学的交叉結合により決定する
ことが大へん重要であった。

【００４７】本研究ではジスクシンイミジル交叉結合剤
ＥＧＳを用いて^１２５Ｉ−ＧＲＰをスイス３Ｔ３細胞膜
調製物のＭｒ７５，０００−８５，０００タンパク質に
共有結合させた。この成分のアフィニティ標識化は特異
的であり、そしてＭｇ^２＋の存在下に調製された膜フラ
クションでのみに観察された。我々の知るかぎり、
^１２５Ｉ−ＧＲＰが標的細胞または組織の膜調製物中の
タンパク結合部位に交叉結合された例は今回が初めてで
ある。我々の結果の顕著な特徴は、Ｍｒ７５，０００−
８５，０００アフィニティ標識バンドが膜において検出
された唯一の交叉結合複合体であるということである。
これらの所見は、膜調製物での今回の試験でおよび３Ｔ
３細胞全体での以前の試験において同定されたＭｒ７
５，０００−８５，０００タンパク質が受容体またはボ
ンベシン受容体の結合サブユニットであることを強く示
唆している。特異的なホンベシン受容体を保持する膜調
製物が得られるということは、その分子特性および調節
特性を調べるのに有用であろう。更に、かかる膜調製物
により、この重要なニューロペプチド受容体の可溶化お
よび精製を行なうための最も重要な工程が提供される。 図の説明 第６図：スイス３Ｔ３細胞からの膜フラクションへの
^１２５Ｉ−ＧＲＰの特異的結合のＭｇ^２＋依存性。 Ａ．５ｍＭのＭｇＣｌ_２の非存在下（白棒）または存在
下（斜線棒）の何れかで調製およびアッセイされたスイ
ス３Ｔ３細胞膜フラクションへの^１２５Ｉ−ＧＲＰの結
合。膜フラクションは「実験方法」に記載されるように
して調製された。膜フラクション（２５μｇ）への
^１２５Ｉ−ＧＲＰ（０．５ｎＭ）の特異的結合は「実験
方法」に記載されるようにして測定した。結果は、１５
℃および３７℃で行なった実験からの平均±ＳＥＭ、ｎ
＝１５を表わす。 Ｂ．膜フラクションタンパク質の凾数としての^１２５Ｉ
−ＧＲＰの特異的結合。^１２５Ｉ−ＧＲＰ（０．５ｎ
Ｍ）を５ｍＭのＭｇＣｌ_２の非存在下（白角）または存
在下（黒角）の何れかで調製およびアッセイされた種々
の濃度の膜と１５℃で３０分間インキュベートした。こ
の実験では、総インキュベーション容量を２５０μｌと
し、遊離のリガンドの利用可能性が制限されないように
確保した。結果は３回の別個の実験の平均を表わす。 Ｃ．スイス３Ｔ３膜への^１２５Ｉ−ＧＲＰの特異的結合
はＭｇＣｌ_２濃度依存性である。スイス３Ｔ３細胞から
の膜フラクションは、調製の全体を通してＭｇＣｌ_２濃
度を指示通りに変化させる以外は「実験方法」に記載さ
れるとおりに調製した。種々の指示される濃度のＭｇＣ
ｌ_２の存在下における膜２５μｇへの^１２５Ｉ−ＧＲＰ
（０．５ｎＭ）の特異的結合は「実験方法」に記載され
るようにして測定した。挿入図．指示されるＭｇＣｌ_２
濃度で調製しそして５ｍＭのＭｇＣｌ_２を用いてアッセ
イしたスイス３Ｔ３細胞から調製した（〇）かまたはＭ
ｇＣｌ_２非存在下で調製しそして指 ２５μｇ）への^１２５Ｉ−ＧＲＰの特異的結合。全例に
おいて結合は１５℃で３０分行なった。結果は３通りの
測定の平均で表わし、各測定値の平均値からの変動は５
％未満であった。 第７図：スイス３Ｔ３膜フラクションへの^１２５Ｉ−Ｇ
ＲＰの結合速度。 左図：スイス３Ｔ３膜への^１２５Ｉ−ＧＲＰの結合の会
合経時的変化。^１２５Ｉ−ＧＲＰ（０．５ｎＭ）を結合
接培地００μｌ中膜タンパク質２５μｇと１５℃で指示
された時間インキュベートした。次に「実験方法」に記
載されるようにして^１２５Ｉ−ＧＲＰ特異的結合を測定
した。挿入図：データの半対数プロット時間を横軸に、
そしてｌｎ［（Ｂｅｑ−Ｂｔ）／（ＢｏＬｏ−ＢｅｑＢ
ｔ）］を縦軸にプロットした。Ｂｏは遊離受容体の当初
濃度であり、これはスカッチャード分析第８図（左）か
ら０．１３７ｎＭである見積られた。Ｂｅｑは占拠され
た受容体の平衡温度であり、３０分後に得られた値であ
る０．０９５ｎＭとした。Ｌｏはリガンド当初濃度
（０．５ｎＭ）である。当初の点（０〜８分）の期間中
の回帰直線の傾斜により、関係式Ｋ_１＝傾斜×（Ｂｅｑ
／Ｂｅｑ^２−ＢｏＬｏ）に従い２次会合速度定数Ｋ_１が
得られる。 右図：スイス３Ｔ３膜からの^１２５Ｉ−ＧＲＰ解離の経
時的変化。膜（２５μｇ）を結合培地１００μｌ中で
^１２５Ｉ−ＧＲＰ（０．５ｎＭ）と１５℃で３０分イン
キュベートした。次に各チューブにボンベシン過剰量
（１μＭ）を添加し、そして^１２５Ｉ−ＧＲＰ特異的結
合を「実験方法」に記載されたようにして指示された時
間に測定した。各点は１つの実験の３回の測定の平均を
示す。挿入図：データの半対数プロット。時間を横軸
に、そしてｌｎ（Ｂｔ／Ｂｅｑ）を縦軸にプロットし
た。直線の傾斜から１次速度定数ｋ_２が得られた。第８
図：１５℃および３７℃における、スイス３Ｔ３細胞由
来の膜フラクションへの結合の^１２５Ｉ−ＧＲＰ濃度の
凾数としての分析。

【００４８】結合培地１００μｌ中の膜（２５μｇ）を
指示に従って１５℃または３７℃の何れかで、種々の濃
度の^１２５Ｉ−ＧＲＰの存在下にインキュベートした。
特異的結合を３７℃で１０分後、または１５℃で３０分
後、「実験方法」に記載されるようにして測定した。非
特異的結合は、１ｎＭ未満の濃度の^１２５Ｉ−ＧＲＰ濃
度に対し、少なくとも１０００倍過剰の未標識ボンベシ
ンまたは１μＭボンベシンを添加することにより測定し
た。挿入図はデータのスカッチャード分析を示し、結合
（Ｂ）^１２５Ｉ−ＧＲＰはｆモル／２５μｇ膜タンパク
として表わし、遊離^１２５Ｉ−ＧＲＰ濃度であるＦはｐ
Ｍで表わした。 第９図．スイス３Ｔ３細胞から調製した膜フラクション
への^１２５Ｉ−ＧＲＰの特異的結合に及ぼす種々のボン
ベシンアゴニストおよび拮抗体の作用。

【００４９】^１２５Ｉ−ＧＲＰ（０．５ｎＭ）およびス
イス３Ｔ３細胞からの膜フラクション２５μｇを指示さ
れる濃度の以下に示すアゴニストおよび拮抗体の非存在
下または存在下、結合培地１００μｌ中１５℃で３０分
インキュベートした。ボンベシン（●，ｂｏｍ）、ＧＲ
Ｐ（○）、ニューロメジンＢ（▲黒四角▼，ＮＢ）、ボ
ンベシン８−１４（□，Ｂｏｍ（８−１４））、ＧＲＰ
１−１６（◇，ＧＲＰ）、［ＤＡｒｇ^１，ＤＰｈｅ^５，
ＤＴｒｐ^７，９，Ｌｅｕ^１１］物質Ｐ（▲，ＳＰ２）、
［ＤＡｒｇ^１，ＤＰｒｏ^２，ＤＴｒｐ^７，９，Ｌｅｕ
^１１］物質Ｐ（△，ＳＰ１）。「実験方法」に記載され
るようにして反応を停止させそして特異的結合を測定し
た。結果は２つの個別の実験の混成であり、各例の対照
値のパーセントで表わす。^１２５Ｉ−ＧＲＰの特異的結
合の平均対照値は２９０±２５ｆモル／ｍｇタンパク
（平均±ＳＥＭ，ｎ−１４）であった。 第１０図：種々の非放射性ボンベシンアゴニストおよび
拮抗体が、スイス３Ｔ３細胞由来の膜への^１２５Ｉ−Ｇ
ＲＰの結合を阻害する効力は、これらのペプチドが未損
傷のスイス３Ｔ３細胞への^１２５Ｉ−ＧＲＰの結合を阻
害する能力と相関する。

【００５０】第９図に略語を示したペプチドがスイス３
Ｔ３細胞から調製した膜への^１２５Ｉ−ＧＲＰの結合を
５０％阻害する濃度（ＩＣ_５０，膜）（ｎＭ）を第９図
からもとめ、これを既に報告されているデータ（８，４
５）から得られた、同じペプチドが未損傷スイス３Ｔ３
細胞への^１２５Ｉ−ＧＲＰの結合を５０％阻害する濃度
（ＩＣ_５０，細胞）（ｎＭ）に対しプロットした。 第１１図：ホモ２官能性交叉結合剤ＥＧＳを用いる７
５，０００−８５，０００膜タンパク質のアフィニティ
標識化。 左図：特異的アフィニティ標識化のＭｇ^２＋依存性。ス
イス３Ｔ３膜フラクションをＭｇＣｌ_２を用いないか
（Ａ，Ｂ）または５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を用いるか（Ｃ）
して、「実験方法」に記載されるようにして調製した。
一部分（１５０μｇ）を０．５ｎＭ^１２５Ｉ−ＧＲＰを
含有しＭｇＣｌ_２未添加（Ａ）または５ｍＭ ＭｇＣｌ
_２添加（Ｂ，Ｃ）の交叉結合培地５００μｌ中で１μＭ
ボンベシンの非存在下（−）または存在（＋）にインキ
ュベートした。１５℃で３０分間インキュベートした
後、遠心分離により膜をペレット化し、５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ_２の非存在下（Ａ）または存在下（Ｂ，Ｃ）でＥＧＳ
（４ｍＭ）との化学的交叉結合を「実験方法」に記載さ
れるようにして行なった。「実験方法」に記載されるＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで得られた代表的オートラジオグラムを
左図に示し、棒グラフはオートラジオグラムの走査密度
測定から得られた平均値±ＳＥＭ，ｎ＝４を示す。３７
℃で１０分間のインキュベーション後にも同様の結果が
得られた。 右図：スクロース溶液上での遠心分離により更に精製し
たスイス３Ｔ３膜への化学的交叉結合。「実験方法」に
記載のようにして細胞を回収しホモジナイズした。細胞
全体および核を除去した後の上清を４５％（ｗ／ｖ）ス
クロースを含有する溶液Ａ上に重層させそして３０分間
９０００×ｇで遠心分離した。原形質膜を界面から回収
し、溶液Ａで５倍に希釈し、そして３００００×ｇで３
０分間遠心分離した。ペレットを１ｍｇ／ｍｌの濃度で
同じ緩衝液中に再懸濁した。次に膜（７５μｇ）をボン
ベシン（１μＭ）の非存在下（−）または存在下（＋）
に、０．５ｎＭ^１２５Ｉ−ＧＲＰを含有する交叉結合培
地５００μｌ中で３７℃で１０分間インキュベートし
た。ＥＧＳ（４ｍＭ）を用いた３７℃での化学的交叉結
合およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を「実験方法」に
記載されるようにして実施した。この調製物の０．５ｎ
Ｍ^１２５Ｉ−ＧＲＰで測定した特異的結合は７９０ｆモ
ル／ｍｇであり、左図で用いられた膜の特異的活性の２
倍増加を示した。 第１２図：ＧＲＰは濃度依存的様式でアフィニティ標識
７５，０００−８５，０００膜タンパク質を阻害する。

【００５１】「実験方法」に記載のようにしてスイス３
Ｔ３細胞から調製した膜タンパク質（１５０μｇ）を
０．５ｎＭ^１２５Ｉ−ＧＲＰを含有する交叉結合培地中
３７℃で１０分間インキュベートした。次に、「実験方
法」に記載されるようにしてＥＧＳ（４ｍＭ）を用いた
化学的交叉結合を行なった。「実験方法」に記載される
ようにして試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。上
図は代表的なオートラジオグラムを示す。下図に示す値
はオートラジオグラムの走査密度測定から得られた最大
レベルのパーセント（●）として表示し、２つの独立し
た実験の平均値である。比較のために、（第９図から得
られた）膜への^１２５Ｉ−ＧＲＰの結合の未標識ＧＲＰ
による阻害の容量応答（○）を示す。

【００５２】

【表１】 スイス３Ｔ３細胞から得た膜フラクションタンパク質の
一部分（２５μｇ）を０．５ｎＭ^１２５Ｉ−ＧＲＰおよ
び上記マイトジエンを以下の濃度で含有する結合培地中
でインキュベートした：ボンベシンおよびＧＲＰ（１０
０ｎＭ）；ＧＲＰ（１−１６）バソプレッシン、ブラジ
キニン、ＶＩＰ、物質Ｐ、物質Ｋおよびソマトスタチン
（１μＭ）；ＰＤＧＦ（１５ｎＭ）；ＦＧＦ（６ｎ
Ｍ）；ＥＧＦ（４０ｎＭ）、インシュリン（１．５μ
Ｍ）；ＰＢｔ_２（４００ｎＭ）。３７℃で１０分間イン
キュベートした後に、「実験方法」に記載されるように
して特異的結合を測定した。結果は平均±ＳＥＭ，ｎ＝
３で示す。他の２つの独立した実験でも同様の結果が得
られた。

【００５３】

【表２】 スイス３Ｔ３細胞からの膜フラクションタンパク質の一
部分（１５０μｇ）を０．５ｎＭ^１２５Ｉ−ＧＲＰおよ
び上記した試薬を以下の濃度で含有する交叉結合培地中
でインキュベートした。ボンベシン、リトリンおよびＧ
ＲＰ（１−２７）（１００ ｎＭ）；ボンベシン（８−
１４）およびＧＲＰ（１−１６）（１０μＭ）、ニュー
ロメジンＢ、バソプレッシン、ブラジキニンおよび物質
Ｐ（１μＭ）；ＰＤＧＦ（１５ｎＭ）；ＦＧＦ（６ｎ
Ｍ）；ＥＧＦ（４０ｎＭ）。インシュリン（１．５μ
Ｍ）；ＰＢｔ_２（４００ｎＭ）。３７℃で１０分間イン
キュベートした後、膜を遠心分離によりペレット化し、
そして「実験方法」に記載されるようにして４ｍＭ Ｅ
ＧＳを用いて化学的交叉結合を行なった。「実験方法」
に記載されるようにして試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび
オートラジオグラムの走査密度測定により分析した。示
される結果は添加物の非存在下で得られたレベルのパー
セントとして表わした３回の独立した実験の平均値を示
す。 注記１：略語の一覧 ＰＢＳ − リン酸緩衝食塩水 ＢＳＡ − ウシ血清アルブミン ＧＲＰ − ガストリン放出性ペプチド ＥＧＳ − エチレングリコールビス（スクシーイミジ
ルスクシネート） ＤＳＳ − スベリン酸ジスクシンイミジル ＥＧＴＡ− エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）
四酢酸 Ｈｅｐｅｓ−４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペ
ラジンエタンスルホン酸 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動 ＶＩＰ − 血管活性腸内ペプチド ＰＤＧＦ− 血小板由来成長因子 ＦＧＦ − 繊維芽細胞増殖因子 ＥＧＦ − 表皮成長因子 ＰＢｔ_２− ホルボール１２，１３−ジブチレート 注記２：リガンドの内在化および分解は４℃で顕著に低
下する（３３）。しかしながら、未損傷の細胞への
^１２５Ｉ−ＧＲＰの結合は４℃で非常にゆっくりと進行
する。この非生理学的温度で長時間インキュベートした
後でも厳密な平衡結合を得るのは困難である。 参考文献

【００５４】

【００５５】

【００５６】

【００５７】

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図は実施例１に記載される実験の結果を示
す。

【図２】第２図は実施例１に記載される実験の結果を示
す。

【図３】第３図は実施例２に記載される小細胞肺癌細胞
系に及ぼす拮抗体Ａ、ＤおよびＧの阻害作用の結果を示
す。

【図４】第４図は実施例２に記載される小細胞肺癌細胞
系に及ぼす拮抗体Ａ、ＤおよびＧの阻害作用の結果を示
す。

【図５】第５図は実施例２に記載される小細胞肺癌細胞
系に及ぼす拮抗体Ａ、ＤおよびＧの阻害作用の結果を示
す。

【図６】第６図はスイス３Ｔ３細胞のＭｇ^＋＋安定化膜
調製物から単離された受容体を用いる実験の結果を示
す。

【図７】第７図はスイス３Ｔ３細胞のＭｇ^＋＋安定化膜
調製物から単離された受容体を用いる実験の結果を示
す。

【図８】第８図はスイス３Ｔ３細胞のＭｇ^＋＋安定化膜
調製物から単離された受容体を用いる実験の結果を示
す。

【図９】第９図はスイス３Ｔ３細胞のＭｇ^＋＋安定化膜
調製物から単離された受容体を用いる実験の結果を示
す。

【図１０】第１０図はスイス３Ｔ３細胞のＭｇ^＋＋安定
化膜調製物から単離された受容体を用いる実験の結果を
示す。

【図１１】第１１図はスイス３Ｔ３細胞のＭｇ^＋＋安定
化膜調製物から単離された受容体を用いる実験の結果を
示す。

【図１２】第１２図はスイス３Ｔ３細胞のＭｇ^＋＋安定
化膜調製物から単離された受容体を用いる実験の結果を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/00 21/08 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ウォル，ペネラ イギリス国 ロンドン，ダヴリューシー ２， リンカーンズ イン フィールズ （番地なし） インペリアル キャンサー リサーチ ファンド内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記特徴を有するポリペプチド、すなわ
   ち： （１）マンノース側鎖に富む一本鎖グリコポリペプチド
   である。 （２）ボンベシル型のポリペプチドと選択的に結合す
   る。 （３）７５〜８５キロダルトン（Ｋｄ）の分子量を有す
   る。 （４）６．４〜６．９の等電点を有する。 （５）フラボバクテリウム・メニンゴセプチクム（Ｆｌ
   ａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉ
   ｃｕｍ）からのエンド−β−Ｎ−グルコサミニダーゼを
   用いて得られたコアタンパク質が分子量約４２Ｋｄを有
   する。 （６）３〜１５ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭのＭｇ
   ^＋＋を含有する水性媒体中でスイス３Ｔ３細胞を破壊す
   ることにより得られた膜調製物を用いた場合、１５℃で
   の平衡解離定数が速度論的分析によれば１．９×１０
   ^−１０Ｍでありそしてスカッチャード分析（平衡結合）
   によれば２．１×１０^−１０Ｍである。または該ポリペ
   プチドに対する抗体を、非経口的に許容される担体とと
   もに含有する医薬組成物。
2. 【請求項２】 該ポリペプチドに対する抗体がモノクロ
   ーナル抗体である請求項１記載の医薬組成物。
3. 【請求項３】 下記特徴を有するポリペプチド、すなわ
   ち： （１）マンノース側鎖に富む一本鎖グリコポリペプチド
   である。 （２）ボンベシル型のポリペプチドと選択的に結合す
   る。 （３）７５〜８５キロダルトン（Ｋｄ）の分子量を有す
   る。 （４）６．４〜６．９の等電点を有する。 （５）フラボバクテリウム・メニンゴセプチクム（Ｆｌ
   ａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉ
   ｃｕｍ）からのエンド−β−Ｎ−グルコサミニダーゼを
   用いて得られたコアタンパク質が分子量約４２Ｋｄを有
   する。 （６）３〜１５ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭのＭｇ
   ^＋＋を含有する水性媒体中でスイス３Ｔ３細胞を破壊す
   ることにより得られた膜調製物を用いた場合、１５℃で
   の平衡解離定数が速度論的分析によれば１．９×１０
   ^−１０Ｍでありそしてスカッチャード分析（平衡結合）
   によれば２．１×１０^−１０Ｍである。または該ポリペ
   プチドに対する抗体を含有する診断組成物。
4. 【請求項４】 該ポリペプチドに対する抗体がモノクロ
   ーナル抗体である請求項３記載の診断組成物。
5. 【請求項５】 該ポリペプチドに対する抗体が検出可能
   な標識を担持する請求項３または４記載の診断組成物。
6. 【請求項６】 該ポリペプチドに対する抗体が固形支持
   体上に不溶化されている請求項３〜５のいずれかに記載
   の診断組成物。
7. 【請求項７】 下記特徴を有するポリペプチド、すなわ
   ち： （１）マンノース側鎖に富む一本鎖グリコポリペプチド
   である。 （２）ボンベシル型のポリペプチドと選択的に結合す
   る。 （３）７５〜８５キロダルトン（Ｋｄ）の分子量を有す
   る。 （４）６．４〜６．９の等電点を有する。 （５）フラボバクテリウム・メニンゴセプチクム（Ｆｌ
   ａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉ
   ｃｕｍ）からのエンド−β−Ｎ−グルコサミニダーゼを
   用いて得られたコアタンパク質が分子量約４２Ｋｄを有
   する。 （６）３〜１５ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭのＭｇ
   ^＋＋を含有する水性媒体中でスイス３Ｔ３細胞を破壊す
   ることにより得られた膜調製物を用いた場合、１５℃で
   の平衡解離定数が速度論的分析によれば１．９×１０
   ^−１０Ｍでありそしてスカッチャード分析（平衡結合）
   によれば２．１×１０^−１０Ｍである。に対する抗体を
   一構成要素として含有する診断試験キット。
8. 【請求項８】 該ポリペプチドに対する抗体がモノクロ
   ーナル抗体である請求項７記載の診断試験キット。
9. 【請求項９】 該ポリペプチドに対する抗体が検出可能
   な標識を担持する請求項７または８記載の診断試験キッ
   ト。
10. 【請求項１０】 該ポリペプチドに対する抗体が固形支
    持体上に不溶化されている請求項７〜９のいずれかに記
    載の診断試験キット。