DE68920439T2

DE68920439T2 - Methode für die änderung der bindung eines zelladhäsionrezeptors.

Info

Publication number: DE68920439T2
Application number: DE68920439T
Authority: DE
Inventors: James Gailit; Kurt Gehlsen; Aarno Hautanen; Michael Pierschbacher; Erkki Ruoslahti
Original assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Current assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Priority date: 1988-09-14
Filing date: 1989-09-13
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2009-09-14
Also published as: DE68920439D1; ATE116548T1; JPH04501715A; EP0435946B1; WO1990002556A1; EP0435946A1

Description

Die Zelladhäsion spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung und Förderung der Verankerung, Polarität, Migration und Differenzierung von Zellen. Die Adhäsionsprozesse werden von Zelloberflächenrezeptoren vermittelt, die Adhäsionsliganden in spezifischer Weise erkennen und binden.
Viele der bekannten Adhäsionsrezeptoren gehören zu einer Familie von Rezeptoren, die Integrine genannt werden. Die Integrin-Familie schließt Rezeptoren für Fibronektin, Vitronektin und Fibrinogen als auch Rezeptoren für den von Willebrand-Faktor, Laminin, die Komplement-Komponente C3bi und einige Zell-Zell-Adhäsionsrezeptoren ein. Die Integrine sind heterodimere Membranproteine mit großen extrazellulären Domänen und kleinen zytoplasmatischen Enden. Die Ligandenproteine derartiger Integrine haben mit bekannten Liganden ein gemeinsames Merkmal, welches darin besteht, daß das Tripeptid Arg-Gly-Asp (RGD) einen wesentlichen Teil der von dem Rezeptor erkannten Proteinstruktur darstellt. Die durch Integrin vermittelten Adhäsionsprozesse können manipuliert werden, indem entweder immobilisierte oder lösliche Arg-Gly-Asp enthaltende Peptide bereitgestellt werden. Die Möglichkeit der Manipulation derartiger Prozesse eröffnet ein enormes Anwendungspotential. Die Eigenschaften und Verwendungen von Arg-Gly-Asp enthaltenden Peptiden sind beispielsweise in den US-Patenten Nrn. 4 578 079 und 4 614 517, sowie von Pierschbacher und Ruoslahti, Nature, 309:30 (1984), und Pierschbacher und Ruoslahti, PNAS, 81:5985 (1984), beschrieben.
Die Bindung von Adhäsionsrezeptoren an ihre Liganden erfordert die Anwesenheit bivalenter Kationen wie Ca²&spplus; oder Mg²&spplus;. Die α- Untereinheiten des Rezeptors enthalten verschiedene kurze Aminosauresequenzen, die den Ca²&spplus;-Bindungsstellen anderer bekannter Ca²&spplus;-bindender Proteine ähnlich sind, und die bivalenten Kationen üben ihre Wirkung vermutlich über diese Sequenzen aus.
Aufgrund der entscheidenden Rolle bei Zelladhäsionsprozessen besteht ein Bedarf daran, derartige Systeme weiter zu manipulieren. Die vorliegende Erfindung befriedigt diesen Bedarf und stellt gleichermaßen damit zusammenhängende Vorteile bereit. Es war bereits bekannt, Zink- und Aluminiumionen für Zusammensetzungen zur Wundheilung zu verwenden (Rote Liste, 1976, 31551B und 31512B). Über Zinksalze zur Unterstützung der Wundheilung ist berichtet worden in Martindale "The Extra Pharmacopoeia", 28. Ausgabe, Seite 945.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die Bindungsavidität von Zelloberflächenrezeptoren für ihre Liganden durch Bereitstellung bestimmter Kationen modifiziert werden kann. Vorzugsweise ist der Rezeptor der Fibronektin-, Vitronektin-, Laminin- oder ein Kollagen-Rezeptor, obgleich andere Integrine ebenfalls verwendet werden können. Zu den Kationen, die zu einer Erhöhung der Bindungsavidität führen, gehören die Kationen Mn²&spplus;, Co²&spplus;, Cd²&spplus; und Ni²&spplus;. Erfindungsgemäß ist das Kation nicht Zn²&spplus; oder Al³&spplus; und keine physiologische Konzentration an Ca²&spplus; oder Mg²&spplus;. Gd³&spplus; führt zu einer verminderten Avidität der Fibronektin- und Vitronektin-Rezeptoren für ihre Liganden. Auf der Grundlage dieses Konzepts betrifft die Erfindung die Verwendung von Kationen mit einer die Integrinbindung modifizierenden Aktivität zur Herstellung eines Medikaments zur Modifikation der Bindungsavidität von Integrinen. Das erfinderische Konzept kann ferner angewendet werden im Zusammenhang mit einer Ligandenmatixsäule, um die Ausbeute damit gereinigter Rezeptoren zu erhöhen. Die Erfindung kann ferner angewendet werden, um die Bindung von Rezeptoren an ein Substrat zu erhöhen, wie in einem ELISA- oder Radiorezeptorassay, und um die Migration von Zellen zu steigern.
Figur 1 zeigt den Effekt von Kationen auf die Bindung von Fibronektin-Rezeptor-Liposomen an Fibronektin. Die ohne Hinzufügung von Kationen hergestellten Rezeptor-Liposomen wurden mit CaCl&sub2;, MgCl&sub2; oder MnCl&sub2; in den angegebenen Konzentrationen vermischt, und ihre Fähigkeit zur Anheftung an die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aus Kunststoff, die mit Fibronektin beschichtet sind, wurde analysiert. Die Ergebnisse aus drei Versuchen sind angegeben im prozentualen Verhältnis zu einer Kontrollanheftung, die in Gegenwart von 1 mM CaCl&sub2; und 1 mM MgCl&sub2; gemessen und mit 100% festgesetzt wurde.
Figur 2 zeigt die Anheftung von Fibronektin-Rezeptor-Liposomen an Fibronektin in Gegenwart des Fibronektin-Fragments von 110 kDa. Die Rezeptor-Liposomen wurden entweder mit 1 mM CaCl&sub2; und 1 mM MgCl&sub2; oder mit 1 mM MnCl&sub2; hergestellt. Der Mittelwert für die Ergebnisse aus drei Versuchen ist angegeben als prozentualer Anteil der in Gegenwart geeigneter Kationen ohne Inhibitor gemessenen Kontrollanheftung.
Figur 3 zeigt die Anheftung gemäß Figur 2 unter Verwendung von GRGDSP als löslicher Inhibitor.
Figur 4 zeigt das Binden des Fibronektin-Rezeptors an Fibronektin im ELISA und die Hemmung der Bindung durch lösliche Liganden. Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden beschichtet mit 1 ug/ml Fibronektin, und man ließ einen gereinigten Rezeptor an die beschichteten Vertiefungen binden in Gegenwart steigender Konzentrationen an Fibronektin, GRGDSP, GRGESP oder eines damit nicht verwandten Peptids. Die Bindung des Rezeptors an die Vertiefung wurde mit enzymmarkierten Antikörpern nachgewiesen.
Figur 5 zeigt einen Membran-Invasions-Kultur-System (MICS)-Assay mit A365-Zellen in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an Mn²&spplus; oder Ca²&spplus;. Ein 30%-iger Anstieg der Invasion wird bei 100 uM MnCl&sub2; beobachtet.
Figur 6 zeigt die Hemmung einer A375M-Invasion mit GRGDSP in Gegenwart von 100 uM CaCl&sub2; oder 100 uM MnCl&sub2; im MICS-Assay.
Die Erfindung betrifft die neue Erkenntnis, daß die Anwesenheit von Mn²&spplus; die Bindungsavidität von Integrinen für ihre Liganden erhöht. Derartige Integrine schließen Fibronektin-, Laminin-, Vitronektin- und Kollagen-Rezeptoren ein. Es ist nunmehr bekannt, daß auch andere Kationen die Bindung von Integrinen an ihre Liganden modifizieren. Sämtliche Integrin α-Untereinheiten, deren Aminosäuresequenzen bekannt sind, enthalten Sequenzen, die bekannten Ca²&spplus;-Bindungsstellen anderer Proteine ähneln. Obgleich man nicht an diese Erklärung gebunden sein möchte, scheint die Gegenwart dieser Sequenzen die Rezeptoren sensitiv für die Anwesenheit von Mn²&spplus; zu machen.
Grinnell, Journal of Cell Science, Bd. 65 (1984), berichtet über eine Studie zum Vergleich einer Mn-abhängigen Zelladhäsion an nicht-spezifische Substrate mit der Zelladhäsion an Substrate, die mit adhäsiven Liganden beschichtet sind. Der Autor gelangt zu der Schlußfolgerung, daß Integrine bei der Mn-abhängigen Adhäsion nicht beteiligt sind.
Die Integrine im allgemeinen und ihre Untereinheiten sind detailliert beschrieben von Ruoslahti und Pierschbacher, Science, 238:491 (1987). Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Reschreibung verwendete Terminologie stimmt mit den Definitionen und Beschreibungen dieser Druckschrift überein. Im wesentlichen umfassen diese Integrine eine Familie miteinander verwandter heterodimerer Glykoproteine der Zelloberfläche, die an der Vermittlung zelladhäsiver Wechselwirkungen beteiligt sind. Die Integrine schließen Rezeptoren für Fibronektin, Vitronektin, Kollagene, Laminin, Tenascin, und das Zelloberflächenprotein IIB/IIIA ein, das Fibrinogen, Fibronektin und den von Willebrand-Faktor sowie Thrombospondin erkennt, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Leukozyten-Adhäsionsrezeptoren LFA-1, Mac-1 und gp 150/95 gehören ebenfalls der Integrin-Rezeptorfamilie an.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung schließt der Begriff "Kationen" solche Ionen ein, die eine positive Ladung aufweisen, vorzugsweise 2+ oder 3+. Diese schließen Metalle und die Seltenerdmetalle wie die Gruppe der Lanthanoide ein.
Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung umfaßt die Modifikation der Rezeptorbindung sowohl Veränderungen der Bindungsavidität als auch Veränderungen der Bindungsaffinität. Eine gesteigerte Bindungsaffinität bedeutet einen Anstieg der Stärke der Bindung zwischen individuellen Rezeptoren und ihren Liganden. Eine gesteigerte Bindungsavidität kann entweder eine Steigerung der Bindungsaffinität oder eine Erhöhung der Gesamtzahl von Rezeptormolekülen bedeuten, die an Liganden binden.
Die vorliegende Erfindung betrifft den beeindruckenden Effekt, der durch die Anwesenheit von Mn²&spplus; auf die Bindung des Fibronektinrezeptors an Fibronektin ausgeübt wird. Sowohl die Bindungsavidität als auch die Bindungsaffinität werden in Gegenwart von Mn²&spplus; stark erhöht. Darüber hinaus ist gezeigt worden, daß Mn²&spplus; die Bindungsavidität anderer untersuchter Integrine für mindestens einen ihrer Liganden erhöht, wie durch einen oder mehrere der in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Assays gemessen wurde. Diese Integrine schließen die Rezeptoren für Fibronektin, Vitronektin, Kollagen Typ I und IV und Laminin ein.
Andere Kationen üben ebenfalls einen Effekt auf die Bindungsavidität des Fibronektin-Rezeptors und anderer Integrine aus. Derartige Metalle schließen Co²&spplus;, Cd²&spplus;, Ni²&spplus; und Gd³&spplus; ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die drei erstgenannten bewirken einen Anstieg der Bindungsavidität. Gd³&spplus; führt zu einer Verminderung der Bindungsavidität und kann zur allgemeinen Abschwächung der Integrinaktivität eingesetzt werden. Eine derartige Modifikation der Bindungsavidität kann durch eine Reihe verschiedener Assays nachgewiesen werden, die in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen an Kationen durchgeführt werden. Hierzu gehören Assays zum Nachweis der Bindung von Integrin enthaltenden Liposomen an bestimmte Liganden, die Verwendung markierter Antikörper zur Bestimmung einer Bindung zwischen Integrinen und Liganden, die Verwendung markierter Integrine zur Bestimmung einer Integrin-Ligand-Bindung und die Affinitätschromatographie zur Bestimmung der Bindung von Integrinen an eine mit Liganden konjugierte Matrix. Da jeder dieser Assays unterschiedliche Aspekte der Bindungsavidität wie die Bindungsaffinität oder einen Anstieg in der Zahl der zur Bindung verfügbaren Rezeptoren reflektieren kann, kann es sein, daß die verschiedenen Assays nicht alle einen ähnlichen Effekt zeigen. Es wird davon ausgegangen, daß Kationen, die die Bindungsaktivität von Integrinen beeinflussen, eine die Integrinbindung modifizierende Aktivität aufweisen. Wenn durch eine oder mehrere Assays nachgewiesen wird, daß die Bindungsavidität in Gegenwart eines Kations gesteigert wird, geht man davon aus, daß das Kation eine die Integrinbindung fördernde Aktivität aufweist. Wenn durch einen oder mehrere Assays nachgewiesen wird, daß die Bindungsavidität in Gegenwart eines Kations vermindert wird, wird davon ausgegangen, daß das Kation eine die Integrinbindung inhibierende Aktivität aufweist.
Der Nachweis, daß die Integrinbindung fördernde Kationen die Bindungsavidität von Integrinen verändert, eröffnet eine Reihe von Anwendungen. Um die Bindungsavidität zu modifizieren, können die Integrinbindung fördernde Kationen entweder allein oder in Verbindung mit anderen Kationen bereitgestellt werden, wie die physiologisch prävalenten Ca²&spplus; und Mg²&spplus;. Beispielsweise kann die Reinigung von Integrinen wie auf einer mit Liganden konjugierten Matrixsäule vereinfacht werden. Eine derartige Säulenaufreinigung wurde beschrieben von Pytela et al., PNAS, 82:5766-5770 (1985). Demnach wird ein gegenüber dem interessierenden Integrin reaktiver Ligand an eine geeignete Trägermatrix wie Sepharose konjugiert, obgleich andere Matrixmaterialien wie Sephadex oder Agarose verwendet werden können. Derartige Liganden schließen intakte Integrinliganden als auch Fragmente derselben ein, wie das 110 kD-Fragment von Fibronektin und synthetische Peptide, die Arg-Gly-Asp enthalten. Eine das gewünschte Integrin enthaltende Lösung wird über die Säule geleitet, wodurch dem Integrin die Bindung an die Matrix ermöglicht wird. Anschließend wird eine Lösung über die Säule geleitet, die in der Lage ist, das gebundene Integrin von der Matrix abzulösen, wodurch jegliches gebundenes Integrin eluiert wird. In Gegenwart eines geeigneten, die Integrinbindung fördernden Kations in der Bindungslösung wird die Menge an säulengebundenem Integrin erhöht, was zu einer erhöhten Ausbeute an gereinigtem Integrin führt.
Darüber hinaus werden Assays zur Bestimmung der Gegenwart von entweder Integrinen oder ihren Liganden vereinfacht durch die gesteigerte Integrin-Bindungsavidität in Gegenwart von Kationen, die die Integrinbindung fördern. Beispielsweise stehen verschiedene Immunoassays zur Bestimmung der Gegenwart von Bindungspaaren, wie einem Rezeptor-Ligand, unter Verwendung markierter Antikörper zur Verfügung, die entweder gegenüber dem Liganden oder dem Rezeptor reaktiv sind. Derartige Verfahren sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt. Vgl. z.B. Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Hrsg.), Blackwell Scientific Publications (3. Auflage 1978). Geeignete Marker schließen Enzyme, Komponenten eines fluoreszierenden, lumineszierenden oder chemilumineszierenden Systems, und Radionuklide ein. Alternativ kann ein in ähnlicher Weise markierter Rezeptor oder ein markierter Ligand zur Bestimmung der Gegenwart des Liganden bzw. des Rezeptors in Anwesenheit von die Integrinbindung fördernden Kationen verwendet werden.
Die Integrinbindung fördernde Kationen erleichtern ferner die Zellmigration. Ein derartiges Ergebnis ist besonders überraschend, wenn man berücksichtigt, daß die Zellmigration sowohl eine Zellanheftung als auch eine Zellablösung erfordert. Der Umstand, daß Faktoren, die die Zellanheftung unterstützen, auch bei der Zellmigration behilflich sein würden, ist nicht zwangsläufig gegeben. Insbesondere mit Mn²&spplus; ist gezeigt worden, daß die Zellmigration sowohl in einem System des Invasionstyps als auch in einem Modell zur Wundheilung gesteigert wird. Die die Integrinbindung fördernden Kationen, vorzugsweise Mn²&spplus;, können direkt an der Stelle aufgebracht werden, wo eine Zellmigration erwünscht ist, wie beispielsweise auf eine Wunde oder eine Verbrennung, um die Heilung zu fördern. Das Kation kann auf verschiedene Weise verabreicht werden, wie durch Auftragen einer oder Immersion in eine Lösung, durch Injektion oder durch Bereitstellung des Kations in einem geeigneten Verband, wie einer Bandage oder einem innerlichen Reservoir. Darüber hinaus kann die Verabreichung in Verbindung mit einer Prothese oder einem Transplantat die Migration und die Anheftung von Wirtszellen erleichtern. Die Verabreichung im Rahmen langsam freisetzender oder fortdauernd freisetzender Systeme kann angewendet werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung aber nicht der Beschränkung der Erfindung.
Die Beispiele unter Verwendung von Ca²&spplus; und/oder Mg²&spplus; allein in physiologischen Konzentrationen sind Vergleichsbeispiele.

BEISPIEL I

Mn²&spplus; steigert die Bindung von Fibronektin-Rezeptor-Liposomen an Fibronektin

Der Effekt von Kationen auf die Bindung des Fibronektinrezeptors an seinen Liganden wurde untersucht, indem der Rezeptor in Liposomen eingeschlossen und die Anheftung des Rezeptor-Liposoms an eine mit Fibronektin beschichtete Oberfläche in Gegenwart verschiedener Kationen gemessen wurde.
Die Fibronektin-Rezeptoren wurden aus menschlicher Plazenta durch Affinitätschromatographie eines chymotryptischen Fibronektinfragments von 110 kDa nach dem Verfahren von Pytela et al., Cell, 40:191 (1985), und Pytela et al., Meth. Enzymol., 144:475- 489 (1987), mit den folgenden Veränderungen gereinigt. Das Fragment von 110 kDa korrespondiert mit dem von Pytela et al. (1985), a.a.O., beschriebenen Fragment von 120 kDa. Eine Abweichung von dem ursprünglichen Verfahren bestand in der Verwendung von Tris-gepufferter Saline (TBS, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,3) anstelle eines Phosphatpuffers, um die Löslichkeit der bivalenten Kationen sicherzustellen. Kurz gesagt wurde homogenisiertes Plazentagewebe einmal mit 2 Volumina kalter TBS enthaltend 1 mM CaCl&sub2;, 1 mM MgCl&sub2; und 3 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), gewaschen, zentrifugiert, und der Niederschlag wurde mit 1 Volumen kalter TBS enthaltend 100 mM Octyl-β-D-glukopyranosid (Calbiochem, La Jolla, CA), und Calcium, Magnesium und PMSF nach der Vorschrift von Pytela et al., (1985), a.a.O., extrahiert. Der klare Extrakt wurde bei 4ºC zunächst langsam auf eine reine Sepharose-Säule und anschließend auf Sepharose-Fibronektinfragment von 110 kDa aufgetragen. Die Affinitätssäule wurde bei Raumtemperatur mit 6 Volumina TBS enthaltend 25 mM Octyl-β-D-thioglukopyranosid (Calbiochem), und 1 mM CaCl&sub2; und 1 mM MgCl&sub2; gewaschen. Gebundene Rezeptoren wurden eluiert mit dem Waschpuffer, der anstelle von Calcium und Magnesium 20 mM EDTA enthielt. Die eluierten Rezeptoren wurden unmittelbar zur Herstellung von Rezeptor-Liposomen verwendet oder zur Aufbewahrung eingefroren. Bei einigen Versuchen wurden CaCl&sub2; und MgCl&sub2; während des Isolationsverfahrens durch 1 mM MnCl&sub2; substituiert.
Es wurden Phosphatidylcholin-Liposomen hergestellt und ihre Anheftung an Oberflächen im wesentlichen gemäß der Beschreibung von Pytela et al., (1985), a.a.O., analysiert. Kurz gesagt wurden die gereinigte Rezeptoren enthaltenden Liposomen hergestellt durch Dialyse gegen TBS ohne Kationen. Kleinere Mengen der resultierenden Liposomenpräparation wurden mit den geeigneten Kationen vermischt zu Beginn des Assays, in dem Liposomen hinsichtlich ihrer Anheftung an mit verschiedenen Proteinliganden beschichteten Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aus Kunststoff untersucht wurden. Die Proteine wurden in einer Konzentration von 25 ug/ml auf den Kunststoff aufgezogen, wobei bekannt ist, daß diese Konzentration zu einer maximalen Anheftung von Liposomen führt. Die spezifische Anheftung wurde berechnet durch Subtraktion der Anheftung an bovines Serumalbumin von der Anheftung an Fibronektin und andere Liganden. Die hinsichtlich der Inhibition in dem Anheftungsassay untersuchten Peptide wurden mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie nach Pierschbacher und Ruoslahti, J. Biol. Chem., 262:17294 (1987), gereinigt.
Kationentitrationen wurden durchgeführt, um die Effekte von Mn²&spplus; mit denjenigen von Ca²&spplus; und Mg²&spplus;, welches die relevantesten physiologischen Kationen sind, zu vergleichen. Wie in Figur 1 dargestellt ist, zeigen diese Versuche, daß Mn²&spplus; die Rezeptorbindung über einen weiten Konzentrationsbereich effektiver steigert als Mg²&spplus; oder Ca²&spplus;, und das Mn²&spplus; bei einer im Vergleich zu den anderen beiden Kationen sehr viel niedrigeren Konzentration wirksam ist. Mn²&spplus; forderte die Liposomenanheftung bei Konzentrationen von 3 uM, was einem Wert nahe der Gewebekonzentration an Mn²&spplus; entspricht. Wenn die Liposomenanheftung in Gegenwart von 1 mM Ca²&spplus; oder Mg²&spplus; und unterschiedlichen Konzentrationen an Mn²&spplus; gemessen wurde, konnte die von Mn²&spplus; verursachte Förderung deutlich demonstriert werden, selbst wenn die Konzentration an Mn²&spplus; lediglich ein Zehntel der Konzentration an Ca²&spplus; oder Mg²&spplus; betrug (vgl. Tabelle I). Tabelle I Effekt von Mn²&spplus; auf die Bindung von Fibronektin- Rezeptor-Liposomen an Fibronektin in Gegenwart von Ca²&spplus; oder Mg²&spplus; Zugabe von Mn²&spplus; keine 1,00* (Vergleich)
* Die Ergebnisse sind als multiple Bindungen angegeben, die für Ca²&spplus; oder Mg²&spplus; allein gemessen wurden. Der Mittelwert und die Standardabweichung aus zwei Versuchen sind angegeben.

BEISPIEL II

Effekte anderer bivalenter Kationen

Wie aus Tabelle II ersichtlich, können andere Kationen als Mn²&spplus; ebenfalls die Bindungsaktivität von Fibronektin-Rezeptor-Liposomen für Fibronektin beeinflussen, wobei die Herstellung und Analyse nach dem Verfahren des Beispiels I erfolgten. Insbesondere führten Co²&spplus; und Cd²&spplus; zu einer Steigerung der obigen in Anwesenheit von Ca²&spplus; und Mg²&spplus; erhaltenen prozentualen Anheftung. In einem ähnlichen Assay führte Zn²&spplus; zu einer Anheftung, die 128% des Kontrollwertes betrug. Ni²&spplus; war so effektiv wie die Kombination von Ca²&spplus; und Mg²&spplus;. Vier Kationen, nämlich Ba²&spplus;, Be²&spplus;, Fe²&spplus; und Fe³&spplus; führten zu einer geringeren Anheftung als Ca²&spplus;, aber führten die Fibronektin-Rezeptor-Anheftung auf einen oberhalb des bei Abwesenheit von entweder Ca²&spplus; oder Mg²&spplus; gefundenen Wert. Der Effekt von Cu²&spplus;, Gd³&spplus;, La³&spplus; und Sr²&spplus; auf die Fibronektin-Rezeptor-Anheftung war schwierig zu bestimmen, was offensichtlich zum Teil an Löslichkeitsproblemen lag, aber jeder einzelne Vertreter führte zu einer gesteigerten Anheftung, die über derjenigen lag, die in Abwesenheit von Ca²&spplus; oder Mg²&spplus; in mindestens einem Versuch gefunden wurde. Es war nicht möglich, ein definitives Ergebnis für Pb²&spplus; zu erhalten, was möglicherweise wiederum auf Löslichkeitsprobleme zurückzuführen ist. Tabelle II Effekt von Kationen auf die Bindung von Fibronektin- Rezeptor-Liposomen an Fibronektin Kation % Anheftung Ca²&spplus; und Mg²&spplus; (Vergleich)
Kleinere Mengen der Rezeptor-Liposomen-Zubereitungen wurden mit den angegebenen Kationen (1 mM) vermischt, und die Anheftung der Liposomen an die mit Fibronektin beschichteten Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurde analysiert. Die Ergebnisse sind angegeben im prozentualen Verhältnis zur Kontrollanheftung, die in Gegenwart von 1 mM CaCl&sub2; und 1 mM MgCl&sub2; gemessen wurde. Der Mittelwert und die Standardabweichung aus drei Versuchen sind angegeben.

BEISPIEL III

Mn²&spplus; verändert die Bindungsaffinität und -spezifität des Fibronektin-Rezeptors

Die Hemmung der Anheftung der Rezeptor-Liposomen durch lösliche Liganden wurde angewendet, um Veränderungen in der relativen Affinität des Rezeptors zu analysieren. Das Fibronektin-Zellanheftungsfragment von 110 kDa inhibierte die Anheftung der Rezeptor-Liposomen an Fibronektin auf konzentrationsabhängige Weise, wie in Figur 2 dargestellt. Es verminderte die Bindung um 50% bei 2 x 10&supmin;&sup7; M in Anwesenheit von Mn²&spplus;, und bei 9 x 10&supmin;&sup7; in Anwesenheit von Ca²&spplus;/Mg²&spplus;. Ein Vergleich dieser Konzentrationen weist darauf hin, daß Mn²&spplus; die relative Affinität des Rezeptors für das Fragment um einen Faktor von 4,5 erhöhte.
Ein Arg-Gly-Asp enthaltendes Peptid, Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro (GRGDSP), führte ebenfalls zu einer Hemmung der Anheftung der Rezeptor-Liposomen an Fibronektin. GRGDSP inhibierte die Bindung von mit Mn²&spplus; behandelten Fibronektin-Rezeptor-Liposomen bei sehr viel geringeren Konzentrationen als solchen, die zur Hemmung der mit Ca²&spplus;/Mg²&spplus; behandelten Liposomen erforderlich waren. Die Peptidkonzentration, die zu einer 50%-igen Hemmung führte, betrug 1,3 x 10&supmin;&sup5; M im Falle von Mn²&spplus;, und 6,7 x 10&supmin;&sup4; M im Falle von Ca²&spplus;/Mg²&spplus;. Ein Vergleich der Peptidkonzentrationen, die zu einer 50%-igen Hemmung führten, zeigt, daß Mn²&spplus; die relative Rezeptoraffinität für das Peptid um einen Faktor von 50 erhöhte. Diese Ergebnisse zeigen, daß Mn die Inhibierbarkeit der Rezeptoren hinsichtlich der Bindung an die Liganden erhöhte. Insbesondere die Hemmaktivität der kurzen synthetischen Peptide wird in Gegenwart von Mn²&spplus; gesteigert.

BEISPIEL IV

Fibronektin-Rezeptor-ELISA

Es wurde ein Enzym-gekoppelter Immunadsorbentassay unter Verwendung von Mn²&spplus; entwickelt, um die Rezeptorbindungsaktivität zu messen.
Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aus Kunststoff (Linbro, Titertek, Flow Laboratories) wurden mit 1 ug/ml Fibronektin oder anderen Proteinen in Tris-gepufferter Saline (TBS) über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet. Vor diesen Bindungsassays wurden die Platten zweimal mit TBS, die 0,01% Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat) (TBS-Tween) enthielt, und zweimal mit Wasser gewaschen. Der Fibronektin-Rezeptor wurde mit TBS verdünnt, die 20 mM Octyl-β-D-thioglukopyranosid und 1 mM MnCl&sub2; enthielt. Die Rezeptorverdünnungen wurden 90 Minuten lang bei Raumtemperatur in mit Fibronektin beschichteten Vertiefungen inkubiert. Die nicht gebundenen Rezeptoren wurden durch dreimaliges Waschen mit TBS entfernt, das Octylglukosid und Mn²&spplus; enthielt.
Die gebundenen Rezeptoren wurden nachgewiesen durch Inkubation mit gereinigten anti-Fibronektin-Rezeptor-Antikörpern des Kaninchens für eine Zeitdauer von 120 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt durch eine Inkubation über Nacht mit anti-Kaninchen-IgG der Ziege, gekoppelt an alkalische Phosphatase (Sigma). Die nicht gebundenen Antikörper wurden entfernt, indem zweimal mit TBS-Tween und zweimal mit Wasser gewaschen wurde. Die Enzymaktivität in den Vertiefungen nach Zugabe des Substrats für die alkalische Phosphatase (1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat (Sigma), in 1 M Diethanolamin, pH-Wert 9,8, enthaltend 1 mM MgCl&sub2;) wurde mittels eines Multikanal-Photometers (Titertek, Multiscan, Flow Laboratories) gemessen. Für jeden Assay wurden doppelte Bestimmungen durchgeführt. Die Kontrollen schlossen mit BSA beschichtete und nicht beschichtete Vertiefungen ein.
Bei Hemmexperimenten wurden die Verdünnungen von Fibronektin, die Fibronektinfragmente oder die Peptide in mit Fibronektin beschichteten Vertiefungen einer Mikrotiterplatte in Gegenwart einer konstanten Konzentration des Fibronektinrezeptors inkubiert (führte zu etwa 50% der maximalen Bindung im direkten Bindungsassay). Die gebundenen Rezeptoren wurden wie oben beschrieben nachgewiesen. Zur Untersuchung der Effekte von Ca²&spplus; und Mg²&spplus; erfolgte die Durchführung des Assays unter Verwendung von phosphatgepufferter Saline (PBS) anstelle von TBS, obgleich sie auch mit TBS erfolgen kann.
Mittels ELISA wurde eine dosisabhängige Bindung des Fibronektin- Rezeptors an Fibronektin festgestellt. In Gegenwart von Mn²&spplus; betrug die kleinste Menge an Fibronektin-Rezeptor, die nachgewiesen werden konnte, etwa 10 ng. Selbst bei den höchsten Konzentrationen des Rezeptors konnte lediglich eine minimale Bindung des Fibronektin-Rezeptors an Laminin und keine Bindung an Vitronektin, bovines Serumalbumin oder an nicht beschichtete Vertiefungen einer Mikrotiterplatte nachgewiesen werden. Die negativen Kontrollen zeigten, daß ein Weglassen des Rezeptors, des ersten Antikörpers, oder beiden zu einer Eliminierung des Signals für Fibronektin führte. Eine zur Beschichtung durchgeführte Titration des Fibronektins zeigte, daß die optimale Beschichtungskonzentration von Fibronektin 1 ug/ml betrug. Diese Beschichtungskonzentration wurde in den nachfolgenden Hemmversuchen zusammen mit einer Rezeptormenge eingesetzt, die zu etwa 50% der maximalen Bindung führte.
Fibronektin, die Zellanheftungsfragmente von 110 kDa und 11,5 kDa (Pytela et al., (1987)), und das aus der Fibronektin- Zellanheftungsstelle abgeleitete Peptid GRGDSP wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, die Bindung des Fibronektin-Rezeptors an Festphasen-Fibronektin im ELISA zu inhibieren. Das Fibronektinfragment von 110 kDa besaß die höchste Hemmaktivität, wobei eine halbmaximale Hemmung (ID&sub5;&sub0;) bei ungefähr 5 x 10&supmin;&sup9; M erhalten wurde. Die Hemmkapazität der anderen Liganden nahm in der Reihenfolge Fibronektin > GRGDSP > 11,5 kDa-Fragment ab, und die ID&sub5;&sub0;-Werte betrugen 8,6 x 10&supmin;&sup9; M, 8,8 x 10&supmin;&sup8; M bzw. 7,7 x 10&supmin;&sup7; M. Vergleiche Figur 4, die die Hemmung durch Fibronektin und das Peptid GRGDSP zeigt. Sie zeigt ferner, daß das nahe verwandte Peptid GRGESP 2000-fach geringer inhibitorisch ist als GRGDSP, und das ein nicht verwandtes Peptid im wesentlichen keine Aktivität besitzt.
Die oben beschriebenen Assays wurden durchgeführt in Gegenwart von Mn, um die Bindung des Rezeptors an Fibronektin zu steigern. In Gegenwart der physiologischen bivalenten Kationen Ca²&spplus; und Mg²&spplus; war die Sensitivität des Assays geringer. Diese Beobachtung bestätigte die in Relation zu Ca²&spplus; und Mg²&spplus; gesteigerte Affinität des Rezeptors für seinen Liganden in Gegenwart von Mn²&spplus;
Bei einem alternativen Nachweisverfahren wurden anstelle der Antikörper radioaktiv markierte Rezeptoren verwendet. Die Assays wurden in entfernbaren Mikrotitervertiefungen durchgeführt (Immunolon 2, Removawell, Dynatech Laboratories). Die Beschichtungseffizienz wurde untersucht, indem ¹²&sup5;I-Fibronektin in den Konzentrationen von 0,1, 0,5, 1,5 und 10 ug/ml über Nacht in Vertiefungen untersucht wurden. Nicht gebundenes Fibronektin wurde wie im ELISA weggewaschen, und die in den Vertiefungen verbliebene Radioaktivität wurde gemessen.
Um die optimale Beschichtungskonzentration von Fibronektin für die Rezeptorbindung herauszufinden, wurden dieselben Konzentrationen an unmarkiertem Fibronektin wie oben zur Beschichtung der Vertiefungen eingesetzt, gefolgt durch Zugabe einer konstanten Konzentration an ¹²&sup5;I-markiertem Fibronektin-Rezeptor (250 ng/ml). Nach einer Inkubation von 90 Minuten bei Raumtemperatur wurden die nicht gebundenen Rezeptoren wie im ELISA-Verfahren weggewaschen, und die gebundene Radioaktivität wurde gemessen. Es gabe eine dosisabhängige Bindung von ¹²&sup5;I-markierten Fibronektin-Rezeptoren an die Vertiefungen.
Die Affinitätskonstante zwischen Fibronektin und Fibronektin-Rezeptor wurde durch ein Austauschexperiment bestimmt. Eine einzelne Konzentration von ¹²&sup5;I-markiertem Fibronektin-Rezeptor (250 ng/ml) wurde eingesetzt, und sein Austausch wurde gemessen als Funktion steigender Konzentrationen des nicht-radioaktiven Rezeptors (0 bis 25 ug/ml). Die Beschichtungskonzentration von Fibronektin betrug 1 ug/ml, und eine nicht-spezifische Bindung wurde definiert als Menge an radioaktivem Rezeptor, die an Vertiefungen gebunden hatte, die mit 1 ug/ml BSA beschichtet waren. Die geschätzte Dissoziationskonstante betrug 3 x 10&supmin;&sup8; M.

BEISPIEL V

Mn²&spplus; erhöht die Ausbeute an Fibronektin-Rezeptor einer Affinitätschromatographie

Der Fibronektinrezeptor kann isoliert werden durch Affinitätschromatographie unter Verwendung des Fibronektinfragments von 110 kDa (vgl. Pytela et al., (1985), (1987), a.a.O.). Die Ausbeuten sind jedoch gering, da der Rezeptor lose an die Affinitätsmatrix bindet und teilweise durch den Waschpuffer entfernt wird. Die Rezeptorausbeute aus der Affinitätschromatographie wurde verbessert, indem Ca²&spplus;/Mg²&spplus; in den Chromatographie-Puffern durch 1 mM Mn²&spplus; ersetzt wurde. Die Ausbeute, geschätzt durch Densitometrie von Banden aus einer SDS-PAGE-Analyse, war 4-fach höher mit Mn²&spplus; als mit Ca²&spplus; und Mg²&spplus;, wie in Tabelle III dargestellt. Für das Scannen von Gelen, die mit Coomassie-Blau gefärbt waren, wurde ein Gelman-Densitometer verwendet. Drei ähnliche Versuche zeigten, daß dieser Anstieg in der Ausbeute repräsentativ war. Ferner führte Mn²&spplus; zu einer vergleichbaren Ausbeute, wenn 0,5% Nonidet P-40 (Calbiochem) als Detergenz anstelle von Octyl-β-D-Glukopyranosid eingesetzt wurde. Die mit oder Ca²&spplus;/Mg²&spplus; isolierten Rezeptorpräparationen verhielten sich in der SDS-PAGE ähnlich. Wenn der mit Mn²&spplus; isolierte Rezeptor im Liposomenanheftungsassay untersucht wurde, war die Bindung des Rezeptors im Falle von Mn²&spplus; um einige male höher als im Falle von Ca²&spplus;/Mg²&spplus;, wodurch der Schluß nahegelegt wird, daß der Effekt von Mn²&spplus; auf den Rezeptor reversibel ist. Tabelle III Densitometrie einer SDS-PAGE-Analyse eines in Gegenwart von Ca²&spplus;/Mg²&spplus; oder Mn²&spplus; isolierten Fibronektin-Rezeptors Kationen Rezeptor-Peakfläche 1 mM Ca²&spplus; und 1mM Mg²&spplus; (Vergleich)

BEISPIEL VI

Mn²&spplus; erhöht die Bindung anderer Integrine an Liganden

Der Vitronektin-Rezeptor wurde aus menschlicher Plazenta gereinigt, wie in Beispiel I für den Fibronektin-Rezeptor beschrieben, aber es wurde eine unterschiedliche Affinitätsmatrix verwendet, die das Peptid Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys enthielt. Das Peptid wurde mit einem Applied Biosystems Model 430A gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Der Vitronektin-Rezeptor wurde nach dem Verfahren des Beispiels I isoliert in Gegenwart von 1 mM Ca²&spplus; und 1 mM Mg²&spplus; oder von 1 mM Ca²&spplus; allein. Bei einer Reihe von Assays zur Liposomenanheftung führte Mn²&spplus; zu einer Steigerung der Bindung dieses Integrins an Vitronektin um 20 bis 50% gegenüber der für Ca²&spplus; und Mg²&spplus; gemessenen Bindung.
Der Typ I-Kollagen-Rezeptor wurde ebenso aus Plazenta isoliert unter Anwendung des Verfahrens des Beispiels I mit den folgenden Abweichungen. In diesem Verfahren wurde Mn²&spplus; für die Chromatographiepuffer verwendet, und die Affinitätsmatrix enthielt Typ I- Kollagen. Typ I-Kollagen-Rezeptor-Liposomen, die mit Ca²&spplus; und Mg²&spplus; behandelt waren, führten zu keiner meßbaren Bindung an Kollagen. In Anwesenheit von Mn²&spplus; wurde jedoch eine klare und spezifische Bindung an Kollagen gemessen.

BEISPIEL VII

Steuerung der Zellmigration in Assays zur Zellinvasion

Der Effekt von Mn²&spplus; auf die Zellmigration wurde bestimmt durch Untersuchung von Tumorzellen als Indikationssystem. Das invasive Verhalten wurde bestimmt unter Anwendung eines veränderten Membran-Invasions-Kultur-Systems (MICS), wie von Hendrix et al. (1985), Clin. Exp. Metastasis, 3:221-223, beschrieben, worauf hiermit Bezug genommen wird. Die verwendete Zellinie war eine mit A375M bezeichnete menschliche Melanomzelllinie, deren Ableitung von Kozlowski et al., J.N.C.I., 72:913 (1984), beschrieben worden ist, worauf hiermit Bezug genommen wird. Die Zellen wurden für die Untersuchungen ausgewählt, da bekannt ist, daß sie in leicht quantifizierbarer Anzahl durch das Membransystem migrieren. Als Kontrollzellen wurden nicht-invasive Fibroblasten eingesetzt. Sämtliche Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Gibco, Chagrin Fall, OH), unter Zusatz von 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum (Tissue Culture Biologicals, Tulare, CA) und 0,1% Gentamicin (Gibco) kultiviert. Die Zellen wurden aus den Kulturschalen in allen Assays unter Verwendung von 2 mM EDTA in PBS ohne Ca²&spplus; und Mg²&spplus; entfernt. Die Zellen wurden 48 Stunden lang mit 0,25 uCi/ml ¹&sup4;C-Thymidin (New England Nuclear, Boston, MA) in DMEM, das 2% fötales Rinderserum enthielt, radioaktiv markiert und anschließend entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von MnCl&sub2; in den oberen Bereich der MICS-Kammern ausgesät, die wie folgt hergestellt wurden.
Frische menschliche Plazenten wurden bei der Geburt erhalten, und in jedem Fall wurde das Amnion nahe der Region der Nabelschnur erhalten. Nach verschiedenen Spülschritten mit steriler PBS, Fungi-Zone/Penicillin/Streptomycin (Irvine Scientific, Irvine, CA) und wiederum PBS wurde das Amnion so zubereitet, daß es in speziell geformte MICS-Kammern paßte, wie sie von Gehlsen und Hendrix bezeichnet sind ((1987) Pigment Cell, 1:16-21, Figur 1, worauf hiermit Bezug genommen wird). Das Amnion wurde aseptisch zwischen die obere und untere Platte der MICS-Vorrichtung angeordnet, wobei die Epitheloberfläche zur oberen Platte ausgerichtet war. Die Befestigungsschraube wurde angezogen, und das überstehende membranöse Material wurde mit einem Skalpell entfernt. Bevor die Membran in die Kammer eingebracht wurde, wurden die Vertiefungen des Bodens (die "Zielvertiefungen") mit sterilem DMEM (Gibco) gefüllt, das 10% fötales Rinderserum enthielt. Das Epithelgewebe des Amnions wurde entfernt, indem es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit frisch hergestelltem 0,25 M Ammoniumhydroxid (NH&sub4;OH) behandelt wurde, gefolgt durch intensives Waschen mit PBS, wodurch eine freigelegte Basalmembran mit einem darunter liegenden kollagenösen Stroma übrigblieb. Auf diese Weise konnte die Wechselwirkung von Zellen mit einer extrazellulären Matrix ohne die Beeinträchtigung von Wirtszellen untersucht werden.
Die markierten Zellen wurden in jede obere oder "Aussaat"-Kammer" in einer Endkonzentration von 1,0 x 10&sup5;/ml in Serum enthaltendem DMEM überführt, und in einen befeuchteten Inkubator bei 37ºC mit 5% CO&sub2; und 95% Luft verbracht. Sämtliche Membranen wurden vor der Aussaat der Zellen sorgfältig auf Lecks untersucht.
Die Anzahl an Zellen, die in der Lage waren, in die Basalmembran und das darunter liegende kollagenöse Stroma einzudringen, wurde ermittelt, indem das Medium der unteren Vertiefungen (1,1 ml) nach jedem 24-stündigen Zuwachs und nach 72 Stunden über die seitlichen Öffnungen der MICS-Kammern entfernt wurde, ohne das laufende Experiment zu unterbrechen. Nachdem jede untere Vertiefung als Probe vorlag, wurden die unteren Vertiefungen mit frischem Medium aufgefüllt. Auf diese Weise konnte die Zellinvasion wiederholt in demselben Versuch über verschiedene Zeiträume analysiert werden. Die mit ¹&sup4;C-Thymidin radioaktiv markierten Zellen in allen Proben der unteren Vertiefungen wurden sedimentiert und anschließend in Scintillationsröhrchen überführt. Bei allen Versuchen wurden die gesammelten, mit ¹&sup4;C markierten Zellen anschließend mit 0,5 ml 1 N NaOH lysiert. Geringe Mengen von 100 ul Eisessigsäure wurden jedem Röhrchen zugegeben, um einer Chemilumineszenz vorzubeugen, und 10 ml ACS-Scintillations-Cocktail (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL) wurden zugegeben, bevor eine radioaktive Bestimmung unter Anwendung eines Scintillationszählers (Beckman Instruments, Brea, CA) erfolgte.
Die Steuerung der Migration der Amnionmembran durch Mn²&spplus; wurde untersucht, indem der oben beschriebene Assay durchgeführt wurde, wobei MnCl&sub2; in verschiedenen Konzentrationen (10 bis 1000 uM) in die oberen und unteren Vertiefungen der MICS-Kammern eingeschlossen wurde. Die Fähigkeit der A375M-Zellen, in das Amnion einzudringen, ist in Figur 5 für Mn²&spplus; bzw. Ca²&spplus; dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigen, daß Mn²&spplus; bei einer Konzentration von 100 uM zu einer Steigerung der Migration der A375M-Zellen nach 72 Stunden um 30% führte. Bei höheren Konzentrationen an Mn²&spplus; wird die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt und daher die Migration verringert.

BEISPIEL VIII

Gesteigerte Hemmung der Tumorzelleninvasion durch Adhäsionspeptide in Anwesenheit von Mn²&spplus;

Es hat sich gezeigt, daß die RGD-Sequenz enthaltende Peptide die Invasion von Tumorzellen durch die Amnionmembran im MICS-System inhibieren. Dieser Effekt wird auf die Hemmung der Funktion des Fibronektin-Rezeptors durch die Peptide zurückgeführt (Gehlsen et al., JCB, 106:925-930 (1988)). Da Mn²&spplus; die Affinität des Fibronektin-Rezeptors für GRGDSP stärker als für Fibronektin erhöht, wurde der Effekt des synthetischen Peptids mit dem oben beschriebenen Invasionsassay in Gegenwart von Mn²&spplus; untersucht. GRGDSP wurde dem Invasionsassay auf dem Wege einer Titration (10 -1000 ug/ml) mit entweder 100 uM MnCl&sub2; oder CaCl&sub2; zugegeben. Die Zellinvasion wurde demnach nach 72 Stunden berechnet.
Die Ergebnisse in Figur 6 zeigen, daß die zur 50%-igen Hemmung der Invasion erforderliche Konzentration 5 x 10&supmin;&sup5; M für Mn²&spplus; gegenüber 1,2 x 10&supmin;&sup4; für Ca²&spplus; betrug. Ein Kontrollpeptid GRGESP (E ist Glutaminsäure) bewirkte bei keinem der Kationen einen Effekt. Die Daten zeigen, daß in Gegenwart von Mn²&spplus; weniger Peptid zur Hemmung der Invasion erforderlich ist, als bei Ca²&spplus;.

BEISPIEL IX

Steuerung der Zellmigration in einem in vitro "Wunden"-Modell

Ein in vitro Wundassay wurde entwickelt, um die Wirkungen von Mn²&spplus; auf die Zellmigration in einen verwundeten (zellfreien) Bereich zu untersuchen, der mit verschiedenen Adhäsionsproteinen beschichtet wurde. Dieser Assay ermöglichte die Bestimmung der spezifischen Liganden und der jeweiligen Rezeptoren, die an dem Migrationsprozeß beteiligt sind. Insbesondere wurde dieser Assay angewendet, um die Zellmigration auf verschiedenen Substraten in Gegenwart von Mn²&spplus; zu untersuchen. A375M-Zellen wurden bis zur Konfluenz in Kulturschalen mit sechs Vertiefungen (Corning, New York, NY) kultiviert. Ein speziell ausgestalteter Kamm, der 4- 2 mm breite Spuren hinterläßt, wurde verwendet, um in der Zellschicht ein Kreuzmuster zu erzeugen, wodurch die Zellen entfernt wurden. Die zellfreien Spuren wurden anschließend 1 Stunde lang bei 37ºC mit einem der folgenden Liganden beschichtet: Fibronektin, Vitronektin, Typ I oder Typ IV Kollagen, bovines Serumalbumin oder Laminin. Diese Proteine wurden in PBS in einer Konzentration von 10 ug/ml gelöst und anschließend direkt auf die "verwundete" Zellschicht gegeben.
Den Kulturschalen wurde Standardkulturmedium zugegeben, das Ca²&spplus; und Mg²&spplus; sowie 100 uM MnCl&sub2; enthielt, während sich in den Kontrollschalen dasselbe Medium ohne Mn²&spplus; befand. Die Zellmigration wurde visuell festgehalten.
In Anwesenheit von Mn²&spplus; zeigten die A375M-Zellen gegenüber den Kontrollen eine zunehmende Migration oder Auffüllung der mit Fibronektin und Typ IV-Kollagen beschichteten freien Flächen. Diese Daten zeigen, daß die Migration von Zellen auf Substraten durch Bereitstellung von Mn²&spplus; gesteigert werden kann.

BEISPIEL X

Gd³&spplus; verringert die Bindung der Integrine an ihre Liganden

Die Fähigkeit von Gd³&spplus; zur Hemmung der Bindung von Integrinen wurde mit dem Liposomen-Anheftungssystem analysiert. Die Fibronektin-Rezeptor (FNR)- und Vitronektin-Rezeptor (VNR)-Liposomen wurden hergestellt durch Dialyse gegen TBS, die 1 mM CaCl&sub2; und 1 mM MgCl&sub2; enthielt. Geringe Mengen an GdCl&sub3; wurden den Liposomen zu Beginn des Assays zugegeben. Bei Konzentrationen von über 0,3 mM verursachte Gd³&spplus; eine signifikante Verringerung der Anheftung des Fibronektin-Rezeptors und Vitronektin-Rezeptors an ihre Liganden, wie in Tabelle IV dargestellt ist. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß Gd³&spplus; ein allgemeiner Inhibitor der Integrinfunktion ist, und daß es eingesetzt werden kann, um unerwünschte Effekte der Integrinaktivität abzuschwächen. Derartige Situationen schließen die Bindung von entzündlichen Zellen an der Stelle einer Gewebeverletzung ein, die beispielsweise durch eine ischämische Episode hervorgerufen wird, wie sie mit einem Herz- oder Hirninfarkt zusammenhängt. Tabelle IV Hemmung der Integrinbindung durch Gd³&spplus; Konzentration an Gd³&spplus; (mM) % Hemmung

Claims

1. Verwendung von Kationen mit einer die Integrinbindung modifizierenden Aktivität zur Herstellung eines Medikaments zur Förderung der Wundheilung, bei der die Bindungsavidität oder -affinität eines Integrins für seinen Liganden modifiziert worden ist durch Bereitstellung einer wirksamen Menge eines bivalenten oder trivalenten Kations mit einer die Integrinbindung modifizierenden Aktivität unter der Voraussetzung, daß das bivalente oder trivalente Kation nicht Zn²&spplus; oder Al³&spplus; oder eine physiologische Konzentration von Ca²&spplus; oder Mg²&spplus; ist.

2. Verwendung nach Anspruch 1, bei der das Kation ausgewählt wird aus Mn²&spplus;, Co²&spplus;, Cd²&spplus;, Ni²&spplus;, Zn²&spplus; und Gd³&spplus;.

3. Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Modifikation eine Steigerung der Bindungsavidität des Integrins für seine Liganden umfaßt.

4. Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Modifikation die Verringerung der Bindungsavidität des Integrins für seine Liganden umfaßt.

5. Verwendung nach Anspruch 1, bei der das Kation Mn²&spplus; ist.

6. Verwendung nach Anspruch 4, bei der die Kationen der Lanthanoidengruppe angehören.

7. Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Modifikation die Steigerung der Bindung eines Integrins aus einer Lösung an eine mit Liganden beschichtete Oberfläche durch Bereitstellung von Mn²&spplus; umfaßt.

8. Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Modifikation eine Steigerung der Bindung eines Liganden an einen Integrin-Rezeptor in Lösung durch Bereitstellung eines die Integrinbindung fördernden Kations umfaßt.

9. Verwendung nach Anspruch 8, bei der der Ligand ein Peptid ist, das die Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp enthält, wobei das Peptid eine die Zellanheftung fördernde Aktivität besitzt.

10. Verwendung nach Anspruch 8, bei der das Kation ein bivalentes Kation ist.

11. Verwendung nach Anspruch 8, bei der das Kation ausgewählt wird aus Mn²&spplus;, Co²&spplus;, Ni²&spplus; und Zn²&spplus;.

12. Verwendung nach Anspruch 1, bei der das Integrin in Lösung vorliegt.

13. Verwendung nach Anspruch 12, bei der das Kation ein bivalentes oder trivalentes Kation ist.

14. Verwendung nach Anspruch 12, bei der das Kation ausgewählt wird aus Mn²&spplus;, Co²&spplus;, Cd²&spplus;, Ni²&spplus;, Zn²&spplus; und Gd³&spplus;.

15. Verwendung nach Anspruch 12, bei der die Modifikation eine Steigerung der Bindungsavidität des Integrins für seinen Liganden umfaßt.

16. Verwendung nach Anspruch 1, bei der das Integrin ein Liposomenvesikel ist.

17. Verwendung nach Anspruch 16, bei der das Kation ausgewählt wird aus Mn²&spplus;, Co²&spplus;, Cd²&spplus;, Ni²&spplus;, Zn²&spplus; und Gd³&spplus;.

18. Verwendung nach Anspruch 16, bei der die Modifikation eine Steigerung der Bindungsavidität des Integrins für seinen Liganden umfaßt.

19. Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Modifikation eine Verringerung der Bindungsaffinität des Integrins für seine Liganden umfaßt.

20. Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Integrine ausgewählt werden aus Fibronektin-, Vitronektin-, Laminin-, Typ I-Kollagen- und Typ VI-Kollagen-Rezeptoren.

21. Verwendung nach Anspruch 1, bei der Mn²&spplus; ausgewählt wird zur Steigerung der Bindungsavidität der Fibronektin-, Vitronektin-, Kollagen Typ I- und/oder Kollagen Typ II-Rezeptoren für ihre jeweiligen Liganden.

22. Verfahren zur Reinigung von Rezeptoren durch Passage derselben durch und Elution derselben von einer Säule mit einer Matrix, an der ein Integrinligand haftet, umfassend die Bereitstellung eines die Integrinbindung fördernden Kations in der Bindungslösung.

23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem das die Integrinbindung fördernde Kation ferner Mn²&spplus; umfaßt.

24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, bei dem der Ligand das Fibronektinfragment von 110 kD ist.

25. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, bei dem der Ligand ein Peptid ist, das die Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp enthält, wobei das Peptid eine die Zellanheftung fördernde Aktivität besitzt.

26. Verfahren nach den Ansprüchen 22 bis 25, das ferner das Eluieren der Rezeptoren mit EDTA umfaßt.

27. Verwendung nach Anspruch 8, bei der die Liganden ausgewählt werden aus Fibronektin, Vitronektin, Typ I-Kollagen und Typ IV-Kollagen.

28. Verfahren zum Nachweis der Bindung von Integrinen an ihre Liganden, bei dem man:

a) den Integrinen die Bindung an die Liganden in Gegenwart von die Integrinbindung modifizierenden Kationen gewährt,

b) die Integrin-Liganden-Bindung nachweist.

29. Verfahren nach Anspruch 28, bei dem die Integrin-Liganden- Bindung nachgewiesen wird, indem markierte Antikörper bereitgestellt werden, die gegenüber den Integrin-Liganden- Komplexen reaktiv sind.

30. Verfahren zum Nachweis der Bindung von Integrinen an ihre Liganden, bei dem man:

a) die Integrine markiert, um sie nachweisbar zu machen, und

b) den markierten Integrinen die Bindung an die Liganden in Gegenwart von die Integrinbindung fördernden Kationen gewährt,

c) die Anwesenheit des gebundenen markierten Integrins nachweist.

31. Verfahren nach Anspruch 30, bei dem der nachweisbare Marker ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Radionukliden, Enzymen, fluoreszierenden oder lumineszierenden Molekülen.

32. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines Integrins, bei dem man:

a) dem Integrin die Bindung an einen immobilisierten Liganden in Anwesenheit eines die Integrinbindung fördernden Kations gewährt,

b) Antikörper bereitstellt, die gegenüber dem Integrin reaktiv sind, wobei die Antikörper zum Nachweis geeignet sind, und

c) die Bindung zwischen den Antikörpern und dem Integrin nachweist.

33. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eine Integrinliganden, bei dem man:

a) einem Integrin die Bindung an den Integrinliganden gewährt, und

b) die Bindung zwischen dem Integrin und dem Liganden nachweist.

34. Verfahren zur Förderung der Zellmigration durch Bereitstellung von die Integrinbindung fördernden Kationen.

35. Verfahren nach Anspruch 34, bei dem die die Integrinbindung fördernden Kationen bivalente Kationen sind.

36. Verfahren nach Anspruch 34, bei dem die die Integrinbindung fördernden Kationen ausgewählt werden aus Mn²&spplus;, Co²&spplus;, Cd²&spplus; und Ni²&spplus;.

37. Verfahren zur Hemmung der Bindung eines Integrins an einen Liganden durch Bereitstellung von Mn²&spplus; und einem löslichen Liganden, wobei der Ligand die Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp einschließt und eine die Zellanheftung fördernde Aktivität besitzt.