DE69427484T2 - Angiotensin ii rezeptor typ i spezifische monoklonale antikörper und hybridoma - Google Patents
Angiotensin ii rezeptor typ i spezifische monoklonale antikörper und hybridomaInfo
- Publication number
- DE69427484T2 DE69427484T2 DE69427484T DE69427484T DE69427484T2 DE 69427484 T2 DE69427484 T2 DE 69427484T2 DE 69427484 T DE69427484 T DE 69427484T DE 69427484 T DE69427484 T DE 69427484T DE 69427484 T2 DE69427484 T2 DE 69427484T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- receptor
- monoclonal antibody
- angiotensin
- peptide
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title claims abstract description 23
- 108050000824 Angiotensin II receptor Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 102000008873 Angiotensin II receptor Human genes 0.000 title claims abstract description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 101150059573 AGTR1 gene Proteins 0.000 claims description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 9
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 9
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 8
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 claims description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 208000036029 Uterine contractions during pregnancy Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 2
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims 1
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 101800000733 Angiotensin-2 Proteins 0.000 description 16
- 102400000345 Angiotensin-2 Human genes 0.000 description 16
- CZGUSIXMZVURDU-JZXHSEFVSA-N Ile(5)-angiotensin II Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=[NH2+])NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC([O-])=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 CZGUSIXMZVURDU-JZXHSEFVSA-N 0.000 description 16
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 13
- 229950006323 angiotensin ii Drugs 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 102000015427 Angiotensins Human genes 0.000 description 5
- 108010064733 Angiotensins Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 101100257624 Arabidopsis thaliana SPS4 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N [(1S,2R,3S,4S,5R,6S)-2,3,5-trihydroxy-4,6-diphosphonooxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@H]1OP(O)(O)=O MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 4
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 4
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 3
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 3
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 3
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000019100 sperm motility Effects 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- PQSUYGKTWSAVDQ-ZVIOFETBSA-N Aldosterone Chemical compound C([C@@]1([C@@H](C(=O)CO)CC[C@H]1[C@@H]1CC2)C=O)[C@H](O)[C@@H]1[C@]1(C)C2=CC(=O)CC1 PQSUYGKTWSAVDQ-ZVIOFETBSA-N 0.000 description 2
- PQSUYGKTWSAVDQ-UHFFFAOYSA-N Aldosterone Natural products C1CC2C3CCC(C(=O)CO)C3(C=O)CC(O)C2C2(C)C1=CC(=O)CC2 PQSUYGKTWSAVDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 101000890952 Rattus norvegicus Type-1A angiotensin II receptor Proteins 0.000 description 2
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229960002478 aldosterone Drugs 0.000 description 2
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010021118 Hypotonia Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 206010041277 Sodium retention Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 101710160880 Type-1A angiotensin II receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 210000004404 adrenal cortex Anatomy 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 108700025616 angiotensin II amide Proteins 0.000 description 1
- JYPVVOOBQVVUQV-CGHBYZBKSA-N angiotensinamide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JYPVVOOBQVVUQV-CGHBYZBKSA-N 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 208000017561 flaccidity Diseases 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 238000005222 photoaffinity labeling Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000002315 pressor effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000036454 renin-angiotensin system Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035922 thirst Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/04—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for inducing labour or abortion; Uterotonics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige hybridomale Zellinie und insbesondere eine neue hybridomale Zellinie, die monoklonale Antikörper ausscheidet, welche fähig sind, an den AT&sub1;-Subtypus des Angiotensin-II-Rezeptors (AT&sub1;-Rezeptors) anzubinden. Die Erfindung betrifft außerdem durch das Hybridom ausgeschiedene monoklonale Antikörper, die in einem Testkit, welches verschiedene diagnostische und überwachende Anwendungen aufweist, verwendet werden können. Sie betrifft ferner die Verwendung der monoklonalen Antikörper in therapeutischen Anwendungen wie der Kontrolle der Anregung von glatten Muskeln.
- Das Hormon Antiotensin-II bildet einen Teil des Renin- Angiotensin-Systems, das bei der Kontrolle der Elektrolytbalance und des Blutdrucks im Körper hilft. Es gibt verschiedene Gewebe im Körper, auf die Ang-II wirkt, diese beinhalten die Nebenniere, die Gebärmutter, die Leber, das Gehirn und die Nieren.
- Unter den verschiedenen nachgewiesenen Funktionen von Angiotensin-II ist Angiotensin-II dafür bekannt, die Kontraktion der glatten Muskelzellen anzuregen. Es regt die Kontraktion der glatten Muskelzellen in den Blutgefäßwänden an und verursacht so Gefäßkontraktionen, die zu Bluthochdruck führen. Die meisten Behandlungen bei Bluthochdruck werden die Blockierung der Funktion des Angiotensins auf die eine oder andere Art beinhalten. Glatte Muskeln treten auch in anderen Bereichen wie z. B. der Gebärmutter, dem Verdauungstrakt und anderswo auf.
- Ang-II regt auch die Ausscheidung von Aldosteron durch die Nebennierenrinde an. Aldosteron ist ein starkes Hormon, das in erster Linie auf die Nieren wirkt, um die Natriumzurückbehaltung zu fördern und so inter alia die blutdruckerhöhende Wirkung von Angiotensin, das direkt auf die Vaskulatur wirkt, zu erhöhen.
- Man weiß, daß Ang-II auf verschiedene Bereiche im Gehirn wirkt, und eine seiner Handlungen in Tieren ist die Steuerung von Durst und Trinken.
- Angiotensin weist auch ernährende Wirkungen auf die Vaskulatur auf und fördert das Wachstum der Muskeln in den Arterienwänden. Es wird auch angenommen, daß es gefäßbildend ist; das heißt, es verursacht die Gefäßbildung von sich neu entwickelndem Gewebe.
- Die Handlungen von Angiotensin-II in Zellen werden durch zwei wichtige zellständige Signalmechanismen vermittelt. Wenn das Hormon an seinen Rezeptor anbindet, aktiviert es ein bestimmtes Enzym, Phospholipase C, das auf einen Phosphatidylinositol genannten Bestandteil der Zellmembran wirkt. Dieser wird durch das Enzym in zwei Komponenten gespalten, die Inositoltriphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) genannt werden. Beide Komponenten sind an der Auslösung weiterer Wirkungen in der Zielzelle beteiligt. IP3 regt erhöhte zelluläre zytosolische Calziumkonzentrationen an, die wiederum andere zelluläre Reaktionen hervorrufen, während DAG ein anderes bestimmtes, Proteinkinase C (PKC) genanntes Enzym anregt.
- Bei den meisten der nachgewiesenen Wirkungen von Ang-II wurde festgestellt, daß sie über den AT&sub1;-Subtypus des Ang- II-Rezeptors erfolgen, der ein Sieben-Transmembran-Bereichsrezeptor ist. Dieser Rezeptor wurde von verschiedensten Geweben geklont und sequenziert, und es wurde festgestellt, daß es sich dabei um ein Aminosäurepolypeptid mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von rund 40 kD (Bernstein und Alexander, (1992), Endocr. Rev., 13, 381- 386) handelt. Untersuchungen, die Photoaffinitätsmarkierung und Vernetzungsmittel benutzten, haben auf Molekulargewichte für reife Rezeptoren von etwa 65 kD und 116 kD hingedeutet, die eine Glycosylierung von Asparaginresten innerhalb des extrazellulären Bereichs wiederspiegeln könnten.
- Während polyklonale Antikörper und anti-idiotypische Antikörper zum Ang-II-Rezeptor bereitet wurden, von denen vorausgesetzt wurde, daß der Rezeptor ein Molekulargewicht von 60 bis 95 kD bzw. 63 kD aufweist, war bisher noch niemand dabei erfolgreich, einen monoklonalen Antikörper zu diesem Rezeptor zu bereiten.
- Garcia u. a. beschreiben in Science, 257, 502-507, (1992), die Bereitung eines monoklonalen Antikörpers zum Hormon Ang-II selbst.
- Couraud beschrieb in J. Immunol., 138(4), 1164-8, (1987), die Bereitung eines anti-idiotypischen Serums von einem Kaninchen, das mit einem Anti-Angiotensin-II-monoklonalen Antikörper immunisiert war. Pfister et al. beschrieben in Regul. Pept., 44(2), 109-17, (1993), die Bereitung eines anti-idiotypischen Antikörpers, der am Angiotensin-II- Rezeptor anband. Die Bereitung polyklonaler Antikörper zum AT&sub1;-Subtypus des Angiotensin-II-Rezeptors wurde von Zelezna et al. in Biochem. & Biophys. Res. Co mm., 183(2), 781-788, (1992), und Paxton et al. in Hypertension, 21(6), 1062- 1065, (1993), beschrieben. Phillips et al. beschrieben in Am. J. Physiol., 264(6), 989-95, (1993), die Bereitung polyklonaler Antikörper zu den Aminosäuren 225 bis 257 des AT&sub1;-Rezeptorproteins, während Richards et al. in Hypertension, 21(6), 1062-1065, (1993), nur ein gegen die Aminosäuren 14 bis 23 der vaskulären Rattenmuskel-AT&sub1;-Rezeptorsequenz erstelltes Antiserum erwähnten, ohne die Bereitung von monoklonalen Antikörpern zu erwähnen.
- Es wurde nun herausgefunden, daß durch Immunisierung von Mäusen mit einem synthetischen Peptid, das den Aminosäureresten 8 bis 17 des glatten vaskulären Rattenmuskel-AT&sub1;- Rezeptors (Murphy, T. J. et al., (1992), Nature, 351, 233- 236), entspricht, und anschließende Verschmelzung von Milzzellen der immunisierten Mäuse mit Mausmyelomzellen eine neue hybridomale Zellinie hergestellt wird, die monoklonale Antikörper zum AT&sub1;-Subtypus des Ang-II-Rezeptors ausscheiden.
- Nach einem Gesichtspunkt der Erfindung wird eine hybridomale Zellinie angeboten, die monoklonale Antikörper erzeugt, welche fähig sind, an den AT&sub1;-Subtypus des Angiotensin-II-Rezeptors anzubinden. Eine hybridomale Zellinie, die derartige monoklonale Antikörper ausscheidet, wurde am 24. Juli 1993 nach dem Budapester Vertrag bei der European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Großbritannien, hinterlegt und mit der Hinterlegungsnummer 93072117 gekennzeichnet.
- Eine solche hybridomale Zellinie erzeugt Antikörper, die spezifisch an die Aminosäurereste 8 bis 17 des glatten vaskulären Rattenmuskel-AT&sub1;-Rezeptors anbinden. Es wurde jedoch festgestellt, daß die monoklonalen Antikörper an den AT&sub1;-Rezeptor in Rindergewebe und menschlichem Gewebe ebenso wie in Rattengewebe anbinden würden. Bis heute wurde diese Sequenz von Aminosäureresten gefunden und ist daher in allen bisher geklonten mammalischen AT&sub1;-Rezeptoren konserviert. Somit erzeugt die hybridomale Zellinie Antikörper, die spezifisch an ein Peptid mit der nachstehenden Aminosäuresequenz anbinden:
- H&sub2;N-Glu-Asp-Gly-Ileu-Lys-Arg-Ileu-Gln-Asp-Asp-COOH
- Nach einem zweiten Gesichtspunkt der Erfindung wird ein monoklonaler Antikörper angeboten, der an den AT&sub1;-Subtypus des Angiotensin-II-Rezeptors anbindet. Derartige monoklonale Antikörper binden spezifisch an die Aminosäurereste 8 bis 17 des mammalischen AT&sub1;-Rezeptors an, das heißt, sie binden spezifisch an ein Peptid, das die oben angegebene Aminosäuresequenz aufweist, an.
- Eine hybridomale Zellinie nach der Erfindung kann durch Immunisierung von durch Inzucht erhaltenen Mäusen mittels einer auf diesem Gebiet allgemein bekannten Technik (Kohler und Milstein, (1975), Nature, 256, 495-497) erfolgen. Ein Peptid, das den Aminosäureresten 8 bis 17 (extrazellular) des veröffentlichten glatten vaskulären Rattenmuskel-AT&sub1;- Rezeptors entspricht, wurde synthetisiert. Das Peptid wurde dann zu Rinderserumalbumin konjugiert und zur Immunisierung von Mäusen verwendet.
- Im Anschluß an eine Booster-Injektion des Peptid-BSA-Konjugats wurden die Mausmilzen entfernt und die Splenozyten mit Mausmyelomzellen kombiniert. Gemischte Myelom-Lymphozyt- Hybriden wurden nach Wachstum in Hypoxanthin, Thymidin und Aminopterin in einem passenden Zellkulturmedium ausgewählt.
- Das Vorhandensein von hybridomalen Zellinien, die monoklonale Antikörper zum AT&sub1;-Subtypus des Angiotensin-II-Rezeptors herstellen, wurde zuerst durch Screening des hybridomal konditionierten Mediums zur Bindung an eine Rattenleberzellaufschlämmung festgestellt. Eine solche positive Bindung wurde unter Verwendung von Peroxidase-konjugierten Kaninchen-Anti-Maus-Immunoglobin(igG)-Antikörpern festgestellt. Nach dem ursprünglichen Screening wurden die Zellkulturen, die positive Ergebnisse zeigten, ausgeweitet und unter Verwendung eines Fluorescein-konjugierten Kaninchen-Anti-Maus (IgG)-Antikörpers hinsichtlich spezifischer Bindungen an Rattennebennierenglomerulen auf sowohl gefrorenen Abschnitten als auch verteilten Zellabstrichen getestet. Die Vollständigkeit der durch das Hybridom erzeugten Anti-AT&sub1;-Rezepter-monoklonalen Antikörper wurde durch Bindung an Ratten-AT1A-Rezeptoren, die vorübergehend durch transfizierte Cos-7-Zellen geäußert wurden, bestätigt.
- Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung können mit Verbindungen, die bei verschiedenen Wellenlängen fluoreszieren, markiert werden, so daß die Stelle und die Verteilung von AT&sub1;-Rezeptoren in Körpergeweben durch immunohistologische Techniken bestimmt werden können. Beispielsweise wurden AT&sub1;-Rezeptoren unter Verwendung dieses monoklonalen Antikörpers in Brusttumoren gefunden, so daß dieser Antikörper auf dem Gebiet der Krebsdignostik nützlich sein kann.
- Zusätzlich wurde unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung eine bisher unbekannte Stelle der Wirkung von Angiotensin-II entdeckt. Es wurde herausgefunden, daß Spermienschwänze sowohl von Menschen als auch von Ratten den Angiotensin-II-Rezeptor äußern, und die Physiologie der Steuerung seines Ausdrucks zur Möglichkeit führt, daß das Hormon bei der Kontrolle der Spermienbeweglichkeit sehr wichtig sein könnte, was eine mögliche Wirkung auf die männliche Fruchtbarkeit hätte. Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung könnten daher in einem Standard-Radioimmunoassay oder einem heterologen Enzym-Immunoassay verwendet werden, um die Spermienbeweglichkeit zu untersuchen und möglicherweise zu messen und auch bei der Verhütung verwendbar sein.
- Nach einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Diagnosekit angeboten, das die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung an einem detektierbaren Label angebracht aufweist. Derartige detektierbare Label beinhalten Radioisotope, Enzyme und fluoreszierende Verbindungen.
- Es wurde festgestellt, daß der Zusatz des monoklonalen Antikörpers nach der vorliegenden Erfindung zu lebenden Zellen die Angiotensin-II-verursachte IP3-Reaktion hemmt, doch keine Wirkung auf die PKC-Aktivierung aufweist. Daher tritt der Antikörper spezifisch mit nur einem der beiden durch Angiotensin-II angeregten Hauptsignalwege in Wirkung. Diese Eigenschaft kann experimentell zur Unterscheidung zwischen den Wirkungen dieser beiden Wege, aber auch in therapeutischen Anwendungen benutzt werden. Beispielsweise können die monoklonalen Antikörper bei der Kontrolle der Gefäßkontraktionen verwendet werden und daher zur Behandlung von Bluthochdruck benutzt werden, aber auch zur Steuerung der Menstruation und zur Kontrolle von Gebärmutterkontraktionen zur Verhinderung von Fehlgeburten verwendet werden.
- Außerdem können diese monoklonalen Antikörper sowohl in der Immunohistochemie als auch in der Immunoelektronenmikroskopie verwendet werden und können Anwendungen beim Immunoblotten als auch bei der immunozytologischen Färbung aufweisen.
- Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel veranschaulicht.
- Ein Peptid wurde entsprechend den Aminosäureresten 8 bis 17 des veröffentlichten glatten vaskulären Rattenmuskel-AT&sub1;- Rezeptors mit dem Zusatz eines Cysteinrests zur Erleichterung der anschließenden Konjugation zu Rinderserumalbumin (BSA) an entweder dem Carboxylende oder dem Aminoende über eine N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat-Brücke (SPDP-Brücke) synthetisiert. Die Synthese erfolgte unter Verwendung der FMOC-Chemie auf einer automatisierten Synthesevorrichtung gefolgt von einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen. FMOC-Chemie ist die Verwendung von fluorenylmethoxicarbonyl-geschützen Aminosäuren bei der Peptidsynthese.
- Zur Bereitung der Peptid-BSA-Konjugate wurde eine 0,2 mM- Lösung von BSA in einem entgasten 100mM-Natriumphosphatpuffer (SPSC-Puffer, pH-Wert 7,5) durch sechzigminütige Inkubation bei Raumtemperatur mit 20 mM SPDP (in absolutem Ethanol) bei einem Verhältnis von 9 : 1 (v/v), die durch eine Dialyse im SPSC-Puffer gefolgt wurde, "aktiviert". 3 mg des Peptids in 1,2 ml SPSC-Puffer wurden dann mit 6 mm des "aktivierten" BSA sechzig Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Balb-C/c-Mäuse (acht Wochen alt) wurden dann durch subkutane Injektion mit 0,2 ml einer 1 : 1- Emulsion des Peptid-BSA-Konjugats im SPSC-Puffer (etwa 400 ug/ml Peptid entsprechend) und Freunds vollständigem Adjuvans immunisiert. Dieser Vorgang wurde durch eine Booster-Injektion nach vier Wochen, bei der eine gleichartige Emulsion von Peptid-Konjugat in Freund's unvollständigem Adjuvans verwendet wurde. Vier Tage später wurden die Milzen der Mäuse entfernt.
- Sp2/0-Ag-14-Mausmyelomzellen wurden in einem RPMI 1640- Medium, dem 20% (v/v) fötales Rinderserum (FBS) beigegeben war, gezüchtet. Diese Myelomzellen wurden mit von den immunisierten Mäusen erhaltenen Milzzellen kombiniert und die Bildung von verschmolzenen Hybriden durch Verwendung von 40% (v/v) Polyethylenglykol unterstützt. Gemischte Myelom-Lymphozyten-Hybride wurden nach Kultur unter Verwendung von RPMI, das 20% FBS und Hypoxanthin (13,6 mg/l), Aminopterin (0,19 mg/l) und Thymidin (3,88 mg/l) (HAT) (Galfre und Milstein, (1981), Methods Enzymol., 73, 3-46) in einer Platte mit 96 Wannen ausgewählt.
- Nach 14 Tagen der HAT-Auswahl wurde das hybridomkonditionierte Medium entfernt und nach der Anbindung an eine Rattenleberzellenaufschlämmung, die sorgfältig mit serumfreiem Medium gewaschen und unter Verwendung von 3,7% (v/v) Formaldehyd in 10 mM phosphatgepufferter Salzlake (PBS, pH-Wert 7,3) auf poly-L-lysinüberzogene Platten mit 96 Wannen fixiert wurde, gescreent. Ein Peroxidase-konjugierter Kaninchen-Anti-Maus-Immunoglobin(IgG)-Antikörper wurde benutzt, um die positive Anbindung festzustellen, und dies wurde mit imidazolhaltigem Diaminobenzidin(DAB)- Reagens als braune Färbung sichtbar gemacht. Nach dem ersten Screening wurden Zellen von positiven Wannen in Platten mit 24 Wannen erweitert und in RPMI 1640, das 20 & Myoclone (erhalten von Gibco BRL, Uxbridge, Großbritannien) und Hypoxantin (13,6 mg/l) und Thymidin (0,19 mg/l) enthielt, und dem 10% v/v thymozytenkonditioniertes Medium beigegeben war, gezüchtet. Die konditionierten Medien wurden dann unter Verwendung eines Fluorescein-konjugierten Kaninchen-Anti-Maus-IgG wie durch Laird, S. M. et al. in Acta Endocrinologica (Copenh.) (1988), 19, 420-426, beschrieben hinsichtlich einer spezifischen Anbindung an Rattennebennierenglomerulen auf sowohl gefrorenen Abschnitten als auch verteilten Zellabstrichen getestet. Glomerulenspezifische Bestände wurden dann durch beschränkende Verdünnung wie durch Goding, J. W. in J. Immunol. Methods, (1980), 39, 285-306, beschrieben, geklont.
- Ratten-AT1A-Rezeptoren wurden wie von Barker, S. et al. in Biochem Biophys. Res. Commun., (1993), 192, 392-398, beschrieben, vorübergehend in COS-7-Zellen geäußert. Die Zellen wurden auf Eis in einem 50 mM Tris-HC-Puffer (ph- Wert 7,4), der Aprotinin (1ug/ml), einen Sojabohnentrypsinhemmstoff (1 ug/ml), Phenylmethylsulfonylfluorid (30 ug/ml) und Ethylendiamintetraessigsäure EDTA (300 u g/ml) enthielt, beschallt und bei 800 g fünf Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert. Der sich ergebende Überstand wurde bei 100.000 g eine Stunde lang bei 4ºc zentrifugiert. Der partikuläre Anteil wurde dann erneut im obigen Puffer aufgeschlämmt und verdünnt, um 100 ug Protein/25 ul zu ergeben. Das Screening und Cloning-Präparat wurde dann dreißig Minuten lang bei 4ºC unter Anwesenheit von 1% (v/v) Triton X100 (Handelsmarke) inkubiert, um die Membranproteine löslich zu machen. Scheintransfizierte COS-7- Zellen wurden auf die gleiche Weise behandelt.
- 100 g der löslich gemachten Proteine, die vom Membrananteil von COS-7-Zellen erhalten wurden und wie oben bereitet wurden, wurden in jede Wanne gegeben und die Proteine wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese (SDS-PAGE) auf einem 8%igen Gel, die für etwa vier Stunden bei 200 V lief, voneinander getrennt. Molekulargewichtsmarkierungsstoffe (106 kD bis 18,5 kD) wurden ebenfalls eingefüllt. Die Proteine wurden dann über Nacht bei 200 mA zu Hybond-verstärkten Chemilumineszenz(ECL)-Nitrocellulosemembranen elektroübertragen. Die Membranen wurden unter Verwendung von PBS, das 10% (v/v) Milchprotein enthielt, für eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Nach einer sorgfältigen Wäsche mit PBS, das 0,1 % (v/v) Tween 20 (Handelsmarke) (PBS-T) enthielt, wurden die Membranen für eine Stunde bei Raumtemperatur mit primären Antikörpern (1 : 20 v/v in PBS-T) inkubiert. Die Membranen wurden wie vorher mit PBS-T gewaschen und dann für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur mit meerrettichperoxidasegekoppelten Schaf-Anti-Maus-Ig-Antikörpern bei einer Verdünnung von 1 : 5000 in PBS-T inkubiert. Nach einer weiteren sorgfältigen Wäsche mit PBS-T wurden die Membranen mit einem ECL-Reagens behandelt und durch Hyperfilm-ECL-Aussetzung Chemiluminiszenz festgestellt.
- Unter den interessanten hybridomalen Klonen war einer, der Antikörper ausschied, und der als Zellinie mit der Hinterlegungsnummer 93072117 bei der European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Großbritannien, hinterlegt wurde. Zur Bestätigung, daß diese Zellinie wirklich Antikörper erzeugte, die den AT&sub1;-Rezeptor erkannten, wurden SDS-PAGE und Immunoblotting von löslich gemachten Proteinen, die vom Membrananteil von COS-7-Zellen, welche mit Rattennebennieren-AT1A-Rezeptor-cDNA transfiziert waren, erhalten wurden, wie oben beschrieben ausgeführt. Fig. 1 zeigt, daß der durch diese Zellinie erzeugte Antikörper zwei bedeutende Proteinarten mit Molekulargewichten von annähernd 40 und 60 kG identifizierte. Diese wurden in Parallelproben von scheintransfizierten COS-7-Zellvergleichsproben nicht festgestellt.
- Von zwölf Freiwilligen und Patienten der durch das Newham Hospital unterstützten Fruchtbarkeitsklinik wurden menschliche Spermienproben erhalten. Die Proben wurden in einem abgewandelten zumindest erforderlichen Medium mit Earle's Salzen (MEM) und Glutamin aufgeschlämmt und in einer Makler-Kammer unter Verwendung eines Olympus-Invertmikroskops, das mit einer Olympus ARTF-2-Videokamera ausgerüstet war, betrachtet. Felder wurden auf Videoband aufgezeichnet und die prozentuelle Beweglichkeit bewertet.
- Die prozentuelle Beweglichkeit wurde bei der Wiedergabe des Videobandes durch Standbilder zur Zählung aller Spermien innerhalb eines Felds und anschließenden Vorwärtslauf zur Zählung der unbeweglichen Spermien, d. h., jener Spermien, die sich während des Beobachtungszeitraums nicht in ein benachbartes Quadrat (100 um) auf dem Makler-Kammer-Gitter bewegten, beurteilt. In der Praxis war eine strenge Verwendung dieser Bestimmung kaum nötig, da die Spermien entweder völlig unbeweglich waren oder sich frei fortbewegten.
- Eine Serie von Proben wurde zur Kontrolle zurückbehalten. Einer zweiten Serie wurde Angiotensin-II-Amid (10 nMol/l) beigegeben. Eine dritte Serie wurde vor der Beigabe von Angiotensin mit monoklonalen Antikörpern zum AT&sub1;-Rezeptor behandelt.
- Die Geschwindigkeit wurde durch vorwärts progressive Zeitstoppung der Spermien, die das Makler-Kammer-Gitter überquerten, und händische Zeitstoppung gemessen.
- Aus Fig. 2(a) ist ersichtlich, daß die Anregung mit Angiotensin-II die vorwärts progressive Geschwindigkeit im Vergleich mit den nicht behandelten Kontrollproben deutlich anregte, während der Zusatz des monoklonalen Antikörpers die Reaktion auf Angiotensin-II hemmte.
- Aus Fig. 2(b) ist ersichtlich, daß für die Wirkung auf den Prozentsatz der beweglichen Spermien gleichartige Ergebnisse erzielt wurden.
- Die Gebärmutter einer Wistar-Ratte (350 g) wurde entnommen und in ein zumindest erforderliches Medium (MEM) gegeben und bei Raumtemperatur gehalten. Das Organ wurde von Fett gereinigt und ein Gewebestück mit einer Länge von 3 cm von einem Horn abgeschnitten und unter Verwendung von Nahtmaterial an einen basalen isotonischen Meßwandler gebunden, der mit einem Analog-Digital-Umformer verbunden war. Das sich ergebende Signal wurde unter Verwendung einer Chart Software durch einen Computer analysiert. Ein kleines Gewicht (etwa 1 g) wurde angebracht, um die Gewebsschlaffheit aufzunehmen. Das Gewebe wurde dann zur Gänze in ein Inkubationsmedium (MEM) in einem bei 37ºC gehaltenen isolierten Organbad eingetaucht und inkubiert, bis regelmäßige Kontraktionen mit konstanter Amplitude beobachtet wurden. Ein frisches Medium wurde verwendet und dem Gewebe erneut gestattet, ins Gleichgewicht zu kommen. Die Wirkungen von Angiotensin-II und dem monoklonalen Antikörper wurden durch direkte Beigabe dieser Wirkstoffe zum Organbad beurteilt. Das Gewebe wurde zwischen unterschiedlichen Versuchsbedingungen in einigen Auswechslungen des Mediums gewaschen.
- Aus Fig. 3(a) ist ersichtlich, daß bei einer Beigabe von Angiotensin-II in einem Ausmaß von 0,1 nMol/l bei Pfeil (A) die Amplitude und die Frequenz darauf folgender Gebärmutterkontraktionen deutlich erhöht war.
- Aus Fig. 3(b) ist ersichtlich, daß eine anschließende Beigabe des monoklonalen Antikörpers bei Pfeil (B) die Rate und die Stärke der Kontraktionen nicht nur unter das durch Angiotensin angeregte Niveau, sondern auch unter das basale Niveau drückte.
- (1) Allgemeine Informationen
- (i) Anmelder
- (A) Name: Queen Mary & Westfield College
- (B) Straße: Mile End Road
- (C) Stadt: London
- (E) Staat: Großbritannien
- (F) Postleitzahl: E1 4NS
- (A) Name: VINSON, Gavin Paul Queen Mary & Westfield College
- (B) Straße: Mile End Road
- (C) Stadt: London
- (E) Staat: Großbritannien
- (F) Postleitzahl: E1 4NS
- (A) Name: BARKER, Stewart Queen Mary & Westfield College
- (B) Straße: Mile End Road
- (C) Stadt: London
- (E) Staat: Großbritannien
- (F) Postleitzahl: E1 4NS
- (ii) Titel der Erfindung: Neues Hybridom und dadurch hergestellte Antikörper
- (iii) Anzahl der Sequenzen: 1
- (iv) Computerlesbare Form
- (A) Art des Mediums: Diskette
- (B) Computer: IBM PC kompatibel
- (C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
- (D) Software: PatentIn Release #1,0 Version #1,25 (EPC)
- (v) Aktuelle Anmeldedaten Anmeldernummer: PCT/GB94/
- (vi) Frühere Anmeldedaten
- (A) Anmeldenummer: GB9319877.8
- (B) Anmeldedatum: 27. September 1993
- (2) Informationen für Seq. Id. Nr.: 1
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge:
- (B) Art: Aminosäure
- (C) Strangigkeit: unbekannt
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekülart: Peptid
- (vi) Originalquelle:
- (H) Zellinie: Hybridom (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 1:
Claims (11)
1. Eine hybridomale Zellinie, welche einen monoclonalen Antikörper
erzeugt, wirkend gegen ein Peptit des AT&sub1;-Subtypen des
Angiotensin-II-Rezeptors, worin das Peptid mit den
Aminosäureresten 8-17 (extra-zellulär) des veröffentlichten
glatten, vascularen rattenmuskel-AT&sub1;-Rezeptors korrespondiert und
wobei der monoclonale Antikörper in der Lage ist, an den AT&sub1;-
Subtypen des Angiotensin-II-Rezeptors zu binden.
2. Eine hybridomale Zellinie nach Anspruch 1, welche einen
monoclonalen Antikörper erzeugt, der spezifisch an die
Aminosäurereste 8-17 des mammalischen AT&sub1;-Rezeptors bindet.
3. Eine hybridomale Zellinie, welche einen monoclonalen Antikörper
erzeugt, der spezifisch an ein Peptid bindet, das die Aminosäure-
Sequenz aufweist:
H&sub2;N-Glu-Asp-Gly-Ileu-Lys-Arg-Ileu-Gln-Asp-Asp-COOH
4. Eine hybridomale Zellinie nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch
die Zellinienhinterlegung Nr. 93072117, hinterlegt bei der European
Collection of Animal Cell Culture, Porton Down, Großbritannien.
5. Ein monoclonaler Antikörper wirkend gegen ein Peptid vom AT&sub1;-
Subtyp des Angiotensin II-Rezeptors, wobei das Peptid mit den
Aminosäureresten 8-17 (extra-zellulär) des veröffentlichten
glatten, vascularen rattenmuskel- AT&sub1;-Rezeptors korrespondiert
und wobei der monoclonale Antikörper in der Lage ist, an den AT&sub1;-
Subtypen des Angiotensin II-Rezeptors zu binden.
6. Ein monoclonaler Antikörper nach Anspruch 5, der an die
Aminosäurereste 8-17 des mammalischen AT&sub1;-Rezeptors bindet.
7. Ein monoclonaler Antikörper, der spezifisch an ein Peptid bindet,
das die Aminosäuresequenz aufweist:
H&sub2;N-Glu-Asp-Gly-Ileu-Lys-Arg-Ileu-Gln-Asp-Asp-COOH
8. Verwendung eines monoclonalen Antikörpers nach einem der
Ansprüche 5-7 bei der Herstellung einer Antikörperpräparation
zur Detektion von AT&sub1;-Subtypen des Angiotensin-II-Rezeptors.
9. Verwendung des monoclonalen Antikörpers nach einem der
Ansprüche 5-7 bei der Herstellung einer Antikörperpräparation
für die Kontrolle der Vaso-Konstriktion oder der Hypertension.
10. Verwendung des monoclonalen Antikörpers nach einem der
Ansprüche 5-7 bei der Herstellung einer Antikörperpräparation
für die Kontrolle der uterinalen Kontraktion.
11. Ein Diagnose-Kit, umfassend den monoklonalen Antikörper nach
einem der Ansprüche 5-7, angebracht an ein detektierbares Label.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB939319877A GB9319877D0 (en) | 1993-09-27 | 1993-09-27 | Novel hybridoma & monoclonal antibodies produced thereby |
| PCT/GB1994/002100 WO1995009186A1 (en) | 1993-09-27 | 1994-09-27 | Type i angiotensin ii receptor specific monoclonal antibodies and hybridomas |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE69427484D1 DE69427484D1 (de) | 2001-07-19 |
| DE69427484T2 true DE69427484T2 (de) | 2002-09-12 |
Family
ID=10742573
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69427484T Expired - Lifetime DE69427484T2 (de) | 1993-09-27 | 1994-09-27 | Angiotensin ii rezeptor typ i spezifische monoklonale antikörper und hybridoma |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6063620A (de) |
| EP (1) | EP0725798B1 (de) |
| JP (1) | JP3727946B2 (de) |
| AT (1) | ATE202117T1 (de) |
| AU (1) | AU695074B2 (de) |
| CA (1) | CA2170606C (de) |
| DE (1) | DE69427484T2 (de) |
| GB (1) | GB9319877D0 (de) |
| WO (1) | WO1995009186A1 (de) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9319877D0 (en) * | 1993-09-27 | 1993-11-10 | Queen Mary | Novel hybridoma & monoclonal antibodies produced thereby |
| GB9410639D0 (en) * | 1994-05-27 | 1994-07-13 | Queen Mary & Westfield College | Method of improving fertilization |
| CA2314811A1 (en) * | 2000-08-02 | 2002-02-02 | Brian Archibald Macvicar | Autoimmunity to angiotensin at1 receptors in schizophrenia |
| US20030187495A1 (en) | 2002-04-01 | 2003-10-02 | Cully Edward H. | Endoluminal devices, embolic filters, methods of manufacture and use |
| GB0219524D0 (en) * | 2002-08-21 | 2002-10-02 | Queen Mary & Westfield College | Therapeutic uses of monoclonal antibodies to the angiotensin-II type-1 receptor |
| US20040093012A1 (en) | 2002-10-17 | 2004-05-13 | Cully Edward H. | Embolic filter frame having looped support strut elements |
| US9149609B2 (en) * | 2006-10-16 | 2015-10-06 | Embolitech, Llc | Catheter for removal of an organized embolic thrombus |
| WO2009055782A1 (en) | 2007-10-26 | 2009-04-30 | Possis Medical, Inc. | Intravascular guidewire filter system for pulmonary embolism protection and embolism removal or maceration |
| GB0802931D0 (en) * | 2008-02-18 | 2008-03-26 | Queen Mary & Westfield College | Synthetic scFv analogue to the 6313/G2 (anti angiotensin II type 1 receptor) monoclonal anitbody variable regions |
| JP2011111422A (ja) * | 2009-11-27 | 2011-06-09 | Sekisui Chem Co Ltd | モノクローナル抗体 |
| US11103263B2 (en) | 2015-07-24 | 2021-08-31 | Ichor Vascular Inc. | Embolectomy system and methods of making and using same |
| CN115838425B (zh) * | 2022-08-31 | 2024-06-18 | 首都医科大学 | 一种靶向血管紧张素ii 1型受体细胞外第二环的抗体及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4911909A (en) * | 1987-01-02 | 1990-03-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method of controlling hypertension using monoclonal antibodies to angiotensin-II |
| GB9319877D0 (en) * | 1993-09-27 | 1993-11-10 | Queen Mary | Novel hybridoma & monoclonal antibodies produced thereby |
-
1993
- 1993-09-27 GB GB939319877A patent/GB9319877D0/en active Pending
-
1994
- 1994-09-27 AU AU77032/94A patent/AU695074B2/en not_active Expired
- 1994-09-27 US US08/624,374 patent/US6063620A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-27 DE DE69427484T patent/DE69427484T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-27 AT AT94927727T patent/ATE202117T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-09-27 EP EP94927727A patent/EP0725798B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-27 CA CA002170606A patent/CA2170606C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-27 WO PCT/GB1994/002100 patent/WO1995009186A1/en active IP Right Grant
- 1994-09-27 JP JP51017795A patent/JP3727946B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-03-31 US US09/540,816 patent/US6805864B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6805864B1 (en) | 2004-10-19 |
| AU7703294A (en) | 1995-04-18 |
| EP0725798A1 (de) | 1996-08-14 |
| ATE202117T1 (de) | 2001-06-15 |
| JPH09509563A (ja) | 1997-09-30 |
| US6063620A (en) | 2000-05-16 |
| CA2170606A1 (en) | 1995-04-06 |
| AU695074B2 (en) | 1998-08-06 |
| GB9319877D0 (en) | 1993-11-10 |
| DE69427484D1 (de) | 2001-07-19 |
| WO1995009186A1 (en) | 1995-04-06 |
| CA2170606C (en) | 2005-09-20 |
| JP3727946B2 (ja) | 2005-12-21 |
| EP0725798B1 (de) | 2001-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE68922808T2 (de) | Monoklonale Antikörper gegen den Rezeptor des Epidermis-Wachstumsfaktors und diese enthaltende therapeutische Zubereitungen. | |
| DE69322860T2 (de) | Antikörper gegen alpha v beta 3 integrin | |
| DE69535419T2 (de) | Antikörper die einen Erythropoietinrezeptor aktivieren | |
| DE69330643T2 (de) | Monoklonaler antikörper, welcher spezifisch an vaskularisiertes tumorendothelium bindet und verwendungen davon | |
| DE69605181T3 (de) | Antikörper gegen cd30, die proteolytische spaltung und abgabe des membrangebundenen cd30 antigens verhindern | |
| DE69220940T2 (de) | Verkürzte Formen den Hepatozyten Wachstumsfaktor (HGF) Rezeptors | |
| DE69129760T2 (de) | T-cadherin-bindungsmolekül | |
| DE69406664T2 (de) | Zusammensetzungen und diagnostische verfahren unter verwendung von monoklonalen antikoerpern gegen cd44v6 | |
| DE69427484T2 (de) | Angiotensin ii rezeptor typ i spezifische monoklonale antikörper und hybridoma | |
| DE69034116T2 (de) | Hemmung der Anheftung von Lymphocyten an das Gefässendothel mittels einer neuen extrazellulären Matrixrezeptor-Ligand-Wechselwirkung | |
| EP0480440B1 (de) | Monoklonale Antikörper gegen Melanom | |
| DE69233125T2 (de) | Inhibitorische immunglobulin-polypeptide gegen den pdgf beta-rezeptor | |
| DE4134982A1 (de) | Verwendung von antikoerper enthaltenden praeparationen zur immunsuppression | |
| DE69821246T2 (de) | Testverfahren für collagenpeptid | |
| DE69522689T2 (de) | Zellzyklus-unabhängige, gliomaoberflach-spezifische, menschliche monoklonale antikörper | |
| DE3789781T2 (de) | Antigene, Antikörper und Verfahren zur Identifizierung humaner metastatischer Tumoren und Zellinien zur Herstellung dieser Antikörper. | |
| DE69428292T2 (de) | Rekombinanter c140-rezeptor, seine agonisten und antagonisten | |
| DE69934250T2 (de) | Zusammensetzungen und verfahren zur herstellung monoklonaler antikörper, repräsentativ für einen spezifischen zelltyp | |
| DE69434024T2 (de) | Auf humanen cortikalen thymozyten exprimierte oberflächenproteine und ihre verwendung | |
| DE69430313T2 (de) | Monoklonale antikörper, die flk-2-rezeptoren erkennen, und die isolierung primitiver hämatopoietischer stammzellpopulationen | |
| DE69413009T2 (de) | Verwendung von antikörpern gegen pdgf-rezeptoren zur inhibierung von hyperplasie der intima | |
| DE3852236T2 (de) | Verfahren zur Kontrolle der Leukozyten-Extravasation. | |
| EP2129403B1 (de) | Bispezifisches polypeptidisches Konstrukt mit therapeutischem und diagnostischem Potential | |
| Dixon et al. | Ultrastructural localisation of fibronectin in mouse kidney | |
| DE69331942T2 (de) | Verwendung und herstellung eines metastaseninhibitors bzw. eines zelladhäsionsinhibitors enthaltend einen antikörper |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8332 | No legal effect for de | ||
| 8370 | Indication related to discontinuation of the patent is to be deleted | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition |