DE68917729T2

DE68917729T2 - Reinigung und verabreichung von dns-reparatur-enzymen.

Info

Publication number: DE68917729T2
Application number: DE68917729T
Authority: DE
Inventors: Daniel Yarosh
Original assignee: Applied Genetics Inc
Current assignee: Applied Genetics Inc
Priority date: 1988-07-06
Filing date: 1989-06-27
Publication date: 1995-04-06
Anticipated expiration: 2009-06-28
Also published as: EP0423214A1; JPH11346767A; JP3292473B2; WO1990000598A1; US5077211A; AU634970B2; AU660767B2; JP3328603B2; IL90880A; AU3393993A; DE68917729D1; EP0423214B1; JPH03505671A; EP0423214A4; ZA894971B; AU3872489A; US5296231A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gegenstand der Erfindung

Die Erfindung betrifft DNA-Reparaturenzyme und insbesondere 1) Verfahren zur Reinigung von DNA-Reparaturenzymen und 2) Verfahren und Mittel zur Verabreichung von DNA-Reparaturenzymen an lebende Zellen in situ, z.B. menschliche Hautzellen, so daß die Enzyme in die Zellen eindringen und die Reparatur beschädigter DNA in den Zellen verbessern können.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Hautkrebs ist ein ernstliches menschliches Gesundheitsproblem. Die Inzidenz von nicht-Melanom-Hautkrebs in den Vereinigten Staaten beträgt 500.000 pro Jahr und 23.000 pro Jahr für Melanome. Die jährlichen Todesfälle betragen 2.000 bzw. 6.000, und für die nächsten 88 Jahre werden 800.000 Tote aufgrund von Hautkrebs vorausgesagt, falls sich die augenblicklichen Trends fortsetzen.
Die kausale Beziehung zwischen nicht-Melanom-Hautkrebs und der Bestrahlung durch ultraviolettes Licht durch die Sonne wurde klar nachgewiesen, und die Einwirkung der Sonne ist ein wichtiger auslösender Faktor bei Melanomen. Es ist allgemein anerkannt, daß das Ziel für die Schäden durch ultraviolettes Licht, die zu Krebs führen, die DNA ist.
Xeroderma pigmentosum ist eine genetische Erkrankung des Menschen, bei der Patienten Sonnenschäden entwickeln, Pigmentierungs-Abweichungen und maligne Erkrankungen in der der Sonne ausgesetzten Haut. Ein Überblick über diese Erkrankung wurde von J.H. Robbins, K.H. Kraemer, M.A. Lutzner, B.W. Festoff und H.G. Coon, unter dem Titel "Xeroderma Pigmentosum: An Inherited Disease with Sun Sensitivity, Multiple Cutaneous Neoplasms, and Abnormal DNA Repair", gegeben und in Annals of Internal Medicine, Band 80, Nummer 2, Seiten 221-248, Februar 1974, veröffentlicht. Die Erkrankung tritt weltweit mit einer Wahrscheinlichkeit von 1 auf 250.000 auf. Zellen von Patienten mit Xeroderma pigmentosum können Ultraviolett-Schäden der DNA nicht reparieren, wodurch eine Krebshäufigkeit resultiert, die 4.800 Mal höher liegt als die der übrigen US-Bevölkerung. Es gibt keine Heilungsmöglichkeit, und die Behandlung besteht darin, daß Sonneneinstrahlung vermieden wird und Hautläsionen herausgeschnitten werden. Bei den Patienten tritt der Tod 30 Jahre früher ein als bei der übrigen US-Bevölkerung.
Die auf die grundlegenden Mechanismen der DNA-Reparatur gerichtete Forschung konnte einen Überblick über die biochemischen Wege geben, durch die eine ultraviolette Schädigung der DNA entfernt wird. Es konnte gezeigt werden, daß sich bakterielle Reparatursysteme von der Reparatur in menschlichen Zellen signifikant unterscheiden. Das Enzym Endonuclease V (hier auch als T4-Endonuclease V und denV Endonuclease V bezeichnet) weist die Fähigkeit auf, die DNA-Reparatur in menschlichen Zellen zu verbessern, was durch erhöhtes, UV-spezifisches Schneiden zellulärer DNA, eine erhöhte DNA-Reparaturreplikation und ein erhöhtes UV-Überleben nach Behandlung mit dem Enzym gezeigt werden konnte.
Das Enzym Endonuclease V wird durch das denV-Gen des Bakteriophagen T4 produziert. Es wurde gezeigt, daß dieses Enzym den geschwindigkeitsbestimmenden ersten Schritt bei der Entfernung von UV-induzierter DNA-Schädigung, nämlich den Einzelstrang- Schnitt der DNA an der Schadstelle, katalysiert. Insbesondere weist das Enzym Glycosylase- und Apurin/Apyrimidin-Endonuclease-Aktivitäten auf, und es wirkt an der Stelle von durch Ultraviolett induzierten Pyrimidin-Dimeren. Vergleiche "Evidence that the UV Endonuclease Activity Induced by Bacteriophage T4 Contains Both Pyrimidine Dimer-DNA Glycosylase and Apyrimidinic/Apurinic Endonuclease Acitivities in the Enzyme Molecule" von H.R. Warner, L.M. Christensen and M.L. Persson, in Journal of Virology, 1981, Band 40, Seiten 204-210; "denV Gene of Bacteriophage T4 Codes for Both Pyrimidine Dimer DNA Glycosylase and Apyrimidinic Endonuclease Activities" von S. McMillan, H.J. Edenberg, E.H. Radany, R.C. Friedberg und E.C. Friedberg, in Association of Pyrimidine Dimer DNA Glycosylase and Apurinic/Apyrimidinic DNA Endonulease Essential for Repair of Ultraviolet-damaged DNA" von Y. Nakabeppu und M. Sekiguchi, in Proceedings of the National Academy of Sciences, 1981, Band 78, Seiten 2742-2746.
Es wurden auch andere Enzyme identifiziert, die die Fähigkeit zur Reparatur von DNA-Schäden besitzen. Diese Enzyme umfassen O&sup6;-Methylguanin-DNA-Methyltransferasen, Photolyasen, Uracil- und Hypoxanthin-DNA-Glycosylasen, Apyrimidin/Apurin-Endonucleasen, DNA-Exonucleasen, geschädigte-Basen-Glycosylasen (z.B. 3- Methyladenin-DNA-Glycosylase), Correndonucleasen allein oder in Komplexen (z.B. E. coli uvrA/uvrB/uvrC-Endonuclease-Komplex) und andere Enzyme und Enzymkomplexe, deren Aktivitäten zur Zeit nur teilweise verstanden sind, beispielsweise die Produkte der ERCC-Gene des Menschen und der RAD-Gene von Hefe. Verschiedene dieser Enzyme wurden aus Mikroorganismen bis zur Reinheit gereinigt, und die Gene für einige dieser Enzyme wurden kloniert. Der Begriff "DNA-Reparaturenzyme", wie er im folgenden verwendet wird, soll die oben stehenden Enzyme umfassen, das T4-Endonuclease V-Enzym und andere, zur Zeit bekannte Enzyme oder später entdeckte oder entwickelte, die die Fähigkeit besitzen, bei der Reparatur geschädigter Nukleinsäuren und insbesondere geschädigter DNA teilzunehmen.
Bis heute war die Verwendung exogener Enzyme in DNA-Reparatursystemen auf Laborexperimente beschränkt, die so ausgelegt waren, daß die biochemischen und evolutionären Beziehungen unter den DNA-Reparaturwegen untersucht werden konnten. Eine klinische Anwendung dieser Laborergebnisse wurde nicht vorgenommen, weil es unter anderem keinen wirksamen Weg gab, kommerzielle Mengen von DNA-Reparaturenzymen zu reinigen, und es gab keinen wirksamen, nicht-toxischen Weg, DNA-Reparaturenzyme lebenden Zellen zu applizieren. Die vorliegende Erfindung ist auf diese beiden, seit langem auf diesem Fachgebiet bestehenden Probleme gerichtet.
Die Reinigung von DNA-Enzymen zur kommerziellen Verwendung erfordert ein homogenes Endprodukt, eine hohe Ausbeute, Geschwindigkeit, Einfachheit und geringe Kosten. Die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren waren nicht in der Lage, diese Aufgabe zu lösen; diese Verfahren sind wie folgt:
(1) P. Seawell, E.C. Friedberg, A.K. Ganesan und P.C. Hanawalt, "Purification of Endonuclease V of Bacteriophage T4" in DNA Repair: A Laboratory Manual of Research Procedures, herausgegeben von E.C. Friedberg und P.C. Hanawalt, Marcel Dekker, Inc., New York, 1981, Band 1, Teil A, Seiten 229-236.
Dieses Verfahren verwendet mit dem Phagen T4 infizierte E. coli, und die Reinigung beruht auf Phasen-Trennungs- und zwei Ionenaustauschchromatographieschritten (DEAE- und Phosphozellulose). Der DEAE-Chromatographieschritt limitiert die Ausbeute des Verfahrens, da alle Proteine binden müssen, um das interessierende Enzym zu eluieren. Das Verfahren ist nicht schnell: jedem Chromatographieschritt geht eine Dialyse voran, jede Elution erfordert wenigstens 20 Stunden, und jede Fraktion wird auf ihre Aktivität hin untersucht. Das Verfahren ist weder einfach noch preisgünstig: mühsame Phasentrennungen und wiederholte Tests werden durchgeführt, und das gesamte verbrauchte Dialysat und die abgetrennten Phasen werden verworfen. Es ist bezeichnend, daß die Autoren dieses Verfahrens ihr Endprodukt als nur teilweise gereinigt beschreiben.
Die grundlegenden Schritte des Verfahrens von Seawell et al. wurden zuerst durch E.C. Friedberg und J.J. King in "Dark Repair of Ultraviolet-irradiated Deoxyribonucleic acid by Bacteriophage T4: Purification and Characterization of a Dimer-Specific Phage-Induced Endonuclease", Journal of Bacteriology, 1971, Band 106, Seiten 500-507 beschrieben. Diese frühere Version des Verfahrens umfaßte einen zusätzlichen DNA-Zellulose-Schritt, der bei der letzten Version weggelassen wurde. Von S. Yasuda und M. Sekiguchi, "T4 Endonuclease Involved in Repair of DNA", Proceedings of the National Academy of Sciences, Dezember 1970, Band 67, Seiten 1839-1845, wurde ein Verfahren beschrieben, das dem von Friedberg und King beschriebenen Verfahren ähnelt. Anstatt wie im Verfahren von Friedberg und King einen DNA-Zellulose-Schritt zu verwenden, umfaßte das Verfahren von Yasuda und Sekiguchi einen wahlweisen Gelfiltrationsschritt.
(2) Y. Nakabeppu, K. Yamashita und M. Sekiguchi, "Purification and Characterization of Normal and Mutant Forms of T4 Endonuclease V", Journal of Biological Chemistry, 1982, Band 257, Seiten 2556-2562.
Die grundlegenden Schritte dieses Verfahrens wurden zunächst von S. Yasuda und M. Sekiguchi, "Further Purification and Characterization of T4 Endonuclease V", Biochimica et Biophysica Acta, 1976, Band 442, Seiten 197-207, beschrieben. Diese Verfahren gleichen dem von Seawell et al. beschriebenen Verfahren mit der Ausnahme, daß die Kationenaustausch(Carboxymethyl-Sephadex)-Chromatographie durch eine Anionaustausch (DEAE)-Chromatographie ersetzt wurde und zusätzliche Chromatographieschritte aufgenommen wurden, einschließlich entweder einer Hydroxylapatit- oder Gelfiltration und einer UV-DNA-Zellulose (das Verfahren von Yasuda und Sekiguchi unterscheidet sich von dem Verfahren von Seawell et al. weiterhin dadurch, daß es keinen Phosphozellulose-Schritt umfaßt). Diese Verfahren weisen die gleichen Nachteile auf wie das Verfahren von Seawell et al., mit den zusätzlichen Problemen einer geringeren Ausbeute, einer geringeren Geschwindigkeit und Einfachheit und größeren Kosten.
(3) K.M. Higgins und R.S. Lloyd, "Purification of the T4 Endonuclease V", Mutation Research, 1987, Band 183, Seiten 117- 121.
Dieses Verfahren verwendet einen E. coli-Stamm, der ein Plasmid mit dem denV-Strukturgen des Phagen T4 unter Kontrolle des nach rechts gerichteten Promotors des Phagen Lambda aufweist. Die Chromatographieschritte umfassen einzelsträngige DNA-Agarose-Chromatographie, Chromatofokussierung und Kationaustausch(Carboxymethyl-Sephadex). Verglichen mit der vorliegenden Erfindung ist die Ausbeute gering, da 12 Liter Bakterien für 15 mg reines Enzym erforderlich sind. Die Ausbeute ist ebenfalls beschränkt durch das Erfordernis, daß alle Proteine an die Chromatofokussierungssäule binden müssen, um das gewünschte Enzym zu eluieren. Das Verfahren ist nicht schnell: jedem Chromatographieschritt geht eine Dialyse und eine Konzentrierung durch Ultrafiltration voraus; wenigstens zwei der Schritte erfordern für die Elution ungefähr 17,5 Stunden; jedem Schritt folgen weiterhin sowohl Enzym-Aktivitätstests und eine Polyacrylamid-Gelanalyse jeder Fraktion. Das Verfahren ist nicht einfach: die einzelsträngige DNA-Agarosechromatographie erfordert die Vereinigung von 84% der gesammelten Fraktion (520 ml von 700 ml Elutionsmittel), extensives Verdünnen des aufgeladenen Proteins; Versuche in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung zeigen, daß der Chromatofokussierungsschritt unter Verwendung von DEAE-Agarose und Servalyte-Ampholinen nicht reproduzierbar war; neben der Dialyse ist weiterhin noch eine Ultrafiltration erforderlich; weiterhin werden nach jedem Schritt mühsame, wiederholte Aktivitätstests und eine Gelanalyse durchgeführt.
Das Verfahren ist teuer: große Ultrafiltrationsvorrichtungen werden verwendet und bei jedem Schritt verworfen; die Agarose mit der einzelsträngigen DNA wird bakteriellen Rohlysaten mit aktiven Nucleasen ausgesetzt, die die Lebensdauer der Säule drastisch verringern; weiterhin müssen teure Chromatofokussierungsreagenzien einschließlich Pharmacia PBE 94-Gel und Polypuffer-Ampholine verwendet werden.
Zusätzlich hierzu wurden zwei Verfahren zur Reinigung von O&sup6;Methylguanin-DNA-Methyltransferase veröffentlicht. Vergleiche hierzu B. Demple, A. Jacobsson, M. Olsson, P. Robbins und T. Lindahl, "Repair of Alkylated DNA in Escherichia coli: Physical properties of O&sup6;-methylguanine-DNA methyltransferase" in The Journal of Biological Chemistry, Band 257, Seiten 13776-13780, 1982, und Y. Nakabeppu, H. Kondo, S. Kawabata, S. Iwanaga und M. Sekiguchi, "Purification and Structure of the Intact Ada Regulatory Protein of Escherichia coli K12 O&sup6;-Methylguanine-DNA Methyltransferase" in The Journal of Biological Chemistry, Band 260, Seiten 7281-7288, 1986. Das Verfahren von Demple verwendet eine Phosphozellulose-Chromatographie vor der DNA-Zellulose und Gelfiltration und umfaßt einen abschließenden Phenylagarose- Chromatographieschritt. Das Verfahren von Nakabeppu verwendet zwei Ionenaustausch(DEAE)-Chromatographie-Durchläufe, gefolgt von einer Phosphozellulose- und Gelfiltrationschromatographie.
Einen allgemeinen Überblick über die Reinigungsverfahren für DNA-Reparaturenzyme ist zu finden in DNA Repair: A Laboratory Manual of Research Procedures, herausgegeben von E. Friedberg und P.C. Hanawalt, veröffentlicht von Marcel Dekker, New York. Band I, Teil A, dieses Textes enthält Verfahren zur Reinigung von fünf Enzymen: Photolyase, Endonuclease V (oben beschrieben), AP-Endonuclease, Uracil-DNA-Glycosylase bzw. Hypoxanthin- DNA-Glycosylase in den Kapiteln 18-22. Band II, Kapitel 3-5, diskutieren das oben angesprochene Verfahren von Demple und Verfahren zur Reinigung von 3-Methyladenin-DNA-Glycosylase. Band III, Abschnitt IV, enthält Verfahren zur Reinigung von Photolyase, der uvrABC-Exzisionsnuclease und der uvrD-Helicase in den Kapiteln 23-25. Keines dieser Verfahren und auch nicht die zwei oben genannten Verfahren zur Reinigung von O&sup6;-Methylguanin-DNA-Methyltransferase verwendet die Reinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung.
Auf dem Gebiet der DNA-Reparatur wurden verschiedene Ansätze in Betracht gezogen, um DNA-Reparaturenzyme an Säugetierzellen zu verabreichen. Das Ziel dieser Bemühungen war darauf gerichtet, die Wege der DNA-Reparatur in Säugetierzellen und ihre Evolution aufzudecken und zu charakterisieren, nicht jedoch darauf, kommerzielle Verfahren zu entwickeln, um die DNA-Reparatur zu vergrößern. Demnach wurden von den Forschern keine normalen Zellen verwendet, beispielsweise epidermale Haut-Keratinozytenzellen, als Targetzellen, sondern die Forscher konzentrierten sich besonders auf Fibroblasten aus Patienten mit Xeroderma pigmentosum. In ähnlicher Weise war die Forschung im Stand der Technik auf nicht-physiologische Techniken zur Einführung von DNA-Reparaturenzymen in Zellen gerichtet, die nur im Labor nützlich sind und die die Physiologie der Targetzellen aufweisen. Die über diese Arbeit veröffentlichten Berichte umfassen:
(1) K. Tanaka, M. Sekiguchi und Y. Okada, "Restoration of ultraviolet-induced unscheduled DNA synthesis of xeroderma pigmentosum cells by the concomitant treatment with bacteriophage T4 endonuclease V and HVJ (Sendai virus)", Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 1975, Band 72, Seiten 4071-4075; und K. Tanaka, H. Hayakawa, M. Sekiguchi und Y. Okada, "Specific action of T4 endonuclease V on damaged DNA in xeroderma pigmentosum cells in vivo", Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 1977, Band 74, Seiten 2958-2962.
In diesen zwei Berichten wurden aus Patienten mit Xeroderma pigmentosum stammende Fibroblasten mit inaktiviertem Sendai-Virus und Endonuclease V nach UV-Bestrahlung behandelt. Proteine auf der Hülle des Sendai-Virus machen die Zellen für die Endonuclease V durchlässig. Diese Behandlung erhöhte die DNA-Reparaturreplikation und erhöhte das Überleben der behandelten Zellen. Das Verfahren zur Einführung des Enzyms ist jedoch zur kommerziellen Anwendung aufgrund der Pathogenität des Sendai-Virus ungeeignet. Weiterhin sind große externe Enzymkonzentrationen notwendig. Im Abschnitt "Diskussion" diskutieren Tanaka et al. Ansätze zur Untersuchung der Evolution makromolekularer (d.h. DNA-Reparatur-) Systeme in Organismen und erwähnen Liposomenverfahren und Erythrozytengeist/HVJ-Verfahren als auch andere Verfahren zur Einführung von Makromolekülen in Zellen. Bezeichnenderweise ziehen Tanaka et al. am Ende den Schluß, daß das Sendai-Virus-Verfahren in der Grundlagenforschung das einfachste und anwendbarste Verfahren zur Einführung ziemlich kleiner Makromoleküle von etwa 20.000 Dalton, d.h. dem T4-Endonuclease V-Molekül, ist.
(2) G. Ciarrocchi und S. Linn, "A cell-free assay measuring repair DNA synthesis in human fibroblasts", Proceedings of the National Academy of Science U.S.A., 1978, Band 75, Seiten 1887-1891.
In dieser Veröffentlichung wurden normale und Xeroderma pigmentosum-Humanfibroblasten durch einen osmotischen Schock nach UV-Bestrahlung zerstört und mit Endonuclease V inkubiert. Die DNA-Reparatursynthese war in beiden Zellarten erhöht, und die Reparatur in Xeroderma pigmentosum-Zellen war auf das Niveau normaler Zellen erhöht. Dieses Verfahren zum Einführen von Enzymen in Zellen wurde nur zur in vitro-Forschung verwendet, da es die Unversehrtheit der Zellmembran und die Lebensfähigkeit drastisch beeinflußt. Weiterhin sind große externe Enzymkonzentrationen notwendig.
(3) D. Yarosh und R. Setlow, "Permeabilization of Ultraviolet- irradiated Chinese hamster cells with polyethylene glycol and introduction of ultraviolet endonuclease from Micrococcus luteus", Molecular and Cellular Biology, 1981, Band 1, Seiten 237-244.
In diesem Verfahren wurden Hamsterzellen mit Polyethylenglykol nach UV-Bestrahlung behandelt und dann mit einem DNA-Reparaturenzym inkubiert, das in ähnlicher Weise wie Endonuclease V wirkt. Das Enzym trat in die Zellen ein und wirkte auf die dort vorliegende DNA ein. Das Verfahren war für die Targetzellen toxisch, wahrscheinlich deshalb, weil es auf einer Permeabilisierung beruhte und lebensnotwendige Moleküle beim Eintritt des Enzyms austraten. Dieses Verfahren erfordert zur Wirksamkeit ebenfalls große externe Enzymkonzentrationen.
(4) J.H.J. Hoeijmakers, "Characterization of genes and proteins involved in excision repair of human cells", Journal of Cell Science Suppl., 1987, Band 6, Seiten 111-125.
Diese Veröffentlichung gibt einen Überblick über die Forschungen, bei denen Proteine in die Zellkerne durch Mikroinjektion eingeführt wurden. Wenn die Endonuclease V in die Kerne von Xeroderma pigmentosum-Zellen injiziert wurde, nahm die DNA-Reparatursynthese zu. Dieses Verfahren ist jedoch nur für die Laborforschung anwendbar.
(5) K. Valerie, A.P. Green, J.K. de Riel und E.E. Henderson, "Transient and stable complementation of ultraviolet repair in xeroderma pigmentosum cells by the denV gene of bacteriophage T4", Cancer Research, 1987, Band 47, Seiten 2967-2971.
In diesem Verfahren wurde das denV-Gen unter der Kontrolle eines Säugerpromotors in Xeroderma pigmentosum-Zellen transfiziert. Auf die Aufnahme des denV-Gen selektierte Klone zeigten eine erhöhte Schnittrate an UV-DNA, eine erhöhte DNA-Reparatursynthese und eine erhöhte Beständigkeit gegen UV-Bestrahlung. Das Transfektionsverfahren ist jedoch für normale menschliche Zellen sehr ineffizient (weniger als ein Treffer pro einer Million Zellen). Diese Verfahren fallen in die Kategorie "Gentherapie" und liegen beim augenblicklichen Stand der Technik nicht im Bereich der kommerziellen Anwendbarkeit.
In einigen wenigen Laboratorien wurden Liposomen zur topischen Beförderung von Arzneimitteln verwendet, nicht jedoch von Enzymen und insbesondere nicht von DNA-Reparaturenzymen. Die Berichte über den Einschluß und die topische Bereitstellung von Arzneimitteln umfassen:
Beförderung von Triaminolon: Michael Mezei und Vijeyalakshmi Gulasekharam, "Liposomes - A selective drug delivery system for the topical route of administration, I. lotion dosage form" in Life Sciences, Band 26, Seiten 1473-1477, 1980; Michael Mezei und Vijeyalakshmi Gulasekharam, "Liposomes - A selective drug delivery system for the topical route of administration: gel dosage form" in Journal of Pharmacy and Pharmacology, Band 34, Seiten 473-474, 1981. Beförderung von Tetracain: Adrienn Gesztes und Michael Mezei, "Topical anaesthesia of the skin by liposome-encapsulated tetracaine", Anesthesia and Analgesia, Band 67, Seiten 1079-1081, 1988. Beförderung von Methotrexat: H.M. Patel "Liposomes as a controlled-release system" in Biochemical Society Transactions, Band 13, Seiten 513-516, 1985. Beförderung von Hydrokortison: W. Wohlrab und J. Lasch, "Penetration kinetics of liposomal hydrocortisone in human skin" in Dermatologica, Band 174, Seiten 18-22, 1987.
Die Verwendung von pH-sensitiven Liposomen zur Vermittlung der zytoplasmatischen Beförderung von Calcein und FITC-Dextran wurde in den nachfolgenden Druckschriften beschrieben: Robert Straubinger, Keelung Hong, Daniel Friend und Demetrios Papahadjopoulos, "Endocytosis of Liposomes and Intracellular Fate of Encapsulated Molecules: Encounter with a low pH Compartment after Internalization in Coated Vesicles", Cell, Band 32, Seiten 1069-1079, 1983; und Robert Straubinger, Nejat Duzgunes und Demetrios Papahadjopoulos, "pH-Sensitive Liposomes Mediate Cytoplasmic Delivery of Encapsulated Macromolecules", Febs Letters, Band 179, Seiten 148-154, 1985. Weitere Diskussionen über pH-sensitive Liposomen sind in Kapitel 11 des Buches Cell Fusion, herausgegeben von A.E. Sowers, mit dem Titel "Fusion of Phospholipid Vesicles induced by Divalent Cations and Protons" von Nejat Duzgunes, Keelung Hong, Patricia Baldwin, Joe Bentz, Shlomo Nir und Demetrios Papahadjopoulos, veröffentlicht von Plenum Press, N.Y., 1987, Seiten 241-267, zu finden. Vergleiche weiterhin Ellens, Bentz und Szoka, "pH-Induced destabilization of phosphatidylethanolamine-containing liposomes: role of bilayer contact", Biochemistry, Band 23, Seiten 1532-1538, 1984, und Bentz, Ellens und Szoka, "Destabilization of Phosphatidylethanolamine-Containing Liposomes: Hexagonal Phase and Asymmetric Membranes", Biochemistry, Band 26, Seiten 2105-2116, 1987. Keine dieser Druckschriften diskutiert oder legt die Verwendung von pH-sensitiven Liposomen zur topischen Verabreichung von DNA-Reparaturenzymen an die menschliche Haut nahe.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Unter Berücksichtigung des oben geschilderten Standes der Technik ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Verfahren zur Reinigung von DNA-Reparaturenzymen bereitzustellen. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Reinigung von DNA-Reparaturenzymen bereitzustellen, die schnell, einfach anwendbar und nicht teuer sind und die eine hohe Ausbeute an homogenem Endprodukt ergeben.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, nicht-toxische Verfahren und Mittel zur Verabreichung von DNA-Reparaturenzymen in aktiver Form an lebende Zellen in situ bereitzustellen. Insbesondere ist es eine Aufgabe der Erfindung, Verabreichungsverfahren und Mittel hierzu bereitzustellen, die keine signifikanten Veränderungen in den Permeabilitätseigenschaften der Membranen lebender Zellen umfassen. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verabreichungsverfahren und Mittel hierzu bereitzustellen, welche zur topischen Gabe von DNA-Reparaturenzymen an die menschliche Haut in situ verwendbar sind.
In Zusammenhang mit den oben genannten Aufgaben ist es eine weitere und spezielle Aufgabe der Erfindung, das T4-Endonuclease V-Enzym zu reinigen und dieses Enzym an menschliche Hautzellen zu verabreichen.
Diese und andere Aufgaben werden erfindungsgemäß zur Bereitstellung eines Verfahrens zur Reinigung von DNA-Reparaturenzymen gelöst, das die nachfolgenden Schritte umfaßt:
(a) Auftragen einer wäßrigen Lösung des DNA-Reparaturenzyms in unreiner Form (z.B. ein Extrakt von Zellen, die genetisch verändert wurden, um das DNA-Reparaturenzym zu produzieren) auf ein Molekularsieb (z.B. eine Gelfiltrationssäule) mit einer durchschnittlichen Porengröße, so daß die Ausschlußgrenze (bestimmt entweder durch das Molekulargewicht oder den Stokes-Radius) wie folgt ist:
(i) größer als das bestimmte Molekulargewicht oder der Stokes-Radius des DNA-Reparaturenzyms (z.B. im Falle von T4-Endonuclease V, eine Ausschlußgrenze größer als etwa 16.500 Dalton oder etwa 18.000 Å), und
(ii) kleiner als das geschätzte Molekulargewicht oder der Stokes-Radius wenigstens einiger der Verunreinigungen (z.B. eine Ausschlußgrenze kleiner als etwa 60.000 Dalton oder etwa 35 Å);
(b) isokratisches Eluieren des DNA-Reparaturenzyms aus dem Molekularsieb mit einem Elutionspuffer, um das DNA-Reparaturenzym in einer oder in mehreren ausgewählten Fraktionen des Eluats mit erhöhter Reinheit zu erhalten, wobei der Elutionspuffer so ausgewählt wird, daß sich zwischen dem DNA- Reparaturenzym und ausgewählten Nucleinsäuren Komplexe ausbilden können;
(c) in Kontakt bringen einer oder mehrerer ausgewählter Fraktionen aus Schritt (b) mit einer oder mehreren ausgewählten Nucleinsäuren (z.B. einzelsträngiger DNA), die auf einem festen Träger (z.B. CNBr-aktivierte Sepharose) immobilisiert sind, um immobilisierte Nucleinsäure/DNA-Reparaturenzym-Komplexe zwischen dem DNA-Reparaturenzym und einer oder mehrerer ausgewählter, immobilisierter Nucleinsäuren zu bilden;
(d) Waschen der immobilisierten Komplexe (z.B. mit dem Elutionspuf fer), um wenigstens einige der verbleibenden Verunreinigungen zu entfernen; und
(e) Eluieren des DNA-Reparaturenzyms aus der einen oder aus mehreren ausgewählten immobilisierten Nucleinsäuren mit einem Elutionspuffer, der einen Gradienten aus einem Material (z.B. NaCl) enthält, das zur Disassoziation des DNA-Reparaturenzyms von einer oder mehreren der ausgewählten immobilisierten Nucleinsäuren befähigt ist, um das DNA-Reparaturenzym in einer oder mehreren ausgewählten Fraktionen des Eluats in höherer Reinheit zu erhalten.
Wie durch die unten beschriebenen Beispiele gezeigt werden wird, wird in den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung das DNA-Reparaturenzym in Form eines homogenen Proteins am Ende des Verfahrensschritts (e) erhalten.
Dieses Reinigungsverfahren nutzt in vorteilhafter Weise zwei hochspezifische Eigenschaften der meisten DNA-Reparatursysteme aus: ihre geringe Größe und ihre Affinität an Nucleinsäuren, insbesondere an einzelsträngige DNA. Proteine werden durch Molekularsieb(Gel)-Filtration abgetrennt, wobei die übergroße Mehrheit an Proteinen größer ist als die DNA-Reparaturenzyme, während die Elution der DNA-Reparaturenzyme verzögert wird. Da die Filtrationssäule isokratisch mit beinahe jedem Puffer eluiert wird, können die verzögert laufenden Proteine direkt auf eine Nucleinsäure-Affinitätssäule ohne Test, Dialyse oder Konzentrierung geladen werden. Die Nucleinsäure-Affinitätssäule wird dann entweder mit unspezifischen Veränderungen (z.B. Salzgradienten, pH, Detergenz, Spannung oder Temperatur) oder spezifischen Veränderungen (z.B. kompetierende Liganden) entwikkelt, wobei das DNA-Reparaturenzym in konzentrierter Form eluiert wird. Da die zur Elution eines Proteins aus einer Nucleinsaure-Affinitätssäule erforderliche Bedingung eine charakteristische Eigenschaft des Proteins ist, kann der Peak aus reinem DNA-Reparaturenzym ohne Test gepoolt werden. Das Verfahren entspricht damit den Zielen der kommerziellen Proteinreinigung: es produziert ein homogenes, reines Enzym; es führt zu einer hohen Ausbeute, da nur die gewünschten Proteine auf den Chromatographiesäulen verbleiben; es ist schnell und kann an einem Tag abgeschlossen werden; es ist einfach und erfordert keine Dialyse oder Aktivitätstests; weiterhin ist es preisgünstig, da es zur Dialyse oder zu den Tests keine Wegwerf reagenzien verbraucht und die Nucleinsäure-Affinitätssäulen vor Rohzellysaten schützen.
Wie in den unten stehenden Beispielen ausführlich beschrieben werden wird, wurde das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren erfolgreich zur Reinigung des T4-Endonuclease V-Enzyms angewandt. Kurz umrissen läuft das Verfahren wie folgt ab: E. coli mit einem Plasmid mit dem denV-Strukturgen unter der Kontrolle des TAC-Promotors wurde bis zur Log-Phase wachsengelassen, und die denV-Genexpression wurde durch Zugabe von Isopropylthiogalactopyranosid induziert. Es wurde ein Zellysat hergestellt, konzentriert und gegen den Puffer dialysiert, der anschließend sowohl zur Gelfiltrations- als auch zur DNA-Affinitätschromatographie verwendet wurde. Der Porendurchmesser des Gelfiltrationsmediums wurde so ausgewählt, daß er aus dem Gel die meisten kontaminierenden Proteine ausschließt, während er das gewünschte T4-Endonuclease V-Protein einschließt. Das Zellysat wurde auf die Gelfiltrationssäule aufgebracht und isokratisch eluiert, die ausgeschlossenen Proteine wurden verworfen und die verbliebenen Proteine gesammelt. Die zurückgehaltenen Proteine wurden dann direkt auf eine Agarosesäule mit einzelsträngiger DNA aufgebracht. Die DNA wurde gewaschen und dann mit einem Salzgradienten eluiert. Das Eluat wurde bei 280 nm auf die optische Dichte hin kontrolliert, und der Peak der optischen Dichte wurde gepoolt. Der Peak umfaßte das gewünschte denV-Endonuclease V-Enzym, von dem anschließend gezeigt wurde, daß es zur Homogenität aufgereinigt worden war.
Zusätzlich zu den oben genannten Reinigungsverfahren stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls Verfahren und Mittel zur Verabreichung von DNA-Reparaturenzymen an lebende Zellen bereit. Insbesondere werden gemäß dieser Ausführungsformen der Erfindung DNA-Reparaturenzyme in Liposomen eingeschlossen, um pharmazeutische Zubereitungen bereitzustellen, die zur Verabreichung an lebende Zellen und insbesondere zur topischen Verabreichung an die menschliche Haut geeignet sind. Wenn sie in dieser Form zu den menschlichen Zellen befördert werden, werden die DNA-Reparaturenzyme in die Zellen eintreten, die beschädigte DNA herausschneiden, die DNA-Reparatursynthese erhöhen und das Überleben der Zelle nach Exposition gegen Ultraviolett- Licht erhöhen.
Im Vergleich zu den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren weist das erfindungsgemäße Beförderungssystem als Vorteile auf, daß es eine hohe Enzymkonzentration nur in den Liposomen und nicht allgemein außerhalb der Zellen benötigt, und es kann die Enzyme befördern, wobei die Integrität der Targetzellen erhalten bleibt. Weiterhin ist es möglich, durch geeignete Modifikationen der Liposomen-Membranen spezifische Subpopulationen von Zellen zu binden, wodurch die Effizienz und/oder Spezifität der Enzymbeförderung bzw. -bereitstellung erhöht wird. Die erfindungsgemäß bereitgestellten Verbesserungen ermöglichen eine klinische Verwendung von DNA-Reparaturenzymen entweder vor oder nach Exposition gegen Ultraviolett-Licht, um sowohl bei normalen Personen als auch bei an Xeroderma pigmentosum leidenden Patienten Hautkrebs zu bekämpfen, der durch UV-geschädigte DNA verursacht wurde.
Wie in den nachfolgenden Beispielen vollständig beschrieben werden wird, wurde das erfindungsgemäße Beförderungssystem erfolgreich zur Verabreichung von Endonuclease V an normale menschliche epidermale Keratinozyten und Fibroblasten, transformierte menschliche normale Zellen und Xeroderma pigmentosum- Zellen und an lebende Haut verwendet. Kurz gesagt wurde eine Lipidmischung in einem Glasbehälter in organischen Lösungsmitteln gelöst und zu einem dünnen Film getrocknet. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wurde die Lipidmischung so ausgewählt, daß sie pH-sensitive Liposomen ergab. Endonuclease V, die in Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Verfahren gereinigt wurde, wurde in einer hohen Konzentration in einem wäßrigen Puffer zum Behälter zugegeben, um das Lipid zu rehydrieren. Die Mischung wurde dann durch Vortexen geschüttelt und ultraschallbehandelt, um die Liposomen zu bilden. Die Kügelchen wurden dann durch Zentrifugation oder Gelfiltration von nicht aufgenommenem Enzym abgetrennt. Die Liposomen wurden dann im Medium verdünnt und zu den Targetzellen zugegeben. Alternativ hierzu wurden im Fall von lebender Haut die Liposomen in einer Lotion suspendiert, und die Lotion wurde auf die Haut aufgebracht. Die Zugabe der Liposomen zu den Zellen ergab eine erhöhte DNA-Reparatur, was durch erhöhtes UV-spezifisches Ausschneiden, erhöhte DNA-Reparaturreplikation und erhöhte UV- Überlebensrate deutlich wurde.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Figur 1 zeigt die Ergebnisse einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese von T4-Endonuclease V und erfindungsgemäß gereinigter O&sup6;-Methylguanin-DNA-Methyltransferase. 25 ug gereinigter T4-Endonuclease V (linke Spur) und 25 ug gereinigter Methyltransferase (mittlere Spur) wurden mit SDS denaturiert, auf ein 15% diskontinuierliches Polyacrylamidgel geladen und zusammen mit Molekulargewichtsmarkern (rechte Spur) einer Elektrophorese unterzogen. Die Größe der Molekulargewichtsmarker von oben nach unten waren: 67.000; 45.000; 36.000; 29.000; 24.000; 20.100 und 14.200. Die Proteine im Gel wurden mit Coomassie Blau gefärbt. Das Gel zeigt, daß jedes Protein homogen und rein war und die entsprechende Größe (T4-Endonuclease V: 16.500 und Methyltransferase: 19.000) aufwies.
Die Figur 2 zeigt die Enzymaktivität von in Liposomen eingeschlossener T4-Endonuclease V. Die Liposomen wurden aus Phosphatidylcholin/Dicetylphosphat (PE/DCP), Phosphatidylethanolamin/Dicetylphosphat (PE/DCP) und Phosphatidylglycerin/Dicetylphosphat (PG/DCP) in Molverhältnissen von 7:3 in der in den unten angegebenen Beispielen beschriebenen Weise hergestellt. Die Liposomen wurden zu Zweifachmischungen von UV-bestrahlten und unbestrahlten Plasmiden zugegeben, wobei die zweite Mischung 1% Triton X-100 enthielt, um die Liposomen zu lösen. Nach Inkubation wurden die Mischungen in 0,8% Agarose einer Elektrophorese unterzogen, um die Plasmidformen aufzutrennen. Die Spur 1 enthält die unbehandelte Plasmidmischung mit Liposomen. Die unterste Bande ist UV-supercoiled Plasmid und die nächst unterste Bande ist nicht bestrahltes supercoiled Plasmid. Zu den Mischungen wurden PC/DCP-Liposomen in den Spuren 2 und 3 zugegeben, wobei die Spur 3 Triton X-100 enthält. Die ungelösten Liposomen in Spur 2 wiesen auf das UV-supercoiled Plasmid keine Wirkung auf, während die gelösten Liposomen in Spur 3 das UV-supercoiled Plasmid schnitten und eine Wanderung in der entspannten Form in der dritten Bande von unten bewirkten, während die Wanderung des unbestrahlten supercoiled Plasmids unbeeinflußt blieb. Die PE/DCP-Liposomen wurden zu den Mischungen in den Spuren 4 und 5 zugegeben, und die PG/DCP-Liposomen wurden zu den Mischungen in den Spuren 6 und 7 zugegeben. Triton X-100 lag nur in den Spuren 5 und 7 vor. In jedem Fall zeigte die Zugabe von Triton X-100 eine UV-spezifische Schneideaktivität der im Innern der Liposomen eingeschlossenen Endonuclease V.
Die Figur 3 zeigt eine Photographie der T4-Endonuclease V enthaltenden Liposomen, die durch Immunfluoreszenz angefärbt waren. Die aus Phosphatidylcholin und Cholesterin (Molverhältnis 9:1) und T4-Endonuclease V zusammengesetzten Liposomen wurden auf einem Glas-Objektträger getrocknet und mit eiskaltem Aceton fixiert. Der Objektträger wurde mit 1% Rinderserumalbumin blokkiert und mit Kaninchen anti-T4-Endonuclease V IgG-Antikörpern und mit an Alkalische Phosphatase-konjugierten Ziege-Anti-Kaninchenantikörpern gefärbt. Die Stellen der Antikörperbindung wurden durch Inkubation mit 4-Methylumbelliferylphosphat (4- MUP), das durch die Alkalische Phosphatase zu einem Fluoreszenzfarbstoff geschnitten wurde, und Sichtbarmachung durch ein Fluoreszenzmikroskop ermittelt. Bei den hellen Kreisen unterschiedlicher Größe handelt es sich um gefärbte, T4-Endonuclease V enthaltende Liposomen.
Die Figur 4 zeigt das Überleben von XP12BE-Zellen, die mit UV- bestrahlt und entweder mit (gefüllte Kreise) oder ohne (offene Kreise) Endonuclease V enthaltende Liposomen behandelt worden waren. Im Feld A wurden die Zellen mit DPPC/PC/Chol-Liposomen mit 0,1 ug/ml Endonuclease V behandelt, und im Feld B wurden die Zellen mit PC/DCP/Chol-Liposomen mit 0,075 ug/ml Endonuclease V behandelt.
Die Figur 5 zeigt die pH-Sensitivität von Liposomen, die aus Phosphatidylcholin, PhosphatidyIethanolamin, Ölsäure und Cholesterinhemisuccinat zusammengesetzt waren. 8-Aminonaphthalin- 1,3,6-trisulfonsäure (ANTS) und p-Xylen-bis-pyridiniumbromid (DPX) wurden in die aus Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, ölsäure und Cholesterinhemisuccinat zusammengesetzten Liposomen in einem Molverhältnis von 2:2:1:5 eingeschlossen. Die Liposomen wurden in einem Puffer mit einem pH-Wert von 5 oder 8 verdünnt, bei 37ºC inkubiert, und die Fluoreszenz wurde über einen Zeitraum von 30 Minuten mit Liposomen verglichen, die in Triton X-100 gelöst waren. ANTS ist ein Farbstoff, dessen Fluoreszenz gelöscht wird, wenn eine hohe DPX-Konzentration in die Liposomen eingeschlossen wird. Das Lösen der Liposomen in Triton X-100 verdünnt das DPX relativ zum ANTS und erhöht somit die Fluoreszenz. Die Inkubation der Liposomen bei pH 8 veränderte ihre Fluoreszenz nicht (gefüllte Kreise). Die Inkubation der Liposomen bei pH 5 (offene Kreise) erhöhte ihre Fluoreszenz über die Zeit, was die pH-Sensitivität der Liposomen zeigt.
Die Figur 6 zeigt die nicht geplante DNA-Synthese in normalen epidermalen Humankeratinozyten, die mit UV-C bestrahlt waren und die entweder mit Endonuclease V enthaltenden Liposomen behandelt oder nicht behandelt worden waren. Die Zellen wuchsen auf Deckgläsern, die entweder UV-bestrahlt waren oder nicht, und wurden mit [H-3]-Thymidin und entweder ohne Liposomen (offene Kreise) oder mit Liposomen mit 0,02 ug/ml (gefüllte Kreise), 0,1 ug/ml (offene Vierecke) oder 0,2 ug/ml Endonuclease V (gefüllte Vierecke) inkubiert. Nach vier Stunden wurden die Zellen fixiert und mit Nuclear-Track-Emulsion beschichtet. Sieben Tage nach Exposition wurden die Deckgläser entwickelt, und die Körner über den Kernen von 25 Zellen, die nicht stark markiert waren (d.h. nicht in der 5-Phase vorlagen), wurden für jedes Deckgläschen gezählt und gemittelt. Die mit Liposomen behandelten Zellen zeigten eine erhöhte, nicht geplante DNA-Synthese nach der UV-Bestrahlung im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen.

BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Wie oben angeführt, betrifft die vorliegende Erfindung 1) ein Verfahren zur Reinigung von DNA-Reparaturenzymen unter sequentieller Verwendung einer Molekularsieb-Chromatographiesäule und einer Nucleinsäure-Affinitätssäule und 2) die Verwendung von Liposomen zur Verabreichung von DNA-Reparaturenzymen an lebende Zellen.
Die Reinigung und die Verabreichung als Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind auf eine Vielzahl von DNA-Reparaturenzymen anwendbar, die an sich bekannt sind oder im Anschluß an diese Erfindung entwickelt oder entdeckt werden. Insbesondere ist die Erfindung mit T4-Endonuclease V, O&sup6;-Methylguanin- DNA-Methyltransferasen und mit den anderen, oben angegebenen und besprochenen DNA-Reparaturenzymen verwendbar.
Bezugnehmend auf die erfindungsgemäßen Reinigungsschritte dient der erste Schritt des Reinigungsverfahrens (Molekularsiebanwendung) zur Abtrennung der DNA-Reparaturenzyme von der großen Mehrheit von größeren Proteinen, bezogen auf die relativen Wanderungsgeschwindigkeiten der DNA-Reparaturenzyme, und den kontaminierenden Proteinen durch die Molekularsiebmatrix.
Das Molekularsiebverfahren ist durch viele Methoden, einschließlich der Gelfiltration und der Elektrophorese, durchführbar. Bei der Gelfiltration fließen Proteine um und durch Poren von Kugeln aus Dextran, Polyacrylamid, Agarose, Agarose- und Acrylamid-Verbundstoffen oder andere Materialien. Aufgrund der Größe der Kugelporen werden Proteine aufgrund ihrer Größe eingeschlossen oder ausgeschlossen. Bei der Elektrophorese wandern Proteine in einem angelegten elektrischen Feld durch eine nach Größen auftrennende Matrix.
Das erfindungsgemäß bevorzugt verwendbare Molekularsiebverfahren ist die Gelfiltration, da das Enzym leicht wiedergewonnen werden kann und da das Verfahren von Faktoren wie der Netto- Proteinladung unabhängig ist. Die Porengröße der in diesem Verfahren verwendeten Kugeln wird ausgewählt, so daß die Trennung der DNA-Reparaturenzyme von der Masse der anderen Proteine maximiert wird. Als allgemeine Richtlinie zur Auswahl der Gelfiltrationsmatrix sollte das Gel eine Ausschlußgrenze von über etwa dem Zweifachen des Molekulargewichts oder des Stokes-Radius des DNA-Reparaturenzyms und unter etwa 60.000 Dalton oder 35 Å besitzen.
Zur Elution des DNA-Reparaturenzyms aus der Gelfiltrationssäule ist eine weite vielzahl an Elutionspuffern verwendbar. Der ausgewählte Puffer sollte den nachfolgenden Kriterien genügen: 1) der Puffer sollte das DNA-Reparaturenzym nicht denaturieren oder inaktivieren; 2) der Puffer sollte eine Ionenabsorption des DNA-Reparaturenzyms an das Gelfiltrationsmedium nicht erlauben; und 3) der Puffer sollte mit der Beladung des Eluats auf die Nucleinsäure-Affinitätssäule kompatibel sein, d.h. der Elutionspuffer sollte so ausgewählt werden, daß sich zwischen dem DNA-Reparaturenzym und den immobilisierten Nucleinsäuren der Affinitätssäule Komplexe ausbilden.
Der zweite Schritt des Reinigungsverfahrens (Nucleinsäure- bindung) trennt die DNA-Reparaturenzyme von den verbliebenen Proteinverunreinigungen durch die Fähigkeit der DNA-Reparatur- enzyme, an Nucleinsäure reversibel zu binden. Die Trennung der Nucleinsäurebindung ist durch verschiedene Methoden erreichbar, einschließlich Nucleinsäure-Affinitätschromatographie. Bei diesem Verfahren werden Nucleinsäuren auf einer inerten Matrix, beispielsweise Agarose, Polyacrylamid-Kugeln, Zellulose oder einem anderen Medium, immobilisiert. In Abhängigkeit vom zu reinigenden DNA-Reparaturenzym können die immobilisierten Nucleinsäuren eine doppel- oder einzelsträngige DNA, eine doppel- oder einzelsträngige RNA oder andere Arten, Längen, Strukturen oder eine Kombination von Nucleinsäuren sein, beispielsweise tRNA, Z-DNA, supercoiled DNA, UV-bestrahlte DNA oder durch andere Mittel modifizierte DNA. Im allgemeinen wird einzelsträngige DNA bevorzugt.
Die Nucleinsäuren können an die Festphasenmatrix durch eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich kovalenter Anhaftung an die Nucleinsäure durch primäre Amine oder durch Adsorption der Nucleinsäuren an eine Matrix, beispielsweise Zellulose, die die Nucleinsäuren langsam freisetzt, angelagert werden. Das bevorzugte Immobilisierungsverfahren ist die Verwendung von Cyanogenbromid-aktivierter Sepharose und die kovalente Bindung der Nucleinsäuren an die aktivierte Sepharose. Alternativ hierzu kann an Agarose kovalent gebundene einzelsträngige DNA kommerziell von der Firma Bethesda Reseach Labs, Gaithersburg, Maryland (Katalog Nr. 5906SA) bezogen werden.
Die DNA-Reparaturenzyme werden an die Nucleinsäuren in einer Lösung aufgebracht, die den nachfolgenden Kriterien genügen sollte: 1) die Lösung sollte eine reversible Bindung des DNA- Reparaturenzyms an die Nucleinsäuren ermöglichen; 2) die Lösung sollte eine unspezifische Bindung kontaminierender Proteine an die Nucleinsäuren verringern; und 3) die Lösung sollte die Nucleinsäuren nicht beschädigen. Im allgemeinen wird eine neutral-gepufferte Lösung mit physiologischem Kochsalz und 1 mM EDTA diesen Kriterien genügen. Wie oben angeführt, werden die Elutionsfraktionen aus der Molekularsiebsäule erfindungsgemäß direkt auf die Nucleinsäure-Affinitätssäule geladen. Demgemäß sollte der mit der Molekularsiebsäule verwendete Elutionspuffer so ausgewählt werden, daß er den oben beschriebenen Kriterien genügt.
Die gebundenen DNA-Reparaturenzyme werden aus der Nucleinsäure- Affinitätssäule mit einem Gradienten eluiert, der das Enzym von der Nucleinsäure unter einer charakteristischen Bedingung entfernt und das Enzym durch die Fokussierungswirkung des Gradienten konzentriert. Das Elutionssystem sollte jedoch das Enzym weder denaturieren noch Kontaminanten in das Endprodukt einführen. Ein NaCl-Gradient bis zu 1,0 M wird im allgemeinen ausreichend sein, um die Bindung der meisten DNA-Reparaturenzyme an die Nucleinsäuren umzukehren. In entsprechenden Fällen kann der Gradient auch aus einem anderen Salz bestehen, der pH-Wert höher oder niedriger liegen, eine andere Temperatur, Spannung oder ein anderes Detergenz ausgewählt werden, oder, falls erwünscht, ein kompetierender Ligand eingeführt werden, um die Nucleinsäurebindung zu ersetzen.
Bezugnehmend auf die erfindungsgemäße Verabreichung können die Liposomen, die zur Verabreichung der DNA-Reparaturenzyme verwendet werden, von unterschiedlicher Art sein und verschiedene Zusammensetzungen aufweisen. Zu den Haupteinschränkungen gehört, daß die Liposomen gegen die lebenden Zellen nicht toxisch sein sollten und daß sie ihren Inhalt in das Innere der zu behandelnden Zellen zuführen sollten.
Die Liposomen können unterschiedliche Größen aufweisen, und sie können entweder eine oder mehrere Membranschichten aufweisen, die die Innen- und Außenkompartimente voneinander trennen. Die wichtigsten Elemente der Liposomenstruktur sind die Aufnahme des Enzyms in einer ausreichenden Menge, so daß nur ein Liposom oder nur einige Liposomen in die Zellen eindringen müssen, um das DNA-Reparaturenzym bereitzustellen, und daß das Liposom gegen Zerstörung beständig ist. Liposomenstrukturen umfassen kleine unilamellare Versikel (SUVs, weniger als 250 Å Durchmesser), große unilamellare Versikel (LUVs, über 500 Å Durchmesser) und multilamellare Versikel (MLs). In den unten angegebenen Beispielen werden SUVs zur Verabreichung der DNA-Reparaturenzyme verwendet. SUVs sind von anderen Liposomen und nicht aufgenommenem Enzym durch Molekularsiebchromatographie isolierbar, was zwar genau, jedoch zeitraubend ist und Liposomen ausdünnt, oder durch differentielle Zentrifugation, was schnell geht, jedoch einen weiteren Bereich an Liposomengrößen ergibt. Die Liposomen können aus natürlichen und synthetischen Phospholipiden, Glycolipiden und anderen Lipiden und Lipidverwandten; Cholesterin, Cholesterinderivaten und anderen Cholesterinverwandten; geladenen Spezies, die der Membran eine Nettoladung verleihen; reaktiven Spezies, die nach der Liposomenbildung reagieren können, um zusätzliche Moleküle an die Liposomenmembran zu binden; und anderen lipidlöslichen Verbindungen hergestellt sein, die eine chemische oder biologische Aktivität zeigen.
Die Liposomenmembranen sind einem Phasenübergang von der kristallinen zur flüssigen Phase bei einer Temperatur (Tc) unterworfen, die für die Phospholipidzusammensetzung charakteristisch ist. Wenn das Phospholipid über den Tc-Wert erhitzt und dann abgekühlt wird, hält die Membran Wasser in ihrem amphiphilen Gitter zurück und besitzt die Eigenschaften eines Gels. Um den flüssigen oder Gelzustand zu erreichen, muß die Phospholipidzusammensetzung derart sein, daß der Tc-Wert geringer ist als die Temperatur, die das eingeschlossene Enzym inaktiviert. Cholesterin in der Phospholipidmischung verringert wirksam den Tc-Wert durch Erweiterung des Bereichs, bei dem der Phasenübergang auftritt. Unter Berücksichtigung dieser Erfordernisse umfaßt eine geeignete Mischung zur Herstellung der erfindungsgemäßen Liposomen Phosphatidylcholin (oder ein Derivat hiervon mit einem Tc-Wert von unter 42ºC), Dicetylphosphat (oder eine negativ geladene Spezies bei Neutralität) und Cholesterin (oder ein Cholesterinderivat) in einem Molverhältnis von 7:2:1.
Wie oben beschrieben, werden pH-sensitive Liposomen bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung als Liposom bevorzugt verwendet. Robert Straubinger, Keelung Hong, Daniel Friend und Demetrios Papahadjopoulos beschrieben in ihrer Druckschrift mit dem Titel "Endocytosis of Liposomes and Intracellular Fate of Encapsulated Molecules: Encounter with a Low pH Compartment after Internalization in Coated Vesicles", auf die oben Bezug genommen wurde, daß ein Weg zum Eintritt von Liposomen in das Zellplasma die Endozytose in Lysozymen bei einem niedrigen pH- Wert ist. Demnach sind Liposomen, die bei einem neutralen pH- Wert stabil sind, ihren Inhalt jedoch bei einem sauren pH-Wert freisetzen, zur Beförderung von Enzymen in die Lysozymen des Cytoplasmas verwendbar, worauf ihr Inhalt freigesetzt wird. Da DNA-Reparaturenzyme wie die T4-Endonuclease V bei einem niedrigen pH-Wert relativ stabil sind, ermöglicht dieses Verfahren eine wirksame Beförderung aktiver Enzyme in die Zellen.
Liposomen können durch die Lipidzusammensetzung gegen den niedrigen pH-Wert der Lysozyme sensitiv gemacht werden. Vergleiche hierzu allgemein das Kapitel 11 des oben angegebenen Buches "Cell Fusion". Insbesondere sind pH-sensitive Liposomen unter Verwendung von Phospholipiden herstellbar, die, wenn sie geladen sind, Lipiddoppelschichten bilden, jedoch im neutralisierten Zustand keine geordnete Formen annehmen. Ein Beispiel für ein derartiges Phospholipid ist PhosphatidyIethanolamin, das bei einem pH-Wert von über 9 negativ geladen ist. Die Nettoladung des Phospholipids kann bei einem pH-Wert, der ansonsten die Kopfgruppen neutralisieren würde, dadurch aufrechterhalten werden, daß geladene Moleküle in der Lipiddoppelschicht aufgenommen werden, die selbst neutralisiert werden können. Beispiele für derartige geladene Moleküle sind Ölsäure und Cholesterinhemisuccinat, die bei einem neutralen pH-Wert negativ geladen sind, bei einem pH-Wert von 5 jedoch neutralisiert werden. Die Wirkung einer Kombination dieser Verbindungen in einer Lipiddoppelschicht ist so, daß bei einem pH-Wert von 9 alle Moleküle geladen sind; bei einem pH-Wert von 7 hält die negative Nettoladung der Ölsäure und des Cholesterinhemisuccinats die Stabilität des Phosphatidylsethanolamins aufrecht, bei einem pH-Wert von 5 werden alle Bestandteile protoniert, und die Lipidmembran wird destabilisiert. Weitere neutrale Moleküle, beispielsweise Phosphatidylcholin, können zu den Liposomen so lange zugegeben werden, wie sie mit der Stabilisierung des pH- sensitiven Phospholipids durch die geladenen Moleküle nicht interferieren.
Die unten angegebenen Beispiele veranschaulichen zwei spezielle Verfahren zur Herstellung von pH-sensitiven Liposomen. Beim ersten Verfahren destabilisiert die Kombination von Phosphatidylethanolamin und Cholesterinhemisuccinat (CHEMS) in der Lipidmembran das Liposom bei einem pH-Wert von unter 4,5, beschrieben durch Joe Bentz, Harma Ellens und Francis Szoka in der Druckschrift mit dem Titel "Destabilization of Phosphatidylethanolamine-Containing Liposomes: Hexagonal Phase and Asymmetric Membranes", auf die Bezug genommen wird. Diese Druckschrift bestimmte die Destabilisierung durch eine Herabsetzung der Phasenübergangstemperatur oder durch ein Lecken eines Liposoms in Gegenwart eines anderen Liposoms einer unterschiedlichen Zusammensetzung. Vergleiche auch Harma Ellens, Joe Bentz und Francis C. Szoka, "pH-Induced role of bilayer contact", auf die Bezug genommen wird. Bei dem zweiten Verfahren destabilisiert der Einschluß von Ölsäure mit Phosphatidylethanolamin ebenfalls die Lipiddoppelschicht bei einem pH-Wert von unter 6,5 und verleiht dem Liposom bei einem neutralen pH-Wert eine negative Nettoladung, beschrieben in "pH-Sensitive Liposomes Mediate Cytoplasmic Delivery of Encapsulated Macromolecules" von Robert Straubinger, Nejat Duzgunes und Demetrios Papahadjopoulos, auf die Bezug genommen wird.
Die Beispiele zeigen weiterhin, daß aus einer Mischung von Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin zusammengesetzte Liposomen pH-sensitiver sind als solche, die nur aus Phosphatidylethanolamin bestehen. Weiterhin wurde gefunden, daß Liposomen mit einem Molverhältnis von CHEMS zu den übrigen Bestandteilen des Liposoms von etwa 1:1 auf pH-Änderungen schneller reagieren als Liposomen, die geringere Mengen an CHEMS enthalten, z.B. 20 Minuten im Gegensatz zu 3 Stunden. Demnach ist eine bevorzugte Zusammensetzung für die pH-sensitiven Liposomen Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Ölsäure und Cholesterinhemisuccinat (PE/PC/OA/CHEMS) in einem Molverhältnis von 2:2:1:5. Natürlich sind bei der Durchführung der Erfindung auch andere Zusammensetzungen zur Herstellung von pH-sensitiver Liposomen, die bekannt sind oder noch entwickelt werden, verwendbar.
Die Liposomen der vorliegenden Erfindung werden durch Kombinieren eines Phospholipidbestandteils mit einem das DNA-Reparaturenzym enthaltenden wäßrigen Bestandteil unter solchen Bedingungen hergestellt, die zur Vesikelbildung führen. Die Phospholipidkonzentration muß ausreichend sein, um lamellare Strukturen auszubilden, und der wäßrige Bestandteil muß mit der biologischen Stabilität des Enzyms kompatibel sein. Verfahren zum Kombinieren des Phospholipids und der wäßrigen Bestandteile zur Bildung der Vesikel umfassen: Trocknen der Phospholipide auf Glas und anschließendes Dispergieren der Phospholipide im wäßrigen Bestandteil; Einführen von in einem verdampfenden oder nicht-verdampfenden organischen Lösungsmittel gelösten Phospholipiden in den wäßrigen Bestandteil, der vorher erhitzt wurde; und Auflösen von Phospholipiden in der wäßrigen Phase mit Detergentien und anschließendes Entfernen des Detergens durch Dialyse. Die Konzentration des DNA-Reparaturenzyms im wäßrigen Bestandteil ist durch Lyophilisierung des Enzyms auf den getrockneten Phospholipiden und anschließender Rehydratisation der Mischung mit einem verringerten Volumen eines wäßrigen Puffers erhöhbar. SUVs sind aus den oben genannten Mischungen entweder durch Ultraschallbehandlung oder durch Dispergierung der Mischung, entweder durch eine kleine Bohrung oder durch die kleine Öffnung einer French-Presse, herstellbar.
In den unten angegebenen Beispielen wurden die SUVs durch Trocknung der Phospholipide auf Glas, Rehydratisation in einem das DNA-Reparaturenzym enthaltenden wäßrigen Puffer unter Schütteln bei 37ºC, Ultraschallbehandlung der so erhaltenen Mischung und Isolieren der das DNA-Reparaturenzym enthaltenden SUVs durch Molekularsiebchromatographie und Konzentrierung der SUVs durch Zentrifugation hergestellt. Die Figur 3 zeigt die erfolgreiche Anwendung dieser Technik zum Einbau von DNA-Reparaturenzymen in Liposomen.
Die in Liposomen aufgenommenen DNA-Reparaturenzyme können intern oder topisch an lebende Zellen verabreicht werden. Die innere Verabreichung an Tiere oder Menschen macht es erforderlich, daß Liposomen pyrogenfrei und steril sind. Zum eliminieren von Pyrogenen werden pyrogenfreie Rohmaterialien, einschließlich aller Chemikalien, Enzyme und Wasser, zur Bildung der Liposomen verwendet. Die Sterilisierung ist durch Filtration der Liposomen durch 0,2 um Filter durchführbar. Zur Injektion werden die Liposomen in einem sterilen, pyrogenfreien Puffer mit einer physiologisch wirksamen Konzentration suspendiert. Die topische Verabreichung macht es ebenfalls erforderlich, daß die Liposomenzubereitung pyrogenfrei ist, und es ist ebenfalls wünschenswert, daß sie steril vorliegt. In diesem Fall kann eine physiologisch wirksame Konzentration an Liposomen in einem gepufferten Polymerglykolgel zur gleichmäßigen Aufbringung auf die Haut suspendiert werden. Im allgemeinen sollte das Gel nichtionische Detergentien nicht enthalten, da diese die Liposomenmembranen zerstören können. Andere Träger sind ebenfalls zur topischen Verabreichung der Liposomen verwendbar. Die Enzymkonzentration in der Endzubereitung kann über einen weiten Bereich variieren, wobei eine typische Konzentration in der Größenordnung von 50 ug/ml liegt. Im Falle pH-sensitiver Liposomen sind geringere Konzentrationen des DNA-Reparaturenzyms verwendbar, beispielsweise in der Größenordnung von 0,01 bis 1,0 ug/ml für intern an Zellen verabreichte Liposomen. Im Falle einer topischen Anwendung werden höhere Liposomenkonzentrationen verwendet, z.B. zehnfach höhere Konzentrationen oder darüber.
Ein allgemeiner Überblick über Liposomen und die Liposomentechnologie ist im folgenden Artikel zu finden: "Liposomes" von Marc J. Ostro, veröffentlicht in Scientific American, Januar 1987, Band 256, Seiten 102-111, und in einem dreibändigen Werk mit dem Titel Liposome Technology, herausgegeben von G. Gregoriadis, 1984, veröffentlicht von CRC Press, Boca Raton, Florida. Die einschlägigen Teile der Literatur werden zum Zwecke der umfassenden Offenbarung voll inhaltlich in die vorliegende Beschreibung mit aufgenommen.
Die nachfolgende Erfindung wird nunmehr anhand nicht beschränkender Ausführungsbeispiele weiter beschrieben.

BEISPIEL 1

Reinigung von Endonuclease V

(1) Enzymreinigung

(A) Zellwachstum und Induktion

Der das Plasmid pTACdenV enthaltende E. coli-Stamm SR1268 ist von J. Chenevert, L. Naumovski, R.A. Schultz und E.C. Friedberg in Molecular and General Genetics, 1986, Band 203, Seiten 163-171 beschrieben. Eine Probe dieses Stammes wurde von Dr. Errol Friedberg, Department of Pathology, Stanford, California 94305 erhalten. Eine Kultur der Bakterien wurde in 200 ml LB+amp (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, 125 ug/ml Ampicillin, pH 7,5) hergestellt und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Kultur wurde in LB+amp auf 2 Liter verdünnt und bei 37ºC inkubiert, bis die optische Dichte bei 600 nm 0,3 betrug. Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid wurde auf eine Konzentration von 1 mM zugegeben, und die Inkubation wurde weitere 60 Minuten lang fortgesetzt.

(B) Zellyse und Proteinpräzipitation

Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 12.785 x g für 15 Minuten bei 4ºC gesammelt und in 200 ml TES (50 mM Tris, pH 8,0, 50 mM Na&sub2;EDTA, 15% Sucrose) resuspendiert. 0,2 g Lysozym wurden zugegeben, und die Mischung wurde bei 25ºC 30 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurden 160 ml eiskaltes destilliertes Wasser und 40 ml 10% Streptomycinsulfat zugegeben und bei 4ºC 30 Minuten lang gerührt. Das Lysat wurde bei 15.188 x g 15 Minuten lang zentrifugiert, und der Überstand wurde gesammelt. Hierzu wurden 83,2 g Ammoniumsulfat langsam unter Rühren bei 4ºC zugegeben und 30 Minuten lang weiter gerührt. Die Mischung wurde bei 15.188 x g 15 Minuten lang abzentrifugiert, und der Überstand wurde gesammelt. 79,6 g Ammoniumsulfat wurden zugegeben und bei 4ºC 30 Minuten lang gerührt. Die Mischung wurde bei 15.188 x g 15 Minuten lang abzentrifugiert, und das Präzipitat wurde im Puffer A (50 mM Tris, pH 8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) resuspendiert und gegen 1,0 l Puffer A über Nacht bei 4ºC dialysiert.

(C) Gel-Filtration

Die dialysierten Proteine wurden auf eine Standardsäule (2,5 cm Durchmesser x 30 cm) aus AcA54-Gelfiltrationsmedium (LKB) mit einer Fließgeschwindigkeit von 50 ml/h beladen. Die Proteine wurden isokratisch mit dem Puffer A eluiert, und 5 ml Fraktionen wurden auf ihre optische Dichte bei 280 nm kontrolliert. Der zweite große Protein-Peak, der bei etwa R(f)=1,67 eluierte, wurde gesammelt.

(D) Chromatographie mit einzelsträngiger DNA

Sepharose mit einzelsträngiger DNA wurde durch Kochen von Kalbsthymus-DNA, und ihre kovalente Bindung an CNBr-aktivierte Sepharose (Pharmacia) gemäß den Weisungen des Herstellers hergestellt. Die so erhaltene Sepharose wurde auf eine Superflo 50-Radialflußsäule (Sepragen) gepackt. Alternativ hierzu wurde eine einzelsträngige DNA/Agarose-Säule von der Firma Bethesda Research Labs verwendet (vergleiche oben). Der zweite Protein-Peak aus der Gelfiltration wurde direkt auf die DNA-Säule mit einzelsträngiger DNA mit einer Fließgeschwindigkeit von 400 ml/h geladen und mit 250 ml Puffer A gewaschen. Mit der gleichen Fließgeschwindigkeit wurde die Säulenchromatographie mit einem linearen Gradienten von 200 ml von 50 mM bis 1,0 M NaCl in Puffer A durchgeführt. 5 ml große Fraktionen wurden bei der optischen Dichte von 280 nm kontrolliert. Der Protein- Peak, der bei etwa der Hälfte des Gradientenflusses eluierte, wurde gesammelt. Wie unten gezeigt, bestand dieser Peak aus reiner Endonuclease V.

(E) Lagerung.

Heringssperma-DNA wurde zum Enzym in einer Konzentration von 20 ug/ml zugegeben, und die erhaltene Mischung wurde über Nacht bei 4ºC gegen einen Puffer aus 50 ml mM Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid dialysiert. Dieser Mischung wurde Polyethylenglykol in einer Konzentration von 3% zugegeben, und die Endlösung wurde bei 4ºC bis zur Verwendung gelagert.

(2) Test auf Endonuclease V-Aktivität

Der zur Bestimmung der Endonuclease V-Aktivität verwendete Test bestimmte die Relaxation durch das Enzym von supercoiled Plasmid-DNA, die durch in die UV-bestrahlte DNA eingeführte Einzelstrang-Brüche produziert wurde. Eine Einheit der Enzymaktivität wird definiert als die Enzymmenge, die im Mittel einen Bruch pro Molekül in 1 g pBR322-Plasmid, das mit 40 J/m² von 254 nm UV-Licht bei einer Inkubation von 10 Minuten bei 37ºC bestrahlt wurde, erzeugt.

(A) Substrat

Das Plasmid pBR322 wurde mit 40 J/m² 254 nm UV-Licht bestrahlt und mit unbestrahltem Plasmid pSV2neo vermischt. Da das pBR322-Plasmid kleiner ist als das pSV2neo-Plasmid, laufen sowohl ihre supercoiled als auch die relaxierten Formen in Neutralagarosegelen schneller als die entsprechenden pSV2neo-Formen. Jedoch läuft die supercoiled Form von pSV2neo schneller als die relaxierte Form von pBR322. Das Substrat für den Test ist die UV-bestrahlte pBR322-DNA, und die pSV2neo- DNA dient als Kontrolle für eine nicht-spezifische Nucleaseaktivität. Diese Substrat-DNA wurde mit einer Konzentration von 20 ug/ml eines jeden Plasmids in Endo V-Puffer (50 mM NaHPO&sub4;, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 ug/ml Rinderserumalbumin, pH 6,5) hergestellt.

(B) Reaktion

25 ul Substrat-DNA wurden mit 25 ul der Enzympräparation aus obigem Schritt 1(E) vermischt, in Endo V-Puffer verdünnt und bei 37ºC 10 Minuten lang inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 ul 10x-Gelladepuffer (0,25% Bromphenolblau, 30% Ficoll) gestoppt.

(C) Agarosegelelektrophorese

In TAE-Puffer (40 mM Tris, pH 8,4, 5 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA) wurde ein 0,8% Agarosegel hergestellt. 10 ul einer jeden Reaktion wurden beladen und bei 7 V/cm einer Elektrophorese unterworfen. Wenn der Farbstoff 2/3 der Gellänge gewandert war, wurde das Gel in Ethidiumbromid (1 ug/ml) getränkt, in 1 mM MgSO&sub4; entfärbt und im Durchlicht in einem 360 nm UV-Licht betrachtet. Das Gel wurde unter Verwendung eines Wrattan-Rotfilters und eines Polaroid-Positiv/Negativfilms vom Typ 665 photographiert. Das Negativ wurde in destilliertem Wasser gewaschen.

(D) Filmanalyse

Zur Quantifizierung der Endonuclease-Aktivität wurde das Negativ durch einen Densitometer abgetastet, und die Spannungs-Analogablesungen wurden in digitaler Form in einem Computer gespeichert. Zur Integration der Fläche einer jeden durch die Densitometrie nachgewiesenen Bande wurde Labtech Chrom Software (Laboratory Technologies Corporation, Wilmington, Massachusetts) verwendet. Die durchschnittliche Anzahl an Brüchen in jedem Plasmid wurde aus dem natürlichen Logarithmus der Fraktion mit den supercoiled-Molekülen berechnet. Die durchschnittliche Anzahl UV-spezifischer Brüche wurde aus der Differenz der durchschnittlichen Brüchen zwischen pBR322- und pSV2neo-DNA, korrigiert um die Differenz in den unbehandelten Proben, berechnet.

(3) Ergebnisse

Typische Ergebnisse des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens waren wie folgt: zwei Liter Bakterienkultur wurden präpariert und lysiert. Nach der Präzipitation der Nucleinsäuren durch Streptomycinsulfat verblieben 660 mg Protein. Aus der Ammoniumsulfatpräzipitation wurden 525 mg Protein wiedergewonnen und auf die Gelfiltrationssäule geladen, und 15 mg reine Endonuclease V wurden nach der DNA-Affinitätssäule in einer Konzentration von 0,2 mg/ml wiedergewonnen. Die Enzymaktivität betrug 10.000 Einheiten pro ug Protein. Die Präparation produzierte eine einzige Bande auf dem Polyacrylamid-Elektrophoresegel (vgl. Figur 1), und auf den Western-Blots des Proteins, die mit gegen Endonuclease V gerichtetes Kaninchen-Antiserum markiert waren, tauchte eine einzelne Bande auf. Das Enzym war für wenigstens 4 Monate bei 4ºC und für wenigstens 5 Tage bei 37ºC stabil und wies eine Halbwertszeit bei 42ºC von über 30 Minuten auf.

BEISPIEL 2

Reinigung von O&sup6;-Methylguanin-DNA-Methyltransferase

O&sup6;-Methylguanin-DNA-Methyltransferase ist ein DNA-Reparaturenzym, das aus der DNA Alkylgruppen entfernt und sie auf sich selbst in einer Suizidreaktion überträgt. Die Eigenschaften dieses Enzyms wurden von Daniel Yarosh in einem Übersichtsartikel mit dem Titel "The role of O&sup6;-methylguanine-DNA methyltransferase in cell survival, mutagenesis and carcinogenesis", veröffentlicht in Mutation Research, Band 145, Seiten 1-16, 1985, zusammengefaßt.

(1) Enzymreinigung

(A) Zellwachstum und Induktion

Der das Plasmid pSM31 enthaltende E. coli-Stamm N445 wurde bis zur stationären Phase in LB+amp gezogen, wie dies im obigen Beispiel 1 beschrieben wurde. Das Plasmid pSM31 enthält das gesamte ada-Gen mit seinem eigenen Promotor und kodiert für die O&sup6;-Methylguanin-DNA- Methyltransferase von E. coli. Eine Probe des N445- Stammes wurde von Dr. Sankar Mitra, Biology Department, Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, Tennessee 37831, erhalten. Die Produktion der Transferase durch diese Zellen wurde durch Zugabe von N-Methyl-N'-nitro- N-nitrosoguanidin auf eine Konzentration von 0,5 ug/ml und Inkubieren der Kultur bei 37ºC für 90 Minuten induziert.

(B) Zellyse und Proteinpräzipitation

Die Zellen wurden durch die gleichen Verfahren, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurden, gesammelt und lysiert. Nucleinsäuren wurden durch Streptomycinsulfat wie in Beispiel 1 beschrieben präzipitiert. Ammoniumsulfat wurde bei einer Konzentration von 112 g pro 200 ml Überstand zugegeben und bei 4ºC 60 Minuten lang gerührt. Die präzipitierten Proteine wurden durch Zentrifugation bei 15.188 x g für 30 Minuten gesammelt, in 5 ml Puffer A resuspendiert und über Nacht gegen 1,0 Liter Puffer A bei 4ºC dialysiert.

(C) Gelfiltration und Chromatographie mit einzelsträngiger DNA

Die Chromatographie des Zellysats wurde wie für die Endonuclease V beschrieben durchgeführt. Die Transferase eluierte aus dem AcA54-Gel in Form einer Schulter auf dem ersten großen optische Dichte-Peak und von der einzelsträngigen DNA nach etwa einem Drittel des Gradienten. Wie unten gezeigt, bestand der gesammelte Peak aus reiner O&sup6;-Methylguanin-DNA-Methyltransferase.

(2) Test auf O&sup6;-Methylguanin-DNA-Methyltransferase-Aktivität

Der zur Bestimmung der Aktivität des O&sup6;-Methylguanin-DNA- Methyltransferase-Enzyms verwendete Test bestimmte die Übertragung von radioaktiv markierten Methylgruppen aus der DNA zum Protein, und er wurde von B. Myrnes, K. Nordstrand, K. Giercksky, C. Sjunneskog und H. Krokan in einem Bericht "A simplified assay for O&sup6;-methylguanine-DNA methyl transferase and its application to human neoplastic and non-neoplastic tissues", veröffentlicht in Carcinogenesis, 1984, Band 5, Seiten 1061-1064, beschrieben.

(A) Substrat

Das Substrat für den Test war DNA, die mit einem einfachen Methylierungsmittel alkyliert und dann auf O&sup6;-Methylguanin durch Depurinierung anderer alkylierter Purine angereichert war. Kalbsthymus-DNA in einer Konzentration von 5 mg/ml wurde mit Methylnitrosoharnstoff, enthaltend Tritium im Methylrest mit 1 mCi pro ml eines 0,2 M Natriumcacodylatpuffer, pH 7, 5 mM EDTA, bei 37ºC 4 Stunden lang umgesetzt. Die DNA wurde durch Ethanol präzipitiert, mit Ethanol gewaschen und auf eine Konzentration von 2,5 mg/ml in 0,1 M NaCl, 10 mM Natriumcitrat, 10 mM Kaliumdihydrogenphosphat, pH 7,4 resuspendiert. Die DNA wurde bei 80ºC 16 Stunden lang erhitzt, mit Ethanol präzipitiert, gewaschen und in 10 mM Tris, pH 7, 1 mM EDTA resuspendiert. Dieses Substrat enthielt mehr als die Hälfte aller markierten Addukte in Form von O&sup6;-Methylguanin.

(B) Reakion

0,33 pmol O&sup6;-Methylguanin in der DNA wurden mit der Enzympräparation im Transferasepuffer aus 70 mM Hepes, pH 7,1, 1 mM EDTA vermischt und bei 37ºC 30 Minuten lang inkubiert, um eine Übertragung der markierten Addukte von der DNA auf das Protein zu ermöglichen. Die Mischung wurde auf 5% Trichloressigsäure gebracht und bei 80ºC 30 Minuten lang erhitzt, um die Proteine zu präzipitieren und nicht-umgesetztes O&sup6;-Methylguanin löslich zu machen. Die präzipitierten Proteine wurden aus den löslich gemachten Basen durch Filtrieren über Glasfaserfilter abgetrennt. Die Filter wurden mit Ethanol gewaschen, und die aufgefangene Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung bestimmt. Die Transferasemenge wurde aus der aufgefangenen Radioaktivität und der bekannten spezifischen Aktivität der markierten methylierten Basen berechnet.

(3) Ergebnisse

Typische Ergebnisse aus dieser Reinigung waren wie folgt: nach Präzipitation der Nucleinsäuren aus 2,0 Liter Zellextrakt wurden 218 mg Protein auf die Gelfiltrationssäule geladen, 77 mg Protein wurden gesammelt und auf die Säule mit der einzelsträngigen DNA geladen, und 14 mg reine O&sup6;-Methylguanin-DNA-Methyltransferase wurden wiedergewonnen. Die Enzymaktivität betrug 3.000 pmol Methylgruppen, die pro mg Protein übertragen wurden. Das Protein zeigte eine einzelne Bande (vergleiche Figur 1) auf Polyacrylamidgelen und in Western-Blots unter Verwendung von gegen das Transferaseprotein gerichtetem Kaninchen-Antiserum.

BEISPIEL 3

Einschluß der denV-Endonuclease V in PC/DCP- und PC/SA-Liposomen

(1) Herstellung der Liposomen

Wie oben beschrieben, können Liposomen durch viele Verfahren unter Verwendung vieler Lipid- und nicht-Lipid-Mischungen über einen weiten Bereich von Konzentrationen hergestellt werden. Die nachfolgenden Verfahren wurden in diesem Beispiel verwendet. 22 mg Phosphatidylcholin aus Eigelb und entweder 13,5 mg Dicetylphosphat oder 7,3 mg Stearylamin wurden in 5 ml Chloroform gelöst. 2 ml dieser Mischung wurden zu einem Film auf dem Boden einer 25 ml großen runden Flasche durch einen Luftstrom in einem Wasserbad bei 37ºC getrocknet. Der Film wurde durch ein Vakuum weitere 60 Minuten lang getrocknet. 2 ml von denV-Endonuclease V in einer Konzentration von 0,2 mg/ml, deren Herstellung in Beispiel 1 beschrieben wurde, wurden zugegeben, und die Mischung wurde mit einem Vortex behandelt, um das Lipid in der wäßrigen Lösung zu lösen. Die Flasche wurde 60 Minuten lang in ein Ultraschallbad gegeben. Bei Phosphatidylcholin/Dicetylphosphat-Liposomen wurde die Lösung bei 12.000 x g 5 Minuten lang abzentrifgiert, und der Überstand wurde abgegossen und verworfen. Das Liposomenpellet wurde in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) resuspendiert und wiederum durch Zentrifugation gewaschen. Das Liposomenpellet wurde abschließend in 1 ml PBS resuspendiert. Im Falle der Phosphatidylcholin/Stearylamin-Liposomen wurde die Lösung über eine 1,5 x 30 cm große Säule mit AcA54-Gelfiltrationsmedium eluiert, und 2 ml große Fraktionen wurden gesammelt. Die Liposomen eluierten in den Fraktionen 10-13, und diese Fraktionen wurden gesammelt. Die Liposomenkonzentration wurde durch Verdünnen der suspendierten Liposomen im Verhältnis 1:100 und durch Bestimmung der optischen Dichte bei 600 nm gemessen.

(2) Test auf Liposomeneinschluß

(A) Einschlußeffizienz

Ein radioaktiv markiertes Tracer-Molekül wurde in die wäßrige Proteinlösung aufgenommen, und der in der Liposomenfraktion gefundene Prozentsatz an Radioaktivität wurde mit der in der verbleibenden Fraktion gefundenen Radioaktivität verglichen.

(B) Endonuclease V-Aktivität

Der in Beispiel 1 beschriebene Endonuclease V-Aktivitätstest wurde zur Bestimmung des aktiven Enzyms in den Liposomen verwendet. Die Liposomenpräparation wurde zu Zweifach-Tests zugegeben, wobei der eine 1% Triton X- 100 zum Auflösen der Liposomen enthielt. Der Vergleich der Aktivität zwischen intakten und aufgelösten Liposomen diente als Maß für die Menge an in die Liposomen eingeschlossenem aktiven Enzym. Die Figur 2 zeigt die Art der Ergebnisse, die mit diesem Testprotokoll erhältlich war.

(3) Ergebnisse

Typische Ergebnisse dieses Verfahrens zur Liposomenherstellung waren wie folgt: Liposomen wurden mit Phosphatidylcholin und Stearylamin hergestellt. Unter Verwendung von [H- 3]-Thymidin als Tracer und Abtrennung der Liposomen von nicht-eingebautem Tracer durch Gelfiltration wurden 42.400 cpm in der Liposomenfraktion und 10.939.600 cpm aus der Restfraktion wiedergewonnen, was einer Einschlußeffizienz von 0,39% entspricht. In den Liposomen ohne Triton X-100 wurde keine Endonuclease V-Aktivität nachgewiesen, während die gelösten Liposomen 23.000 Einheiten in 1 ml oder 0,59% der Anfangsaktivität von 4.000.000 Einheiten der Endonuclease V enthielten.

BEISPIEL 4

Einschluß von denV-Endonuclease V in PC/DCP/Chol und PC/SA/Chol-Liposomen

(1) Herstellung der Liposomen

Die Liposomen wurden aus Phosphatidylcholin, Dicetylphosphat und Cholesterin oder aus Phosphatidylcholin, Stearylamin und Cholesterin, je in einem 7:2:1-Molverhältnis, in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise unter Verwendung der Zentrifugationstechnik des Beispiels 3 zur Isolation der Liposomen hergestellt.

(2) Test auf Liposomeneinschluß

(A) Enzymkonzentration

Die in Liposomen aufgenommene Enzymkonzentration wurde durch einen Enzym-gekoppelten Immunosorbens-Assay (ELISA) bestimmt. Die Liposomen wurden auf eine optische Dichte bei 600 nm von 1,0 in 0,1 ml PBS und 25 mM Octyl-beta-D-galactopyranosid zum Auflösen der Liposomen verdünnt. 50 ul wurden dann im Zweifachansatz in 0,2 ml Beschichtungspuffer (50 mM Natriumbicarbonat, pH 9,6, 0,1 mg/ml Thimersol) verdünnt und in einer 96-Loch Mikrotiterplatte seriell 1:1 weiter verdünnt. In identischer Weise wurden Standards von gereinigter Endonuclease V in einer Konzentration von 5 ug/ml in PBS/Octylgalactopyranosid hergestellt. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4ºC wurden die Vertiefungen (Löcher) mit 50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl (TBS) + 0,1% Non-Idet NP 40-Detergenz (TBS/NonI) gewaschen und mit 0,2% Rinderserumalbumin in Beschichtungspuffer 2 Stunden lang bei 25ºC geblockt. Die Vertiefungen wurden gewaschen, und für 2 Stunden bei 25ºC wurde primäres Antiserum von Anti-Endonuclease V-IgG-Antikörpern (5 ug/ml) aus Kaninchen zugegeben. Die Vertiefungen wurden gewaschen, und für 30 Minuten bei 25ºC wurde ein sekundäres Antiserum aus Anti-Kaninchen-IgG-Antikörpern aus Ziege, konjugiert an Alkalische Phosphatase, zugegeben. Die Vertiefungen wurden gewaschen, und o-Nitrophenyl phosphat (1 mg/ml) wurde zugegeben. Nach 30 Minuten Inkubation wurden die optischen Dichten der Vertiefungen bei 405 nm bestimmt. Die Enzymkonzentration in der Liposomenpräparation wurde von einer Standardkurve, bei der die optische Dichte gegen die Enzymkonzentration für die Endonuclease V-Standards aufgetragen war, berechnet.

(B) Endonuclease V-Aktivität

Die Endonuclease V-Aktivität wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 3 beschrieben bestimmt.

(3) Ergebnisse

Die Ergebnisse diese Versuche sind in Tabelle I angegeben. Hieraus ist ersichtlich, daß PC/DCP/Chol-Liposomen und PC/SA/Chol-Liposomen gleiche Mengen an Enzym, ausgedrückt in ug/ml, einbauten. Ausgedrückt in Enzymaktivität wiesen jedoch die PC/SA/Chol-Liposomen mehr als die vierfache Aktivität der PC/DCP/Chol-Liposomen auf.
Unter Verwendung anderer Phospholipide einschließlich Distearoylphosphatidylcholin (DSPC), Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC), Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), Phosphatidylglycerin (PG) und PhosphatidyIethanolamin (PE) wurden Liposomen hergestellt, und die Ergebnisse unter Verwendung dieser Liposomen sind ebenfalls in der Tabelle I angegeben. Die Aktivität des aufgenommenen Enzyms dieser anderen Liposomen wurde qualitativ durch visuelle Prüfung des Aktivitätsgels verifiziert, jedoch nicht quantitativ bestimmt.

BEISPIEL 5

Verstärkung der Reparatur von Human-DNA durch Endonuclease V enthaltende Liposomen

(1) Wachstum und Bestrahlung von Humanzellen in Kultur

Unter Verwendung von Gewebekultur-Standardverfahren wurden Humanzellen kultiviert und zur Bestimmung der Verstärkung der DNA-Reparatur durch Endonuclease V enthaltende Liposomen verwendet. Die verwendeten Humanzellen waren: sekundäre Kultur normaler Human-Epidermis Keratinicyten, noramle Human-Fibroblastenlinie WI-38 und SV-40-transformierte Fibroblastenlinie XP12BE aus einem Patienten mit Xeroderma pigmentosum. Alle Zellen wurden bei 37ºC in angefeuchteter 5% CO2-Atmosphäre, angehaftet an Kunststoffschalen, inkubiert. Die normalen Human-Epidermis Keratinozyten wurden von der Firma Clonetics Corporation, San Diego, Calif., bezogen und entsprechend den von dieser Firma beschriebenen Bedingungen in Keratinozyten-Wachstumsmedium, das ein modifiziertes, mit Rinder-Hypophysenextrakt supplementiertes MDCB-151-Medium ist, kultiviert. Die verbliebenen Zellen wurden in der Dulbecco's Minimal Essential Medium mit 10% Serum aus neugeborenen Kälbern, supplementiert mit Antibiotika und Vitaminen, kultiviert. Alle Zellen wurden fast bis zur Konfluenz wachsengelassen und dann in einem 1:4-Verhältnis subkultiviert. Zur Bestrahlung wurde von den Zellen alles Medium abgegossen, und die Zellen wurden unter einer keimtötenden UV-Lampe ohne Schalendeckel exponiert. Die Lampenleistung lag überwiegend bei 254 nm, und die Fluenzrate wurde mit einem UVX-Digital-Radiometer der Firma Ultra-violet Products, Inc., San Gabriel, Calif., bestimmt, das mit der UVX-25-Probe bei einem 254 nm-Licht ausgestattet war. Die Fluenzrate betrug entweder 1 J/m²/s oder 2,5 J/m²/s in allen Versuchen.

(2) Tests auf erhöhte DNA-Reparatur

(A) Test mit alkalischem Agarosegel auf Liposomen-vermitteltes Schneiden UV-bestrahlter DNA

Die theoretische Basis und die praktische Anwendung des Testsystems mit alkalischem Agarosegel zum Nachweis von Einzelstrangbrüchen ist in der Veröffentlichung von Steven E. Freeman, Anthony D. Blackett, Denise C. Monteleone, Richard B. Setlow, Betsy M. Sutherland und John C. Sutherland mit dem Titel "Quantitation of Radiation-, Chemical-, or Enzyme-Induced Single Stranded Breaks in Nonradioactive Dimers", veröffentlicht in Analytical Biochemistry, Band 158, Seiten 119-129, 1986, beschrieben. Humanzellen wurden mit 100 J/m² 254 nm UV-Licht bestrahlt, und dann wurden Liposomen enthaltendes Medium mit den Zellen 2 Stunden lang inkubiert. Das Medium wurde entfernt, die Zellen von der Platte in PBS geschabt, und die DNA wurde gereinigt. Eine DNA-Aliquot wurde mit 3 V/cm in einem 0,4% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und mit 1 ug/ml Ethidiumbromid gefärbt. Das Gel wurde photographiert, und das Bild der Gelbanden auf dem entwickelten Filmnegativ wurde mit einem Densitometer abgetastet. Das Densitometerergebnis wurde von Analog-Spannungen in die Digitalwerte umgewandelt und in einem Computer gespeichert. In das Gel wurden ebenfalls DNA-Molekulargewichtsmarker mit aufgenommen und gleichfalls abgetastet. Das Molekulargewicht-Zahlenmittel der DNA in jeder Spur wurde wie von Freeman et al. beschrieben durch Normieren der Mobilität im Gel mit den Molekulargewichtsmarkern berechnet. Das durch die Liposomen vermittelte Schneiden ergab ein kleineres Molekulargewicht-Zahlenmittel der DNA als eine DNA, die aus dem bestrahlten, nicht mit Liposomen behandelten Zellen oder aus mit Liposomen behandelter unbestrahlter DNA extrahiert wurde.

(B) DNA-Reparaturreplikation

Die DNA-Reparatur umfaßt die Resynthese beschädigter DNA, die während der Reparatur herausgeschnitten wurde. Der Einbau radioaktiver DNA-Basen während dieser Reparatursynthese ergibt eine radioaktiv markierte DNA mit einem hohen Molekulargewicht in den Zellen, in denen die Reparatur durchgeführt wird. Die Verwendung dieses Bestimmungsverfahrens der DNA-Reparatursynthese ist in einem übersichtsartikel in 1974 Annals of Internal Medicine am Beispiel von Xeroderma pigmentosum von J. Robbins et al. zusammengefaßt, auf den hier Bezug genommen wird. In dem Standardverfahren zur Bestimmung der Reparatursynthese wurden Humanzellen mit 0,01 uCi/ml [C-14]-Thymidin inkubiert, um ihre DNA gleichmäßig zu markieren, und sie wurden dann mit 10 mM Hydroxyharnstoff 60 Minuten lang inkubiert, um die normale DNA-Synthese zu supprimieren. Die Zellen wurden dann mit 100 J/m² 254 nm Uv-dicht bestrahlt und mit 10 mM Hydroxyharnstoff, Endonuclease V und [H-3]-Thymidin mit 5 uCi/ml enthaltenden Lipsoinen 4 Stunden lang inkubiert, wobei während dieser Zeit die Reparatursynthese stattfand. Das Medium wurde entfernt, und die Zellen wurden in PBS abgekratzt, auf Glasfaserfilter gesammelt und dann lysiert und mit 5% Trichloressigsäure und Ethanol gewaschen. Nicht eingebautes [C-14]- und [H-3]- Thymidin und DNA mit einem kleinen Molekulargewicht wurden von den Filtern abgewaschen; DNA mit einem hohen Molekulargewicht wurde jedoch präzipitiert und verblieb auf den Filtern. Die Filter wurden getrocknet, und die Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung bestimmt. Das Verhältnis von in DNA eingebautes [H-3]- zu [C-14]-Thymidin wurde als Maß für die Menge der DNA-Reparatursynthese pro DNA-Einheit verwendet. Die Reparatursynthese wurde auf 100% für unbestrahlte, nicht mit Liposomen behandelte Proben normalisiert.

(C) Überleben der Zellen

Das Überleben der Zellen nach der UV-Bestrahlung wurde durch den Metabolismus eines Tetrazoliumsalzes bestimmt, wie dies von Tim Mosmann in dem Artikel "Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assay", veröffentlicht in Journal of Immunological Methods, Band 65, Seiten 55-63, 1983, beschrieben wird. Lebende Zellen verstoffwechseln das Tetrazoliumsalz MTT (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid), das gelb ist, zu MTT-Formazan, das blau ist. Das Formazan kann mit einem Multiwell-Scanning-Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 540 nm (beispielsweise einem ELISA-Plattenlesegerät) bestimmt werden, und über einen Bereich von Zelldichten besteht eine lineare Beziehung zwischen der Formazanbildung und der Zellanzahl. In den das Überleben der Zellen nach der UV-Bestrahlung bestimmenden Versuchen wurden Humanzellen in einer Menge von 1.000 Zellen pro Vertiefung in eine 96-Well-Mikrotiterplatte eingesät. Nach Inkubation über Nacht wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden mit UV-Licht bei 254 nm mit einer Fluenz-Rate von 2,5 J/m²/s mit verschiedenen UV-Dosen bestrahlt. Medium und Endonuclease V enthaltende Liposomen wurden zugegeben, und die Zellen wurden 5 Tage lang inkubiert. 1 mg/ml MTT enthaltendes frisches Medium wurde zugegeben, und die Zellen wurden 4 Stunden lang inkubiert. Das Medium wurde sorgfältig entfernt, wobei das präzipitierte MTT-Formazan am Boden der Vertiefungen verblieb, das dann durch Zugabe von 50 ul Dimethylsulfoxid pro Vertiefung aufgelöst und bei 37ºC 30 Minuten lang inkubiert wurde. Die Platten wurden mit einem ELISA- Plattenlesegerät bei 540 nm abgetastet, und die optischen Dichten der UV-bestrahlten Vertiefungen wurden mit denjenigen unbestrahlter Vertiefungen verglichen, um die Rate der überlebenden Zellen zu bestimmen.

(3) Ergebnisse

(A) Schneiden UV-bestrahlter DNA

Ein typisches Ergebnis des durch Liposomen vermittelten Schneidens UV-bestrahlter DNA war wie folgt: Endonuclease V enthaltende Liposomen wurden aus einer Lipidmischung von Dipalmitoyl-L-alpha-phosphatidylcholin, Phosphatidylcholin und Cholesterin (DPPC/PC/Chol; Molverhältnis 7:2:1) bei 20 mM in einer wäßrigen, 0,2 mg/ml Endonuclease V enthaltenden Lösung hergestellt. Die Liposomensuspension wies eine optische Dichte von 0,33 bei 600 nm auf. Konfluente WI38-Humanfibroblastenzellen wurden mit 100 J/m² Uv-Licht bestrahlt und 2 Stunden lang bei 37ºC mit Liposomen behandelt, die um das 100-fache in Kochsalz verdünnt worden waren. Die DNA wurde extrahiert, und Einzelstrangbrüche wurden durch Elektrophorese auf einem alkalischen Gel bestimmt. Als zusätzliche Kontrolle wurde extrahierte DNA mit gereinigter Endonuclease V behandelt, um die DNA an allen Stellen mit Pyrimidindimeren zu brechen, und diese DNA wurde ebenfalls einer Elektrophoresebehandlung unterzogen. Das Gel wurde photographiert, das Negativ abgetastet, und das Molekulargewichts-Zahlenmittel und die Zahl der Brüche pro 1.000.000 Basen in der DNA wurden berechnet.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der Tabelle 2 angegeben. Wie dort gezeigt wird, wurden durch die UVBestrahlung (344,0 - 62,0) = 282 Pyrimidindimerstellen pro million Basen in die DNA eingeführt, von denen durch die Liposomenbehandlung (80,8 - 62,0) = 18,8 Stellen pro million Basen oder 6,7% aller Stellen herausgeschnitten werden konnten. Diese Schneidehäufigkeit nähert sich der praktischen Grenze von 10-40% an, die mit mechanisch zerstörten WI38-Zellen und nicht eingeschlossener Endonuclease V erreichbar ist, wie dies in der Veröffentlichung von Yarosh und Setlow, in Molecular and Cellular Biology, 1981, auf die hier Bezug genommen wird, dargestellt ist.

(B) Reparaturreplikation

Typische Ergebnisse aus Versuchen mit durch Liposomen vermittelter Reparaturreplikation waren wie folgt: die Liposomen wurden wie im Beispiel 4 und der Tabelle 1 beschrieben hergestellt. XP12BE-Xeroderma pigmentosum- Zellen und normale Human-Epidermis-Keratinozyten wurden gleichmäßig geteilt und bis nahe zur Konfluenz in 60 mm Schalen wachsengelassen, mit 254 nm UV-Licht in einer Stärke von 100 J/m² bestrahlt und mit verschiedenen Liposomenkonzentrationen ("Endo V ug/ml" in der Tabelle 3) behandelt. Die Zellen wurden mit [H-3]-Thymidin 4 Stunden lang puls-markiert, und die Menge der Reparaturreplikation wurde durch Szintillationszählung bestimmt und als Prozentsatz der Kontrollwerte ohne Liposomenbehandlung ausgedrückt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der Tabelle 3 angegeben.
Die Werte in dieser Tabelle zeigen, daß die DNA-Reparatursynthese auf bis zu 30% in normalen Human-Epidermis Keratinozyten, die mit Liposomen behandelt waren, erhöht wurde, und zwar in einer Weise, die der von den Liposomen beigetragenen Enzymkonzentration proportional war. Die PG/DCP-Liposomen erforderten die etwa 10-fache Enzymkonzentration, um die gleiche biologische Wirkung wie PC/DCP-Liposomen zu erreichen. Ähnliche Ergebnisse wurden mit XP12BE-Zellen mit einer maximalen Zunahme von 82% erreicht. Die größere Wirkung in XP-Zellen im Vergleich zu normalen Humanzellen wurde erwartet, da in XP-Zellen die Endonuclease V die durch einen chemischen Defekt blockierte DNA-Reparatur wiederherstellt, während in normalen Humanzellen die Endonuclease V einen bereits aktiven Prozeß fördert. Als zusätzliche Kontrolle wurden unbestrahlte XP12BE-Zellen mit PC/DCP-Liposomen behandelt; es konnte jedoch keine Zunahme der Reparaturreplikation beobachtet werden.

(C) Zell-Überleben nach UV-Bestrahlung

Typische Ergebnisse zweier getrennter Zellüberlebensversuche unter Verwendung des colorimetrischen Tests waren wie folgt XP12BE-Xeroderma pigmentosum-Zellen wurden in Vertiefungen von 96-Loch-Platten mit 1.000 Zellen pro Vertiefung eingesät und über Nacht inkubiert. Das Medium wurde entfernt, und die Zellen wurden mit verschiedenen UV-Dosen bestrahlt. Medium wurde zu den Vertiefungen zusammen mit Endonuclease V enthaltenden Liposomen zugegeben. DPPC/PC/Chol- und PC/DCP-Liposomen wurden in optischen Dichten bei 600 nm im Medium von 0,14 bzw. 0,26 verwendet. Nach 5 Tagen Inkubation wurde frisches Medium mit MTT zugegeben, und die Platten wurden nach 4 Stunden Inkubation abgetastet. Der Anteil überlebender Zellen bei jeder Dosis wurde durch Vergleich der optischen Dichte bestrahlter Zellen mit der optischen Dichte unbestrahlter Zellen mit der gleichen Liposomenbehandlung berechnet. Die Steigung der Überlebenskurve und der Korrelationskoeffizient der Steigung wurden durch lineare Regressionsanalyse des Logarithmus der überlebenden Fraktion, aufgetragen gegen die UV-Dosis, berechnet. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der Figur 4 und in der Tabelle 4 angegeben.
Die theoretische Basis zur Analyse der Überlebenskurven wurde von Walter Harm in seinem Buch Biological Effects of Ultraviolet Radiation, Cambridge University Press, Cambridge, 1980, angegeben. In Kapitel 4 mit dem Titel "Inactivation of cells and viruses" ist beschrieben, daß der Fluenz-Reduktionsfaktor das Verhältnis der Steigung unbehandelter Zellen zur Steigung behandelter Zellen ist. Er repräsentiert den konstanten Faktor, durch den die biologische Wirkung der UV-Bestrahlung abgeschwächt wurde, in diesem Fall die durch die Liposomenbehandlung erreichte Verringerung der Letalität. Die bei Verwendung von Liposomen in der Tabelle 4 angegebenen Fluenz-Reduktionsfaktoren nähern sich der theoretischen Grenze 2,29-2,89 an, wenn das Gen für die Endonuclease V in Xeroderma pigmentosum-Zellen insertiert und das Enzym endogen produziert wird, wie dies von K. Valerie et al. in ihrer Veröffentlichung in Cancer Research, 1987, beschrieben wird, auf die hier Bezug genommen wird.
In den mit Liposomen behandelten unbestrahlten Zellen wurde keine Toxizität beobachtet. Das Überleben in diesen Zellen lag in einem Bereich zwischen 87% und 123% im Vergleich zu nicht mit Liposomen behandelten Zellen.

BEISPIEL 6

Erhöhung der Human-DNA-Reparatur durch pH-sensitive, Endonuclease V enthaltende Liposomen

(1) pH-sensitive Liposomen weisen in Bezug auf die Bereitstellung von DNA-Reparaturenzymen an Humanzellen im Vergleich zu pH-insensitiven Liposomen eine überlegene Wirkung auf.

(A) Aus einer Mischung von Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin zusammengesetzte Liposomen sind pH- sensitiver als solche, die nur aus Phosphatidylethanolamin zusammengesetzt sind. Die Liposomen wurden gemäß den in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Phosphatidylethanolamin, Ölsäure und Cholesterinhemisuccinat (PE/OA/CHEMS) in einem 7:2:1-Verhältnis oder Phosphatidylcholin, PhosphatidyIethanolamin, Ölsäure und Cholesterinhemisuccinat (PE/PC/OA/CHEMS) in einem 3,5:3,5:2:1-Verhältnis hergestellt. Ähnliche Liposomen wurden hergestellt, wobei Phosphatidylcholin durch Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Phosphatidylethanolamin durch Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE) ersetzt wurde.
Der im Beispiel 3 beschriebene Aktivitätstest wurde zur Bestimmung der pH-Sensitivität der Liposomen modifiziert. Die Liposomen wurden auf 0,5 ug Endonuclease V pro ml entweder in 100 mM Tris, pH 8, 200 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM DTT oder 100 mM Citratphosphat, pH 5, 200 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM DTT oder dem 2% Triton X-100 enthaltendem Puffer mit einem pH-Wert von 8 verdünnt. Nach Inkubation bei 37ºC für 20 Minuten wurde zu jeder Reaktion ein gleiches Volumen Plasmidsubstrat in Wasser zugegeben, und die Inkubation wurde für weitere 10 Minuten fortgesetzt. Die Proben wurden dann auf ein neutrales 0,8% Agarosegel geladen, und die Plasmid-DNA wurde wie in Beispiel 3 beschrieben auf Brüche analysiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 angegeben. Liposomen mit einer Mischung von Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylcholin zu gleichen Teilen zeigten eine 30- fache Freisetzung an Endonuclease V-Aktivität bei pH 5 im Vergleich zu Liposomen, die nur Phosphatidylethanolamin enthielten. Wenn die synthetischen DPPE- und DPPC- Phospholipide verwendet wurden, wurde ein Unterschied um fast das 2-fache beobachtet. In jedem Fall ergab die Mischung aus Cholin- und Ethanolamin-Kopfgruppen in der Lipidmembran eine größere pH-sensitive Destabilisierung als bei Ethanolamin-Phospholipid alleine. Zusätzlich zeigte die PE/PC-Mischung eine um fast das 2-fache höhere Enzymfreisetzung als die DPPE/DPPC-Mischung.
(B) Aus 50% Cholesterinhemisuccinat zusammengesetzte Liposomen sind pH-sensitiver als aus 10% cholesterinhemisuccinat zusammengesetzte Liposomen. Dieser Test auf die pH-Sensitivität von Liposomen basiert auf dem Auslöschen (Quenchen) der Fluoreszenzprobe 8-Aminonaphthalin-1,3,6-trisulfonsäure (ANTS) durch eine hohe Konzentration an p-Xylen-bis-pyridiniumbromid (DPX), das in die Liposomen eingeschlossen ist; verwiesen wird hier auf die Veröffentlichung von Bentz, Ellens und Szoka in Biochemistry 1987, die oben bereits erwähnt wurde. Durch ein Auslaufen der Liposomen wird das DPX in Bezug zum ANTS verdünnt, das Quenchen wird verringert und die Fluoreszenz erhöht.
PC/PE/OA/CHEMS in Verhältnissen von entweder 3,5:3,5:2:1 oder 2:2:1:5 enthaltende Liposomen, die 12,5 mM ANTS und 45 mM DPX einschlossen, wurden entweder in 15 mM Citrat-Phosphat pH 5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA oder 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 1:400 verdünnt und bei 37ºC inkubiert. Zur Kontrolle wurden Liposomen in identischen, 1% Triton X-100 enthaltenden Puffern verdünnt, um die Liposomen aufzulösen, und bei 37ºC inkubiert. Die Fluoreszenz wurde in einem Hoefer TK-100-Fluoreszenzmeßgerät bestimmt, wobei der Erregungspeak bei 365 nm und der Filter-Emissionspeak 460 nm lag. Die Grundlinie wurde als Fluoreszenz der Liposomen zum Zeitpunkt Null gesetzt, und 100% Fluoreszenz wurde als die Fluoreszenz in den Triton X-100 gelösten Proben gesetzt.
Die Ergebnisse für die 2:2:1:5-Liposomen sind in der Figur 5 angegeben. Bei einem pH-Wert von 8 zeigte die Fluoreszenz der Liposomen (gefüllte Kreise) keine signifikante Veränderung während der Inkubation, bezogen auf die Fluoreszenz der gelösten Liposomen bei einem pH-Wert von 8 (auf 100% gesetzt). Die Fluoreszenz der Liposomen bei einem pH-Wert von 5 (offene Kreise) nahm jedoch relativ zu den gelösten Liposomen (auf 100% gesetzt) während der 20-minütigen Inkubation zu. Diese Ergebnisse zeigen, daß diese Liposomen durch einen verringerten pH-Wert destabilisiert werden, und sie setzen ihren Inhalt innerhalb von 20 Minuten frei. Im Gegensatz dazu zeigten die 3,5:3,5:2:1-Liposomen eine wesentlich geringere pH-Destabilisierung, wie dies in der Tabelle 6 gezeigt wird. Nach 20 Minuten, wenn die 2:2:1:5-Liposomen ihren gesamten Inhalt freigesetzt hatten, hatten die 3,5:3,5:2:1-Liposomen nur 13% ihres Inhalts freigesetzt, und nach 3 Stunden nur etwa ein Drittel des Inhalts. Diese Ergebnisse zeigen, daß die am pH-sensitivsten Liposomen aus PC/PE/OA/CHEMS in einem 2:2:1: 5-Molverhältnis zusammengesetzt sind.

(2) Biologische Tests zur Erhöhung der DNA-Reparatur durch pH- sensitive Liposomen

Liposomen wurden aus Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Ölsäure und Cholesterinhemisuccinat in einem 2:2:1:5-Molverhältnis in der im Beispiel 3 beschriebenen Weise unter Verwendung der Molekularsiebtechnik des Beispiels 3 zur Isolation der Liposomen hergestellt. Die Aktivität des in den Liposomen eingeschlossenen Enzyms wurde durch den in Beispiel 3 beschriebenen Aktivitätstest bestimmt, und die Enzymkonzentration wurde durch das in Beispiel 4 beschriebene ELISA-Verfahren bestimmt. Als Kontrolle wurde ein Aliquot der Endonuclease V 60 Minuten lang gekocht, und die Liposomen wurden in gleicher Weise wie für das native Enzym hergestellt. Der Aktivitätstest zeigte kein aktives Enzym in den aus der gekochten Endonuclease V hergestellten Liposomen. Humanzellen wurden wie in Beispiel 5, Abschnitt (1), beschrieben, kultiviert, einschließlich der SV40-transformierten normalen Humanfibroblastenlinie GM637. Die Zellen wurden mit der in Beispiel 5 beschriebenen UV-C-Quelle bestrahlt.
(A) pH-sensitive Liposomen ergaben eine größere Verstärkung der DNA-Reparatur als pH-insensitive Liposomen. Die Reparaturreplikation in normalen Human-Epidermis Keratinozyten nach Behandlung mit pH-sensitiven Liposomen wurde wie in Beispiel 5 beschrieben bestimmt, und die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 angegeben. pH-sensitive Liposomen erreichten eine fast maximale Verstärkung der DNA-Reparatur bei 0,01 ug/ml. Dies kann den Ergebnissen mit anderen Liposomen, wie sie in der Tabelle 3 gezeigt sind, gegenübergestellt werden. Keine andere Liposomenzusammensetzung erreichte diesen Grad an DNA-Reparaturverstärkung, und kein anderes Liposom zeigte eine signifikante biologische Aktivität bei einer Endonucleasekonzentration von 0,01 ug/ml.
Die verbleibenden biologischen Tests in diesem Beispiel verwendeten PE/PC/OA/CHEMS-Liposomen in einem Molverhältnis von 2:2:1:5.
(B) Test auf unplanmäßige DNA-Synthese (UDS) für verstärkte DNA-Reparatur
Dieser Test gleicht dem in Beispiel 5, Abschnitt 2B, beschriebenen Reparaturreplikationstest, und er ist ebenfalls in der Veröffentlichung von J. Robbins et al., 1974 Annals of Internal Medicine, in einer Übersicht dargestellt. Im UDS-Test wurden Zellen auf Glasdeckgläschen kultiviert, mit UV-Licht bestrahlt und mit oder ohne Liposomen im 10 uCi/ml [H-3]-Thymidin enthaltenden Medium inkubiert. Nach 4 Stunden wurde das Medium mit frischem, 10 mM kaltes Thymidin enthaltenden Medium versetzt und eine weitere Stunde lang inkubiert. Die Zellen wurden dann mit Aceton fixiert, und die Deckgläschen mit einer Nuclear-Track-Emulsion der Firma Kodak beschichtet. Nach 7 Tagen wurden die beschichteten Gläschen mit einem Kodak D-19-Entwickler entwikkelt, und die Zellen wurden mikroskopisch überprüft. Zellen in der 5-Phase (die ihre gesamte DNA replizierten) zeigten während der 4-stündigen Inkubation dunkelschwarze Kerne und wurden nicht analysiert. Bei den Zellen, die sich während der Inkubation nicht in der S- Phase befanden, wurden die schwarzen Körner über den Kernen von 25 zufällig ausgewählten Zellen gezählt. Die Körner über diesen Kernen sind proportional zur Menge des während der Reparatursynthese eingebauten [H-3]- Thymidins, und sie sind ein Maß für die DNA-Reparatur. Diese Technik weist im Vergleich zum in Beispiel 5 beschriebenen Reparatursynthesetest den Vorteil auf, daß die Zellen, die während der Reparaturperiode ihre DNA replizieren, von der Analyse ausgeschlossen werden, wodurch der Hintergrund, gegen den die DNA-Reparatursynthese gemessen wird, stark verringert wird.
Die Ergebnisse des UDS-Tests mit UV-bestrahlten normalen Human-Keratinozyten, die verschiedene Konzentrationen von in Liposomen eingeschlossener Endonuclease V enthielten, sind in der Figur 6 angegeben. Ohne Liposomen inkubierte Zellen (offene Kreise) zeigten mit Bestrahlung erhöhte Körner/Kern-Verhältnisse, was für Reparatur-kompetente Zellen erwartet wurde. Die Behandlung mit in pH-sensitive Liposomen eingeschlossener Endonuclease V in einer Konzentration von 0,02 ug/ml (gefüllte Kreise), 0,1 ug/ml (offene Rechtecke) oder 0,2 ug/ml (gefüllte Rechtecke) erhöhte jedoch ihre Reparatursynthese stark. Die Werte aus dieser Figur und weiterhin die Versuche mit XP12BE-Zellen aus einem Patienten mit Xeroderma pigmentosum und mit normalen GM637-Humanzellen sind in der Tabelle 8 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß die Behandlung UV-bestrahlter Zellen mit Endonuclease V die Reparatur von DNA-Schäden im Vergleich zu bestrahlten Kontrollzellen verstärkte. Die Zunahme in XP-Zellen im Vergleich zu normalen Zellen war proportional größer, was in den in Beispiel 5 beschriebenen Reparatursyntheseversuchen beobachtet wurde.
(C) Test auf eine Endonuclease-sensitive Stelle (ESS) für vermehrtes Entfernen von DNA-Läsionen
Der ESS-Test bestimmt Dimere in der DNA in Form von stellen, die auf durch die T4-Endonuclease V verursachte Einzelstrangbrüche sensitiv reagieren. Aus jeder Probe wird die DNA gereinigt und dann entweder mit T4- Endonuclease V behandelt oder nicht. Die DNA wird dann durch Elektrophorese auf einem alkalischen Agarosegel nach ihrer Größe aufgetrennt, und das mittlere Molekulargewicht der behandelten und unbehandelten DNA wird wie in Beispiel 5 beschrieben bestimmt. Da der rezeproke Wert des mittleren Molekulargewichts der DNA die durchschnittliche Anzahl von Einzelstrangbrüchen pro DNA-Einheit darstellt, repräsentiert die Differenz in der durchschnittlichen Anzahl an Brüchen zwischen behandelten und unbehandelten Proben die Anzahl an Dimeren pro DNA-Einheit, hier ausgedrückt in Form von Dimeren pro million DNA-Basen.
Humanzellen wurden bestrahlt und entweder mit aktiver oder inaktiver Endonuclease V behandelt, die in einer Konzentration von 0,3 ug Enzym/ml in Liposomen eingeschlossen war. Nach 6 Stunden wurde die DNA aus jeder Probe extrahiert, und die Anzahl an Pyrimidindimeren pro million DNA-Basen wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 9 angegeben. Für alle Zellen, einschließlich normaler Human-Epidermis-Keratinozyten und SV40-transformierter Fibroblasten aus einem normalen und einem XP-Patienten, erhöhte die Behandlung mit der aktiven Endonuclease in den Liposomen die Entfernung von Dimeren aus der DNA um zwischen 25 und 60%. Die Erhöhung war in XP-Zellen stärker, da die Liposomen die Reparatur wiederherstellten, die durch den biochemischen Defekt blockiert war, während in normalen Zellen die Liposomen einen bereits aktiven Weg verstärkten.
(D) Koloniebildungstest, um eine erhöhte Überlebensrate festzustellen
XP12BE-Zellen aus einem XP-Patienten wurden in einer Menge von 500 und 5.000 Zellen pro Schale in Gewebekulturschalen eingesät und über Nacht anhaften gelassen. Das Medium wurde dann aus den Schalen mit 5.000 Zellen entfernt, und sie wurden 3 J/m² UV-C bestrahlt. Zu allen Zellen wurde frisches Medium mit 4% Serum und mit pH-sensitiven Liposomen, die entweder aktive oder inaktive Endonuclease V enthielten, zusätzlich zu einem Kontrollmedium ohne Liposomen zugegeben und über Nacht inkubiert. Das Medium wurde durch frisches Medium mit 10% Serum ersetzt, und die Zellen wurden bei 37ºC inkubiert, bis sie innerhalb von 10 Tagen Kolonien ausbildeten. Die Kolonien wurden mit Giemsa-Färbung gefärbt, gezählt, und die Ergebnisse sind in der Tabelle 10 angegeben. Die Behandlung nur mit den Liposomen ohne UV verringerte die Überlebensrate. XP-Zellen, die mit eine aktive Endonuclease V enthaltenden Liposomen behandelt wurden, überlebten die Uv-Bestrahlung jedoch in einem viel höheren Grad als Zellen, die mit inaktiver Endonuclease oder ohne Liposomen behandelt worden waren.

BEISPIEL 7

Verstärkung der DNA-Reparatur in Tieren durch topische Behandlung der Haut mit Endonuclease V enthaltenden pH-sensitiven Liposomen

(1) Behandlung von Mäusen mit Endonuclease V enthaltenden Liposomen in einer topischen Creme

PC/PE/OA/CHEMS (2:2:1:5) pH-sensitive Liposomen wurden unter Verwendung aktiver und inaktiver Endonuclease V durch die in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Liposomen wurden in eine Babylotion (Johnson and Johnson, skillman, New Jersey) mit 10% PBS gemischt, um eine topische Creme zu bilden. Weibliche Mäuse des haarlosen Albinostammes SKH-1 wurden von Charles River Labs im Alter von 6 oder 7 Wochen erhalten. Sie wurden uneingeschränkt mit 10.000 J/m² UV-B aus zwei Westinghouse FS40 UV-B-Lampen bestrahlt, deren Fluenzrate von 5 bis 6 J/m²/s mit dem UVX- Radiometer unter Verwendung der UV-B-Probe beobachtet wurde. Die Creme wurde auf die Haut über der Wirbelsäule mit einer Menge von 0,25 g/Tier sofort nach der Bestrahlung aufgebracht. Nach 6 Stunden wurden die Tiere getötet, und über der Wirbelsäule wurde ein Hautstreifen in einer Größe von 5 x 20 mm von jedem Tier herausgeschnitten und mit 0,25% Trypsin in PBS über Nacht bei 4ºC verdaut. Die Epidermis wurde von der Haut abgeschabt, und die DNA wurde extrahiert und gereinigt. Die Dimerhäufigkeit in der gereinigten DNA wurde durch den in den Beispielen 5 und 6 beschriebenen Elektrophoresetest in einem alkalischen Agarosegel bestimmt.

(2) Ergebnisse

Die Häufigkeit von Dimeren in der Epidermis-DNA von mit pH- sensitiven Liposomen behandelten Mäusen ist in der Tabelle 11 angegeben. In bestrahlten Mäusen, die entweder unbehandelt oder mit inaktiver Endonuclease V in Liposomen behandelt wurden, lag die Häufigkeit von Dimeren in der Epidermis-DNA zwischen 90 und 96 pro million Basen. In mit eine aktive Endonuclease V enthaltenden Liposomen behandelten Mäusen war die Häufigkeit an Dimeren viel geringer, und der Prozentsatz an Reduktion in der Dimerenhäufigkeit lag bei bis zu 74%. Diese Werte zeigen, daß die topische Anwendung von Endonuclease V enthaltenden Liposomen nach UV-Bestrahlung das Stratum corneum durchdringen, in die Epidermis-Keratinozyten eindringen und die Entfernung von Pyrimidindimeren in der DNA der Säuger-Haut innerhalb von 6 Stunden nach Bestrahlung erhöhen kann.
Obwohl spezifische Ausgestaltungen der Erfindung beschrieben und veranschaulicht wurden, ist es für den Fachmann klar, daß Veränderungen durchführ sind, ohne von der Erfindung abzuweichen. Obwohl die Erfindung anhand von durch UV- Licht verursachten DNA-Schäden beschrieben wurde, ist es in gleicher Weise möglich, sie auf eine DNA-Schädigung anzuwenden, die aus anderen Quellen resultiert, beispielsweise aus ionisierender Strahlung, aus kovalente Addukte an die DNA bildenden Chemikalien und auf andere Deformationen von Basen und Strangbrüchen. In gleicher Weise können die die DNA-Reparaturenzyme enthaltenden Liposomen, die in den oben beschriebenen Beispielen nach der DNA-Schädigung verwendet wurden, prophylaktisch vor dem Zeitpunkt angewandt werden, zu dem die Zellen Bedingungen ausgesetzt werden, unter denen eine DNA-Schädigung wahrscheinlich ist. TABELLE 1 Liposomen Mol-Verhältnis Optische Dichte Endo Va ug/ml Einschlußb Prozentsatz PC/Stearylamin/Chol
a Endo V-Konzentration in gelösten Liposomen, bestimmt unter Verwendung von Standards von reinem Endo V. Alle Messungen wurden zweifach durchgeführt.
b Prozentsatz an in die Liposomenpräparation anfangs einschlossenem Enzym.
c Konzentration = 1.500 Einheiten/ml
d Konzentration = 6.600 Einheiten/ml TABELLE 2 Behandlung Molekulargewichts-Zahlenmittel (Basen) Brüche pro million Basen keine DPPC/PC/Chol + Endonuclease V TABELLE 3 ZELLE LIPOSOM ENDO V ug/mol Prozentsatz an Reparatur-replikation Normale Human-Epidermis-Keratinozyten TABELLE 4 Liposomenbehandlung Überlebenssteigung Korrelationskoeffizient Fluenz-Reduktions-Faktor keine TABELLE 5 Liposomenzusammensetzung Überschüssige UV-spezifische Brüche pro Plasmid: pH 5 über pH 8 TABELLE 8 Prozentsatz an Fluoreszenz bei pH5 PC/PE/OA/CHEMS Verhältnis Minuten TABELLE 7 PE/PC/OA/CHEMS-Liposomen (2:2:1:5) Endo V ug/ml Prozentsatz der Kontroll-Reparaturreplikation keine TABELLE 8 UDS-Prozentsatzkontrolle Endo V in Liposomen
a Als Kontrolle wurden bestrahlte Zellen verwendet, die nicht mit Liposomen behandelt waren.
b Als Kontrolle wurden bestrahlte Zellen verwendet, die mit inaktive Endonuclease V enthaltenden Liposomen behandelt waren. TABELLE 9 Dimere pro million DNA-Basen Liposomenbehandlung Zellinie Aktiv Inaktiv % Reduktion Normale Human-Keratinozyten GM637 - Human-Fibroblasten XP12BE - XP-Fibroblasten TABELLE 10 Prozentsatz von überlebenden XP12BE-Zellen Endo V in Liposomen (ug/ml) ohne UV mit 25 J/m² % Kontrolle keine inaktiv aktiv TABELLE 11 Mäusehaut Endo V in Liposomen Dimere pro million Basen % Reduktion keine aktiv inaktiv

Claims

1. Verfahren zur Reinigung eines DNA-Reparaturenzyms, dadurch gekennzeichnet,

daß es die nachfolgenden Verfahrensschritte aufweist:

(a) Inkontaktbringen einer wäßrigen Lösung des DNA-Reparaturenzyms in unreiner Form mit einem Molekularsieb mit einer solchen Ausschlußgrenze, daß das DNA-Reparaturenzym durch das Molekularsieb mit einer geringeren Geschwindigkeit hindurchtreten wird als wenigstens ein Teil der Verunreinigungen in der wäßrigen Lösung;

(b) isokratische Elution des DNA-Reparaturenzyms aus dem Molekularsieb mit einer wäßrigen Elutionslösung, um das DNA-Reparaturenzym in einer oder mehreren ausgewählten Fraktionen des Eluats mit erhöhter Reinheit zu erhalten, wobei die wäßrige Elutionslösung so ausgewählt wird, daß sich zwischen dem DNA-Reparaturenzym und ausgewählten Nukleinsäuren Komplexe ausbilden können;

(c) Inkontaktbringen einer oder mehrerer ausgewählter Fraktionen aus (b) - ohne weitere Aufreinigung - in der wäßrigen Elutionslösung mit einer oder mehreren ausgewählten Nukleinsäuren, die auf einem Festträger immobilisiert wurden, um immobilisierte Nukleinsäure/DNA-Reparaturenzym-Komplexe zwischen dem DNA-Reparaturenzym und der einen oder mehreren ausgewählten, immobilisierten Nukleinsäuren zu bilden;

(d) Waschen der immobilisierten Komplexe, um wenigstens einen Teil der verbleibenden Verunreinigungen zu entfernen; und

(e) Elution des DNA-Reparaturenzyms von der einen oder von mehreren ausgewählten immobilisierten Nukleinsäuren, um das DNA-Reparaturenzym in einer oder mehreren ausgewählten Fraktionen des Eluats in Form einer weiter erhöhten Reinheit zu erhalten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Ausschlußgrenze des Molekularsiebs (i) größer ist als der Stokes-Radius des DNA-Reparaturenzyms und (ii) kleiner ist als der Stokes- Radius wenigstens eines Teils der Verunreinigungen bevorzugt, worin die Ausschlußgrenze des Molekularsiebs größer ist als etwa das Zweifache des Stokes-Radius des DNA-Reparaturenzyms und/oder worin die Ausschlußgrenze des Molekularsiebs kleiner ist als etwa 35 Å (10&supmin;¹&sup0;m); oder worin die Ausschlußgrenze des Molekularsiebs (i) größer ist als das Molekulargewicht des DNA-Reparaturenzyms und (ii) kleiner ist als das Molekulargewicht wenigstens eines Teils der Verunreinigungen bevorzugt, worin die Ausschlußgrenze des Molekularsiebs größer ist als das etwa Zweifache des Molekulargewichts des DNA-Reparaturenzyms und/oder worin die Ausschlußgrenze des Molekularsiebs kleiner ist als etwa 60000 Dalton.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Molekularsieb eine Gelfiltrationssäule umfaßt.

4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 3, worin die eine oder mehrere der ausgewählten Nukleinsäuren Desoxyribonukleinsäuren sind, bevorzugt einzelsträngige Desoxyribonukleinsäuren.

5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 4, worin die ausgewählten, immobilisierten Nukleinsäuren eine Nukleinsäure-Affinitätssäule umfassen.

6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1- 5, worin das DNA-Reparaturenzym von der einen oder von mehreren ausgewählten, immobilisierten Nukleinsäuren unter Verwendung einer wäßrigen Elutionslösung eluiert wird, die einen Gradienten eines Materials enthält, das in der Lage ist, das DNA-Reparaturenzym von der einen oder von mehreren ausgewählten immobilisierten Nukleinsäuren des Materials zu disassoziieren, wobei das Material bevorzugt ausgewählt wird aus Salzen, Säuren, Detergenzien und kompetitiven Liganden.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 6, worin das DNA-Reparaturenzym am Ende des Verfahrensschrittes (e) ein homogenes Protein ist, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

8. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 7, worin die wäßrige Lösung des DNA-Enzyms in unreiner Form erhalten wird durch (i) Aufbrechen der das DNA-Reparaturenzym enthaltenden Zellen, (ii) Entfernen der Zelltrümmer und (iii) Sammeln der entstandenen Lösung, wobei die Lösung die wäßrige Lösung des DNA-Enzyms in unreiner Form umfaßt; und/oder durch (i) Aufbrechen der das DNA-Reparaturenzym enthaltenden Zellen, (ii) Zentrifugieren der aufgebrochenen Zellen, (iii) Sammeln des Überstandes, (iv) Präzipitieren der Proteine im Überstand und (v) Resuspendieren des Präzipitats in der wäßrigen Elutionslösung, die zum Eluieren des DNA-Reparaturenzyms aus dem Molekularsieb verwendet wurde, wobei das resuspendierte Präzipitat die wäßrige Lösung des DNA-Enzyms in unreiner Form umfaßt und das resuspendierte Präzipitat aus (v) wahlweise gegen die zum Eluieren des DNA-Reparaturenzyms aus dem Molekularsieb verwendete wäßrige Elutionslösung vor dem Inkontaktbringen mit dem Molekularsieb dialysiert wird, und/oder die Nukleinsäuren aus den aufgebrochenen Zellen wahlweise vor der Zentrifugation (ii) präzipitiert werden.

9. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 8, worin das DNA-Reparaturenzym die T4-Endonuclease V ist.

10. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung aus einem DNA-Reparaturenzym,

dadurch gekennzeichnet,

daß es die nachfolgenden Verfahrensschritte aufweist:

(a) Wachsen von Zellen, die das DNA-Reparaturenzym synthetisieren;

(b) Herstellen eines Extrakts der Zellen, der das DNA- Reparaturenzym in unreiner Form enthält;

(c) Reinigen des DNA-Reparaturenzyms durch ein in irgendeinem der Ansprüche 1 - 9 beanspruchtes Verfahren; und

(d) Einschließen wenigstens eines Teils des gereinigten DNA-Reparaturenzyms, das in einer oder in mehreren ausgewählten Fraktionen enthalten ist, in Liposomen und Kombinieren der Liposomen mit einem Träger, um die Zusammensetzung zu bilden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Liposomen pH-sensitive Liposomen sind, die bevorzugt Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin und/oder Cholesterylhemisuccinat enthalten, wobei das Molverhältnis von Cholesterylhemisuccinat zu den verbleibenden Bestandteilen der Liposomenmembranen bevorzugt etwa 1:1 beträgt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin (a) die verbleibenden Bestandteile der Liposomenmembranen Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin und Ölsäure aufweisen und (b) das Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, die Ölsäure und das Cholesterylhemisuccinat in einem Molverhältnis von etwa 2:2:1:5 vorliegen.

13. Zusammensetzung,

dadurch gekennzeichnet,

daß sie Liposomen mit einem darin eingeschlossenen DNA- Reparaturenzym umfaßt.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin die Liposomen und/oder das DNA-Reparaturenzym wie in irgendeinem der Ansprüche 1, 9, 11 oder 12 definiert sind.