DE60318484T2

DE60318484T2 - Bakterielle stämme von exiguobakterium, deren zellkultur und verwendung

Info

Publication number: DE60318484T2
Application number: DE60318484T
Authority: DE
Inventors: Marie-Laure Fardeau; Yannick Combet-Blanc; Bernard Ollivier
Original assignee: Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Current assignee: Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Priority date: 2002-12-13
Filing date: 2003-12-10
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2023-12-11
Also published as: US20070009553A1; JP2006509522A; HK1084972A1; FR2848564B1; JP4720975B2; EP1570050A1; CA2509637A1; EP1570050B1; AU2003296812A1; ATE382679T1; WO2004055173A1; FR2848564A1; DE60318484D1

Description

Die Erfindung betrifft neue Stämme der Gattung Exiguobacterium.
Sie betrifft auch ein Verfahren zur Kultur dieser Stämme sowie ihre gewerblichen Anwendungen.
Die Erfindung betrifft insbesondere Bakterienstämme, wie sie aus Proben isoliert werden, die aus tiefen marinen hydrothermalen Systemen stammen.
Im Journal of Clinical Microbiology, Vol. 38, Nr. 10, Oktober 2000, S. 3623–3630, berichten Drancourt et al. über die Ergebnisse der Untersuchung einer Sammlung von 177 Isolaten aus verschiedenen Quellen und ihre Identifizierung auf der Basis der rRNA.
Aber die in dieser Tabelle angegebenen Spezies sind von den Stämmen der Erfindung weit entfernt.
In dem Artikel, der im International Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 44, Nr. 1, 1994, S. 74–82, erschienen ist, beschreiben Farrow et al. die Vergleichsstudien zwischen verschiedenen Spezies. Die Gattung Exiguobacterium wird erwähnt, aber die Spezies werden nicht präzisiert.
Der Artikel von Frühling et al. im International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol. 52, Nr. 4, Juli 2002, S. 1171–1176, wird über Stämme von Exiguobacterium undae sp. nov. und Exiguobacterium antarcticum sp. nov. berichtet, die aus dem Wasser von Tümpeln isoliert wurden.
Diese Stämme und die anderen Spezies der Gattung Exiguobacterium, die angegeben sind, haben phylogenetische Positionierungen, die von den Stämmen der Erfindung weit entfernt sind.
Das Dokument Data Base EMBL, Zugriffs-Nr. D 55730, gibt die 16S-rRNA eines Klons von Exiguobacterium acetylicum an, was ebenfalls einer Spezies entspricht, die von derjenigen der Erfindung verschieden ist.
Diese Dokumente berichten jeweils über die Sequenz der 16S-rRNA von Exiguobacterium auriantiacum (NDCDO 2321) und von Exiguobacterium undae. Die Kommentare, die oben in Bezug auf das Data-Base-Dokument abgegeben wurden, gelten hier ebenfalls.
Die Untersuchung der genommenen Proben durch die Erfinder führte sie dazu, eine neue Spezies von Exiguobacterium zu isolieren, die Eigenschaften aufweist, die in verschiedenen Bereichen der Industrie von großem Interesse sind.
Die Untersuchung der genommenen Proben durch die Erfinder führte sie dazu, eine neue Spezies von Exiguobacterium zu isolieren, die Eigenschaften aufweist, die in verschiedenen Bereichen der Industrie von großem Interesse sind.
Ziel der Erfindung ist es also, Stämme dieser neue Spezies bereitzustellen.
Sie betrifft auch die Angabe von Kulturvorschriften für diese Stämme, die die physikalisch-chemischen Bedingungen und die Zusammensetzung des Kulturmediums präzisiert, die es erlauben, Zellen und/oder bestimmte Metaboliten, insbesondere L(+)-Lactat, in günstiger Weise zu produzieren.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die direkte Verwendung dieser Stämme oder ihrer Metaboliten in verschiedenen Bereichen der Industrie.
Die Bakterienstämme der Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Exiguobacterium der Art lactigenes handelt und dass sie eine DNA-Sequenz besitzen, von der wenigstens ein Teil in der Lage ist, mit der genomischen oder plasmidischen DNA des Stammes zu hybridisieren, der am 5. Dezember 2002 unter der Nr. I-2962 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) hinterlegt wurde, wobei diese Stämme thermotolerant, saccharolytisch und amylolytisch sind und/oder L-(+)-Lactat produzieren können, Wachstumseigenschaften bei Temperaturen in der Größenordnung von 40 bis 50°C bei einem pH-Wert von 5,4 bis 9,15 mit einem Wachstumsoptimum bei 45°C bei einem pH-Wert von ungefähr 7 haben und einen Gehalt ihrer DNA an Guanin und Cytosin von ungefähr 50 Mol-% aufweisen und außerdem durch die folgende Sequenz SEQ ID Nr. 1 der 16S-rRNA:
oder eine Sequenz, die eine Homologie mit SEQ ID Nr. 1 von über 97% aufweist, charakterisiert sind.
Es sei angemerkt, dass das von den Bakterienstämmen der Erfindung produzierte Lactat vorteilhafterweise zu mehr als 95% L(+)-Lactat ist.
Die Erfindung betrifft insbesondere Stämme der Gattung Exiguobacterium, wie sie durch Vergleich der RNA-Sequenzen der 16S-Fraktion der Ribosomen aufgezeigt wurden.
Diese Stämme sind auch dadurch gekennzeichnet, dass sie kein Sulfat, Thiosulfat, Schwefel oder Sulfit reduzieren.
Die Bakterienstämme der Erfindung sind auch dadurch gekennzeichnet, dass sie Gram-positiv sind.
Die Erfindung betrifft insbesondere den Bakterienstamm, der am 5. Dezember 2002 unter der Nr. I-2962 bei der CNCM hinterlegt wurde.
Die Identifikationsnummer dieses Stammes ist 10C. Als Name der taxonomischen Bezeichnung wird Exiguobacterium lactigenes sp. nov. verwendet.
Die Mutanten der Stämme, die den obigen Definitionen entsprechen, sind ebenfalls im Umfang der Erfindung enthalten, soweit sie wenigstens 70% der Hybridisierungsfähigkeit mit genomischer DNA des hinterlegten Stammes beibehalten.
Gemäß der Erfindung werden die oben definierten Bakterienstämme durch Kultivierung unter fakultativ anaeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von 5,4 bis 9,15 bei 37°C in einem Grundmedium, wie es unten definiert ist und das einen von diesen Stämmen verwertbaren Zucker als Energiequelle enthält, erhalten.
Die Bakterienstämme der Erfindung werden vorteilhafterweise in Verfahren zur Nahrungsfermentation verwendet. Ihre Fermentations- und enzymatischen Eigenschaften erlauben es, diejenigen, die man den üblicherweise verwendeten Milchsäurebakterien zuschreibt, vorteilhafterweise zu ersetzen und/oder zu ergänzen.
Die Fähigkeit der Stämme der Erfindung, eine Vielzahl von Zuckern, insbesondere D-Glucose, D-Fructose, D-Galactose, D-Mannose, Mannit, D-Ribose, D-Saccharose und DL-Maltose, sowie Stärke zu fermentieren, stellt einen wichtigen Trumpf dar. Manche dieser Zucker (Glucose, Fructose, Saccharose), die potentiell als Energiequellen verwendbar sind, stehen tatsächlich in großer Menge zur Verfügung, insbesondere in Zuckerfermentsäften.
Die Möglichkeit, auf den Stoffwechsel dieser Stämme einzuwirken, indem man die physikalisch-chemischen Parameter des Kulturmediums (pH-Wert, Verhältnis Zucker/Peptide) kontrolliert, erweitert ihren Anwendungsbereich. So ist es zum Beispiel möglich, die Fermentation hin zur Produktion von Zellen und von Zellmetaboliten, wie Enzymen, zu lenken.
Die Erfindung betrifft also auch ein Verfahren zur Produktion von Metaboliten, insbesondere L-(+)-Lactat, dadurch gekennzeichnet, dass es Folgendes umfasst:

– die Kultivierung eines Bakterienstammes, wie er oben definiert ist, unter Bedingungen, die für seine Entwicklung und für die Produktion des gewünschten Metaboliten geeignet sind;
– Gewinnung der produzierten Metaboliten, dann Isolierung des gewünschten Metaboliten und Reinigung desselben.

Die durch die Stämme der Erfindung produzierte Milchsäure ist von großem Interesse, da sie zu mehr als 95% aus L(+)-Lactat besteht, das von höheren Organismen assimilierbar ist, während D(–)-Lactat einen Toxizitätscharakter aufweist.
Man trennt sie von der Kultur ab und man konzentriert sie zum Beispiel durch Eindampfen, gegebenenfalls bis zur Trockne.
Die Konzentrate oder Trockenprodukte werden als solche verwendet oder so behandelt, dass die gewünschten Milchsäurederivate entstehen.
Die Anwendungen von Milchsäure oder ihrer Ester und anderer Derivate betreffen zahlreiche Bereiche.
So wird Milchsäure in der Nahrungsmittelindustrie verwendet, indem man sie in Getränke, Biere, Milchprodukte, wie Sahne, Käse, Butter, Eis oder auch Konfitüren einarbeitet.
Als Tensid verwendet man sie mit Vorteil in der Bäckerei und Konditorei, zum Beispiel in Form von Lactylmono- und -diglycerid und von Natriumstearyllactylat.
In der pharmazeutischen Industrie kann Kaliumlactat einen Ersatz für Natriumchlorid bilden, der im Fall von Bluthochdruck besonders wertvoll ist.
Es wird auch wegen seiner Komplexbildungseigenschaften verwendet, insbesondere mit Eisen und Calcium, um Mangelerscheinungen zu behandeln.
Schließlich seien unter den Anwendungen von Milchsäure, ihrer Salze und Derivate in der chemischen Industrie auch ihre Verwendung bei der Verarbeitung von plastischen Harzen, Klebern, Pestiziden, Textilien oder auch in Lacken, Verdünnungsmitteln und Lösungsmitteln oder zur Oberflächenbehandlung von Metallen genannt.
Betont sei auch das große Interesse daran in der Polymerchemie, wo sie dazu dient, Polylactide und/oder Copolymere, zum Beispiel mit Polyalkylenoxiden, mehrwertigen Alkoholen, Glycolsäure, Hydroxycarbonsäuren, Ethylen-PropylenCopolymeren, Butylkautschuken oder thermoplastischen Polyurethanelastomeren herzustellen. Ausgehend von diesen Polymeren und/oder Copolymeren können verschiedene Artikel hergestellt werden, insbesondere für die Verpackung, Filme für medizinische Zwecke, um Verbände herzustellen, oder auch Umhüllungsmaterialien für chirurgische Nahten.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung hervor, die beispielhaft angegeben wird und die den oben erwähnten Stamm 10C betrifft, der bei der CNCM unter der Nr. I-2962 hinterlegt ist.
a. Vorschrift zur Isolierung des Stammes 10C
Die Isolierung wurde ausgehend von Proben aus marinen tiefen hydrothermalen Systemen durchgeführt.
– Kulturmedien und -verfahren
Man verwendet ein Grundmedium, das Folgendes enthält (auf 1 Liter destilliertes Wasser): 1 g NH₄Cl, 0,3 g KH₂PO₄, 0,3 g K₂HPO₄, 25 g NaCl, 0,2 g CaCl₂, 0,1 g KCl, 3 g MgCl₂, 0,5 g CH₃COONa, 0,5 g Cystein-HCl, 0,1 g Hefeextrakt (Difco Laborstories), 10 ml einer Minerallösung nach Balch (1), 1 mg Resazurin. Der pH-Wert wird mit 10 M KOH auf 7,3 eingestellt, und das Medium wird unter einem Stickstoffstrom zum Sieden gebracht und auf Raumtemperatur abgekühlt.

Die Zusammensetzungen der Minerallösung nach Balch und der Lösung von Oligoelementen nach Balch sind folgende: Minerallösung nach Balch

KH₂PO₄	6 g
(NH₄)₂SO₄	6 g
NaCl	12 g
MgSO₄·7H₂O	2,6 g
CaCl₂·2H₂O	0,16 g
destilliertes H₂O q. s. p.	1000 ml

Lösung von Oligoelementen nach Balch

Nitriloessigsäure	1,5 g
MnSO₄·2H₂O	0,5 g
MgSO₄·7H₂O	3 g
NaCl	1 g
FeSO₄·7H₂O	0,1 g
CoCl₂·6H₂O	0,1 g
CaCl₂·2H₂O	0,1 g
ZnCl₂	0,1 g
CuSO₄·5H₂O	0,01 g
AlK(SO₄)₂	0,01 g
H₃BO₃	0,01 g
Na₂MoO₄	0,01 g
destilliertes H₂O q. s. p.	1000 ml

Der pH-Wert des Kulturmediums wird mit 10 M KOH auf 7,3 eingestellt.
Dann wird das Medium zum Sieden gebracht, dann auf Raumtemperatur abgekühlt und unter einem Stickstoffstrom in einer Menge von 5 ml pro Röhrchen auf Hungate-Röhrchen und unter einem Stickstoff- und Kohlendioxidstrom (80:20; v/v) in einer Menge von 20 ml auf Serumkolben verteilt.
Nach Behandlung der versiegelten Behälter im Autoklaven bei 110°C während 45 min fügt man ausgehend von sterilen Lösungen Na₂S·9H₂O, Na₂CO₃ und Glucose hinzu, was zu Konzentrationen von 0,04%, 0,2% bzw. 20 mM führt.
Um die Anreicherung der Kultur einzuleiten, impft man eine Probe von 20 ml Medium und inkubiert bei 37°C. Die Kultur wird unter Verwendung der Hungate-Rollröhrchenmethode mit einem verfestigten Medium mit 15 g/l Agar gereinigt.
b. Beschreibung des Stammes
Der Stamm 10C ist ein Gram-positives, nicht sporenbildendes, fakultativ anaerobes Bakterium, das sich in Form von Stäbchen zeigt, mit einem optimalen Wachstum bei 45°C, pH 7 und 0–2% NaCl.
Es handelt sich um einen heterotrophen Stamm, der Hefeextrakt benötigt, um Zucker zu fermentieren.
Die Wachstumstemperatur des Stammes beträgt 12 bis 50°C bei einem pH-Wert von 5,4 bis 9,1 und einer NaCl-Konzentration zwischen 0 und 12%.
Man beobachtet ein optimales Wachstum bei 45°C, p 7 und 0–2% NaCl.
In einem Medium, das Kohlenhydrate, insbesondere Glucose, als Energiequelle enthält, fügt man vorteilhafterweise Peptide, zum Beispiel Hefeextrakte, hinzu, um das Wachstum zu begünstigen.
– Stoffwechseleigenschaften
Die Fermentation von Zuckern führt im Wesentlichen zu L(+)-Lactat (ungefähr 2 mol Lactat/mol fermentierter Glucose). Unter geeigneten Wachstumsbedingungen beobachtet man die Produktion von Formiat, Acetat und Ethanol.
Genetische Merkmale:
Der Stamm 10C ist durch einen Gehalt der DNA an Guanin + Cytosin von 50,4 Mol-% gekennzeichnet.
Die Reinigung und Extraktion der DNA, die Amplifikation und Sequenzierung der 16S-rRNA erfolgen gemäß (2), (3) und (4). Die DNA wurde durch Chromatographie auf Hydroxyapatit nach dem Verfahren von Cashion et al. (5) isoliert. Die DNA-DNA-Hybridisierung wurde so durchgeführt, wie es von De Ley et al. beschrieben wurde (6), mit der von Huss et al. (7) und Escara und Hutton (8) beschriebenen Modifizierung, indem man ein Spektrophotometer Modell 2600 verwendete, das mit einem Thermoprogramm 2527-R ausgestattet war (Gilford Instrument Laborstories Inc., Oberlin, Ohio, EUA).

Die Sequenz der 16S-rRNA entspricht der oben angegebenen SEQ ID Nr. 1. c. Tabelle der Unterschiede der Substrate zwischen dem Stamm 10C und E. aurantiacum

Substrate	10C	Exig. aurantiacum
Lactat	–	–
Benzoat	–
Glucose	+	+
Fructose	+	–
Galactose	+	+
D-Xylose	–	–
Mannose	+	–
Mannit	+	+
Glycerin	–	+
Fumarat	–	+
Pyruvat	–	–
Arabinose	–	–
Ribose	+	+
Sorbose	–	–
Saccharose	+	+
Maltose	+	+
Acetat	–	–
Butyrat	–	–
Propionat	–	–
Casaminosäuren	–	–
Dulcit	–	–
Lactose	–	–
Rhamnose	–	–
Melizitose	–	–

d. Kulturverfahren und Anwendungen
I-Produktion von Biomasse durch Fermentation von Zucker
Man arbeitet in nicht erneuertem Medium.

Die Fermentation wird bei einem pH-Wert von 7 mit Hilfe einer alkalischen Lösung (zum Beispiel Natronlauge) und bei einer Temperatur von 45°C reguliert. Man verwendet ein Kulturmedium, das der folgenden Zusammensetzung entspricht:

– Glucose	zu berechnen
– Hefeextrakt/Proteinhydrolysat	zu berechnen
– NH₄Cl	1 g/l
– NaCl	0,5 g/l
– KH₂PO₄	0,3 g/l
– K₂HPO₄	0,3 g/l
– MgCl₂·6H₂O	0,2 g/l
– KCl	0,1 g/l
– CaCl₂·2H₂O	0,1 g/l

Die Konzentrationen an Zucker und an Hefeextrakten sind eine Funktion der Konzentration an Zellen, die man erhalten möchte.
Der Zucker wird getrennt vom Rest des Kulturmediums autoklaviert, ebenso wie bestimmte Mineralsalze, die beim Autoklavieren einen Niederschlag bilden.

Anschließend werden sie steril zum anderen Teil des Kulturmediums (Hefeextrakt + Minerale, zusammen autoklaviert) gegeben, und dann wird das Endvolumen mit sterilem destilliertem Wasser eingestellt. Das folgende Beispiel erlaubt es, die Vorschrift zur Herstellung der Medien besser zu verstehen:
Beispiel für die Herstellung von 16 Litern eines Mediums mit 40 g/l Saccharose und 3 g/l Hefeextrakt: 1.) Abwägen und Autoklavieren

	Konzentration	abzuwiegende Masse
Saccharose	40 g/l	640 g	in ungefähr 500 ml destilliertem Wasser. Autoklavieren bei 110°C, 20 bis 30 min.
MgCl₂·6H₂O	0,2 g/l	3,2 g
CaCl₂·2H₂O	0,1 g/l	1,6 g
Hefeextrakt	3 g/l	48 g	in ungefähr 15 l destilliertem Wasser. Autoklavieren bei 121°C, 1 h 30.
NH4Cl	1 g/l	16 g
KH2PO4	0,3 g/l	4,8 g
K2HPO4	0,3 g/l	4,8 g
NaCl	0,5 g/l	8 g
KCl	0,1 g/l	1,6 g

NB: Der Zucker wird in einem geringen Volumen Flüssigkeit autoklaviert, und zwar nur 20 Minuten bei 110°C, um die Hydrolyse der Saccharose zu vermeiden. Das Magnesium- und das Calciumsalz werden getrennt von den anderen Salzen und des Hefeextrakts autoklaviert, um jede Fällung zu vermeiden.

2.) Zusammenfügung: Die Zuckergrundlösung wird in 15 Liter Medium übergeführt, das den Hefeextrakt enthält, dann wird das sterile destillierte Wasser hinzugefügt, um auf 16 Liter zu ergänzen. Alle diese Überführungen erfolgen steril um die Flamme eines Bunsen-Brenners herum mittels einer Stickstoffüberdrucks, der im zu leerenden Gefäß angewendet wird, um die Flüssigkeit zu verdrängen.
3.) Homogenisierung: ein Stickstoffstrom N₂ wird durch das so zusammengefügte Medium perlen gelassen, um alle Elemente miteinander zu vermischen und die Anaerobiose zu gewährleisten.

2. Fermentierungsmodus
Die Untersuchungen wurden im diskontinuierlichen oder Batch-Modus durchgeführt, der durch die Aneinanderreihung der Chargen kontinuierlich gemacht wird. Es handelt sich um ein "Feed-Harvest"-System oder System der wiederholten Chargen, das sich schematisch durch die Aneinanderreihung von drei Schritten darstellen lässt: Füllung des Fermenters durch neues Medium, dann diskontinuierliche Kultur der Bakterien, dann Entleerung der Kulturlösung, wobei man einen Bodensatz für die Impfung der folgenden Charge darin lässt, dann erneute Füllung usw.
Unter praktischen Gesichtspunkten beruht der Vorteil dieses Systems darauf, dass die Phasen der Reinigung und der Sterilisation des Fermenters zwischen zwei Chargen weggelassen werden, und auf der Möglichkeit der Automatisierung des Verfahrens. Tatsächlich ist es möglich, einen Automaten zu programmieren, der die Arbeitsschritte der Entleerung und der Füllung je nach dem Wert von Parametern auslöst, die online von einer Regeleinheit erfasst werden.
II. Produktion von Biomasse durch Fermentation von Stärke
In anderen Experimenten, bei denen ein Stärkesubstrat und das oben definierte gepufferte Medium (aber mit 10 g Stärke pro Liter) verwendet wurden, erhält man eine Umwandlung der Stärke, was mehr als 95% L(+)-Lactat und Spuren von Formiat ergibt.
Literatur

(1) Balch W. E. et al, 1979, Microbiol. Rev. 43,260–296,
(2) Andrews K. T. & Patel B. K. C., 1996, Int. J. Syst. Bacteriol. 46, 265–269,
(3) Love C. A. et al, 1993, Syst. Appl. Microbiol. 16, 244–251,
(4) Redburn A. C. & Patel B. K. C., 1993, FEMS Microbiol. Lett. 113, 81–86.
(5) Cashion P., 1977, Anal. Biochem, 81: 461–466.
(6) De Ley J, 1970, Eur. J. Biochem, 12: 133–142,
(7) Huss V. A. R., 1983, J. Syst. Appl. Microbiol, 4: 184–192,
(8) Escara J. F., 1980, Biopolymers, 19: 1315–1327.

Sequenzprotokoll

Claims

Bakterienstämme, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Exiguobacterium der Art lactigenes handelt und dass sie eine DNA-Sequenz besitzen, von der wenigstens ein Teil in der Lage ist, mit der genomischen oder plasmidischen DNA des Stammes zu hybridisieren, der am 5. Dezember 2002 unter der Nr. I-2962 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) hinterlegt wurde, wobei diese Stämme thermotolerant, saccharolytisch und amylolytisch sind und/oder L-(+)-Lactat produzieren können, Wachstumseigenschaften bei Temperaturen in der Größenordnung von 40 bis 50°C bei einem pH-Wert von 5,4 bis 9,15 mit einem Wachstumsoptimum bei 45°C bei einem pH-Wert von ungefähr 7 haben und einen Gehalt ihrer DNA an Guanin und Cytosin von ungefähr 50 Molaufweisen und außerdem durch die folgende Sequenz SEQ ID Nr. 1 der 16S-rRNA:
oder eine Sequenz, die eine Homologie mit SEQ ID Nr. 1 von über 97% aufweist, charakterisiert sind.
Bakterienstamm, der am 5. Dezember 2002 unter der Nr. I-2962 bei der CNCM hinterlegt wurde.
Verfahren zur Kultivierung von Bakterienstämmen gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man unter fakultativ anaeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von ungefähr 5,4 bis 9,15 bei 37°C, insbesondere bei 6,5 bis 7,5, in einem Grundmedium arbeitet, das einen von diesen Stämmen verwertbaren Zucker als Energiequelle enthält.
Anwendung von Bakterienstämmen gemäß Anspruch 1 oder 2 in Verfahren zur Nahrungsfermentation.
Verfahren zur Produktion von Metaboliten wie L-(+)-Lactat, dadurch gekennzeichnet, dass es Folgendes umfasst: – die Kultivierung eines Bakterienstammes gemäß Anspruch 1 oder 2 unter Bedingungen, die für seine Entwicklung und für die Produktion des gewünschten Metaboliten geeignet sind; – Gewinnung der produzierten Metaboliten, Isolierung und Reinigung des gewünschten Metaboliten.