DE60222910T2 - Vaccinia virus für diagnose und behandlung von tumoren - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft diagnostische und pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein Vaccinia-Virus enthalten, das eine DNA-Sequenz enthält, die ein nachweisbares Protein oder ein Protein, das imstande ist, ein nachweisbares Signal hervorzurufen, zum Beispiel ein lumineszierendes oder fluoreszierendes Protein, codiert, und das nach einer besonderen Ausführungsform weiterhin eine DNA-Sequenz oder DNA-Sequenzen enthält, die ein Protein oder Proteine codiert/codieren, das/die für die Tumortherapie und/oder die Entfernung von metastatischen Tumoren geeignet ist/sind, zum Beispiel ein cytotoxisches oder cytostatisches Protein.
  • Über die Anwesenheit von Bakterien in Tumoren wurde vor etwa fünfzig Jahren berichtet. Zahlreiche Veröffentlichungen belegten die früheren klinischen Erkenntnisse, dass in Tumoren, die Humanpatienten operativ entfernt wurden, eine unerwartet große Zahl von Bakterien entdeckt wurde. Forscher vertreten die Auffassung, dass chronische Infektionen für eine Prädisposition von Zellen für ein bösartiges Wachstum sorgen können. Chronische Infektionen mit verschiedenen Stämmen von Chlamydia sind mit Lungenkrebs und Gebärmutterhalskrebs sowie bösartigen Lymphomen in Zusammenhang gebracht worden. Ein anderer gut beschriebener Zusammenhang zwischen der Anwesenheit spezifischer Bakterienarten und der Entwicklung von Krebs ist Helicobacter pylori in Patienten mit Magengeschwüren. In Patienten mit Zwölffingerdarmgeschwüren und Magen-Adenokarzinomen wurde eine erhöhte Konzentration an Antikörpern, die mit H. pylori assoziiert sind, gefunden. Diese Beobachtungen zeigen eine gleichzeitige Anwesenheit von Bakterien an Tumorstellen; es war jedoch noch nicht klar, ob die Mikroorganismen die Ursache für die Tumorbildung sind oder ob die tumorösen Gewebe empfänglicher für eine Besiedlung mit Bakterien sind. Streng anaerobe Bakterien, Clostridium pasteurianum, die Mäusen intravenös injiziert wurden, replizierten selektiv in dem Tumor, was auf eine hypoxische Mikroumgebung in dem nekrotischen Zentrum hinwies. Die intravenöse Injektion abgeschwächter Salmonella typhimurium-Mutanten führte gemäß histologischer und bakteriologischer Analysen zu erhöhten Bakterientitern in den Tumor-Geweben, verglichen mit den anderen Organen von Mäusen.
  • In ähnlicher Weise wurde bereits 1965 über die Anwesenheit von Viruspartikeln in operativ entfernten humanen Brusttumoren berichtet. Vor kurzem wurde auf der Basis von Polymerasekettenreaktionsdaten (PCR) das humane Papilloma-Virus mit anogenitalen Tumoren und ösophagealem Krebs, Brustkrebs und am häufigsten Gebärmutterhalskrebs in Zusammenhang gebracht. Zusätzlich wurde über die Anwesenheit des Hepatitis-C-Virus in humanen hepatozellulären Karzinomen, des Epstein-Barr-Virus in Plattenepithelkarzinomen in der Kinura-Krankheit, Maus-Mammatumorvirus-artige Partikel (MMTV) in humanem Brustkrebs, des SV40-Virus in Affen-Astrocytomen und des Herpes-Virus in Schildkröten-Fibropapilloma berichtet. Die Konzentration an Viruspartikeln in den Tumoren zeigte überraschenderweise Schwankungen zwischen den Patienten. Die Anwesenheit von humanen Papilloma-Viren in Plattenepithelkarzinomen der Speiseröhre lag im Bereich von 0 bis 72% (10–15). Im Gegensatz zu Tumorgeweben wurden in tumorfreien Bereichen des Speiseröhrenepithels des gleichen Patienten keine Viruspartikel gefunden, was darauf hinweist, dass die Viruspartikel ausschließlich in den Tumorgeweben lokalisiert sind. WO 0125399 A beschreibt die Verwendung von EBV für den Nachweis und die Behandlung von B-Lymphocyten.
  • Es konnte bislang jedoch nicht eindeutig gezeigt werden, ob die oben diskutierten Mikroorganismen für die Entwicklung von Krankheiten, wie Tumoren (abgesehen von Papilloma-Viren) verantwortlich sind oder ob zum Beispiel Tumore Viren oder Bakterien anziehen und/oder schützen können. Es gab demnach keine Grundlage für die Verwendung derartiger Mikroorganismen für die Diagnose oder die Therapie von Tumoren. Herkömmlichen Verfahren für die Diagnose von Tumoren, wie die Magnetresonanztomographie (MRT) (MRI: Magnetic Resonance Imaging), fehlt die Empfindlichkeit und die Spezifität, und therapeutische Verfahren, zum Beispiel die Chirurgie, sind invasiv und nicht sehr empfindlich.
  • Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mittel für die effiziente und zuverlässige Diagnose sowie die Therapie von Tumoren anzugeben, mit dem die Nachteile der diagnostischen und therapeutischen Ansätze, die zur Zeit verwendet werden, überwunden werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird dies durch die Gegenstände erreicht, die in den Ansprüchen definiert sind. Wenn Vaccinia-Viren (LIVP-Stamm), die das lichtemittierende Fusionsgenkonstrukt rVV-ruc-gfp tragen, intravenös in nackte Mäuse injiziert wurden, wurde festgestellt, dass die Viruspartikel innerhalb von 4 Tagen aus allen inneren Organen entfernt wurden, was durch die Löschung der Lichtemission nachgewiesen wurde. Wenn im Gegensatz hierzu der Verbleib der injizierten Vaccinia-Viren in ähnlicher Weise in nackten Mäusen verfolgt wurde, die Tumore trugen, die aus subkutan implantierten C6-Rattengliomzellen gewachsen waren, wurde festgestellt, dass Viruspartikel langzeitig in den Tumorgeweben zurückgehalten wurden, was zu einer anhaltenden Lichtemission führte. Die Anwesenheit und die Vergrößerung der Menge der viruscodierten Fusionsproteine im gleichen Tumor wurden in lebenden Tieren überwacht, indem die GFP-Fluoreszenz unter einem Stereomikroskop beobachtet wurde und indem die Luciferase-katalysierte Lichtemission unter einer Schwachlicht-Videobildgebungskamera erfasst wurde. Die tumorspezifische Lichtemission wurde 4 Tage nach der viralen Injektion in nackte Mäuse nachgewiesen, die subkutane C6-Gliomimplantate trugen, deren Größe im Bereich von 25 bis 2500 mm3 lag. Das Signal wurde nach dem 4. Tag nach der Injektion intensiver und hielt 30 bis 45 Tage an, was auf eine fortgesetzte Virusreplikation hinweist. Die Anreicherung der rVV-ruc-gfp-Viruspartikel im Tumor wurde ebenfalls in nackten Mäusen gesehen, die subkutane Tumoren trugen, die sich aus implantierten humanen PC-3-Prostatazellen entwickelten, und in Mäusen mit orthotopisch implantierten humanen MCF-7-Brusttumoren. Weiterhin stellten auch intrakraniale C6-Rattengliomzellimplantate in immunkompetenten Ratten und MB-49-Mäuse-Blasentumor-Zellimplantate in C57-Mäusen Ziele der Vaccinia-Viren dar. Querschnitte eines C6-Glioms ergaben, dass die Lichtemission in "Flecken" im Randbereich des Tumors, in dem sich die schnell teilenden Zellen befinden, angehäuft war. Im Gegensatz hierzu ergaben Querschnitte von Brusttumoren, dass fluoreszierende "Inseln" über den Tumor verteilt waren. Zusätzlich zu primären Brusttumoren wurden kleine metastatische Tumore ebenfalls im kontralateralen Brustbereich sowie in Knoten auf der exponierten Lungenoberfläche extern nachgewiesen, was auf die Metastase in die kontralaterale Brust und Lunge hinwies. Zusammenfassend können lichtemittierende Zellen oder Mikroorganismen, zum Beispiel Vaccinia-Viren, verwendet werden, um primäre und metastatische Tumoren nachzuweisen und zu behandeln.
  • Ähnliche Ergebnisse wurden mit lichtemittierenden Bakterien (Salmonella, Vibrio, Listeria, E. coli) erhalten, die intravenös in Mäuse injiziert wurden und die sofort in den unversehrten Tieren unter einem Schwachlicht-Bildgebungsgerät sichtbar gemacht werden konnten. Keine Lichtemission wurde sechsunddreißig Stunden nach der Injektion von Bakterien sowohl in athymischen Mäusen (nu/nu-Mäusen) als auch in immunkompetenten C57-Mäusen infolge der Beseitigung durch das Immunsystem nachgewiesen. In der Hautwunde eines intravenös injizierten Tiers nimmt die bakterielle Lichtemission zu und bleibt bis zu sechs Tage nach der Injektion nachweisbar. In nackten Mäusen, die Tumore tragen, die sich aus implantierten C6-Gliomzellen entwickelten, war die Lichtemission sechsunddreißig Stunden nach der Zufuhr der Bakterien vollständig aus dem Tier verschwunden, ähnlich wie bei Mäusen ohne Tumore. Allerdings wurde achtundvierzig Stunden nach der Injektion unerwarteterweise eine starke, schnell zunehmende Lichtemission beobachtet, die nur von den Tumorbereichen stammte. Diese Beobachtung weist auf eine kontinuierliche Replikation der Bakterien im Tumorgewebe hin. Das Ausmaß der Lichtemission hängt vom verwendeten Bakterienstamm ab. Der Vorgang des Einwanderns ("homing in") zusammen mit der anhaltenden Lichtemission wurde auch in nackten Mäusen nachgewiesen, die Prostata-, Blasen- und Brusttumore trugen. Zusätzlich zu primären Tumoren konnten auch metastatische Tumore sichtbar gemacht werden, was beispielhaft am Brusttumor-Modell gezeigt wurde. Die tumorspezifische Lichtemission wurde auch in immunkompetenten C57-Mäusen mit Blasentumoren sowie in Lewis-Ratten mit Hirngliomimplantaten beobachtet. Sobald sie sich in dem Tumor befanden, wurde für die lichtemittierenden Bakterien nicht beobachtet, dass sie wieder in den Blutkreislauf freigesetzt wurden und anschließend implantierte Tumore im gleichen Tier besiedelten. Weiterhin wurde für Säugetierzellen, die das Ruc-gfp-Fusionsprotein exprimieren, beobachtet, dass sie nach der Injektion in die Blutbahn ebenfalls in Gliomtumore einwandern und sich dort vermehren.
  • Diese Erkenntnisse öffnen den Weg für (a) die Entwicklung multifunktioneller viraler Vektoren, die für den Nachweis von Tumoren auf der Basis von Signalen, wie einer Lichtemission, und/oder für die Unterdrückung der Tumorentwicklung und/oder der Angiogenese, beispielsweise signalisiert durch die Auslöschung des Lichtes, und (b) die Entwicklung von Systemen auf der Basis von Bakterienzellen und Säugetierzellen, die auf Tumore gerichtet sind ("tumor targeting sys tems"), in Kombination mit therapeutischen Genkonstrukten für die Behandlung von Krebs. Diese Systeme haben die folgenden Vorteile: (a) Sie sind spezifisch auf den Tumor gerichtet, ohne das normale Gewebe zu beeinträchtigen; (b) die Expression und die Sekretion des therapeutischen Genkonstrukts erfolgen vorzugsweise unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoters, was es ermöglicht, die Sekretion ein- oder auszuschalten; und (c) der Ort des Zufuhrsystems ("delivery system") innerhalb des Tumors kann durch das direkte Sichtbarmachen vor der Aktivierung der Genexpression und der Abgabe des Proteins überprüft werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft demnach eine diagnostische und/oder pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Vaccinia-Virus enthält, das eine DNA-Sequenz enthält, die ein nachweisbares Protein oder ein Protein, das imstande ist, ein nachweisbares Signal hervorzurufen, codiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Vaccinia-Virus der diagnostischen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzung weiterhin (a) eine DNA-Sequenz oder DNA-Sequenzen, die ein Protein oder Proteine codiert/codieren, das/die für die Tumortherapie und/oder die Beseitigung von metastatischen Tumoren geeignet ist/sind, wie ein cytotoxisches Protein, ein cytostatisches Protein, ein Protein, das die Angiogenese hemmt, oder ein Protein, das die Apoptose stimuliert. Derartige Proteine sind dem Fachmann wohl bekannt, und weitere Beispiele für geeignete Proteine werden weiter unten angegeben.
  • Ein Vaccinia-Virus ist brauchbar für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, sofern es in dem Organismus repliziert, für den Organismus nicht pathogen ist, zum Beispiel abgeschwächt ist, und durch das Immunsystem des Organismus erkannt wird, etc. Beispiele für brauchbare Mikroorganismen sind Bakterien und Viren. Der Ausdruck "Bakterien", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Bakterien, die per se nicht auf einen Tumor gerichtet sind (d. h. sie können nicht zwischen einer kanzerösen Zelle oder einem kanzerösen Gewebe und dem entsprechenden nicht kanzerösen Gegenstück dieser Zelle oder dieses Gewebes unterscheiden), da die Ergebnisse der Versuche, die zu der vorliegenden Erfindung geführt haben, zeigen, dass die Bakterien, etc. in dem Tumor aufgrund der Tatsache angereichert werden, dass sie in dieser Umgebung nicht dem Angriff durch das Immunsystem ausgesetzt sind. Eine Liste der Kandidatenbakterien, die für die gleichen Zwecke wie die vorliegende Erfindung brauchbar sein könnten und die nicht auf den Tumor gerichtet sein könnten, wird in der Tabelle 1 weiter unten angegeben. Der Fachmann kann derartige Bakterien, die nicht auf den Tumor gerichtet sind, problemlos durch allgemein verfügbare Verfahren identifizieren, zum Beispiel durch die Verfahren, die in Abschnitt 6.1 von WO 96/40238 beschrieben werden. Bei diesen Bakterien handelt es sich vorzugsweise um interzelluläre Bakterien, wie E. coli, E. faecalis, Vibrio cholerae, Vibro fischeri, Vibrio harveyi, Lactobacillus spp., Pseudomonas spp. In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung sind die Viren nicht auf den Tumor gerichtet.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die diagnostische und/oder pharmazeutische Zusammensetzung ein Vaccinia-Virus, das eine DNA-Sequenz enthält, die ein lumineszierendes und/oder fluoreszierendes Protein codiert.
  • So wie der Begriff "DNA-Sequenz, die ein lumineszierendes und/oder fluoreszierendes Protein codiert", verwendet wird, umfasst er auch eine DNA-Sequenz, die ein lumineszierendes und fluoreszierendes Protein als Fusionsprotein codiert.
  • In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform der diagnostischen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzung ist das Protein, das durch die DNA-Sequenz codiert wird, ein Zellrezeptor, der imstande ist, einen Liganden zu binden, bei dem es sich um einen diagnostischen oder therapeutischen Liganden handeln kann. Der Ligand kann ein Protein (eingeschlossen große oder kleine Peptide, Antikörper, etc.), eine synthetische Verbindung (wie ein synthetisches Steroidanalogon), etc. sein. Somit kann der in vivo-Ort der markierten Liganden in lebenden Tieren und Humanpatienten sichtbar gemacht werden, zum Beispiel in Echtzeit durch SPECT oder PET. Nahezu jedes bekannte Ligand-Rezeptor-Paar-Protein für die Tumormarkierung ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren brauchbar. Für die Erhöhung der Spezifität können die mutierten Proteinliganden (oder die Analoga, falls es sich um eine chemische Verbindung handelt) oder die mutierten Ligandenrezeptoren vorzugsweise genetisch oder chemisch so manipuliert werden, dass sie nicht an beliebige endogene Moleküle binden. Zusätzlich zur Erhöhung der Spezifität begrenzen diese Mutanten/Analoga auch schädliche Effekte auf die normale Wirtsphysiologie.
  • In einer noch bevorzugteren Ausführungsform der diagnostischen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Liganden um einen Radionuklidmarkierten Liganden. Dieser Ligand ist z. B. brauchbar für die Sichtbarmachung des Tumors durch SPECT ("Single-photon emission computer tomography") oder die Positronen-Emissions-Tomographie (PET), die aus dem Anbinden des Radionuklid-markierten Liganden an seine Rezeptoren resultiert, die spezifisch auf der Oberfläche von Tumorzellen exprimiert werden nach der intravenösen Zufuhr z. B. der manipulierten Vaccinia-Viren, die die Rezeptorprotein-Genkonstrukte tragen. Radionuklide können für die herkömmliche Tumorszintigraphie, PET und möglicherweise die interne Radiotherapie von Tumoren verwendet werden. Beispiele für Radionuklide, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, sind (a) β+-Emitter, wie 11C, 13N, 15O oder 64Cu, oder (b) γ-Emitter, wie 123I. Andere Radionuklide, die z. B. als Tracer für die PET verwendet werden können, schließen 55Co, 67Ga, 68Ga, 60Cu(II), 67Cu(II), 57Ni, 55Co, 52Fe, 18F, etc. ein.
  • SPECT und PET stellen empfindliche Techniken dar, die für die bildgebende Darstellung von Tumoren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Sowohl SPECT als auch PET sind imstande, Spurenmengen von β+ und γ-Emissionen von Radionukliden nachzuweisen. PET ist sogar noch empfindlicher als SPECT. In Experimenten, in denen kleine Labortiere verwendet werden, wird die bildgebende Darstellung von Tumoren unter Verwendung eines mikro-PET-Instruments durchgeführt, das im Handel z. B. von Concorde Microsystems (Knoxville, TN) erhältlich ist.
  • Beispiele für brauchbare Radionuklid-markierte Mittel sind das 64Cu-markierte manipulierte Antikörperfragment (Wu et al., PNAS USA 97 (2002), 8495-8500), das 64Cu-markierte Somatostatin (Lewis et al., J. Med. Chem. 42 (1999), 1341-1347, das 64Cu-Pyruvaldehyd-bis(N4-methylthiosemicarbazon) (64Cu-PTSM) (Adonai et al., PNAS USA 99 (2002), 3030-3035, das 52Fe-Citrat (Leenders et al., J. Neural. Transm. Suppl. 43 (1994), 123-132, das 52Fe/52mMn-Citrat (Calonder et al., J. Neurochem. 73 (1999), 2047-2055) und der 52Fe-markierte Eisen(III)-hydroxid-Saccharosekomplex (Beshara et al., Br. J. Haematol. 104 (1999), 288-295, 296-302).
  • Für die Anwendung des Radionuklid-markierten Liganden beim Tumornachweis werden die Gene, die die Rezeptorproteine codieren, an die die Liganden binden können, durch intravenös injizierte Vaccinia-Viren gemäß der vorliegenden Erfindung zugeführt. Da es in den Beispielen weiter unten gezeigt werden konnte, dass bestimmte intrave nös injizierte Bakterien, Viren und Säugetierzellen spezifisch in den Tumoren replizieren, markiert die Expression der Rezeptorproteine in den Tumoren die Tumore für das gezielte Anbinden des Radionuklidmarkierten Liganden.
  • Um einen effizienten Tumornachweis zu ermöglichen, kann im Fall des Vaccinia-Virus beispielsweise das Virus dafür verwendet werden, Genkonstrukte zu tragen, die Rezeptorproteine codieren, an die spezifisch die Liganden binden können. Die intravenöse Injektion von rekombinanten Vaccinia-Viren ermöglicht die Zufuhr des Rezeptorgens und die Oberflächenexpression des Rezeptorproteins in den Tumorgeweben. Anschließend werden die Radionuklid-markierten Liganden intravenös in den Wirt injiziert. Die spezifische Bindung zwischen den Radionuklid-markierten Liganden und ihren Rezeptoren, die auf der Tumorzelloberfläche exprimiert werden, ermöglicht den Nachweis des Tumors auf der Basis von β+- oder γ-Emissionen, die ausschließlich von den Tumoren stammen. Die Markierung der Tumore mit Radionukliden ermöglicht die einfache Unterscheidung zwischen Tumoren und normalen Geweben. Hierfür können β+- oder γ-Detektoren mit Handgriff entwickelt werden, die an einem chirurgischen Messerhalter befestigt werden. Auf der Basis des β+- oder γ-Emissionssignals können die markierten Tumore sauber herausgeschnitten werden, während die Entfernung von normalen Geweben bei einem Minimum gehalten wird.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist Gallium-67 besonders bevorzugt. Gallium-67 (67Ga) kann für die diagnostische Bildgebung unter Verwendung von PET, SPECT oder der Szintigraphie verwendet werden. Es ist für seine Fähigkeit bekannt, sich in entzündlichen Wunden und Tumoren, speziell in Lymphomen, aber auch in vielen anderen Typen von Tumoren, wie Bauchspeicheldrüsentumoren, Lungentumoren etc., anzureichern. Für den Mechanismus der 67Ga- Aufnahme ist vorgeschlagen worden, dass er sowohl über einen Transferrin-abhängigen Weg als auch einen Transferrin-unabhängigen Weg erfolgt. Für den Transferrin-abhängigen Weg ist gezeigt worden, dass eine Überexpression des Transferrin-Rezeptors die 67Ga-Aufnahme durch Tumorzellen deutlich erhöht. Weiterhin blockiert der Anti-Transferrinrezeptor-Antikörper die 67Ga-Aufnahme durch Tumorzellen beträchtlich. Für die Abbildung eines kleinen Tumors sind sehr hohe Konzentrationen an 67Ga erforderlich, um das Hintergrundsignal zu überwinden. Daher ist in diesem Fall die Verwendung von rekombinanten Vaccinia-Viren, die ein Transferrin-Rezeptor-Genkonstrukt für die Überexpression von Transferrin-Rezeptoren spezifisch auf der Oberfläche der Tumorzellen in lebenden Tieren oder in Humanpatienten nach der intravenösen Injektion der Viren tragen, bevorzugt. 67Ga wird ebenfalls intravenös zugeführt. Die Anreicherung von 67Ga in hohen Konzentrationen in Tumorzellen mit Hilfe der überexprimierten Transferrin-Rezeptoren hilft dabei, die Möglichkeiten eines Tumornachweises in lebenden Tieren und in Humanpatienten beträchtlich zu verbessern.
  • In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße diagnostische und/oder pharmazeutische Zusammensetzung ein Vaccinia-Virus, das eine DNA-Sequenz enthält, die ein Protein codiert, das imstande ist, ein Signal hervorzurufen, das durch die Magnetresonanztomographie (MRT) nachweisbar ist, z. B. Metall-bindende Proteine. Weiterhin kann das Protein Kontrastmittel, Chromophore, Liganden oder Verbindungen, die für die Sichtbarmachung von Geweben erforderlich sind, binden. Dieses Protein ist vorzugsweise ein Zellrezeptor, der imstande ist, einen paramagnetischen oder superparamagnetischen Metall-markierten Liganden zu binden. Die Sichtbarmachung des Tumors durch MRT, die aus dem Anbinden von paramagnetischen oder superparamagnetischen Metall-markierten Liganden an ihre Rezeptoren resultiert, die spezifisch auf der O berfläche der Tumorzellen exprimiert werden, beispielsweise nach der intravenösen Zufuhr der manipulierten Viren gemäß der vorliegenden Erfindung, die die Rezeptor-Protein-Genkonstrukte tragen, hat mehrere Vorteile. Das hohe Ausmaß der Anreicherung dieser Metalle in den Tumoren erleichtert den Tumornachweis. Praktisch alle paramagnetischen oder superparamagnetischen Metalle können für diesen Zweck verwendet werden. Aufgrund der systemischen Toxizität von nackten Schwermetallen werden die paramagnetischen oder superparamagnetischen Metalle sorgfältig ausgewählt, um schädliche Auswirkungen bei einem Minimum zu halten. In den meisten derzeit verfügbaren Kontrastmitteln sind die Metallpartikel entweder an Chelate gebunden oder mit Polymeren beschichtet, wodurch deren Verwendung wesentlich sicherer ist als die Verwendung nackter Partikel. Daher ist die Verwendung von Liganden, die mit chelatierten oder Polymer-beschichteten Metallen markiert sind, bevorzugt.
  • Verfahren für die Erzeugung von Kontrastmitteln, die mit Proteinen verbunden sind, sind dem Fachmann wohl bekannt, beispielsweise wird der Proteinligand (oder ein anderer Ligand aus einer chemischen Verbindung) zunächst chemisch an die Chelate (z. B. Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA)) gebunden. Anschließend wird der Chelat-Protein-Komplex mit Metallen markiert. Ein ähnliches Markierungsverfahren ist bei der Erzeugung von Gallium-markierten Somatostatin-Analoga und bei der Herstellung von Indium-111-markiertem Lipoprotein niedriger Dichte unter Verwendung von DTPA-Bis(stearylamid) verwendet worden. Einzelheiten der Proteinmodifizierung mit Chelaten, die in Kontrastmitteln verwendet werden, sind bereit früher beschrieben worden. Beispielsweise sind die Modifizierung von Proteinen mit dem bifunktionellen Chelat 2-(4-Isothiocyanatobenzyl-6-methyl)diethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA)) (Mirzadeh et al., Bioconjug. Chem. 1 (1990), 59-65) und die Modifizierung von Proteinen mit dem cyclischen Anhydrid von Diethylentriaminpen taessigsäure (cDTPAA) (Duncan und Welch, J. Nucl. Med. 34 (1993), 1728-1738) beschrieben worden.
  • Die MRT kann alternativ mit Hilfe der folgenden Ansätze durchgeführt werden
  • (a) Aktivierung von modifiziertem Gadolinium durch die Enzym/Protein-Zufuhr
  • Dieser Ansatz basiert auf den Prinzipien der GDEPT ("Gene-Directed Enzyme Prodrug Therapy), bei der die Enzyme/Proteine ein systemisch zugeführtes, nichttoxisches Pro-Pharmakon zu dem aktiven, toxischen Arzneimittel aktivieren. Die spezifische Aktivierung des MRT-Kontrastmittels von einem schwachen Relaxivitätszustand in einen starken Relaxivitätszustand durch das Enzym/Protein in den Tumoren erlaubt den Tumornachweis. Die Enzym/Protein-Zufuhr in die Tumore gelingt mit Hilfe der intravenös injizierten, manipulierten Bakterien, Viren und Säugetierzellen, die das Gen tragen, das die β-Galactosidase (oder jedes sonstige verwandte Enzym) codiert. Die β-Galactosidase kann entweder in extrazellulär sezernierter Form oder exprimiert an der Bakterien- oder Säugetierzelloberfläche vorliegen. Ein Beispiel für ein MRT-Mittel, das durch β-Galactosidase gespalten werden kann und in der MRT-Bildgebung für den Tumornachweis verwendet werden kann, ist das 4,7,10-Tri(essigsäure)-1-(2-β-galactopyranosylethoxy)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan) gadolinium (Egad) (Moats et al., 1997). In dieser Verbindung ist ein Galactopyranoserest an der 9. Koordinationsstelle des Gd3+-Ions positioniert. Durch diese Blockierung werden Wasserprotonen daran gehindert, mit den Gd3+-Ionen in Wechselwirkung zu treten, und daher wird der Effekt auf die T1-Relaxationszeit verringert. In Gegenwart der β-Galactosidase spaltet das Enzym die Galactopyranose von dem Chelat ab, wodurch die Koordinationsstelle freigegeben wird, und er laubt den irreversiblen Übergang des Kontrastmittels von einem schwachen in einen starken Relaxivitätszustand. Da die Enzymexpression auf der Basis der Bakterien, Viren oder Säugetierzellen nur in Tumoren stattfindet, kommt es auch nur in den Tumoren zu dem enzymvermittelten Wechsel des Relaxivitätszustands. Daher kann diese enzymvermittelte Aktivierung des MRT-Kontrastmittels für den Tumornachweis verwendet werden.
  • Zusätzlich zu dem obigen MRT-Kontrastmittel können ähnliche neue Kontrastmittel entwickelt werden, in denen andere Typen von Resten an die Chelate gebunden werden können. Diese Reste können durch ihre entsprechenden Enzyme entfernt werden (ähnlich der Entfernung der Galactopyranose durch die Glactosidase) (zum Beispiel α-Mannosidasen, α- und β-Glucosidasen, β-Glucuronidasen), wodurch die 9. Koordinationsstelle des Gd3+-Ions freigegeben wird und die T1-Relaxationszeit für Tumornachweise verändert wird. Die Gene, die diese Enzyme codieren, können alle durch die manipulierten Viren gemäß der vorliegenden Erfindung zugeführt werden. Weiterhin können neue Kontrastmittel, in denen von Gadolinium verschiedene Metalle verwendet werden, für die enzymaktivierte MRT-Tumorabbildung entwickelt werden.
  • Dieser Ansatz kann mit der Therapie kombiniert werden, was in den folgenden Abschnitten gezeigt wird.
  • (b) Erzeugung von Zufuhrvektorsystemen für die Aktivierung der Kontrastmittel (z. B. modifiziertes Gadolinium) in einem ersten Schritt und die nachfolgende Aktivierung eines injizierten Pro-Pharmakons durch das gleiche konstitutiv exprimierte Enzym (z. B. β-Galactosidase) – Nachweis- und Therapiesystem auf der Basis eines Genprodukts (OGPBDTS = "One-Gene-Product-Based Detection and Therapeutic System")
  • Das Kontrastmittel auf Gadolinium-Basis kann beispielsweise durch ein Enzym (z. B. β-Galactosidase), wie weiter oben beschrieben, aktiviert werden, das für den Tumornachweis verwendet werden kann. Anschließend kann das intravenös zugeführte Pro-Pharmakon, wie CBI, TMI, PCI (in dem U.S.-Patent 5,646,298 beschrieben) durch die gleiche β-Galactosidase in den Tumoren gespalten werden, wodurch aktive cytotoxische Arzneimittel gegen Tumorzellen für die Krebsbehandlung erhalten werden.
  • (c) Erzeugung von Zufuhrvektorsystemen mit Nachweis- und Therapiesystemen auf der Basis von zwei Genprodukten (TGPBDTS = "Two-Gene-Product-Based Detection and Therapeutic Systems)
  • Das Gen 1 ist mit einem konstitutiven Promotor verbunden und erzeugt die Enzyme/Proteine, die die Kontrastmittel erkennen (z B metallbindende Proteine, modifiziertes Gadolinium oder andere Mittel), und das Gen 2 ist mit einem exogen aktivierbaren Promotor verbunden, der ohne das aktivierende Arzneimittel still ist und der erst eingeschaltet wird, nachdem das Nachweisvektorsystem positiv durch MRT gefunden wurde. Die Aktivierung des Promotorgenkonstrukts auf Vektorbasis gelingt durch die Injektion oder die orale Verabreichung des aktivierenden Arzneimittels. Die wiederholte Injektion des Kontrastmittels erlaubt die Echtzeitbeobachtung der Tumorgröße und des Ortes von Metastasen während des Behandlungsverfahrens.
  • Für die Transfektion der Zellen sind die DNA-Sequenzen, die die (diagnostischen oder therapeutischen) Proteine codieren, die oben beschrieben werden, zum Beispiel ein luminszierendes und/oder fluoreszierendes Protein, in einem Vektor oder einem Expressionsvektor enthalten. Der Fachmann ist mit Beispielen für diese Vektoren vertraut. Die DNA-Sequenzen können weiterhin in einem rekombinanten Virus enthalten sein, das geeignete Expressionskassetten enthält. Die Viren, die in der erfindungsgemäßen diagnostischen oder pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden können, schließen das Vaccinia-Virus ein. Für die Expression in Säugern stellt beispielsweise der "Immediate Early Promoter" des humanen Cytomegalievirus (pCMV) einen geeigneten Promotor dar. Weiterhin sind gewebe- und/oder organspezifische Promotoren brauchbar. Die DNA-Sequenzen, die zum Beispiel ein lumineszierendes und/oder fluoreszierendes Protein codieren, sind vorzugsweise funktionsfähig mit einem Promotor verknüpft, der eine hohe Expression erlaubt. Derartige Promotoren, zum Beispiel induzierbare Promotoren, sind dem Fachmann wohl bekannt.
  • Für die Erzeugung der oben beschriebenen DNA-Sequenzen und für die Konstruktion von Expressionsvektoren oder Viren, die diese DNA-Sequenzen enthalten, ist es möglich, die allgemeinen Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, zu verwenden. Diese Verfahren schließen zum Beispiel in vitro-Rekombinationstechniken, Syntheseverfahren und in vivo-Rekombinationsverfahren ein, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben werden. Verfahren für die Transfektion von Zellen für die phänotypische Auswahl von Transfektanten und für die Expression der DNA-Sequenzen unter Verwendung der oben beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
  • Der Fachmann kennt DNA-Sequenzen, die Proteine, z. B. lumineszierende oder fluoreszierende Proteine, codieren, die in der erfindungsgemäßen diagnostischen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden können. Im letzten Jahrzehnt sind die Identifizierung und die Isolierung von Strukturgenen, die die lichtemittierenden Proteine der bakteriellen Luciferase von Vibrio harveyi (Belas et al., Science 218 (1982), 791-793) und von Vibrio fischerii (Foran und Brown, Nucleic acids, Res. 16 (1988), 177), der Luciferase des Glühwürmchens (de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7 (1987), 725-737), von Aequorin von Aequorea victoria (Prasher et al., Biochem. 26 (1987), 1326-1332), der Renilla-Luciferase von Renilla reniformis (Lorenz et al., PNAS USA 88 (1991), 4438-4442) und das grün fluoreszierende Protein von Aequorea victoria (Prasher et al., Gene 111 (1987), 229-233) codieren, beschrieben, die das Aufspüren von Bakterien, Viren oder Säugetierzellen auf der Basis einer Lichtemission ermöglichen. Die Transformation und die Expression dieser Gene in Bakterien erlaubt den Nachweis von Bakterienkolonien mit Hilfe von Schwachlichtbildgebungskameras oder einzelner Bakterien unter dem Fluoreszenzmikroskop (Engebrecht et al., Science 227 (1985), 1345-1347; Legocki et al., PNAS 83 (1986), 9080-9084; Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805).
  • Luciferase-Gene sind in einer Vielzahl von Organismen exprimiert worden. Die Promotor-Aktivierung auf der Basis einer Lichtemission unter Verwendung von lux AB, das mit dem Nitrogenase-Promotor verknüpft ist, wurde in Rhizobia, das im Cytoplasma von Zellen von infizierten Wurzelknöllchen residiert, mit Hilfe der Schwachlichtbildgebung gezeigt (Legocki et al., PNAS 83 (1986), 9080-9084; O'Kane et al., J. Plant Mol. Biol. 10 (1988), 387-399). Die Verknüpfung des lux A-Gens und des lux B-Gens führte zu einem vollständig funktionsfähigen Luciferase-Protein (Escher et al., PNAS 86 (1989), 6528-6532).
  • Dieses Fusionsgen (Fab2) wurde in Bacillus subtilis und Bacillus magatherium unter dem Xylose-Promotor eingeführt und dann in Insektenlarven eingeführt und in den Hämolymph von Würmern injiziert. Die bildgebende Darstellung der Lichtemission wurde unter Verwendung einer Schwachlichtvideokamera durchgeführt. Die Bewegung und die Lokalisierung der pathogenen Bakterien in transgenen Arabidopsis-Pflanzen, die das pathogen-aktivierte PAL-Promotor-bakterielle-Luciferase-Fusionsgenkonstrukt tragen, wurde durch die Lokalisierung der Pseudomonas- oder Ervinia spp.-Infektion unter dem Schwachlichtbildgebungsgerät sowohl in Tomatenpflanzen als auch in Kartoffelstapeln gezeigt (Giacomin und Szalay, Plant Sci. 116 (1996), 59-72).
  • Alle Luciferasen, die in Bakterien exprimiert werden, benötigen exogen zugeführte Substrate, wie Decanal oder Coelenterazin, für die Lichtemission. Während die Sichtbarmachung der GFP-Fluoreszenz im Gegensatz hierzu kein Substrat benötigt, wird eine Anregungslichtquelle benötigt. Erst kürzlich wurde der Gencluster, der die bakterielle Luciferase und die Proteine für die Bereitstellung des Decanals innerhalb der Zelle codiert, aus Xenorhabdus luminescens (Meighen und Szittner, J. Bacteriol. 174 (1992), 5371-5381) und Photobacterium leiognathi (Lee et al., Eur. J. Biochem. 201 (1991), 161-167) isoliert und in Bakterien übertragen, was zu einer kontinuierlichen Lichtemission unabhängig von exogen zugeführtem Substrat führte (Fernandez-Pinas und Wolk, Gene 150 (1994), 169-174). Bakterien, die die vollständige Lux-Operon-Sequenz enthalten, ermöglichten, wenn sie intraperitoneal, intramuskulär oder intravenös injiziert wurden, das Sichtbarmachen und Lokalisieren von Bakterien in lebenden Mäusen, was zeigte, dass die Luciferase-Lichtemission durch das Gewebe hindurchdringen kann und extern nachgewiesen werden kann (Contag et al., Mol. Microbiol. 18 (1995), 593-603).
  • Eine Liste von Kandidatenbakterienstämmen, die für den gleichen Zweck wie die vorliegenden Erfindung brauchbar sein könnten (d. h. BMPT (= Bakterien-vermittelte Proteintherapie) und bildgebende Tumordarstellung) und die nicht auf Tumore gerichtet sein könnten, wird in Tabelle 1 angegeben. Der Fachmann kann derartige Bakterien, die nicht auf Tumore gerichtet sind, durch allgemein verfügbare Verfahren, z. B. die Verfahren, die in Abschnitt 6.1 von WO 96/40238 beschrieben werden, einfach identifizieren.
  • Aus Sicherheitsgründen und für die direkte Anwendung beim Menschen sind bakterielle Zelllinien, wie Mikroorganismen, die mit Milch und Käse im Zusammenhang stehen, bevorzugt, die von den meisten Menschen natürlich konsumiert werden und die eine intrinsische Antitumorwirkung haben, wenn sie direkt in feste Tumoren injiziert werden. Derartige Bakterien schließen auch Bakterien ein, die natürlich aus menschlichen Tumoren isoliert wurden, die eine Koexistenz (Symbiose) mit einer Vielzahl von Tumortypen oder mit einem spezifischen Tumortyp entwickelt haben. Die extrazelluläre Sekretion der therapeutischen Proteine durch Bakterien wird entweder durch Signalpeptide oder durch endogene Protein-Sekretionswege vermittelt. Um für eine zusätzliche Sicherheit bei der BMPT zu sorgen, können bakterielle, induzierbare Promotoren, wie der IPTG-induzierte lac-Promotor, verwendet werden, um die Produktion des therapeutischen Proteins durch Bakterien exogen zu regulieren. Die IPTG-regulierte Expression von Säugetierproteinen in Bakterien ist gut dokumentiert worden. Für IPTG ist auch gezeigt worden, dass es bei der Promotoraktivierung in Tieren funktionsfähig ist. Zusätzlich zum lac-Promotor schließen weitere Beispiele für Promotoren, die die Regulation der Genexpression in Bakterien ermöglichen, den Ara-Promotor (durch Arabinose aktiviert) und den PLtetO-1-Promotor (durch Anhydrotetracyclin (aTc) aktiviert) ein (Lutz und Bujard, Nucleic Acids Res. 25 (1997), 1203-1210). Tabelle 1. Beispiele für Kandidaten für Bakterienstämme, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sein könnten:
    Bakterienstamm kurze Beschreibung Literaturhinweis
    aerob, Gram-positiv
    Lactobacillus bulgaricus Joghurtbakterien, nicht pathogen (Teil der normalen Flora, nützlicher Organismus, den der menschliche Körper gebraucht); die Blastolysin-Fraktion, isoliert aus L. bulgaricus, zeigt eine Antitumorwirkung (Bogdanov et al. 1975; Bogdanov et al. 1977; Ketlinskii et al. 1987); kann das Risiko der Entwicklung von Dickdarmtumoren in Menschen reduzieren (Wollowski et al. 2001); ATCC# 11842. Simonds et al. 1971, J Bacteriol 107:382-384; Bogdovan et al. 1975, FERS Lett 57:259-261; Bogdovan et al. 1977, Biull Eksp Biol Med 84:709-712; Ketlinskii et al. 1987, Vopr Onkol 33:51-56; Wollowski et al. 2001, Am J Clin Nutr 73:451S-455S
    Lactobacillus casei nicht pathogen (Teil der normalen Flora, nützlicher Organismus, den der menschliche Körper benötigt); i.v.-injizierter LC9018-Stamm von L. casei zeigt eine ausgeprägte Hemmung des Wachstums von subkutan eingeimpftem Sarcom-180 in Mäusen (Kato et al. 1981); zeigt eine Antitumorwirkung von i.p.-injiziertem L. casei (LC9018-Stamm) (Kato et al. 1988); ATCC#393. Kato et al. 1981, Gann 72:517-523; Kato et al. 1988, Cancer Immunol Immunother 26:215-221
    Lactobacillus acidophilus nicht pathogen (Teil der normalen Flora, nützlicher Organismus, den der menschliche Körper benötigt wird); hemmende Wirkung auf die Lebertumorgenese (Mizutani und Mitsuoka 1980); verkleinert 1,2-Dimethylhydrazin-induzierte (DMH)-Darmtumore in männlichen Sprague-Dawley-Ratten (McIntosh et al. 1999); zeigt eine stark antiproliferative Wirkung von Milch, die durch L. acidophilus fermentiert wurde, auf das Wachstum von humanen Brustkrebszelllinien (Biffi et al. 1997); Mizutani und Mitsuoka 1980, Cancer Lett 11:89-95; Biffi et al. 1997, Nutr Cancer 28:93-99; McIntosh et al. 1999, Nutr Cancer 35:153-159
    Lactobacillus brevis nicht pathogen (Teil der normalen Darmflora, nützlicher Organismus, den der menschliche Körper benötigt);
    Lactobacillus paracasei nicht pathogen (Teil der normalen Flora, nützlicher Organismus, den der menschliche Körper benötigt); zeigt eine antiproliferative Wirkung von Milch, die mit L. paracasei fermentiert wurde, auf das Wachstum einer humanen Brustkrebszelllinie (Biffi et al., 1997); Biffi et al. 1997, Nutr Cancer 28:93-99
    Lactobacillus plantarum nicht pathogen (Teil der normalen Flora, nützlicher Organismus, den der menschliche Körper benötigt); Murosaki et al. (2000) haben beschrieben, dass "die tägliche Verabreichung von L. plantarum L-137 benötigt wird, und eine Antitumorwirkung auf die späten Stufen der Tumorentwicklung ausüben, wenn die IL-12-Erzeugung beträchtlich beeinträchtigt ist"; Murosaki et al. 2000, Cancer Immunol Immunother 49:157-164
    Lactobacillus rhamnosus nicht pathogen (Teil der normalen Flora, nützlicher Organismus, den der menschliche Körper benötigt);
    Lactobacillus salivarius nicht pathogen (Teil der normalen Flora, nützlicher Organismus, den der menschliche Körper benötigt); die Veränderung der Magenflora in IL-10-Knockout-Mäusen durch probiotische Lactobacilli (durch die Fütterung mit Milch) ging mit einem reduzierten Auftreten von Dickdarmkrebs und entzündlicher Aktivität im Bereich der Schleimhäute einher (O'Mahony et al. 2001); O'Mahony et al. 2001, Aliment Pharmacol Ther 15:1219-1225
    Lactobacillus sporogenes nicht pathogen (Teil der normalen Flora, nützlicher Organismus, den der menschliche Körper benötigt);
    Lactobacillus lactis nicht pathogen (Teil der normalen Flora, nützlicher Organismus, den der menschliche Körper benötigt);
    Lactobacillus fermentum ATCC#9338
    Streptococcus thermophilus Joghurtbakterien, nicht pathogen (Teil der normalen Flora, nützlicher Organismus, den der menschliche Körper benötigt); über eine Tumor-spezifische Transplantationsresistenz in Mäusen nach der Behandlung von anfänglichen Tumoren mit S. thermophilus wurde berichtet (Kaklij und Kelkar 1996); T-Lymphocyten sind an der von S. thermopilus gezeigten Antitumorwirkung beteiligt (Kaklij et al, 1991); die intraperitoneale Verabreichung von S. thermopilus führte zu einer vollständigen Heilung in einem sehr beträchtlichen Anteil der Mäuse, die an der aszitischen Form des Sarkom-180 oder des Ehrlich-Asziten-Karzinomtumors leiden (Kelkar et al. 1988); ATCC#BAA-250D. Kelkar et al. 1988, Cancer Lett 42:73-77; Kaklij et al. 1991, Cancer Lett 56:37-43; Kaklij und Kelkar 1996, Microbiol Immunol 40:55-58
    Bacillus subtilis nicht pathogen; die B. subtilis-Bakterämia stand in einem deutlichen Zusammenhang mit Krebspatienten (Banerjee et al. 1988); Banerjee et al. 1988, Arch Intern Med 148:1769-1774
    Bacillus megaterium nicht pathogen; das Peptidoglycan von B. megaterium hemmt das Tumorwachstum (Nauciel und Goguel 1977); Nauciel und Goguel 1977, J Natl Cancer Inst 59:1723-1726
    Bacillus polymyxa nicht pathogen;
    Mycobacterium smegmatis nicht pathogen; schnell wachsend; Saito und Watanabe (1981) zeigten, dass "das Bakteriocin von M. smegmatis morphologische Veränderungen und die Hemmung der Synthese der Ribonucleinsäure, Desoxyribonucleinsäure und des Proteins in den transformierten, nicht jedoch in den nichttransformierten Zellen hervorrief"; Lamensans et al. 1975, Proc Natl Acad Sci USA 72:3656-3660; Saito und Watanabe 1981 Microbiol Immunol 25:13-22
    Mycobacterium vaccae nicht pathogen;
    Mycobacterium microti nicht pathogen; ATCC# 35782
    Mycobacterium habana nicht pathogen; langsam wachsend, photochromogen, ursprünglich aus Affen isoliert;
    Listeria monocytogenes intrazelluläres Pathogen
    Enterococcus faecalis wurden aus Tumoren und der infektionsbedingten Endocarditis isoliert; ATCC# 29212, 51299 Milbrandt 1998, Clin Cardiol 21:123-126
    Aerob, Gram-negativ
    Escherichia coli Intravenös injiziertes E. coli zeigt eine tumorspezifische Lokalisierung. Shabahang et al., nicht veröffentlichte Daten
    Salmonella typhimurium Bermudes und seine Mitarbeiter haben intravenös injizierte Salmonella als Vektor für die Proteinzufuhr verwendet (Pawelek et al. 1997; Bermudes et al. 2000; Clairmont et al. 2000; Zheng et al. 2000); Bermudes und seine Mitarbeiter haben eine Salmonella (TK)-abhängige [(14C]FIAU-Anreicherung gezeigt, die im Tumorgewebe, verglichen mit Muskelgewebe, mindestens 30-fach größer war (Tjuvajev et al. 2001); eine Phase I-Studie zur intravenösen Verabreichung von abgeschwächtem Salmonella typ himurium bei Patienten mit metastatischen Melanomen zeigte keine Antitumor-wirkung (Toso et al. 2002) Pawelek et al. 1997, Cancer Res 57:4537-4544; Bermudes et al. 2000, Adv Exp Med Biol 465:57-63; Clairmont et al. 2000, J Infect Dis 181:1996-2002; Zheng et al. 2000, Oncol Res 12: 127-135; Tjuvajev et al. 2001, J Control Release 74:313-315; Toso et al. 2002, J Clin Oncol 20:142-152
    Vibrio cholera Intravenös injizierte V. cholera zeigten eine tumorspezifische Lokalisierung; nicht pathogene Stämme von V. cholera sind verfügbar Shabahang et al., nichtveröffentlichte Daten
    Vibro harveyi nicht pathogen; lumineszierende Bakterien; ATCC# 700106.
    Pseudomonas fluorescens nicht pathogen; beweglich mit Hilfe von vielen polaren Geißeln; über eine P. fluorescens-Bakterämie ist in Krebspatienten berichtet worden (Hsueh et al 1998); P. fluorescens kann an Nervenzellen binden und verhält sich wie ein Pathogen (Picot et al 2001); wachsen normalerweise bei 26–30°C, ATCC# 17583 kann aber bei 37°C wachsen. Hsueh et al 1998, J Clin Microbiol 36:2914-2917; Picot et al. 2001, Microbes Infect 3:985-995
    Pseudomonas putida Über eine P. putida-Bakterämie in Krebspatienten wurde berichtet (Martino et al. 1996); L-Methioninase von P. putida sorgt für eine Abreicherung von Methionin und hemmt das Tumorwachstum (Kokkinakis et al. 1997); wachsen normalerweise bei 26°C, aber ATCC# 43142, 47054 kann bei 37°C wachsen. Pekhov et al. 1983, Biull Eksp Biol Med 95:87-88; Anaissie et al. 1987, Am J Med 82:1191-1194; Martino et al. 1996, Eur J Clin Microbiol Infect Dis 15:610-615; Kokkinakis et al. 1997, Nutr Cancer 29:195-204; Miki et al. 2000, Cancer Res 60:2696-2702
    anaerob, Gram-positiv
    Bifidobacterium bifidum nicht pathogen (Teil der normalen Flora, nützlicher Organismus, den der menschliche Körper braucht); Kimura et al. (1980) haben gezeigt, dass die Bakterien "in verschiedenen Typen von Maustumoren nach der i. v. Verabreichung selektiv lokalisiert waren und sich dort vermehrten" und dass "keine dieser Bakterien in den Geweben von gesunden Organen, wie der Leber, der Milz, der Niere, der Lunge, dem Blut, dem Knochenmark und einem Muskel 48 oder 96 h nach der i.v.-Verabreichung in tumortragenden Mäusen nachgewiesen werden konnten"; zeigt eine antiproliferative Wirkung von Milch, die mit B. bifidum fermentiert wurde, auf das Wachstum einer humanen Brustkrebszelllinie (Biffi et al. 1997); ATCC# 11863, 15696 Kimura et al. 1980, Cancer Res 40:2061-2068; Biffi et al. 1997, Nutr Cancer 28:93-99
    Bifidobacterium longum nicht pathogen (Teil der normalen Flora, nützlicher Organismus, den der menschliche Körper benötigt); hemmende Wirkung auf die Lebertumorgenese (Mizutani und Mitsuoka 1980); für B. longum wurde gezeigt, dass es "in 7,12-Dimethyl-benz[a]anthracen-induzierten Brusttumoren der Ratte nach der systemischen Verabreichung lokalisiert war und sich vermehrte (Yazawa et al. 2001); es wurde gezeigt, dass es sich in hypoxischen Tumoren selektiv lokalisiert und wächst (Yazawa et al. 2000); ATCC# 15707 Mizutani und Mitsuoka 1980, Cancer Lett 11:89-95; Yazawa et al. 2000, Cancer Gene Ther 7:269-274; Yazawa et al. 2001, Breast Cancer Res Treat 66:165-170
    Bifidobacterium infantis nicht pathogen (Teil der normalen Flora, nützlicher Organismus, den der menschliche Körper benötigt); zeigt eine starke antiproliferative Wirkung von Milch, die mit B. infantis fermentiert wurde, auf das Wachstum einer humanen Brust-krebszelllinie (Biffi et al. 1997) und anderer Tumorzellen oder Tumore (Kohwi et al. 1978; Sekine et al. 1985; Sekine et al. 1995); ATCC# 15697 Kohwi et al. 1978, Gann 69:613-618; Sekine et al. 1985, Cancer Res 45:1300-1307; Sekine et al. 1995, Biol Pharm Bull 18:148-153; Biffi et al. 1997, Nutr Cancer 28:93-99
    Bifidobacterium laterosporus nicht pathogen (Teil der normalen Flora, nützlicher Organismus, den der menschliche Körper benötigt);
    Bifidobacterium animalis zeigt eine antiproliferative Wirkung von Milch, die mit B. animalis fermentiert wurde, auf das Wachstum einer humanen Brustkrebszelllinie (Biffi et al. 1997); ATCC# 25527 Biffi et al. 1997, Nutr Cancer 28:93-99
    Actinomyces israelii Actinomyceten sind pilzähnliche Bakterien, die filamentöse Zweige bilden. Sie sind dafür bekannt, dass sie im Mund und im Darmtrakt leben. Die pathogene Proliferation der Organismen, die üblicherweise das Ergebnis einer Verletzung des Bereichs der Infektion ist, kann zu einer Actinomykose führen
    Eubacterium lentum Eubacterium-Arten gehören zur normalen Flora des Darmtraktes. Sie können jedoch opportunistische Infektionen hervorrufen. E. lentum, die am häufigsten isolierte Art, wurde mit Endocarditis und einigen Wundinfektionen in Zusammenhang gebracht.
    Peptostreptococcus anaerobius Eines der häufigsten Bakterien, das bei NSA-Infektionen ("non sparing anearobic") in bestimmten chirurgischen Gruppen von Patienten gefunden wird; ATCC# 27337 Chatterjee und Chakraborti 1995, J Indian Med Assoc 93:333-5, 339
    Peptococcus prevotii wird in Wundinfektionen gefunden; Chatterjee und Chakraborti 1995, J Indian Med Assoc 93:333-5, 339
    Clostridium novyi strikt anaerob; wild im Boden vorkommend; die Beweglichkeit ist in Gegenwart von Sauerstoff gehemmt; Vogelstein lab (Dang et al. 2001) zeigte, dass "intravenös injizierte C. novyi-NT-Sporen innerhalb der gefäßfreien Bereiche von Tumoren in Mäusen keimten und umgebende lebensfähige Tumorzellen zerstörten", "eine große Zahl (bis zu 108 in einem Volumen von 500 μl) von C. novyi- und C. sordellii-Sporen konnten intravenös in normale Mäuse injiziert werden, ohne irgendwelche wahrnehmbaren Nebenwirkungen hervorzurufen", ATCC# 19402 Dang et al. 2001, Proc Natl Acad Sci U S A 98:15155-15160; Nuyts et al. 2002, Anticancer Drugs 13:115-125
    Clostridium sordellii ATCC# 9714
    Clostridium absonum ATCC# 27555
    Clostridium acetobutylicum Theys et al. (2001) haben eine "spezifische Ausrichtung von Cytosindeaminase auf feste Tumore durch manipuliertes Clostrdium acetobutylicum" gezeigt; andere darauf bezogene Veröffentlichungen (Theys et al. 1999); ATCC# 824 Theys et al. 1999, Appl Environ Microbiol 65:4295-4300; Theys et al. 2001, Cancer Gene Ther 8:294-297
    Clostridium bifermentans ATCC# 17836
    Clostridium difficile Die Verbindung zwischen C. difficile und Krebspatienten ist dokumentiert worden (Anand und Glatt 1993; Simon et al. 2000); ATCC# 700057 Anand und Glatt 1993, Clin Infect Dis 17:109-113; Schuller et al. 1995, Arch Dis Child 72:219-222; Wehl et al. 1999, Med Pediatr Oncol 32:336-343; Simon et al. 2000, Infect Control Hosp Epidemiol 21:592-596
    Clostridium histolyticum ATCC# 19401
    Clostridium perfringens pathogen; über eine C. perfringens-Bakterämie in Krebspatienten ist häufig berichtet worden; das C. perfringens-Enterotoxin tötet Tumorzellen und verringert das Tumorwachstum (Michl et al. 2001); ATCC# 3624, 13124 Bodey et al. 1991, Cancer 67:1928-1942; Michl et al. 2001, Gastroenterology 121:678-684
    Clostridium beijerinckii Brown und seine Mitarbeiter in Stanford haben beschrieben, dass "sie für den Nachweis der Spezifität dieses Ansatzes für die Ausrichtung auf den Tumor die inaktive Sporenform von C. beijerinckii intravenös injizierten, die beim Übergang in einen reproduzierenden Zustand das E. coli-Nitroreduktasegen exprimiert. Die Nitroreduktase-Aktivität war in 10 von 10 Tumoren während der ersten 5 Tage nach der intravenösen Injektion der inaktiven Clostridium-Sporen nachweisbar, was einen schnellen Übergang vom Sporenzustand in den reproduktiven Zustand zeigte (Lemmon et al. 1997); andere Veröffentlichungen zu auf den Tumor gerichteten C. beijerinckii (Minton et al. 1995, FEMS Microbiol Rev 17:357-364; Fox et al. 1996); ATCC# 25752 Minton et al. 1995, FEMS Microbiol Rev 17:357-364; Fox et al. 1996, Gene Ther 3:173-178; Lemmon et al. 1997, Gene Ther 4:791-796
    Clostridium sporogenes unschädlicher Saprophyt; Brown und seine Mitarbeiter in Stanford haben beschrieben, dass "die systemische Zufuhr von 5-FC in Mäuse, denen zuvor CD-transformierte Sporen von C. sporogenes injiziert wurden, zu einer stärkeren Antitumorwirkung führten als die maximal verträglichen Dosen von 5-FU"; ATCC# 19404 Liu et al. 2002, Gene Ther 9:291-296
    Staphylococcus aureus nichtbeweglich, keine Sporen bildend und fakultativ anaerob; ein halotoleranter (salztoleranter) Organismus, der mit der Nasenschleimhaut von Säugetieren assoziiert ist, von dem es sowohl gutartige als auch pathogene Stämme gibt; eine S. aureus-Bakterämie wird häufig in Krebspatienten gesehen; ATCC# 25923
    Staphylococcus epidermidis nicht pathogener Bestandteil der normalen Mikroflora der Haut;
    anaerob, Gram-negativ
    Acidaminococcus fermentans wird in Wundinfektionen gefunden; Chatterjee und Chakraborti 1995, J Indian Med Assoc 93:333-5, 339
    Pflanzenbakterien, Gram-positiv
    Clavibacter michiganensis subsp. michiganerisis Pathogen der Tomate
    Pflanzenbakterien, Gram-negativ
    Agrobacterium tumefaciens A. tumefaciens in Pflanzentumoren (Ullrich und Aloni 2000); Kunik et al. (2001, Proc Natl Acad Sci U S A 98:1871-1876) haben beschrieben, dass "Agrobacterium an verschiedene Typen humaner Zellen bindet und diese genetisch transformiert"; es ist darüber berichtet worden, dass Antikörper gegen A. tumefaciens in Patienten mit verschiedenen Krebsarten gefunden wurden (Aksac 1974, Turk Hij Tecr Biyol Derg 34:48-51); Wachstum bei 26-30°C; ATCC# 15955 Aksac 1974, Turk Hij Tecr Biyol Derg 34:48-51; Zambryski et al. 1982, J Mol Appl Genet 1:361-370; Rezmer et al. 1999, Planta 209:399-405; Ullrich und Aloni 2000, J Exp Bot 51:1951-1960; Azmi et al. 2001, Planta 2001, Mai; 213(1):29-36; Kunik et al. 2001, Proc Natl Acad Sci U S A 98:1871-1876
    Erwinia herbicola nicht verkapselt, nicht sporenbildend, kurze Stäbchen mit einer einzigen monotrichen polaren Geißel, unschädlich für Menschen; gereinigte Tyrosinphenol-Lyase von E. herbicola hemmte das Wachstum von etablierten B-16-Melanomtumoren beträchtlich; Meadows et al. 1976, Cancer Res 36:167-167
    Azorhizobium caulinodans symbiotisch, besiedeln Pflanzen, fixieren Stickstoff;
    Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Pathogen von Pfeffer und Tomate
    Xanthomonas campestris pv. campestris Pathogen von Rüben und Kohl; für den E. coli lac-Promotor wurde gezeigt, dass er in diesem Pflanzenpathogen funktionsfähig ist; Soby und Daniels 1996, Appl Microbiol Biotechnol 46:559-561
    • Hinweis: Der Inhalt dieser Tabelle ist in keiner Weise erschöpfend. Alle sonstigen ähnlichen Bakterienstämme, die in dieser Tabelle nicht aufgeführt sind, werden ebenfalls als in diese Liste eingeschlossen betrachtet.
  • Besonders bevorzugt ist abgeschwächtes Vibrio cholerae.
  • Ein weiteres Beispiel für ein Bakterium, das für die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung für die bildgebende Tumordarstellung oder für die Beobachtung einer therapeutischen Tumorbehandlung brauchbar ist, stellt ein magnetisches Bakterium dar (durch ein metallbindendes Bakterium vermittelter Tumornachweis, "Metal-Binding-Bacteria-Mediated Tumor Detection (MBBMTD)). Derartige Bakterien ermöglichen den Tumornachweis über die Anreicherung von Kontrastmitteln auf Eisenbasis. Magnetische Bakterien können aus frischen und marinen Sedimenten isoliert werden. Sie sind imstande, magnetische Partikel (Fe3O4) zu bilden (Blakemore, Annu. Rev. Microbiol. 36 (1982), 217-238). Um dies zu tun, verfügen sie über ein effizientes Aufnahmesystem für Eisen, das es ihnen erlaubt, sowohl unlösliche als auch lösliche Formen von Eisen zu verwenden. Magnetospirillum magneticum AMB-1 ist ein Beispiel für derartige magnetische Bakterien, das für die Erzeugung magnetischer Partikel isoliert und kultiviert worden ist (Yang et al., Enzyme Microb. Tech nol. 29 (2001), 13-19). Da es erwartet werden kann, dass diese magnetischen Bakterien (natürlich vorkommend oder genetisch verändert), wenn sie intravenös injiziert werden, eine ähnliche Fähigkeit zur Anreicherung in einem Tumor wie beispielsweise Vibrio cholera besitzen, können diese Bakterien für die Anreicherung von Kontrastmitteln auf Eisenbasis in den Tumoren verwendet werden, was wiederum den Tumornachweis durch MRT erlaubt. In ähnlicher Weise können andere natürlich isolierte metallanreichernde Stämme von Bakterien verwendet werden, die auf Tumore ausgerichtet sind, um Metalle von Kontrastmitteln zu absorbieren und gegebenenfalls die Tumore abzubilden.
  • Das Vaccinia-Virus wird für die diagnostischen und therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet; siehe Tabelle 2, in der Beispiele für Viren aufgezählt werden, die für den gleichen Zweck wie die vorliegende Erfindung verwendbar sind. Tabelle 2. Beispiele für Viren, die für den gleichen Zweck wie die vorliegende Erfindung verwendbar sind:
    Virusstamm kurze Beschreibung Literaturhinweis
    Vaccinia-Virus Wir haben gezeigt, dass die Mutation der viralen Thymidinkinase nicht erforderlich ist für die Anreicherung im Tumor durch intravenös injiziertes Vaccinia-Virus Yu et al. 2002, nicht veröffentlichte Daten
    Epstein-Barr-Virus
    humanes Papilloma-Virus zur Hausen 2002, Nat Rev Cancer 2:342-350
    Retrovirus
    Adenovirus Lindsey 2002, Lancet Oncol 3:264
    adenoassoziiertes Virus
    SV40-Virus
    Cyctomegalievirus
    Newcastle Disease-Virus sicher, repliziert in und tötet Tumorzellen; die lokale Injektion ist wirksamer als die systemische Injektion Schirrmacher et al. 2001, Int J Oncol 18:945-952
    bovines Enterovirus Für das bovine Enterovirus wurde gezeigt, dass es einen breiten Gewebetropismus für Zelltypen in vitro zeigt. Es zeigt auch eine onkolytische Wirkung gegenüber humanen Zellen Smyth et al. 2002, Int J Mol Med 10:49-53
    lymphozytisches Choriomeningitis-Virus (LCMV) hohe Stabilität, niedrige Toxizität und breiter Wirtsbereich Beyer et al. 2002, J Virol 76:1488-1495
    Lentiviren
    Abkömmlinge des Edmonston-B-Stammes des Masernvirus (MV-Ed) sicher, lebend abgeschwächt, für dieses Virus wurde gezeigt, dass es die Zurückentwicklung humaner Lymphomheterotransplantate in immungeschwächten Mäusen hervorruft Grote et al. 2001, Blood 97:3746-3754
    Herpes simplex-Virus Typ 1 Lachmann und Efstathiou 1999, Curr Opin Mol Ther 1:622-632; Wu et al. 2001, Cancer Res 61:3009-3015
    Abgeschwächtes Gelbfiebervirus (YF) starkes Vaccin, sicher Barrett 1997, Biologicals 25:17-25; McAllister et al. 2000, J Virol 74:9197-205
    • Hinweis: Der Inhalt dieser Tabelle ist in keiner Weise erschöpfend. Alle sonstigen ähnlichen Virusstämme, die nicht in dieser Tabelle aufgezählt sind, werden auch als eingeschlossen angesehen.
  • In der Erfindung handelt es sich bei dem Virus um das Vaccinia-Virus.
  • Säugetierzellen, wie Stammzellen, die autolog oder heterolog zu den Organismen sein können, sind für eine diagnostische oder therapeutische Zusammensetzung für den gleichen Zweck wie die vorliegende Erfindung geeignet. Beispiele für geeignete Zelltypen werden in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3. Beispiele für Säugetierzellen, die für den gleichen Zweck wie die vorliegende Erfindung brauchbar sind:
    Säugetierzellen kurze Beschreibung Literaturhinweis
    Stammzellen Es ist gezeigt worden, dass Nervenstammzellen, die intravenös außrhalb des zentralen Nervensystems implantiert werden, auf einen intrakranialen Tumor gerichtet sind. Zusätzlich wandern die Donornervenstammzellen durch das normale Gehirngewebe und sind auf die humanen Glioblastomzellen gerichtet, wenn sie intrkranial an entfernten Stellen zum Tumor, wie in die kontralaterale Hemisphäre oder in die zerebralen Ventrikel, implantiert werden. Aboody et al. 2000, Proc Natl Acad Sci U S A 97:12846-12851; Herrlinger et al. 2000, Mol Ther 1:347-357
    Verschiedene Typen von Tumorzellen Es ist für Eierstockkrebszellen beispielsweise gezeigt worden, dass sie in den Pleuraraum von Patienten eindringen, wo sie auf bösartige pleurale Mesotheliome gerichtet sind (Harrison et al. 2000, Ann Thorac Surg 70:407-411). Wir haben gezeigt, dass sich intravenös injizierte Fibrosarcomzellen in Brusttumoren und subkutanen Gliomtumoren anreichen (Yu et al., nicht veröffentlichte Daten).
    • Hinweis: Der Inhalt dieser Tabelle ist in keiner Weise erschöpfend. Alle sonstigen ähnlichen Säugetierzellen, die nicht in dieser Tabelle aufgezählt sind, werden auch als eingeschlossen angesehen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen diagnostischen und/oder therapeutischen Zusammensetzung handelt es sich bei dem lumineszierenden oder fluoreszierenden Protein um eine Luciferase, das grün fluoreszierende Protein (GFP) oder das rot fluoreszierende Protein (RFP).
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das Vaccinia-Virus der erfindungsgemäßen diagnostischen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzung zusätzlich ein Gen, das ein Substrat für die Luciferase codiert. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform enthält das Vaccinia-Virus der erfindungsgemäßen diagnostischen und/oder therapeutischen Zusammensetzung eine ruc-gfp-Expressionskassette, die die cDNA-Sequenzen der Renilla-Luciferase (ruc) und von Aequorea gfp unter der Kontrolle eines starken, synthetischen frühen/späten Promotors (PE/L) von Vaccinia enthält, oder die luxCDABE-Kassette.
  • Eine bevorzugte Verwendung der oben beschriebenen Vaccinia-Viren ist die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung für die bildgebende Tumordarstellung. Die erfindungsgemäße diagnostische Zusammensetzung kann zum Beispiel während einer Operation für die Identifizierung von Tumoren und Metastasen verwendet werden. Weiterhin ist die erfindungsgemäße diagnostische Zusammensetzung für die Überwachung einer therapeutischen Tumorbehandlung brauchbar. Geeignete Vorrichtungen für die Analyse beispielsweise der Lokalisierung oder der Verteilung von lumineszierenden und/oder fluoreszierenden Proteinen in einem Organismus, einem Organ oder einem Gewebe sind dem Fachmann wohl bekannt und werden weiterhin in der oben angegebenen Literatur sowie in den folgenden Beispielen beschrieben. Zusätzlich können die Vaccinia-Viren derart modifiziert werden, dass sie Metalle binden und demzufolge in der MRT-Technologie brauchbar sind, um die Tumorlokalisierung spezifischer zu machen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer antimikrobiellen, zum Beispiel antibakteriellen oder antiviralen Verbindung, zum Beispiel eines Peptids oder Proteins, das mit einem nachweisbaren Protein verknüpft ist, für die Herstellung einer diagnosti schen Zusammensetzung für die bildgebende Darstellung von Tumoren oder die Überwachung einer therapeutischen Tumorbehandlung. Diese diagnostische Zusammensetzung ist für den Tumornachweis anhand der Anbindung der antimikrobiellen Verbindung brauchbar, zum Beispiel eines lichtemittierenden oder radioaktiv markierten antimikrobiellen Peptids/Proteins mit Bakterien, die in Tumoren lokalisiert sind (Peptide-Linked-Tumor-Targeting-Vector-Detection (PLTTVD)).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung einer antimikrobiellen, zum Beispiel antibakteriellen oder antiviralen Verbindung, zum Beispiel eines Peptids oder Proteins, die mit einem therapeutisches Protein verknüpft ist, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Tumortherapie.
  • Beispiele für natürlich vorkommende antimikrobielle Proteine schließen Ubichicidin (UBI, 6,7 kDa) und Lactoferrin (hLF, 77 kDa) ein. UBI wurde ursprünglich aus murinen Makrophagen und später aus humanen Epithelzellen der Luftwege isoliert. hLF wird in Schleimhäuten und in den Neutrophilen gefunden und ist dafür bekannt, dass es an Oberflächenstrukturen sowohl von Gram-negativen als auch von Gram-positiven Bakterien bindet. Kleine synthetische Peptide, die die Domänen von UBI oder hLF für die Anbindung an Bakterien enthalten, sind für die bildgebende Darstellung bakterieller Infektionen entwickelt worden, die von keimfreien Entzündungen unterschieden werden können (Nibbering et al., Nucl. Med. Commun. 19 (1998), 1117-1121; Welling et al., Nucl. Med. Biol. 29 (2000), 413-422; Welling et al., Eur. J. Nucl. Med. 27 (2002), 2929-301). Diese Peptide werden mit 99mTc radioaktiv markiert, was das Sichtbarmachen in Echtzeit in lebenden Tieren unter Verwendung der Planaren Szintigraphie ermöglicht. Beispielsweise kann eine Planare Gamma-Kamera (z. B. Toshiba GCA 7100/UI, Tokio, Japan), die mit einem niederenergetischen Mehrzweck-Parallellochkollimator ausgestattet ist, verwendet werden, um die Verteilung von 99mTc-markierten antimikrobiellen Peptiden in lebenden Tieren oder Menschen sichtbar zu machen. Für die Anwendung dieser synthetischen Peptide für den Tumornachweis werden die tumorösen Personen zunächst mit einem speziellen Stamm von extrazellulären Bakterien infiziert. Nach der Besiedlung der Tumore mit den Bakterien werden die radioaktiv markierten Verbindungen, zum Beispiel Peptide, intravenös zugeführt. Die spezifische Bindung der markierten Peptide an die Bakterien in den Tumoren kann durch die Szintigraphie in Echtzeit sichtbar gemacht werden, was somit die Lokalisierung von Tumoren in Menschen und Tieren ermöglicht. Zusätzlich zur Markierung mit 99mTc können die Verbindungen, zum Beispiel synthetische Peptide, auch mit paramagnetischen oder superparamagnetischen Metallpartikeln für die Sichtbarmachung unter Verwendung der MRT markiert werden, oder die Verbindung können mit Radionukliden, wie 55Co, 68Ga, 60Cu(II), 123I usw. für das nicht invasive Sichtbarmachen durch SPECT oder PET markiert werden. Weiterhin können die Verbindungen, zum Beispiel synthetische Peptide, auch mit fluoreszierenden Sonden, fluoreszierenden Proteinen (wie dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) oder DsRed) oder mit lumineszierenden Proteinen (wie Renilla-Luciferase, Glühwürmchen-Luciferase) für die Sichtbarmachung in einem Individuum in Echtzeit markiert werden.
  • Zusätzlich zu UBI und hLF gibt es viele andere Beispiele für antimikrobielle Peptide/Proteine, die von Bakterien, Pflanzen, Wirbellosen und Wirbeltieren einschließlich den Menschen erzeugt werden (Schroder, Cell. Mol. Life Sci. 56 (1999), 32-46; Cole und Ganz, Biotechniques 29 (2000), 822-826, 828, 830-831), die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, z. B. Pediocin PA-1 von Milchsäurebakterien, Gramicidin S von Bacillus brevis, Protegrin-1 von Leukocyten vom Schwein, SMAP-29 von Myeloidzellen vom Schaf, Buforin I & Buforin II der Schwarznarbenkröte, β-Defensins, LL-37, ein Fragment von humanem Cathelicidin hCAP-18, Arasin I vom Wels, Granulysin, PAMP von Propionibacterium jensenii etc. Auf der Basis dieser natürlich vorkommenden antimikrobiellen Proteine können kleine Peptide entwickelt und synthetisiert werden, die die Fähigkeit zur Bindung an Bakterien weiterhin aufweisen, während die bakterientötende Wirkung des ursprünglichen Proteins nicht mehr vorhanden ist. Diese synthetischen Peptide könnten dann beim bakterienvermittelten Tumornachweis verwendet werden.
  • Ähnlich dem Nachweise von Bakterien durch antibakterielle Verbindungen (z. B. Peptide/Proteine) können antivirale Verbindungen (z. B. Peptide/Proteine) für den Nachweis von Viruspartikeln in den Tumoren verwendet werden. Lactoferricin ist eines der Beispiele für ein antivirales Peptid/Protein, das für die Entwicklung von Peptiden für den Nachweis von Viruspartikeln verwendet werden kann. Zusätzlich zu den diskutierten antimikrobiellen Peptiden/Proteinen können mit einem radioaktiv markierten Protein oder einem lichtemittierenden Protein sondenmarkierte Antikörperfragmente auch verwendet werden, um auf die Bakterien oder Viren, die in Tumoren lokalisiert sind, für den Tumornachweis abzuzielen.
  • Weiterhin kann die antimikrobielle Verbindung mit einem metallbindenden Protein ("Fusion-Peptide-Linked Tumor Targeting Vector Detection" (PLTTVD)) für den Nachweis der Anreicherung von Bakterien, Viren, etc. in Tumoren gemäß der vorliegenden Erfindung verknüpft werden. Nachdem es dem Fusionskonstrukt ermöglicht wurde, an die manipulierten Bakterien etc. im Tumor zu binden, werden metallische Mittel (die für den Nachweis durch MRT, PET oder SPECT verwendet werden können) intravenös injiziert. Die Bindung und die Absorption der metallischen Mittel durch die Bakterien etc. ermöglicht den indirekten Tumornachweis.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Vaccinia-Virus, das eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthält, die einen Zellrezeptor codiert/codieren, der imstande ist, einen Liganden zu binden, und die weiterhin einen Liganden enthält, der an ein Toxin gekoppelt ist (= chimäres Toxin). Geeignete Toxine, die an den Liganden gekoppelt werden können, sind dem Fachmann wohl bekannt. Verschiedene chimäre Toxine sind bereits beschrieben worden. Als Erstes wurde das chimäre Toxin Tfn-CRM 107 hergestellt, indem Transferrin mit dem mutierten Diphtherietoxin CRM 107 kombiniert wurde (Johnson et al., J. Neurosurg. 70 (1989), 240-248), das auf den Transferrin-Rezeptor gerichtet ist. Zweitens wurde das 425.3-PE-Immunotoxin hergestellt, indem der anti-EGF-Rezeptor-Antikörper an vollständiges Pseudomonas-Exotoxin-A gebunden wurde (Myklebust et al., Cancer Res. 53 (1993), 3784-3788). Drittens wurde Tfn-PE hergestellt, indem Transferrin mit dem Pseudomonas-Exotoxin verknüpft wurde (Hall et al., J. Neurosurg. 76 (1992), 838-844; Hall et al., Neurosurgery 34 (1994), 649-656). Es konnte in Tiermodellen und in Humanpatienten gezeigt werden, dass diese chimären Toxine eine Antitumorwirkung gegen Medulloblastome, Kleinzellenlungenkrebs, Gliomheterotransplantate und Hirntumore haben. Demzufolge können beispielsweise rekombinante Vaccinia-Viren entwickelt werden, um spezifisch Transferrin-Rezeptoren auf der Oberfläche von Tumorzellen zu exprimieren, was die Verwendung der chimären Toxine, die auf diese Rezeptoren gerichtet sind, für die Antitumorbehandlung ermöglicht.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung, die umfasst: (a) ein Vaccinia-Virus, das eine DNA-Sequenz enthält, die einen Zellrezeptor codiert, der imstande ist, einen Liganden zu binden, und (b) diesen Liganden, der an ein therapeutisches Protein gekoppelt ist. Geeignete therapeutische Proteine sowie Verfahren für die Erzeugung von therapeutischen Liganden in Form von Fusionsproteinen durch die Verbindung von therapeutischen Proteinen mit Ligandenproteinen sind dem Fachmann wohl bekannt. Beispiele für geeignete therapeutische Proteine werden in den Tabellen 4 und 5 gezeigt. Tabelle 4. Beispiele für Enzym/Pro-Pharmakon-Paare, in denen die Zufuhr des Enzymgens durch intravenös injizierte Mikroorganismen und Zellen erleichtert ist
    Therapeutische Proteine (Enzyme), Arzneimittel, Pro-Pharmaka Beschreibung Literaturhinweise
    Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase (HSV-TK) + Ganciclovir (GCV) am besten bekannte Enzym/Pro-Pharmakon-Kombination Moolten Cancer Res. 1986; 46:5276-5281
    Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase (HSV-TK) + A-5021 (1'S,2'R)-9{[1',2'-Bis(hydroxymethyl)cycloprop-1'-yl]methyl}guanin A-5021 hat eine hochselektive Antiherpes-Wirkung und wurde selektiv durch virale TK in Herpes-Virus-infizierten Zellen phosphoryliert. Die Antiherpes-Wirksamkeit von A-5021 war im Vergleich mit ACV und Penciclovir am stärksten. Hasegawa et al. 2002, Cancer Gene Ther 7:557-562
    Meerrettichperoxidase (HRP) + Indol-3-essigsäure (IAA) Im Fall der Aktivierung durch gereinigte HRP wurde für IAA gezeigt, dass sie die Koloniebildung in Säugetierzellen hemmt, während weder das Enzym noch das Pro-Pharmakon allein in der gleichen Konzentration oder über die gleiche Zeit cytotoxisch war. Der HRP/IAA-induzierte Zelltod war unter normoxischen und anoxischen Bedingungen wirksam. Greco et al. 2000, Cancer Gene Thera. 7:1414-1420
    Bakterielles Enzym Carboxypeptidase G2 (CPG2) + 4-([2-Chlorethyl][2-mesyloxyethyl]amino)benzoyl-L-glutaminsäure (CMDA) oder + 4-[N,N-Bis(2-iodethyl)amino]phenoxycarbonyl-L-glutaminsäure (ZD2767P) CPG2 kann sowohl intrazellulär als auch angebunden an die äußere Oberfläche von Säugetierzellen exprimiert werden, wo es imstande ist, das Senf-Pro-Pharmakon zur Verwendung in einer Suizidgentherapie zu aktivieren Spooner et al. 2000, Cancer Gene Ther. 7:1348-1356 Webley et al. 2001, Br J Cancer 84:1671-1676
    Humanes Cytochrom P450 CYP1A2 + Acetaminophen Acetaminophen ist durch die Cytochrom-P450-vermittelte Erzeugung eines chemisch reaktiven Metaboliten, N-Acetylbenzochinonimin (NABQI), cytotoxisch. Thatcher et al. 2000, Cancer Gene Ther 7:521-525
    Cytochrom P450 4B1 vom Kaninchen (CYP4B1) + 4-Ipomeanol (4-IM) CYP4B1 ist imstande, in niedriger mikromolarer Konzentration in Glioblastomzellen nach der Behandlung mit dem Pro-Pharmakon 4-IM den Tumorzelltod hervorzurufen. Mohr et al. 2000, Cancer Gene Ther. 7:1008-1014; Heuser et al. 2000, Cancer Gene Ther 7:806-12
    Cytochrom P450 4B1 der Ratte (CYP2B1) + Oxaphosporine, wie Ifosfamid (IFO) Das CYP2B1-Genprodukt aktiviert Oxaphosphorine in die Hydroxyform, was zur Bildung der toxischen Produkte Phosphamidsenf und Acrolein führt, die DNA bzw. Proteine alkylieren. Kammertoens et al. 2000, Cancer Gene Ther 7:629-636
    E. coli-Nitroreductase (NTR) + CB 1954 CB1954 ist ein schwaches monofunktionelles Alkylierungsmittel, das durch NTR in die 2- und 4-Hydroxyaminoderivate umgewandelt wird. Zelluläre Thioester, wie Acetylcoenzym A, wandeln anschließend die letzteren Verbindungen in ein starkes bifunktionelles Alkylierungsmittel um, das sowohl proliferierende als auch nicht proliferierende Zellen töten kann. PTX0147 ist das Plasmid, das die NTR des frühen Promotors/Verstärkers des humanen Cytomegalivirus (CMV) exprimiert und das auch das b-Globin zweites Intron und Poly-(A)-Sequenzen und einen G418-selektierbaren Marker trägt. Djeha et al. 2000, Cancer Gene Ther. 7:721-731; Djeha et al. 2001, Mol Ther 3:233-240 Westphal et al. 2000, Cancer Gene Ther 7:97-106 Weedon et al. 2000, Int J Cance 86:848-854
    E. coli-Cytosindeaminase (CD), E. coli-Uracil-Phosphoribosyltransferase (UPRT) + 5-Fluorcytosin (5-FC) Trotz der CD-Expression war eine Zahl von Tumorzellen 5-FC-resistent, was dem Fehlen eines aktiven Cytosintransportsystems in Säugetierzellen und den Abbau des erzeugten 50FU durch die Dihydropyrimidindehydrogenase (DPD) zugeschrieben werden kann. Für eine Verbesserung der Wirkung des CD/5-FC-Systems in der Gentransferstrategie könnte es möglich sein, das Enzymgen, das 5-FU in seine aktiven Formen umwandelt, durch Transduktion einzuschleusen. Einer der Kandidaten ist E. coli UPRT. Es handelt sich um ein Pyrimidin-Salvage-Enzym, und es ist charakteristisch für Bakterien. Es wandelt 5-FU unmittelbar in 5-Fluoruridinmonophosphat (FUMP) im ersten Schritt der 5-FU-Aktivierung um und hat die Fähigkeit, den Aktivierungsweg gegenüber DPD zu verstärken. Koyama et al. 2000, Cancer Gene Ther. 7:1015-1022; Theys et al. 2001, Cancer Gene Ther 8:294-297; Kammertoens et al. 2000, Cancer Gene Ther 7:629-636; Block et al. 2000, Cancer Gene Ther 7:438-445; Bentires-Aly et al. 2000 Cancer Gene Ther 7:20-26; Kawamura et al. 2000, Cancer Gene Ther 7:637-643; Li et al. 1997, Cancer Gene Ther 4:113-117
    Cytochrom P450-Enzyme + Cyclophosphamid (CPA) Lebergewebe hat einen hohen Gehalt an P450-Enzymen, die gegenüber CPA aktiv sind, und es stellt das wesentliche Organ dar, das für die CPA-Aktivierung verantwortlich ist. Aktiviertes CPA, das in der Leber erzeugt wird, fließt durch das Blut und erlangt den Zugang zum Tumorgewebe, wo es seine therapeutischen Wirkungen ausübt. Die CPA-Aktivierung innerhalb eines Tumors kann zu einer hohen, lokalisierten Konzentration an aktivem Arzneimittelmetaboliten an seinem Wirkort führen, wodurch die therapeutischen Wirkungen maximiert werden können, während gleichzeitig die Toxizitäten für den Wirt, die mit der hepatischen Aktivierung des Arzneimittels zusammenhängen, minimiert werden. Huang et al. 2000, Cancer Gene Ther. 7:1034-1042; Kan et al. 2001, Cancer Gene Ther 8:473-482
    Carboxylesterase vom Kaninchen + 7-Ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]carbonyloxycamptothecin (CPT-11) Wenn Neuroblastomzelllinien oder Gemische dieser Zelllinien mit CD34(+)-Zellen 24 h replikationsdefizienten AdRSVrCE in einem Verhältnis von 10:90 ausgesetzt werden und die Zellen anschließend 4 h 1-5 MikroM CPT-11 ausgesetzt werden, führt dies zu einer Erhöhung der Toxizität von CPT-11 um drei. Im Fall von Neuroblastomzelllinien (SJNB-1, NB-1691 und SK-N-SH) zu einer Erhöhung um das etwa 20- bis 50-fache und Auslöschung ihrer klonogenen Fähigkeit Meck et al. 2001, Cancer Res 61:5083-5089
    Pilztyrosinase + Bis-(2-chlorethyl)amino-4-hydroyphenylaminomethanon 28 Ein sterisch anspruchsloses Pro-Pharmakon Bis-(2-chlorethyl)amino-4-hydroxyphenylaminomethanon 28 wurde synthetisiert, und für dieses Pro-Pharmakon wurde festgestellt, dass es mit einer höheren Geschwindigkeit durch Pilztyrosinase zu Tyrosinmethylester oxidiert wird, dessen Carbonsäure das natürliche Substrat der Tyrosinase ist. Jordan et al. 2001, Bioorg Med Chem 9:1549-1558
    E. coli-β-Galactosidase + 1-Chlormethyl-5-hydroxy-1,2-dihydro-3H-benz[e]indol (CC-1065) oder + 1-(1'-Chlorethyl)-5-hydroxy-1,2-dihydro-3H-benz[e]indol Das Pro-Pharmakon, das durch die Galactosidase gespalten wird, zeigt eine hoher Cytotoxizität gegenüber humanen Bronchialkarzinomzellen der Linie A549. Tietze et al. 2001, Chembiochem 2:758-765
    Mutante der Carboxypeptidase G2 (CPG2, Glutamatcarboxypepditase) + 4-[Bis(2-iodethyl)amino]phenyloxycarbonyl-L-glutaminsäure oder + 3-Fluor-4-[bis(2-chlorethyl)amino]benzoyl-L-glutaminsäure oder + 3,5-Difluor-4-[bis(2-iodethyl)amino]benzoyl-L-glutaminsäure Die Aktivierung all dieser drei Pro-Pharmaka führt nicht nur zu einer Vernichtung der Zellen, die die Mutante CPG2 auf der Oberfläche exprimieren, sondern auch der benachbarten Zellen durch einen "By-Stander-Effekt". Friedlos et al. 2002, Cancer Res 62:1724-1729
    Tabelle 5. Weitere Beispiele für therapeutische Proteine, die für die BMPT (Bakterium-vermittelte Proteintherapie), VMPT (Virus-vermittelte Proteintherapie) oder CMPT (Zell-vermittelte Proteintherapie), z. B. mCMPT (Säugetierzell-vermittelte Proteintherapie) gegen Tumore verwendet werden können:
    Therapeutische Proteine, Arzneimittel Beschreibung Literaturhinweise
    rsCD40L Ligand von CD40, sensibilisiert Tumorzellen für die Apoptose, die durch eine Vielzahl von Mitteln, eingeschlossen TNF-α, anti-Fas und cytotoxische Arzneimittel, hervorgerufen wird. Eliopoulus et al. 2000, Mole. Cell. Biol. 20:5503-5515
    Fas-Ligand Sharma et al. 2000, Pharmacol. Ther. 88:333-347
    TRAIL Ligand für Todesrezeptoren, wie DcR2, DcR1, DR5, DR4. Golstein 1997, Curr. Biol. 7:R750-753.
    TNF TNF ist der Ligand für TNFR1, der die Zelltodsignalisierung vermittelt. Baker und Reddy 1996, Oncogene 12:1-9; Theys et al. 1999, Appl Environ Microbiol 65:4295-4300; Lammertyn et al. 1997, Appl Environ Micobiol. 63:1808-1813
    Rekombinante Antikörper
    Anti-GA733-2 sezernierte oder Membranverankerte Form des monoklonalen Antikörpers (mAb) (CO17-1A), der für das Ag (GA733-2) spezifisch ist, das auf der Oberfläche der meisten gastrointestinalen Karzinome vorhanden ist. Paul et al. 2000, Cancer Gene Ther 7:615-623
    Antikrebsmittel Adriamycin (ADM), Cytosin, Arabinosid (Ara-C), cis-Platin, Doxorubicin, Mitomycin C, Fluorouracil, Camptothecin, cis-Diamindichlorplatin(II), CDDP, etc. + anti-Fas-Antikörper Einige Tumorzellen exprimieren das Fas-Antigen auf ihre Oberfläche, und in diesen Zellen wird die Apoptose durch IgM-anti-Fas MoAb ausgelöst. Klinisch relevante Konzentrationen der Antikrebsarzneimittel verstärken die Fas-Rezeptorexpression auf der Plasmamembran von Tumorzellen. Durch die Kombination von ADM oder Ara-C mit IgM-anti-Fas-MoAb wurde das Auslösen der Apoptose in HL60-leukämischen Zellen beträchtlich verstärkt. Wir können daher Bakterien oder Viren verwenden, um das Gen, das den anti-Fas-Antikörper codiert, zuzuführen. Die Ex-Pression des anti-Fas-Antikörpers auf der Oberfläche der Tumorzellen kann diese Zellen für chemotherapeutische Mittel sensibilisieren, was demzufolge zu einer Verbesserung der Effizienz der Chemotherapie führen kann. Nakamura et al. 1997, Anticancer Res. 17:173-179; Micheau et al. 1997, J. Natl. Cancer Inst. 89:783-789; Chang et al. 1998, Osaka City Med. J. 44:173-180; Mizutani et al. 1997, Cancer 79:1180-1189; Jiang et al. 1999, Hepatology 29:101-110; Mizutani et al. 1998, J. Urol. 160:561-570
    Bakterielle Toxine
    Microcin E492 Ein kanalbildendes Bakteriocin mit niedriger Molekularmasse (7887 Da), das von Klebsiella pneumoniae erzeugt wird. Es ist gezeigt worden, dass Microcin E492 die Apoptose in bestimmten humanen Zelllinien auslöst. Die Behandlung mit zVAD-fmk, einem allgemeinen Caspase-Inhibitor, führte zu einer vollständigen Blockierung der cytotoxischen Wirkung dieses Bakteriocins, was für einen Sicherheitsmechanismus sorgen kann, wenn Microcin bei der Antitumorbehandlung verwendet wird. Es wurden Microcin-E492-unempfindliche Mutanten von E. coli K12 isoliert, die als Träger für die Zufuhr von Microcin verwendet werden können (Pugsley et al. 1986, J Gen Microbiol 132:3253-3259). de Lorenzo 1984, Arch Microbiol 139:72-75; Hetz et al. 2002, Proc Natl Acad Sci U S A 99:2696-2701
    Diphtherietoxin (DT) Toxin-markierte monoklonale Antikörper sind verwendet worden, um auf die Oberflächenrezeptoren von Tumorzellen für das Abtöten der Zellen abzuzielen (Kreitman 2001, Curr Pharm Biotechnol 2:313-325; Thomas et al. 2002, J Pediatr Surg 37:539-544). Toxin-markierte Proteinliganden sind außerdem verwendet worden, um auf die Oberflächenrezeptoren von Zellen abzuzielen (Olson et al. 1997, Int J Cancer 73:865-870; Arora et al. 1999, Cancer Res 59:183-188; Wild et al. 2000, Br J Cancer 83:1077-1083).
    Pseudomonas-Exotoxin
    Escherichia coli-Shiga-Toxine Shiga-Toxine, Shiga-ähnliches Toxin I (SLT-I) und Shiga-ähnliches Toxin II (SLT-II) sind zellassoziierte Cytotoxine, für die gezeigt wurde, dass sie imstande sind, Tumorzellen zu töten. Die Toxine töten die Zielzellen, indem sie die Apoptose hervorrufen. O'Brien et al. 1992, Curr Top Microbiol Immunol 180:65-94; Nakao und Takeda 2000, J Nat Toxins 9:299-313
    Escherichia coli-Verotoxin I (VT1) VT1 ist ein von E. coli erzeugtes Toxin in Form einer Untereinheit, das nur gegen (Tumor)-Zelllinien aktiv ist, die den VT1-Rezeptor, Globotriaosylceramid-Gb3, exprimieren. In einem Beispiel für die Wirkung von VT1 ist gezeigt worden, dass VT1 ein humanes Astrocytom-Heterotransplantat in nackten Mäusen eliminiert. Farkas-Himsley et al. 1995, Proc Natl Acad Sci U S A 92:6996-7000; Arab et al. 1999, Oncol Res 11:33-39
    Pflanzentoxine
    Hyperforin Hyperforin ist ein von einer Pflanze stammendes Antibiotikum. Es wurde gezeigt, dass Hyperforin das Tumorwachstum hemmen kann, indem es den durch Mitochondrien vermittelten Apoptoseweg aktiviert. Hostanska et al. 2002, Pharmazie 57:323-331; Schempp et al. 2002, Oncogene 21:1242-1250
  • Da die Tumorgewebe mit Ligandenrezeptoren unter Verwendung von intravenös injizierten manipulierten Bakterien, Viren oder Zellen markiert werden können, ermöglicht das Anbinden von Fusionsproteinen mit einem therapeutischen Liganden an die Ligandenrezeptoren die Ausrichtung der therapeutischen Proteine auf die Tumorgewebe. Intrazelluläre Bakterien und Viren sind besonders gut brauchbar für die Markierung der Tumorzelloberfläche mit gewünschten Rezeptorproteinen. Aufgrund des "Bystander-Effekts" von therapeutischen Proteinen auf benachbarte Zellen können jedoch auch extrazelluläre Bakterien und Säugetierzellen verwendet werden, um die therapeutischen Proteine zuzuführen.
  • Im Fall der GDEPT ("Gene-Directed Enzyme Prodrug Therapy) (siehe weiter unten) können beispielsweise extrazelluläre Bakterien verwendet werden, um das Enzym-Ligand-Fusionsprotein zu sezernieren. Die Tumorzelloberfläche kann mit Hilfe von Viren mit Rezeptorproteinen markiert werden. Nach der intravenösen Zufuhr des Pro-Pharmakons werden nicht nur die Zellen, die die Rezeptoren exprimieren, in dem aktiven Arzneimittel gebadet und von diesem getötet, sondern auch die umgebenden Tumorzellen (die nicht mit Rezeptoren markiert sein müssen) werden getötet.
  • Das Vaccinia-Virus kann auch verwendet werden, um die Tumorzelloberfläche mit Rezeptorproteinen zu markieren. Beispielsweise können die Tumorgewebe spezifisch durch intravenös injizierte manipulierte Vaccinia-Viren infiziert werden, die beispielsweise ein Transferrin-Rezeptorgen (das auch ein einzelnes Peptid für die Zelloberflächenexpression codiert) trägt. Die Expression des Transferrin-Rezeptors auf der Tumorzelloberfläche markiert diese Zellen auch dafür, dass sich die Fusionsproteine mit einem therapeutischen Liganden auf diese Zellen richten ("Targeting"). In diesem Fall handelt es sich bei dem Liganden um das Transferrinprotein, und das therapeutische Protein könnte ein Pseudomonas-Exotoxin (oder jedes sonstige cytotoxische therapeutische Protein) sein. Die Internalisierung des Transferrin-Transferrin-Rezeptorpaares in die Tumorzelle erlaubt die Internalisierung des therapeutischen Proteins, wodurch die Cytotoxizität spezifisch den Tumorzellen zugeführt wird. Das Transferrin/Transferrin-Rezeptor-Paar ist nur eines von vielen Beispielen für Ligand-Rezeptor-Paare, die verwendet werden können. Zusätzlich können mutierte Liganden und mutierte Rezeptoren mit einer hochspezifischen Affinität füreinander verwendet werden, um das Anbinden endogener Proteine zu verhindern.
  • Zusätzliche Beispiele für geeignete Proteine sind das humane Endostatin und das chimäre PE37/TGF-α-Fusionsprotein. Endostatin ist ein Carboxy-terminales Peptid von Collagen XVIII, das charakterisiert worden ist (Ding et al., PNAS USA 95 (1998), 10443). Es ist gezeigt worden, dass Endostatin die Proliferation und die Wanderung von Endothelzellen verhindert, die G1-Arretierung und die Apoptose von Endothelzellen in vitro induziert und in einer Vielzahl von Tumormodellen eine Antitumorwirkung hat. Die intravenöse oder intramuskuläre Injektion von viraler DNA und von in kationischen Liposomen komplexierter Plasmid-DNA, die Endostatin codieren, führt zu einem begrenzten Expressionsniveau des Endostatins in Tumoren. Die intratumorale Injektion von gereinigtem Endostatin zeigt jedoch eine erhebliche Hemmung des Tumorwachstums. Das Pseudomonas-Exotoxin ist ein bakterielles Toxin, das von Pseudomonas aeruginosa sezerniert wird. PE löst seine cytotoxische Wirkung durch die Inaktivierung des Elongationsfaktors 2 (EF-2) aus, was zur Blockierung der Proteinsynthese in Säugetierzellen führt. Das Einzelketten-PE ist funktionell in drei Domänen aufgeteilt: die Domäne Ia ist für das Anbinden an den Zelloberflächenrezeptor erforderlich, die Domäne II ist für die Translokation des Toxins in das Zytosol der Zielzellen erforderlich, und die Domäne III ist durch die Inaktivierung des EF-2 für die Cytotoxizität verantwortlich. PE40 stammt vom Exotoxin des Pseudomonas-Wildtyps, dem die Bindungsdomäne Ia fehlt. Andere Proteine, wie Antikörperfragmente oder Proteinliganden können anstelle der Bindungsdomäne insertiert werden. Dies macht das PE40-Ligand-Fusionsprotein spezifisch für seinen Rezeptor. Eines der hochspezifisch manipulierten chimären Toxine ist das TGF-α/PE40-Fusionsprotein, bei dem der C-Terminus des TGF-α-Polypeptids "in frame" mit dem N-Terminus des PE40-Proteins verknüpft ist. TGF-α ist einer der Liganden des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR), für den gezeigt wurde, dass er bevorzugt auf der Oberfläche einer Vielzahl von Tumorzellen exprimiert wird. Für das TGF-α-PE40- Fusionsprotein ist gezeigt worden, dass es für Tumorzellen mit einer hohen Konzentration an EGFRs auf der Zelloberfläche hochtoxisch ist, während es für die in der Nähe vorhandenen Zellen, die eine geringere Anzahl an Oberflächen-EGFR zeigen, weniger toxisch ist. Die Toxizität des chimären TGF-α-PE40-Proteins hängt von einem proteolytischen Prozessierungsschritt ab, durch den das chimäre Protein in seine aktive Form umgewandelt wird, der von dem Ziel durchgeführt wird. Um das Erfordernis der Proteolyse zu überwinden, ist ein neues chimäres Toxinprotein von Theuer et coll. (J. Biol. Chem. 267 (1992), 16872) konstruiert worden, das keine Prozessierung erfordert. Das neue Fusionsprotein wird als PE37/TGF-α bezeichnet, das gegenüber den Tumorzellen eine höhere Toxizität als das TGF-α-PE40-Fusionsprotein zeigt.
  • In einer besonderen bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen diagnostischen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzung ist der Ligand nicht der natürlich vorkommende Ligand, sondern eine beliebige Verbindung, die imstande ist, spezifisch an den Rezeptor zu binden, zum Beispiel ein Antikörper. Der Ausdruck "Antikörper" bezieht sich vorzugsweise auf Antikörper, die im Wesentlichen aus einem Pool monoklonaler Antikörper mit verschiedenen Epitopspezifitäten bestehen, sowie auf davon verschiedene Zubereitungen monoklonaler Antikörper. Monoklonale Antikörper werden aus einem Antigen hergestellt, das Fragmente des speziellen Rezeptors enthält, unter Anwendung von Verfahren, die dem Fachmann wohl bekannt sind (siehe z. B. Köhler et al., Nature 256 (1975), 495. So wie der Ausdruck "Antikörper" (Ab) oder "monoklonaler Antikörper" (Mab) hier verwendet wird, ist er so zu verstehen, dass er vollständige Moleküle sowie Antikörperfragmente (wie z. B. das Fab-Fragment und das F(ab')2-Fragment) einschließt, die imstande sind, spezifisch an einen Rezeptor zu binden. Dem Fab-Fragment und dem F(ab')2-Fragment fehlt das Fc-Fragment des vollständigen Antikör pers, sie verschwinden schneller aus dem Blutkreislauf und können ein schwächeres nicht-spezifisches Anbinden an Gewebe als ein vollständiger Antikörper haben (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983). Diese Fragmente sind daher bevorzugt, wie auch die Produkte einer Fab-Expressionsbank oder anderer Immunglobulin-Expressionsbanken. Weiterhin schließen die Antikörper der vorliegenden Erfindung chimäre, Einzelketten- und humanisierte Antikörper ein.
  • Antikörper-Liganden sind z. B. in einer Antitumortherapie brauchbar, in der Fusionsproteine (d. h. immuntherapeutische Proteine) aus Antikörpern und therapeutischen Proteinen verwendet werden: In einem ersten Schritt werden die Gene, die die Zelloberflächenrezeptoren codieren, den Tumorzellen in lebenden Organismen mit Hilfe von intravenös injizierten manipulierten Bakterien und Viren zugeführt. Derartige Rezeptoren können z. B. der Transferrin-Rezeptor, der EGF-Rezeptor, der Somatostatin-Rezeptor, etc. sein. Die Überexpression der Rezeptoren auf der Zelloberfläche nach der Infektion mit den Bakterien oder Viren wird verwendet, um die Tumorzellen zu markieren. In einem zweiten Schritt wird ein Fusionsprotein (ein immuntherapeutisches Protein) aus einem Antikörper, vorzugsweise einem Antikörper-Fragment (spezifisch für die überexprimierten Oberflächenrezeptoren) und einem therapeutischen Protein (z. B. jeder Typus von Toxinen, siehe Tabelle 5) hergestellt. Das intravenös injizierte Fusionsprotein kann an die markierten Tumorzellen binden und seine Cytotoxizität gegenüber diesen Zellen in den Tumorgeweben zeigen.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf eine diagnostische und/oder pharmazeutische Zusammensetzung, die ein wie oben beschriebenes Vaccinia-Virus und weiterhin enthält: (a) eine antimikrobielle Verbindung, die mit einem Protein verknüpft ist, das für die Tumortherapie und/oder die Eliminierung von metastatischen Tumoren geeignet ist, und/oder (b) eine antimikrobielle Verbindung, die mit einem nachweisbaren Protein oder einem Protein verknüpft ist, das imstande ist, ein nachweisbares Signal hervorzurufen. Die Antitumortherapie unter Verwendung derartiger Fusionsproteine aus antimikrobiellen Verbindungen (z. B. Peptiden/Proteinen) und therapeutischen Proteinen kann durchgeführt werden, indem zunächst Fusionsgen-Konstrukte hergestellt werden, die Hybridproteine aus antimikrobiellen Peptiden/Proteinen und therapeutischen Proteinen (siehe Tabelle 5, weiter oben) codieren. Nach der Proteinexpression werden die Hybridproteine gereinigt und sind bereit für die intravenöse Injektion. Zweitens werden z. B. lichtemittierende Bakterien, die von den antimikrobiellen Peptiden/Proteinen erkannt werden können und die an diese Peptide/Proteine binden, für eine tumorspezifische Anreicherung intravenös in das Subjekt injiziert. Das spezifische Anbinden der antimikrobiellen Peptide/Proteine an die Bakterien in den Tumoren hilft, die therapeutischen Proteine spezifisch in den Tumoren aufzukonzentrieren, die dadurch eine tumorspezifische Cytotoxizität auslösen können.
  • Weiterhin kann das Protein, das für die Tumortherapie und/oder die Eliminierung von metastatischen Tumoren geeignet ist, ein Enzym sein, das eine inaktive Substanz (Pro-Pharmakon), die dem Organismus verabreicht wurde, in eine aktive Substanz, z. B. ein Toxin, umwandelt, das den Tumor oder die Metastasen tötet (Gene-Directed Enzyme Prodrug Therapy (GDEPT)). Das Prinzip der GDEPT besteht darin, dass ein Enzym/Protein ein systemisch zugeführtes nichttoxisches Pro-Pharmakon in ein aktives toxisches Arzneimittel aktiviert, das cytotoxisch für Tumore ist. Um spezifisch zu sein, ist GDEPT eine Zweischritt-Behandlung. Im ersten Schritt wird das Gen, das ein Fremdenzym codiert, verabreicht und zu dem Tumor gelenkt, wo es unter Verwendung spezifischer Transkriptionselemente exprimiert werden kann. Im zweiten Schritt werden Pro-Pharmaka verabreicht und durch das Fremdenzym, das beim Tumor exprimiert werden, ak tiviert. Wenn die Enzyme/Proteine nur in den Tumoren vorhanden sind, wird das aktive Arzneimittel ebenfalls nur in den Tumoren erzeugt, und es zeigt somit die Cytotoxizität ausschließlich gegenüber den Tumorzellen, während gleichzeitig die systemische Toxizität bei einem Minimum gehalten wird. Das Gen, das das Enzym/Protein codiert, wird den Tumoren spezifisch zugeführt, indem intravenös injizierte manipulierte Bakterien, Viren oder (Säugetier)-Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese Gene können unter der Kontrolle konstitutiver Promotoren oder exogen regulierter, induzierbarer Promotoren stehen, die zusätzlich gewährleisten, dass die Umwandlung des Pro-Pharmakons in das Toxin ausschließlich in dem Zielgewebe stattfindet, d. h. in dem Tumor. Derartige Promotoren sind z. B. die IPTG-, antibiotischen, Hitze-, Ph-, Licht-, Metall-, aerob, Wirtszellen-, Arzneimittel-, Zellzyklus- oder gewebespezifisch induzierbaren Promotoren.
  • Bei dem Enzym kann es sich beispielsweise um die Glucuronidase handeln, die die weniger toxische Form des chemotherapeutischen Mittels Glucuronyldoxorubicin in die toxischere Form umwandelt. Das Gen, das ein derartiges Enzym codiert, wird vorzugsweise durch einen Promotor gesteuert, der ein konstitutiver oder ein induzierbarer Promotor ist. Weitere Beispiele für Enzym/Pro-Pharmakon-Paare, die in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung brauchbar sind, sind in der obigen Tabelle 4 aufgeführt.
  • Weiterhin ermöglicht das Zufuhrsystem der vorliegenden Anmeldung sogar die Anwendung von Verbindungen, die bislang aufgrund ihrer hohen Toxizität, wenn sie systemisch verabreicht werden, nicht für die Tumortherapie verwendet werden konnten. Derartige Verbindungen schließen Proteine, die die Elongationsfaktoren hemmen, Proteine, die an ribosomale Untereinheiten binden, Proteine, die Nucleotide modifizieren, Nucleasen, Proteasen oder Cytokine (z. B. IL-2, IL-12 etc.) ein, da experimentelle Daten vorschlagen, dass die lokale Freisetzung von Cytokinen eine positive Wirkung auf den immunsuppressiven Zustand des Tumors haben könnte.
  • Weiterhin kann das Vaccinia-Virus ein BAC (Bacterial Artificial Chromosome) oder MAC (Mammalian Artificial Chromosome) enthalten, das mehrere oder alle Proteine eines speziellen Weges codiert, z. B. der Antiangiogenese, der Apoptose, der Wundheilung oder der Verhinderung des Tumorwachstums. Zusätzlich kann die Zelle eine am Computer entwickelte Cyber-Zelle oder ein am Computer entwickeltes Cyber-Virus sein, die/das diese Proteine in vielfachen Kombinationen codiert.
  • Für die Verabreichung werden die erfindungsgemäßen Mikroorganismen oder Zellen vorzugsweise mit geeigneten Trägern kombiniert. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt und schließen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Typen von Netzmitteln, sterile Lösungen, etc. ein. Derartige Träger können durch herkömmliche Verfahren formuliert werden und dem Subjekt in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Verabreichung der Mikroorganismen oder Zellen kann auf unterschiedlichen Wegen durchgeführt werden, z. B. durch die intravenöse, intraperitoneale, subkutane, intramuskuläre, topische oder intradermale Verabreichung. Der bevorzugte Weg der Verabreichung ist die intravenöse Injektion. Der Verabreichungsweg hängt selbstverständlich von der Beschaffenheit des Tumors und der Art der Mikroorganismen oder Zellen ab, die in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten sind. Die Dosierung bei der Behandlung wird von dem behandelnden Arzt auf der Basis von verschiedenen klinischen Faktoren festgelegt. Wie auf dem Fachgebiet der Medizin wohl bekannt ist, hängen die Dosierungen für jeden einzelnen Patienten von vielen Faktoren ab, eingeschlossen sind hier die Größe, die Körperoberfläche, das Alter, das Geschlecht, die spezielle zu verabreichende Verbindung, der Zeitpunkt der Verabreichung und der Weg der Verabreichung, die Art, Größe und Lokalisierung des Tumors, der allgemeine Gesundheitszustand und andere Arzneimittel, die gleichzeitig verabreicht werden.
  • Bevorzugte Tumore, die mit dem erfindungsgemäßen Vaccinia-Virus behandelt werden können, sind Blasentumore, Brusttumore, Prostatatumore, Hirntumore, Darmtumore, Lungentumore, Eierstockkarzinome und Bauchspeicheldrüsenkarzinome; Lebertumore, Hauttumore.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1: Externe bildgebende Darstellung der GFP-Expression in subkutanen C6-Gliomtumoren in nackten Mäusen
  • C6-Gliomzellen (5 × 105) wurden. subkutan in den rechten seitlichen Oberschenkel implantiert. Nach einer festgelegten Anzahl von Tagen nach der Implantation der Tumorzellen wurden die Tiere intravenös mit 1 × 108 pfu rVV-ruc-gfp-Viruspartikeln infiziert. Die GFP-Expression wurde unter einem Fluoreszenzstereomikroskop beobachtet. Hellfeldbilder (oben), Fluoreszenzbilder (Mitte) und Überlagerungsbilder aus einem Hellfeldbild und einem Fluoreszenzbild (unten) von subkutanen Gliomtumoren werden gezeigt. Das GFP-Signal kann in Tumoren beobachtet werden, die nur eine Größe von 22 mm3 haben (B-B''), oder die nur 18 Tage alt sind (mit einer Größe von etwa 2500 mm3) (A-A''). In älteren Tumoren wurde die GFP-Expression in "Flecken"-ähnlichen Mustern gesehen (angezeigt durch die Pfeile in A'). Die Markergenexpression in dem Tumor des gleichen Tieres kann kontinuierlich 4 (C-C''), 7 (D-D'') und 14 (E-E'') Tage nach der intravenösen viralen Injektion beobachtet werden. (Balken = 5 mm.)
  • 2: Sichtbarmachung der Tumorangiogenese
  • C6-Gliomzellen (5 × 105) wurden subkutan in den rechten seitlichen Oberschenkel nackter Mäuse implantiert. Zehn Tage nach der Implantation der Tumorzellen wurden die Tiere intravenös mit 1 × 108 pfu rVV-ruc-gfp infiziert. Die GFP-Expression wurde 7 Tage nach der Virusinjektion beobachtet. Die Gefäßneubildung an der Oberfläche des subkutanen C6-Gliomtumors wird gegen den hellgrünen Fluoreszenzhintergrund in dem Tumor nachfolgend auf die Vaccinia-vermittelten Genexpressionen gezeigt. Hellfeld-(A), Fluoreszenz-(B) und Hellfeld-Fluoreszenz-Überlagerungsbilder (C) des subkutanen Gliomtumors werden dargestellt. (Balken = 5 mm.)
  • 3: Expression von GFP in subkutanem Gliomtumor des gleichen Tieres
  • Fünf Tage nach der subkutanen Implantation von 5 × 105 C6-Gliomzellen in den rechten seitlichen Oberschenkel wurden 108 rVV-ruc-gfp-Viruspartikel intravenös injiziert. Fünf Tage nach der Virusinjektion wurde das Tier anästhesiert und für die Analyse der GFP-Expression unter dem Fluoreszenzmikroskop getötet. Der Tumor wurde extern (A-K) sichtbar gemacht, mit der zurückgezogenen darüber liegenden Haut (B-B''), im Querschnitt (C-C'') und in dem amputierten Bein (D-D''). Das Hellfeldbild (A), das Fluoreszenzbild (B) und das Überlagerungsbild (C) aus Hellfeldbild und Fluoreszenzbild des subkutanen Gliomtumors werden dargestellt. Die stärksten GFP-Expressionen werden als Flecken gesehen, die entlang der äußeren Oberfläche des Tumors auf der rechten Seite lokalisiert sind (Doppelpfeile in C-C''). Der scharfe Unterschied zwischen der GFP-Expressionen im Tumorgewebe und in dem normalen Muskelgewebe (Pfeile in D-D'') ist deutlich sichtbar. Die Sternchen markieren die zurückgezogene Haut (B-B'' und D-D''). (Balken = 5 mm.)
  • 4: Hellfeldbild (A) und Fluoreszenzbild (B) der Tumorzellen, die GFP exprimieren
  • Es wurden Gefrierschnitte (Dicke 30 μm) der Gliomtumorgewebe von einer nackten Maus hergestellt, die eine intravenöse Injektion von 1 × 108 rVV-ruc-gfp-Viruspartikeln erhalten hatte. (Balken = 50 μm.)
  • 5: Schwachlichtbild der anästhesierten nackten Maus, um den Ort der von Renilla-Luciferase ausgelösten Lichtemission in Gegenwart des intravenös injizierten Substrats Coelenterazin zu zeigen (5 μg Ethanollösung)
  • 6: Beobachtung der tumorspezifischen viralen Infektion auf der Basis der GFP-Genexpressionen in einer Vielzahl von Tumormodellen
    eingeschlossen der subkutane humane PC-3-Prostatatumor (A-A'') und der humane MCF-7-Brusttumor (B-B'') in nackten Mäusen, der intrakraniale C6 Gliomtumor der Ratte (C-C'', die Pfeile weisen auf den Ort des Tumors hin) in Lewis-Ratten und des MB-49 Blasentumors der Maus (D-D'') in C57-Mäusen. Die Tiere wurden 7 Tage nach der intravenösen Injektion von 1 × 108 rVV-ruc-gfp-Viruspartikeln beobachtet. Die Hellfeldbilder (oben), die Fluoreszenzbilder (Mitte) und die Überlagerungsbilder aus Hellfeldbild und Fluoreszenzbild (unten) des Tumors werden dargestellt. (Balken = 5 mm.)
  • 7: Beobachtung der Vaccinia-vermittelten GFP-Expression in einem Brusttumormodell
  • Einer nackten Maus, die den Brusttumor trägt, wurden intravenös 1 × 108 rVV-ruc-gfp-Viruspartikel injiziert. Sowohl der primäre Tumor (A-A', B-B'' und C-C'') als auch der metastasierte Tumor (D-D'', E-E'' und F-F'') wurden extern sichtbar gemacht (A-A'' und D-D''), wobei die darüber liegende Haut entfernt wurde (B-B'' und E-E''), und wenn sie offengelegt waren (C-C'' und F-F''), wurden sie in einem Satz von Hellfeldbildern, Fluoreszenzbildern (') und Überlagerungsbildern ('') aus Hellfeldbild und Fluoreszenzbild sichtbar gemacht. Die GFP-Expression in Lungenmetastasen im gleichen Tier wurde ebenfalls sichtbar gemacht (G-G''). (Balken = 5 mm (A-A'' bis F-F''), und Balken = 1 mm (G-G'').
  • 8: Sichtbarmachung des Verschwindens der lichtemittierenden Bakterien aus den nackten Mäusen auf der Basis des Nachweises der Lichtemission unter der bildgebenden Schwachlichtkamera
  • Nackten Mäusen wurden 107 Zellen abgeschwächte S. typhimurium(A, B) und V. cholera-Bakterien (C, D) injiziert. Beide Stämme waren mit pLITE201 transformiert, das das lux-Operon trägt. Die Photonen wurde 20 min (A, C) und 2 Tage (B, D) nach den Injektionen der Bakterien erfasst.
  • 9: Einwandern der abgeschwächten Bakterien in Gliomtumore
  • Nackten Mäusen mit einem C6-Gliomtumor im rechten Hinterbein wurden intravenös 107 abgeschwächte S. typhimurium- (A, D) und V. cholera-Bakterien (E-H) injiziert, die beide mit der pLITE201-Plasmid-DNA transformiert waren, die das lux-Operon codiert. Die Photonen wurden über eine Minute unter der bildgebenden Schwachlichtkamera erfasst. Mäuse, denen S. typhimurium injiziert wurde, zeigten sofort eine Lumineszenz im gesamten Tier (A). Im Gegensatz hierzu war die Lumineszenz in den Mäusen, denen V. cholera injiziert wurde, im Leberbereich (E) sichtbar. Zwei Tage nach der Injektion der Bakterien zeigten beide Gruppen von Mäusen nur im Tumorbereich (B, F) eine Lumineszenz. Die Lichtemission in den Tumoren, die mit S. typhimurium infiziert waren, nahm vier (C) und sechs (D) Tage nach der Injektion der Bakterien langsam ab. Tumore, die mit V. cholera infiziert waren, zeigten eine enorm erhöhte Lichtemission vier (G) und sechs (H) Tage nach der Injektion, was auf eine fortgesetzte Replikation der Bakterien in den Tumorgeweben hinwies.
  • 10: Einwandern der Bakterien in Brusttumore
  • Nackte Mäuse mit Brusttumoren im rechten Brustfettpolster wurden intravenös 107 abgeschwächte V. cholera-Bakterien (A-D) oder 107 E. coli-Bakterien (E-F) injiziert, die mit der pLITE201-Plasmid-DNA transformiert waren, die das lux-Operon codiert. Die Erfassung der Photonen erfolgte während einer Minute in einer bildgebenden Schwachlichtkamera. Zwanzig Minuten nach der Zufuhr der Bakterien wurden lumineszierende V. cholera-Bakterien (A) beobachtet. Achtundvierzig Stunden nach der Injektion wurde eine Lichtemission im primären Brusttumor im rechten Brustbereich und in einem metastatischen Tumor (Pfeil) im linken Brustbereich und in der Schnittwunde (B) beobachtet. Am fünften Tag war die Lichtemission nur in den Tumorbereichen und nicht in der Wunde (C) sichtbar. Acht Tage nach der Injektion der Bakterien war die Lumineszenzaktivität des kleineren Tumorbereichs erloschen, sie blieb jedoch stark in dem primären Brusttumor (D). Das Einwandern von E. coli in die Brusttumore in nackten Mäusen wurde ebenfalls zwei Tage nach der intravenösen Injektion von Bakterien beobachtet (E: Seitenansicht, F: Bauchansicht).
  • 11: Einwandern von Bakterien in Blasentumore in C57-Mäusen
  • C57-Mäusen wurden 107 abgeschwächte V. cholera-Bakterien intravenös injiziert, die mit pLITE201, das das lux-Operon codiert, transformiert waren. Neun Tage nach der Zufuhr der Bakterien wurde eine Lumineszenz im Blasenbereich des unversehrten Tiers festgestellt (A). Das Tier wurde getötet, und es wurde ein Bauchschnitt vorgenommen, um die Blase freizulegen. Die Lichtemission war auf den Bereich der Blase (B) beschränkt. Mit der Entfernung der Blase (C) aus der Maus war die vollständige Quelle der Lichtemission entfernt (D) worden, was die Überlagerung des Schwachlichtphotonenemissionsbildes über das photographische Bild der herausgeschnittenen Blase zeigt.
  • 12: Einwandern von Bakterien in Hirngliomtumore in Lewis-Ratten
  • Lewis-Ratten wurden 108 Zellen abgeschwächte V. cholera-Bakterien intravenös injiziert, die mit pLITE201 transformiert waren, das das lux-Operon codiert. Vierundzwanzig Stunden nach der Injektion der Bakterien wurde im Kopfbereich des unversehrten Tiers während der Sichtbarmachung unter der bildgebenden Schwachlichtkamera eine schwache Lumineszenz festgestellt. Die Tiere wurden getötet, und ihr Gehirn wurde entfernt. Die von Ratten mit (A) und ohne (B) Hirntumore emittierten Photonen wurden über eine Minute erfasst. Eine starke Lumineszenz wurde in den Bereichen des Gehirns der Ratte mit dem Hirntumor bestätigt (in A mit Pfeilen markiert). Die Lumineszenz fehlte vollständig in den Kontrollhirngeweben (B).
  • 13: Transformierte humane Fibrosarkomzellen wandern in subkutane Gliomtumore in nackten Mäusen ein
  • Nackten Mäusen mit subkutanen Gliomtumoren wurden 5 × 105 humane Fibrosarkomzellen intravenös injiziert, die permanent mit einem Retrovirus, das von pLEIN stammt, transformiert waren. Sieben Tage nach der Injektion wurden die Tiere anästhesiert und unter einem Fluoreszenzstereomikroskop beobachtet. Fluoreszierende Zellen wurden ausschließlich in dem Tumorbereich der unversehrten Mäuse durch die Haut beobachtet (A1-3). Wenn die Tumorgewebe freigelegt wurden, indem die darüber liegende Haut (B1-3) zurückgezogen wurde, und in Querschnitten der Tumore (C1-3) wurden in verschiedenen Bereichen fluoreszierende Flecken sichtbar. Die genaue Untersuchung der Organe der Mäuse zeigte das Vorhandensein von kleinen Anhäufungen aus fluoreszierenden Zellen in der Lunge der Tiere, was die Affinität der Fibrosarkomzellen für die Lunge zusätzlich zu den tumorösen Geweben nachweist (D1-3). (Balken = 5 mm (A1-C3), = 1 mm (D1-D3)).
  • 14: Einwandern von abgeschwächten Listeria monocytogenes in subkutane Prostatatumore
  • Nackten Mäuse mit einem subkutanen humanen PC3-Prostatatumor im rechten hinteren Bein wurden 107 abgeschwächte L. monocytogenes-Bakterien intravenös injiziert, die mit psod-gfp-Plasmid-DNA, die die gfp-cDNA trägt, transformiert waren. Eine GFP-Fluoreszenz wurde unter dem Fluoreszenzstereomikroskop beobachtet. Siebenundzwanzig Stunden nach der Injektion der Bakterien wurde das GFP-Signal ausschließlich im Tumorbereich nachgewiesen. Der Tumor wird in einem Satz von Bildern gezeigt: einem mit sichtbarem Licht aufgenommenem Bild (A), einem Fluoreszenzbild (B) und einem Überlagerungsbild aus dem mit sichtbarem Licht aufgenommenen Bild und dem Fluoreszenzlichtbild (C). (Balken = 5 mm.) Die vorliegende Erfindung wird durch die Beispiele 1 und 2 erklärt. Die Beispiele 3–7 sind Vergleichsbeispiele.
  • Beispiel 1: Materialien und Verfahren
    • (A) Bakterienstämme. Die verwendeten Bakterienstämme waren abgeschwächte Salmonella typhimurium (SL7207 hisG46, DEL407[aroA544::Tn10]), abgeschwächte Vibrio cholerae (Bengal 3 Serotyp 0139, M010 DattRS1), und abgeschwächte Listeria monocytogenes (D2 mpl, actA, plcB). Die Bakterienstämme wurden freundlicherweise von Prof. W. Göbel (Universität Würzburg, Deutschland) zur Verfügung gestellt.
    • (B) Plasmidkonstrukte. Das Plasmid pLITE201, das die luxCDABE-Kassette enthält, wurde von Dr. Marines, Biotech 24, 1998, 56-58, erhalten). Das Plasmid pXy1A-dual mit der Operon-Sequenz von gfp-cDNA, lux AB, lux CD und lux E unter der Kontrolle des Xylose-Promotors wurde freundlicherweise von Dr. Phil Hill (Universität Nottingham, UK) zur Verfügung gestellt.
    • (C) Transformation der Bakterien Die Bakterien wurden durch Elektroporation transformiert.
    • (D) Tumorzelllinien. Die mit Nitrosoharnstoff induzierte C6-Gliomzelllinie der Ratte (ATCC, Rockville, MID) wurde in RPMI-1640-Medium (Cellgro, Mediatech, Inc., Herndon, VA) kultiviert, das mit 10% (Vol.-%) FBS und 1 × Penicillin/Streptomycin ergänzt war. Die humane PC3-Prostatakarzinomzelllinie (ATCC, Rockville, MD) und die MB-49-Blasentumorzelllinie der Maus und die 9L-Gliomzellen der Ratte wurden in DMEM-Medium (Cellgro, Mediatech, Inc., Herndon, VA) gehalten, das mit L-Glutamin und 10% (Vol.-%) FBS ergänzt war. HT1080-Fibrosarkomzellen (ATCC, Manassas, VA) wurden in essentiellem F12-Minimalmedium (Cellgro, Mediatech, Inc., Herndon, VA) kultiviert, das mit 10% FBS und 1 × Penicillin/Streptomycin ergänzt war. Die humanen MCF-7-Brustkarzinomzelllinie (ATCC, Rockville, MD), die permanent mit einem Plasmid transformiert ist, das die Pro-IGF-II-cDNA trägt (erhalten von Dr. Daisy De Leon, Loma Linda Universität, Loma Linda, CA), wurde in DMEM/F12-Medium kultiviert, das mit 5% FBS und 560 μg/ml G418 (Life Technologies, Grand Island, NY) ergänzt war.
    • (E) Erzeugung und Vermehrung von Retroviren für die Erzeugung einer lichtemittierenden, stabil transformierten Zelllinie. PT67-Packzellen (Clontech, Palo Alto, CA) wurden in DMEM-Medium kultiviert, das mit 10% (Vol.-%) FBS ergänzt war. Bei einer 70%-igen Konfluenz wurden die PT67-Zellen mit pLEIN (Clontech, Palo Alto, CA) unter Verwendung des Calciumphosphatfällungsverfahrens (Profection Mammalian Transfection Systems, Promega, Madison, WI) über 12 Stunden transformiert. Zu diesem Zeitpunkt wurde frisches Medium nachgefüllt. Der retrovirale Überstand, der von den PT67-Zellen 48 Stunden nach der Transformation gesammelt wurde, wurde durch ein 0,45 μm-Filter filtriert und zu HT1080-Zielzellen zusammen mit Polybren bis zu einer Endkonzentration von 4 μg/ml gegeben. Das Medium wurde nach 24 Stunden ersetzt, und die Zellen wurden mit G418-Selection in einer Menge von 400 μg/ml, die schrittweise auf 1200 μg/ml erhöht wurde, behandelt.
    • (F) Vermehrung des rekombinanten Vaccinia-Virus. Der Vaccinia-Virus-Lister-Stamm (LIVP) wurde als Wildtypvirus verwendet. Das rekombinante Vaccinia-Virus rVV-ruc-gfp wurde konstruiert, indem über eine homologe Rekombination die ruc-gfp-Kassette (Wang et al., Proc. Biolumin. Chemilumin. 9, 1996, 419-422) in das Vaccinia-Virus-Genom insertiert wurde. Das Virus wurde in CV-1-Zellen durch die Zugabe von Viruspartikeln bei einer "Multiplicity of Infection" (MOI) von 0,1 pfu/Zelle zu CV-1-Zellmonoschichten, auf die eine Inkubation bei 37°C über 1 h mit kurzem Schütteln alle 10 min folgte, amplifiziert. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Flüssigkeit des Überstands mit Viruspartikeln entfernt, und die Zellmonoschichten wurden einmal mit serumfreiem Medium gewaschen. Dann wurde vollständiges Wachstumsmedium zugegeben, und die Zellen wurden bei 37°C inkubiert. rVV-ruc-gfp-Virionen, die in CV-1-Zellen vermehrt wurden, wurden mit Hilfe eines Saccharosegradienten gereinigt. Ein Plaqueassay wurde 72 h nach der Infektion verwendet, um den Titer an rekombinantem Virus durch die Färbung der Zellen mit einer 50%-igen Kristallviolettlösung in Ethanol zu ermitteln.
    • (G) Erzeugung von Mäusen, die Tumorimplantate tragen. Fünf bis sechs Wochen alte männliche BALB/c athymische nu/nu-Mäuse (25–30 g Körpergewicht) und Lewis-Ratten (250–300 g Körpergewicht) wurden von Harlan (Frederick, MD) erworben. C57BL/6J Min/+-Mäuse wurden von Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) erhalten, Min (multiple intestinal neoplasia) ist ein autosomales dominantes Merkmal, das eine Nonsens-Mutation in Codon 850 des murinen Apc-Gens einschließt, das diese Tiere für die spontane Entwicklung eines Darmadenoms anfällig macht. Um Tumore in nackten Mäusen zu erhalten, wurden C6-Gliomzellen gezüchtet, geerntet, und die Zellzahl wurde durch die Trypan-Blau-Ausschlussmethode ermittelt. Ein Desinfektionsmittel wurde auf der Hautoberfläche angewendet, anschließend wurden etwa 5 × 105 Zellen in 100 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendiert, und die Suspension wurde subkutan in den rechten seitlichen Oberschenkel jeder Maus injiziert. Das Tumorwachstum wurde überwacht, indem die Größe des Tumors mit einer digitalen Schieblehre aufgezeichnet wurde. Das Tumorvolumen (mm3) wurde mit Hilfe der Formel (L × H × B)/2 abgeschätzt, worin L die Länge, B die Breite und H die Höhe des Tumors in mm ist. Intracerebrale Gliomtumore wurden erzeugt, indem C6-Gliomzellen in den Kopf der Ratten injiziert wurden. Vor der Injektion wurden die Ratten mit Natriumpentobarbital (Nembutal® Sodium solution, Abbot Laboratories, North Chicago, IL; 60 mg/kg Körpergewicht) anästhesiert. Ein Einschnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut (0,5–1 cm) wurde erzeugt, die Haut wurde zurückgezogen, und ein 1 mm-Bohrloch wurde in dem Schädel an einer Stelle 2 mm links und 2,5 mm hinter dem Brigma erzeugt. Die Tumorzellen wurden in eine Insulinspritze pipettiert, die mit einer 29-Messnadel ausgestattet wurde, die dann in einem stereotaktischen Halter montiert wurde. Die Nadel wurde vertikal durch das Bohrloch bis auf eine Tiefe von 3 mm eingeführt. Nach der Injektion von 5 × 105 C6-Zellen in einem 10 μl-Volumen in das Gehirn wurde die Nadel 15 s an Ort und Stelle gehalten und dann herausgezogen. Der Hautschnitt wurde mit Operationsklemmen verschlossen. Mäuse, die subkutane Prostatatumore trugen, wurde über einen Zeitraum von einem Monat nach der subkutanen Implantation von 3 × 106 humanen PC3-Prostatazellen erzeugt. MB-49-Blasentumorzellen der Maus wurden in die Blase der C57-Maus implantiert, um Tiere mit Blasentumoren zu erzeugen. Für die Erzeugung von Tieren mit Brustkrebs (Tieren und DeLeon, eingereicht für die Veröffentlichung) wurden nackten weiblichen Mäusen zunächst 0,72 mg 17β-Östradiolpellets (Innovative Research, Rockville, MD) mit einer Freisetzung über 90 Tage in die Haut implantiert, um die Entwicklung des Brusttumors und die Bildung von Metastasen zu erleichtern. Einen Tag nach der Implantation des Östrogenpellets wurden 1 × 106 humane MCF-7-Brustkarzinomzellen, die mit pro-IGF-II transformiert waren (Dull et al., Nature 310 (1984), 777-781) in das Brustfettpolster implantiert. Für orthotope Transplantate wurden Tumore, die sich aus implantierten Zellen entwickelt hatten, herausgeschnitten und in 1-mm3-Würfel zerkleinert für die Gewebetransplantation in das Brustfettpolster.
    • (H) Renilla-Luciferase-Assay in lebenden Tieren. Vor jedem Renilla-Luciferase-Assay wurden die Mäuse mit Nembutal (60 mg/kg Körpergewicht) anästhesiert. Die Renilla-Luciferase-Aktivitäten wurden nach der intravenösen Injektion eines Gemisches aus 5 μl Coelenterazin (0,5 μg/μl verdünnte Ethanollösung) und 95 μl Luciferase-Assay-Puffer (0,5 M NaCl; 1 mM EDTA; und 0,1 M Kaliumphosphat, pH 7,4) ermittelt. Unversehrte lebende Tiere wurden dann in einer Dunkelkammer unter Verwendung der Schwachlichtvideokamera ARGUS 100 von Hamamatsu abgebildet, und die Bilder wurden unter Verwendung der Image Pro Plus 3.1-Software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) aufgezeichnet. Das Falschfarbenphotonenemissionsbild wurde dem Graustufenbild des Tiers überlagert, um den Ort der Lichtemission genau zu lokalisieren.
    • (I) Nachweis der Lumineszenz und der Fluoreszenz. Unmittelbar vor der bildgebenden Darstellung wurden die Mäuse und Ratten mit Nembutal® (60 mg/kg Körpergewicht) anästhesiert. Die Tiere wurden in der Dunkelkammer angeordnet, um die Photonzählung durchzuführen und die Überlagerungsbilder aufzuzeichnen (ARGUS 100, Hamamatsu, Hamamatsu, Japan). Die Erfassung der Photonen erfolgte über eine Minute aus der Bauchansicht und der Rückenansicht der Tiere. Dann wurde ein Lichtbild aufgezeichnet, und das Schwachlichtbild wurde dann über das Lichtbild gelegt, um den Ort der Lumineszenzaktivität aufzuzeichnen. Die Abbildung der GFP-Expression in Tumoren von lebenden Tieren wurde unter Verwendung eines Stereofluoreszenzmikroskops MZ8 von Leica durchgeführt, das mit einer Stromversorgung für eine Quecksilberlampe und einem GFP-Filter (Anregung bei 470 nm) ausgerüstet war. Die Bilder wurden unter Verwendung einer Digitalfotokamera DKC-5000 3CCD von Sony erfasst.
    • (J) Histologie der Tumorgewebe. Die Tiere wurden im anästhesierten Zustand mit einer Überdosis Nembutal® eingeschläfert. Die interessierenden Gewebe wurden entnommen, in Tissue-Tek-OCT-Masse (Miles Scientific, Naperville, IL) eingebettet und unmittelbar ohne Fixierung in flüssigem Stickstoff eingefroren. Gefrierschnitte wurden bei –20°C unter Verwendung eines Kryostaten Cryocut 1800 von Reichert-Jung geschnitten. Die GFP-Fluoreszenz der Gewebe wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop von Leica beobachtet, und die Bilder wurden unter Verwendung der Photoshop-Software aufgezeichnet.
  • Beispiel 2: Ergebnisse, die bei der intravenösen Injektion von rekombinantem Vaccinia-Virus rVV-ruc-gfp in Mäuse erhalten wurden
  • (A) Beobachtung der virusvermittelten Markergenexpression in immundefizienten Mäusen
  • Vaccinia-Viren (1 × 108 pfu), die die Renilla-Luciferase-GFP-Fusionsexpressionskassette tragen (rVV-ruc-gfp) tragen, wurden intravenös in nackte Mäuse, die keine Tumoren aufwiesen, eingebracht. Die Tiere wurden über einen Zeitraum von zwei Wochen einmal alle 3 Tage unter der bildgebenden Schwachlichtkamera beobachtet, um die Luciferase-katalysierte Lichtemission unmittelbar nach der intravenösen Injektion von Coelenterazin zu überwachen, und sie wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um die GFP-Expression sichtbar zu machen. Wenn die Tiere von außen abgebildet wurden, wurde weder eine sichtbare Lumineszenz noch eine grüne Fluoreszenz nachgewiesen, abgesehen von bestimmten Stellen, die kleine Hautverletzungen hatten. Diese Lumineszenz- und Fluoreszenzsignale verschwanden nach einigen Tagen, sobald die Verletzungen ausgeheilt waren. Die Tiere wurden eine Woche und zwei Wochen nach der viralen Infektion getötet, und ihre Organe wurden entfernt und im Hinblick auf das Vorhandensein von Lumineszenz- und GFP-Fluoreszenzsignalen untersucht. Eine Woche nach der viralen Injektion konnte im Gehirn, der Leber, den Lungen, der Milz, den Nieren oder den Hoden weder eine Lumineszenz noch eine grüne Fluoreszenz nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass das rVV-ruc-gfp-Virus nach der Injektion keine Organspezifität zeigte und dass das Virus anscheinend kurz nach der systemischen Zufuhr über den Blutstrom durch das Immunsystem entfernt wurde.
  • (B) Sichtbarmachung der Vaccinia-Virus-vermittelten Markergenexpression in Gliomtumoren von lebenden nackten Mäusen
  • Die Verteilung der injizierten Vaccinia-Viren in nackten Mäusen, die subkutan implantierte C6-Gliomtumore tragen, wurde untersucht. Nackten Mäusen mit Tumoren mit einer Größe von etwa 500 mm3 wurden 1 × 108 pfu rVV-ruc-gfp-Virus intravenös injiziert. Sieben Tage nach der Virusinjektion wurden die Tiere hinsichtlich der GFP-Expression unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um das Vorhandensein einer Virusinfektion und die Vermehrung in den Tumoren, die auf eine Größe von etwa 2500 mm3 angewachsen waren, nachzuweisen. Die grüne Fluoreszenz wurde überraschenderweise ausschließlich in den Tumorbereichen in den lebenden Tieren nachgewiesen. Sieben Tage nach der viralen Injektion war die GFP-Fluoreszenz sehr intensiv in einem fleckenartigen Muster lokalisiert, das auf den Tumorbereich beschränkt war (1A–A''). Diese Flecken, die häufig an dem Ende von Blutgefäßverzweigungen gesehen wurden, könnten auf eine lokale virale Infektion von Tumorzellen hingewiesen haben, die die undichten Enden von Kapillargefäßen umgeben. Während der Echtzeitbeobachtung der gleichen Tumore begann das GFP-Signal aus der Mitte dieser Flecken zu verschwinden, und neue, grün fluoreszierende Zentren erschienen in der Form von Ringen im Randbereich der schwächer werdenden Flecken. Die neuen Stellen mit einer intensiven GFP-Fluoreszenz könnten das Ergebnis eines Fortschreitens der viralen Infektion in benachbarte Zellen innerhalb des Tumors während des Tumorwachstums und der Tumorausdehnung gewesen sein. Nach der sorgfältigen Untersuchung der Mäuse wurde mit Ausnahme des Tumorbereichs keine nachweisbare grüne Fluoreszenz an anderen Stellen auf der Körperoberfläche oder in den zerlegten Organen gesehen. Dieses Experiment zeigte deutlich, dass ein voll entwickelter Tumor mit den markierten Vaccinia-Viren einfach lokalisiert werden könnte, auf der Basis der Lichtemission, und es zeigte außerdem die Affinität der Viruspartikel für das Tumorgewebe.
  • Um nachzuweisen, ob die Tumorgröße und die Gefäßbildung entscheidende Faktoren für den Verbleib der Viren in Tumoren sind, wurden nackten Mäusen 1 × 108 rVV-ruc-gfp-Vaccinia-Viruspartikel einen Tag nach der subkutanen C6-Zellimplantation intravenös injiziert. Überraschenderweise wurde 4 Tage nach der viralen Injektion die GFP-Expression in 5 Tage alten C6-Tumoren gesehen, die ein Volumen von etwa 25 mm3 hatten (1B–B''). Die Untersuchung der Ausrichtung auf Tumore mit markiertem Vaccinia-Virus durch die Sichtbarmachung der GFP-Expression in implantierten Tumoren, die jünger als 5 Tage waren, war in lebenden Mäusen nicht durchführbar, da ein ausreichendes Niveau der Markergenexpression etwa 4 Tage benötigte, um den Nachweis unter einem Fluoreszenzmikroskop zu erlauben.
  • Die Erkenntnis, dass die Injektion von rVV-ruc-gfp-Vaccinia-Viren in den Blutstrom des Wirtes zu einer GFP-Expression und einer Anreicherung in Tumoren führt, die für einen nichtinvasiven Tumornachweis geeignet ist, ermöglichte es uns, den Eintritt und den Replikationsvorgang des Virus in dem gleichen Tier in Echtzeit zu verfolgen (1C–C'', D-D'' und E-E''). Ein kontinuierlich zunehmendes Niveau der GFP-Fluoreszenz wurde in dem gleichen Tier über 20 Tage nach der viralen Injektion beobachtet, wobei es sich um den Zeitraum handelte, der angesetzt war, bevor die Tiere getötet werden. Eine derartige Zunahme der nachweisbaren Fluoreszenz war ein Hinweis auf eine sehr starke virale Replikation in dem Tumorgewebe, das die Funktion einer schützenden, immunprivilegierten Umgebung für die virale Replikation zu haben scheint. Die virale Replikation in den Tumoren wurde durch die Bestimmung des Virustiters und der Lichtemission der isolierten Viruspartikel in Zellkulturen verifiziert. Interessanterweise waren die Lokalisierung der Blutgefäße und die Gefäßneubildung innerhalb des Randbereichs des anwachsenden Tumors leicht sichtbar, und sie wurden durch die externe Sichtbar machung gegenüber einem hellen, grün fluoreszierenden Hintergrund bestätigt (1A–A'', D-D'', E-E'' und 2).
  • Für die Ermittlung des Ortes der viralen Infektion innerhalb der Tumore wurden die Tiere getötet, und die Haut über dem Tumor wurde sorgfältig zurückgezogen, um den Tumor freizulegen. In dem freigelegten Tumor wurde für die GFP-Fluoreszenz gefunden, dass sie ausschließlich im Tumorgewebe konzentriert war (3B–B'' und D-D''). Die nicht-tumorösen Oberschenkelmuskel zeigten keinerlei Fluoreszenz der viralen Infektion, was durch die Pfeile in 3D–D'' angezeigt wird. Die Haut, die über dem Tumor lag, fluoreszierte ebenfalls nicht (angezeigt durch die Sternchen in 3B–B'' und D-D''). Querschnitte des Tumors zeigten jedoch, dass stark grün fluoreszierende Bereiche meistens als Flecken in dem Randbereich des Tumors gefunden wurden (Doppelpfeile in 3C–C''), wo wahrscheinlich die sich aktiv teilenden Tumorzellen lokalisiert sind.
  • Für die weitere Untersuchung des Musters der viralen Infektion in C6-Gliomtumoren auf der Basis der GFP-Expression wurden die Tumorgewebe für die mikroskopische Analyse unter dem Fluoreszenzmikroskop zerschnitten. Die vergleichende Analyse verschiedener Gewebeschnitte zeigte, dass die GFP-Fluoreszenz in großen Zellanhäufungen innerhalb des Tumors vorhanden war (4), dass in normalem Gewebe, wie dem Herzen, der Lunge, der Leber, der Milz, und der Nieren, jedoch keine Fluoreszenz sichtbar war.
  • Zusätzlich zu GFP trug das rekombinante rVV-ruc-gfp-Virus ein zweites Markergen, das die Renilla-Luciferase in Form eines Fusionsproteins mit GFP codiert. Wir waren daher imstande, unmittelbar den Ort der GFP-Fluoreszenz mit der Lichtemission der Renilla-Luciferase in den Tumoren zu überlagern. Unmittelbar nach der Zufuhr von Coelenterazin (Substrat für die Renilla-Luciferase) durch intravenöse Injektion wurde eine sehr starke Luciferase-Aktivität ausschließlich im Tumorbereich unter einer Schwachlichtvideokamera aufgezeichnet (5). Durch Senkung der Empfindlichkeit der Schwachlichtvideokamera zur Vermeidung der Sättigung der Lichtdetektion waren wir imstande, die Renilla-Luciferase-Genexpression in lokalisierten Flecken im Randbereich des Tumors nachzuweisen. Diese fleckenartigen Muster korrelierten genau mit den GFP-Signalen.
  • (C) Affinität der Vaccinia-Viren, die dem Blutstrom zugeführt werden, für verschiedene in Tiere implantierte Tumore
  • Um zu ermitteln, ob die Vaccinia-Viren nur von Gliomtumoren angezogen werden oder ob diese Anziehung auch in anderen Tumoren beobachtet werden kann, wurden rekombinante Vaccinia-Viren rekombinant in Mäuse eingebracht, die verschiedene Typen von implantierten Tumoren trugen. Eines dieser Tumormodelle betraf eine nackte Maus, der subkutan ein humanes PC-3 Prostatakarzinom implantiert wurde. Obwohl die PC3-Implantate, aus denen sich die Tumore entwickelten, mit wesentlich geringerer Geschwindigkeit als die implantierten subkutanen Gliomtumore wuchsen, zeigten diese Tumore die gleiche Dynamik im Hinblick auf die Vaccinia-Virus-Infektion, wenn gleiche Titer (1 × 108) intravenös injiziert wurden (6A–A''). Ähnlich wie bei unseren Erkenntnissen über Gliomtumore wurde die GFP-Expression zunächst 4 Tage nach der Virusinjektion nachgewiesen, und die Fluoreszenz dauerte über den 3-wöchigen Beobachtungszeitraum an.
  • Weibliche nackte Mäuse mit ausgebildeten Brusttumoren wurden ebenfalls für die Injektion von markierten Vaccinia-Viren verwendet. Diese Brusttumore ließ man 6 Monate wachsen, nachdem die Tiere Implantate von humanen MCF-7-Brustkarzinomzellen erhalten hatten, die mit pro-IGF-11-cDNA transformiert waren. Zum Zeitpunkt der Vaccinia-Virus-Injektion hatten die Tumore das maximale Wachstum erreicht, und das Tumorvolumen (etwa 400–500 mm3) änderte sich nicht merklich über den Zeitraum des Experiments. Ähnlich wie bei den vorherigen Experimenten wurde 6 Tage nach der intravenösen Zufuhr von 1 × 108 rVV-ruc-gfp-Viruspartikeln eine starke GFP-Expression im Brusttumorbereich (6B–B'', 7A–A'' und B-B'') und nirgendwo sonst in dem Körper beobachtet.
  • Die Untersuchung der Querschnitte der virusinfizierten Brusttumore zeigte lumineszierende "Inseln" überall in den Tumoren ohne jeden Hinweis auf eine bevorzugte Infektion im Zentrum oder im Randbereich (7C–C''). Die MCF-7-Tumorzellen, die in diesen Brusttumormodellen verwendet werden, sind dafür bekannt, dass sie Metastasen bilden, und zusätzlich zu dem primären festen Tumor zeigte ein kleinerer, metastasierter Tumor, der auf der linken Seite des Körpers gefunden wurde, eine GFP-Fluoreszenz (7D–D'', E-E'' und F-F''). Herausgeschnittene Lungengewebe wurden auch im Hinblick auf den Nachweis von Metastasen untersucht. Metastasierte Tumore auf der Oberfläche der Lunge, die einen Durchmesser von nur 0,5 mm hatten, waren positiv hinsichtlich der GFP-Fluoreszenz (7G–G''). Das Vorhandensein einer starken Renilla-Luciferase-vermittelten Lichtemission bestätigte die Expression des Luciferase-GFP-Fusionsproteins in diesen Brusttumoren, jedoch nirgendwo sonst in dem Körper, wenn das Substrat Coelenterazin intravenös in die lebenden Tiere injiziert wurde. Diese Experimente zeigten, dass intravenös zugeführte Vaccinia-Virus-Partikel selektiv in primären und metastasierten Brusttumoren in nackten Mäusen angereichert wurden und dort replizierten, wahrscheinlich als das Ergebnis des immunbeeinträchtigten Zustands der Tumormikroumgebung.
  • Um herauszufinden, ob Viruspartikel aus den Tumoren herauswandern können und wieder in den Blutkreislauf eintreten können, ha ben wir C6-Gliomzellen in den Oberschenkel von Mäusen injiziert, um einen zweiten Tumor in Tieren zu bilden, die bereits einen Brusttumor trugen, der mit dem markierten Vaccinia-Virus infiziert war. Für den Fall, dass die Viruspartikel aus dem Tumor freigesetzt wurden, um dann in merklicher Anzahl wieder in den Blutkreislauf einzutreten, würden sie imstande sein, den neu implantierten Gliomtumor zu besiedeln. Die Beobachtung dieser zweiten Tumore zeigte, dass in dem neuen Gliomtumor 7 und 14 Tage nach der Implantation der Gliomzellen kein GFP-Signal sichtbar war. Um nachzuweisen, dass sich die markierten Vaccinia-Viren auf die neu implantierten Gliomtumore richten können, wurde eine zweite Dosis rVV-ruc-gfp-Virus (1 × 108 pfu) intravenös injiziert. Fünf Tage später wurde die Tumor-spezifische GFP-Expression in dem neu gebildeten Gliomtumor zusätzlich zu der GFP-Expression, die in dem ursprünglichen Brusttumor gesehen wird, nachgewiesen. Diese Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Viruspartikel in den infizierten Tumoren entweder überhaupt nicht mehr in den Blutkreislauf freigesetzt wurden, oder dass sie nicht in einer ausreichenden Anzahl freigesetzt wurden, um einen zweiten Tumor zu infizieren und sich darin zu vermehren.
  • Zwei zusätzliche Tumormodelle, die Lewis-Ratten mit intrakranialen C6-Gliomtumoren der Ratte und C57-Mäuse mit MB-49-Blasentumoren der Maus in der Blase einschließen, wurden für Vaccinia-Injektionen verwendet. Um festzustellen, ob die Tumor-Affinität der Viruspartikel ein Phänomen ist, das auf Tumore in nackten Mäusen mit einer verringerten T-Lymphocytenfunktion beschränkt ist, oder ob es sich hierbei um eine allgemeine schützende Eigenschaft von Tumoren handelt, die auch in immunkompetenten Tieren gezeigt werden kann, wurden Lewis-Ratten mit intrakranialen C6-Gliomtumoren der Ratte und C57-Mäuse mit MB-49 Blasentumoren der Maus in der Blase verwendet. Eine Gesamtmenge von 5 × 105 C6-Gliomzellen in einem 100-μl-Volumen wurde stereotaktisch in die Gehirne von 2 von 4 immunkompetenten Lewis-Ratten implantiert, wonach man die Tumore 5 Tage wachsen ließ. Den beiden anderen Ratten wurde intrakranial phosphatgepufferte Kochsalzlösung injiziert, die dann als Kontrolle dienten. Am Tag sechs wurde allen 4 Ratten rVV-ruc-gfp-Viruspartikel durch die Oberschenkelvene intravenös injiziert. Fünf Tage nach der Virusinjektion wurden alle 4 Tiere getötet, und ihr Gehirn wurde sorgfältig für die Analyse durch die Fluoreszenzmikroskopie herausgeschnitten. Eine GFP-Expression wurde in den Gehirnen mit implantierten intrakranialen Tumoren nachgewiesen (6C–C''), während in den Kontrollgehirnen keine GFP-Expression gesehen wurde. In Parallelexperimenten wurden C57-Mäuse mit oder ohne Blasentumor in zwei Gruppen aufgeteilt. Einer Gruppe wurden rVV-ruc-gfp-Vaccinia-Viren (1 × 108 pfu) intravenös injiziert, und der anderen Gruppe wurde als Kontrolle eine Kochsalzlösung intravenös injiziert. Fünf Tage nach der Virusinjektion wurden die Tiere getötet und unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Eine GFP-Expression wurde im Blasentumorbereich in den C57-Mäusen beobachtet, jedoch nicht in den Kontrollmäusen (6D–D'').
  • Zusammengenommen zeigen diese Experimente, dass Vaccinia-Viruspartikel selektiv in einer Vielzahl von Tumoren angereichert und dort zurückgehalten wurden, wahrscheinlich geschützt durch die Tumormikroumgebung, und dass sie nicht imstande waren, in den nicht tumorösen Geweben von immunbeeinträchtigten Tieren wie auch von immunkompetenten Tieren zu überleben. Der Vorgang, nach dem intravenös injizierte Vaccinia-Viren, die das lichtemittierende Doppelmarkergen trugen, auf Tumore gerichtet sind ("tumor targeting"), zeigte die Eignung des Vaccinia Virus-Systems, primäre und metastatische Tumore in lebenden Tieren nachzuweisen.
  • Vergleichsbeispiel 3: Ergebnisse der intravenösen Injektion von lichtemittierenden bakteriellen Zellen und Säugetierzellen in Mäuse
  • (A) Sichtbarmachung der lichtemittierenden Bakterien, die in unversehrten Tieren nach der intravenösen Injektion vorhanden sind
  • Um das Schicksal der intravenös injizierten lumineszierenden Bakterien in den Tieren zu ermitteln, wurden 107 Bakterien, die das pLITE201-Plasmid tragen, in 50 μl in die linke Oberschenkelvene der anästhesierten Mäuse injiziert. Nach dem Verschließen des Schnitts mit einer Wundnaht wurden die Mäuse unter der bildgebenden Schwachlichtkamera (ARGUS 100 Camera System, Hamamatsu, Hamamatsu, Japan) in Echtzeit beobachtet, und die Photonen wurden über eine Minute erfasst. Die bildgebende Darstellung wurde in Abständen von zwei Tagen wiederholt, um das Vorhandensein einer Lichtemission bei einem gegebenen Tier zu ermitteln. Es wurde festgestellt, dass das Verteilungsmuster der Lichtemission, die auf eine intravenöse Injektion von Bakterien in Mäuse folgte, charakteristisch für die verwendeten Bakterienstämme war. Die Injektion von abgeschwächtem V. cholera in den Blutstrom führte unmittelbar zu einer Lichtemission, die in der Leber lokalisiert war. Die Injektion von S. thyphimurium war jedoch weit über den Körper des Tieres verteilt, was auf einen Unterschied in Bezug auf die Wechselwirkung mit dem Wirtszellsystem hinweist (8A–8D). Die bildgebende Darstellung der gleichen Tiere 24 und 48 Stunden nach der Infektion zeigte, dass die gesamte nachweisbare Lichtemission vom früheren Zeitpunkt schnell abnahm und von den Tieren, die die Injektion erhalten hatten, vollständig eliminiert wurde. Diese Erkenntnisse weisen darauf hin, dass lichtemittierende Bakterien, die über die Oberschenkelvene in den Blutstrom injiziert werden, entfernt werden. Dieser Vorgang wurde durch die Photonenemissionsanalyse der herausgeschnittenen Organe bestätigt, für die festgestellt wurde, dass bei ihnen die Lichtemission fehlt. Ähnliche Daten wurden in immunkompetenten Mäusen und Ratten erhalten, was darauf hinweist, dass die Beseitigung der Bakterien aus dem Blut in beiden Systemen effizient ist.
  • (B) Bakterien wandern in Gliomtumoren in nackten Mäusen ein
  • Um zu ermitteln, ob Bakterien vorzugsweise tumoröse Gewebe besiedeln, wurden nackten Mäusen mit zehn Tage alten Tumoren (etwa 500 mm3) 107 S. typhimurium- oder 107 V. cholera-Bakterien in einem 50 μl-Volumen einer bakteriellen Suspension über die Oberschenkelvene intravenös in das rechte Hinterbein injiziert. Nach der Injektion wurden die Schnittwunden genäht, und die Tiere wurden sechs Tage unter der bildgebenden Schwachlichtkamera beobachtet. Zu jedem Beobachtungszeitpunkt wurden die Photonen über genau eine Minute erfasst. In Mäusen, denen S. typhimurium injiziert wurde, verteilten sich die lumineszierenden Bakterien über den gesamten Körper des Tieres ähnlich den Ergebnissen in den nicht tumorösen Mäusen (9A). Nackte Mäuse, denen V. cholera injiziert wurde, zeigten nur im Bereich der Leber während des frühen Beobachtungszeitraums eine Lumineszenzaktivität (9E). Unabhängig vom injizierten Bakterienstamm wurde zwei Tage nach der Injektion nur in dem Tumorbereich eine Lumineszenzaktivität beobachtet (9B und 9F). Die Beobachtung der Mäuse unter der bildgebenden Schwachlichtkamera an den Tagen vier und sechs nach der Injektion zeigte abnehmende Mengen an nachweisbarer Lumineszenz in den Tumoren der Tiere, denen S. typhimurium injiziert wurde (9C und 9D). Dieses Ergebnis stand im deutlichen Kontrast zu den Ergebnissen in den Tumoren von Mäusen, denen V. cholera injiziert wurde, die nicht nur ein Überleben, sondern auch eine Vermehrung der Bak terien in der Tumormasse mit einer dramatischen Zunahme der Lichtemission zeigten (9G und 9H).
  • Nackten Mäusen, die subkutane humane PC3-Prostatatumore im rechten Hinterbein tragen, wurden 107 abgeschwächte L. monocytogenes-Bakterien injiziert, die mit psod-gfp-Plasmid-DNA transformiert waren, die die gfp-cDNA trägt. Unter einem Fluoreszenzstereomikroskop wurde eine GFP-Fluoreszenz beobachtet. Siebenundzwanzig Stunden nach der Injektion der Bakterien wurde das GFP-Signal ausschließlich im Tumorbereich nachgewiesen (10). In allen anderen Bereichen des Tieres wurde kein GFP-Signal beobachtet.
  • (C) Ermittlung der minimalen Größe und des minimalen Alters von Gliomtumoren, die/das für die Infektion mit Bakterien erforderlich ist.
  • Das Ziel dieses Experiments bestand darin, zu ermitteln, ob die Größe des Tumors irgendeinen Einfluss auf seine Eignung hat, durch Bakterien besiedelt zu werden. Die Tumore wurden im rechten Hinterbein von nackten Mäusen durch die subkutane Injektion von Gliomzellen wie zuvor beschrieben hervorgerufen. An den Tagen 0, 2, 4, 6, 8 und 10 nach dem Auslösen der Tumorbildung wurden abgeschwächte S. typhimurium- und V. cholera-Bakterien mit dem pLITE201-Plasmid intravenös durch die Oberschenkelvene injiziert. Das Vorhandensein lumineszierender Bakterien in dem Tumor wurde zwei Tage und vier Tage nach der Injektion durch die Erfassung der Photonen über exakt eine Minute unter der bildgebenden Schwachlichtkamera untersucht. Das Tumorvolumen wurde durch die Messung der Abmessungen mit einer digitalen Schieblehre ebenfalls ermittelt. Der früheste Zeitpunkt, zu dem die Lumineszenzaktivität in den Tumoren festgestellt wurde, war am Tag acht nach dem Hervorrufen Tumorbildung. Die entsprechenden Tumorvolumina betrugen etwa 200 mm3.
  • (D) Bakterien wandern in Brusttumore von nackten Mäusen ein
  • Um festzustellen, ob die Besiedlung von Tumoren mit Bakterien auf Gliomzellen beschränkt ist oder ob dies ein allgemeines Phänomen ist, das bei allen Tumoren beobachtet wird, wurden weiblichen nackten Mäusen, die Tumore im rechten Brustfettpolster trugen, 107 V. cholera intravenös in einem 50 μl-Volumen einer Bakteriensuspension injiziert. Die Tiere wurden innerhalb der ersten 10 Minuten nach dem Impfen unter der bildgebenden Schwachlichtkamera über eine Minute beobachtet, und sie zeigten das typische Lumineszenzmuster im Bereich der Leber (11A). Zwei Tage später, während die lumineszierenden Bakterien aus der Leber verschwunden waren, wurde der Brusttumor von den markierten V. cholera-Bakterien besiedelt. Zusätzlich zu dem Haupttumor zeigte ein metastatischer Tumor in der linken Brust eine Lumineszenzaktivität (11B). Am Tag fünf waren die Bakterien, die die Schnittwunde besiedelt hatten, von den Tieren entfernt worden, die Lumineszenz in den Tumoren bestand jedoch fort (11C). 11D zeigt die fortgesetzte Besiedelung und Vermehrung der Bakterien in dem Haupttumor, während die Bakterien aus dem metastatischen, kleineren Tumor verschwunden waren. Die Lumineszenzaktivität hielt in dem Tumor in der rechten Brust weitere 45 Tage an. Ähnliche Experimente wurden unter Verwendung von E. coli durchgeführt, um zu zeigen, dass das Einwandern von Bakterien in Tumore nicht stammabhängig ist (11E und 11F).
  • Um zu ermitteln, ob die Bakterien aus dem Tumor in merklichen Mengen in den Blutkreislauf eintreten, um andere Stellen zu besiedeln, wurde ein zweiter Tumor (C6-Gliom) im rechten Hinterbein in diesen Tieren hervorgerufen. Den Tumor ließ man 10 Tage wachsen. In dem Gliomtumor wurde keine Lumineszenzaktivität beobachtet, was das Fehlen einer signifikanten Bakterienmenge, die eine Besiedelung dieses Tumors verursachen würde, nachweist. Wenn das Tier jedoch erneut 107 abgeschwächten V. cholera-Bakterien durch intravenöse Verabreichung ausgesetzt wurde, zeigte der Beintumor eine starke Lumineszenzaktivität.
  • Die Erkenntnisse aus diesen Experimenten zeigen, dass die Bakterien von größeren Tumoren effizienter über einen Zeitraum zurückgehalten werden. Weiterhin treten die Bakterien innerhalb der Tumore nicht in Mengen in das Blut aus, die ausreichend sind für eine Infektion von geeigneten Stellen, wie anderen Tumoren.
  • (E) Bakterien wandern in Blasentumore in immunkompetenten Mäusen ein
  • C57-Mäusen wurden 107 abgeschwächte V. cholera-Bakterien injiziert, die mit pLITE201 transformiert waren, das das lux-Operon codiert. Am Tag neun nach der Zufuhr der Bakterien wurde die Lumineszenzaktivität durch die Sammlung der Photonen über einen Zeitraum von einer Minute unter der bildgebenden Schwachlichtkamera aufgezeichnet. Die Lichtemission wurde im Blasenbereich der unversehrten Tiere beobachtet (12A). Die Tiere wurden getötet, und es wurde ein Bauchschnitt durchgeführt, um die Blase freizulegen. Dabei wurde positiv bestätigt, dass die Lumineszenzaktivität auf die Blase beschränkt ist (12B). Nach dem Entfernen der Blase aus den Mäusen war nirgendwo in den Tieren eine Lumineszenzaktivität sichtbar, die herausgeschnittenen Blasen zeigten jedoch eine fortgesetzte Lichtemission (12C). Auf der Basis der Ergebnisse dieses Experiments können Tumore sowohl in immunkompetenten Mäusen als auch in nackten Mäusen das Ziel von Bakterien sein. Weiterhin können auch kleinere Tumore das Ziel von Bakterien sein.
  • (F) Bakterien wandern in Gliomtumore im Hirn von Ratten ein
  • Lewis-Ratten mit Gliomtumoren im Gehirn wurden 108 abgeschwächte V. cholera-Bakterien mit dem pLITE201-Plasmid durch die linke Oberschenkelvene intravenös injiziert, um zu ermitteln, ob Bakterien die Blut-Hirn-Schranke überwinden können und Tumore in immunkompetenten Tieren als Ziel haben. Die unversehrten Tiere wurden am folgenden Tag über einen Zeitraum von einer Minute unter der bildgebenden Schwachlichtkamera beobachtet, und durch den Schädel wurde ein niedriges Niveau der Lumineszenzaktivität beobachtet. Die Tiere wurden getötet, und das Gehirngewebe wurde in einem Stück entfernt, um den genauen Ort der lumineszierenden Bakterien weiter auszuwerten. Das Sichtbarmachen des herausgeschnittenen Gehirns unter der bildgebenden Kamera zeigte eine starke Lumineszenzaktivität in spezifischen Bereichen des Gehirns (13A). Eine ähnliche bildgebende Darstellung von Kontrollratten ohne Hirntumore, denen die markierten Bakterien intravenös injiziert wurden, zeigte die Abwesenheit von jeglicher Lumineszenzaktivität (13B).
  • (G) Transformierte humane Fibrosarkomzellen wandern in subkutane Gliomtumore in nackten Mäusen ein
  • Nackten Mäusen mit Brusttumoren wurden 5 × 105 humane Fibrosarkomzellen intravenös injiziert, die permanent mit Retroviren, abgeleitet von pLEIN, transformiert waren. Sieben Tage nach der Injektion wurden die Tiere mit Nembutal anästhesiert und unter einem Fluoreszenzstereomikroskop beobachtet. Fluoreszierende Zellen wurden ausschließlich in dem Tumorbereich der unversehrten Mäuse durch die Haut festgestellt (14A1–3). Nach dem Freilegen der Tumorgewebe durch das Zurückziehen der darüber liegenden Haut (14B1–3) und in Querschnitten des Tumors (14C1–3) waren fluoreszierende Flecken in verschiedenen Bereichen sichtbar. Die genaue Untersuchung der Organe der Mäuse zeigten das Vorhandensein von kleinen Anhäufungen von fluoreszierenden Zellen in der Lunge der Tiere, wodurch die Affinität der Fibrosarkomzellen für die Lunge zusätzlich zu dem tumorösen Gewebe nachgewiesen wurde.
  • Vergleichsbeispiel 4: Konstruktion von bakteriellen Plasmidvektoren, die die Expressionskassetten, die das lichtemittierende Protein codieren, und die Konstrukte für die Expression des therapeutischen Gens in cis-Konfiguration tragen
  • (A) Grundprinzip
  • Bei der Verwendung der oben beschriebenen lichtemittierenden Expressionssysteme konnten Tumore auf der Basis der Lichtemission über bis zu 45 Tage in Tieren abgebildet werden. Diese Erkenntnisse deuten auf eine bemerkenswerte Stabilität der Plasmid-DNA in Bakterien in Abwesenheit einer Selektion hin. Daher kann die Lichtemission, indem die therapeutische Genkassette in cis-Konfiguration zu der Expressionskassette für das lichtemittierende Protein auf dem gleichen Replicon platziert wird, als ein Indikator für das Vorhandensein und die Stabilität des therapeutischen Konstrukts verwendet werden. Im Gegensatz zu lichtemittierenden Proteinen müssen die therapeutischen Proteine, das Endostatin und das Pseudomonas-Exotoxin/TGF-α-Fusionsprotein, von den Bakterien in das Medium oder in das Zytosol der Tumorzellen für die Hemmung des Tumorwachstums sezerniert werden. Um die Proteinsekretion von den extrazellulär replizierenden E. coli-Zellen in den Tumor zu erreichen, können zwei Konstrukte mit verschiedenen Signalsequenzen entworfen werden. Für die Sekretion des Endostatins kann die ompF-Sig nalsequenz stromaufwärts zu der codierenden Sequenz des Endostatins platziert werden, wodurch die Sekretion in den periplasmatischen Raum erleichtert wird. Für die Freisetzung des Endostatins in das Medium muss ein zusätzliches Protein, das PAS-Protein, gemeinsam mit dem Endostatin exprimiert werden. Für PAS ist gezeigt worden, dass es eine Membranlöchrigkeit und die Freisetzung von sezernierten Proteinen in das Medium verursacht (Tokugawa et al., J. Biotechnol. 37 (1994), 33; Tokugawa et al., J. Biotechnol. 35 (1994), 69). Das zweite Konstrukt für die Sekretion des Pseudomonas-Exotoxin/TGF-α-Fusionsproteins aus E. coli weist die OmpA-Signalsequenz stromaufwärts des Fusionsgens auf, und die Freisetzung aus dem periplasmatischen Raum in das Medium wird durch Sequenzen erleichtert, die in der Domäne II des Exotoxins vorhanden sind (Chaudhary et al., PNAS 85 (1988), 2939; Kondo et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 9470; Kihara und Pastan, Bioconj. Chem. 5 (1994), 532). Um die Sekretion des Endostatins und des Pseudomonas-Exotoxin/TGF-α-Fusionsproteins aus L. monocytogenes zu fördern, kann die Signalsequenz von Listeriolysin (LLO) (Mengaud et al., Infect. Immun. 56 (1988), 766) stromaufwärts von jeder codierenden Sequenz platziert werden.
  • Für die Regulation des Expressionsniveaus des Endostatins und des Pseudomonas-Exotoxin/TGF-α-Fusionsproteins in Bakterien können Vektoren erzeugt werden, in denen die Gene, die das therapeutische Protein codieren, unter der Kontrolle des T7-Promotors oder des synthetischen Pspac-Promotors stehen (Freitag und Jacobs, Infect. Immun. 67 (1999), 1844). Ohne die exogene Induktion bleibt die Konzentration an therapeutischen Proteinen in E. coli und in L. monocytogenes gering. Die minimalen Konzentrationen an therapeutischen Proteinen in Bakterien sorgen für eine größere Sicherheit nach der intravenösen Injektion der manipulierten Bakterien. Im Folgenden wird die Konstruktion von sechs Plasmid-DNAs für die konstitutive und regulierte Expression des Endostatins und des Pseudomonas-Exotoxin/TGF-α-Fusionsproteins in E. coli und L. monocytogenes beschrieben. Alle Plasmide, die in E. coli übertragen werden sollen, tragen das konstitutiv exprimierte bakterielle lux-Operon, und alle Plasmide, die in L. monocytogenes übertragen werden sollen, tragen die konstitutiv exprimierte sod-gfp-Kassette. Die Plasmide BSPT#1-ESi und BSPT#2-Pti sind nur in E. coli imstande, zu replizieren, und die Plasmide BSPT#3, #4, #5 und #6 replizieren in E. coli und L. monocytogenes.
  • (B) Konstruktion von Plasmidvektoren für die Proteinexpression und die Proteinsekretion aus E. coli
  • Die Konstruktion des Endostatin-Sekretionsvektors, der in E. coli verwendet werden soll, geschieht folgendermaßen. Die codierende Sequenz des humanen Endostatins (591 bp) wird durch PCR aus dem Plasmid pES3 unter Einführung der erforderlichen Restriktionsstellen an beiden Enden vervielfältigt, worauf die Ligation in einen pBluescript-Clonierungsvektor (Clontech Corp., USA) unter Erzeugung von pBlue-ES folgt. Die ompF-Signalsequenz (Nagahari et al., EMBO J. 4 (1985), 3589) wird mit der Taq-Polymerase vervielfältigt und stromaufwärts "in frame" mit der Endostatinsequenz insertiert, wodurch pBlue-ompF/ES erzeugt wird. Die Expressionskassette, die durch den T7-Promotor gesteuert wird, wird herausgeschnitten und in den pLITE201-Vektor insertiert, der in dem Beispiel 1(B) weiter oben beschrieben wird, der die lux-CDABE-Kassette trägt, wodurch das Plasmid pLITE-ompF/ES erzeugt wird. Die Sequenz, die den PAS-Faktor codiert (ein Polypeptid aus 76 Aminosäuren) wird aus der chromosomalen DNA von Vibrio alginolyticus (früher als Achromobacter iophagus bezeichnet) (NCIB 11038) mit der Taq-Polymerase unter Verwendung der Primer 5'-GGGAAAGACATGAAACGCTTA3-' und 5'-AAACAACGAGTGAATTAGCGCT-3' vervielfältigt und in die multip len Klonierungsstellen von pCR-Blunt (Clontech Corp., USA) insertiert, wodurch die Expressionskassette unter der Kontrolle des Lac-Promotors erzeugt wird. Das resultierende Plasmid erhält den Namen pCR-PAS. Der Lac-Promotor, der mit dem Pas-Gen verknüpft ist, wird aus pCR-PAS herausgeschnitten und in pLITEompF/ES insertiert, wodurch das endgültige Plasmid BSPT#1-ESI erhalten wird.
  • Das Plasmid pVC85 (Kondo et al., 1998, J. Biol. Chem. 263: 9470-9475) enthält einen T7-Promotor, auf den eine ompA-Signalsequenz und eine Sequenz, die die Domäne II und III des Pseudomonas-Exotoxins (PE40) codiert, folgen. Die DNA-Sequenz, die PE40 codiert, wird mit Restriktionsenzymen herausgeschnitten und durch ein Fragment von PE37/TGF-α (Pseudomonas-Exotoxin A 280-613/TGF-α) ersetzt, das von dem Plasmid CT4 (Kihara & Pastan, 1994, Bioconjug. Chem. 5: 532-538) erhalten wird, wodurch das Plasmid pVC85-PE37/TGF-α erzeugt wird. Die Expressionskassette von ompAPE37/TGF-α, die mit dem T7-Promotor verknüpft ist, wird herausgeschnitten und in pLITE201 unter Erhalt des fertigen Plasmids BSPT#2-PTI insertiert.
  • (C) Konstruktion von Plasmidvektoren für die Proteinexpression und die Proteinsekretion aus L. monocytogenes
  • Gene, die das Endostatin oder PE37/TGF-α codieren, werden stromabwärts der Listeriolysin-Signalsequenz (LLO) in das Plasmid pCHHI insertiert, wodurch pCHHI-ES und pCCHI-PE37/TGF-α erzeugt werden. Die konstitutive Expression der therapeutischen Proteine wird erhalten, indem die obigen Sekretionskassetten mit dem Listeriolysin-Promotor verknüpft werden, der aus dem pCHHI-Vektor erhalten wird. Die sod-gfp-Expressionskassette, die aus dem Plasmid psod-gfp (Götz et al., PNAS im Druck) herausgeschnitten wird, wird in pCHHI-ES, wodurch BSPT#3-ESc erzeugt wird, und in pCCHI-PE37/TGF-α, wodurch ESPT#4-PTc erzeugt wird, insertiert. Für die Expression der therapeutischen Proteine unter der Kontrolle eines IPTG-induzierbaren Promotors wird der Listeriolysin-Promotor in BSPT#3ESc und BSPT#4-PTc durch den Pspac-Promotor aus dem Plasmid pSPAC (Yansura und Henner, PNAS USA 81 (1984), 439) ersetzt, wodurch BSPT#5-ESi und BSPT#6-PTi erzeugt werden. Pspac ist ein Hybridpromotor, der aus dem SPO-1-Promotor des Bacillus subtilis-Bakteriophagen und dem lac-Operator. Die IPTG-induzierte GFP-Expression unter dem Pspac-Promotor in das Zytosol von Säugetierzellen ist in L. monocytogenes nachgewiesen worden.
  • Vergleichsbeispiel 5: Nachweis der Expression von Luciferase und GFP in Bakterien und Verifizierung der Sekretion von Endostatin und rekombinantem Toxin/TGF-α-Fusionsprotein und ihrer Funktion in Zellkultur-Assays
  • Um imstande zu sein, das Vorhandensein von E. coli und L. monocytogenes in Tumorgeweben in lebenden Tieren nachzuweisen, muss die Konzentration an konstitutiv exprimierter Luciferase und von GFP in Bakterien angemessen sein. Daher werden nach der Transformation der empfangenden E. coli oder L. monocytogenes mit den in Beispiel 4 beschriebenen Konstrukten die Kolonien mit der stärksten Luciferase-Lichtemission oder GFP-Fluoreszenz selektiert. Zusätzlich zur Charakterisierung der Lichtemission aller selektierten Kolonien vor der intravenösen Injektion muss die Fähigkeit der selektierten Transformanten, das Endostatin und das Pseudomonas-Exotoxin/TGF-α-Fusionsprotein in das Medium zu sezernieren, bestätigt werden. Das Vorhandensein des Endostatins und des Pseudomonas-Exotoxin/TGF-α-Fusionsproteins, die in E. coli und L. monocytogenes synthetisiert werden, wird nachgewiesen, indem diese Proteine aus dem Zellpellet extrahiert werden. Die sezernierten Proteine in dem Medium werden aufkonzentriert und durch Geltrennung analysiert, und die Menge wird durch Western-Blotting bestimmt. Es ist zwingend erforderlich, die prozentuale Menge der neu synthetisierten Proteine, die von jedem Plasmidkonstrukt entweder in E. coli oder in L. monocytogenes exprimiert werden, die in dem Medium vorhanden ist, zu bestimmen. Es ist ebenfalls wesentlich, zusätzlich zur konstitutiven Expression des Endostatins und des Pseudomonas-Exotoxin/TGF-α-Fusionsproteins zu bestätigen, dass die Expression in E. coli und in L. monocytogenes durch die Zugabe von IPTG zu dem bakteriellen Kulturmedium induziert werden kann. Für die Entwicklung zukünftiger Tumortherapieprotokolle müssen zunächst die relativen Mengen an Protein, die durch das konstitutive Expressionssystem sezerniert werden, mit dem induzierten Expressionsniveau über einen definierten Zeitraum zunächst in Bakterienkulturen verglichen werden. Es ist gleichermaßen wichtig zu ermitteln, dass beide Proteine, wenn sie in E. coli und L. monocytogenes synthetisiert werden, biologisch aktiv sind, wenn sie von den vorgeschlagenen Konstrukten erzeugt werden. Beide Proteine wurden zuvor in E. coli synthetisiert, und für sie wurde gezeigt, dass sie aktiv sind.
  • Die Ergebnisse der weiter unten beschriebenen Experimente sollen bestätigen, ob das Endostatin erfolgreich aus E. coli unter Verwendung des OmpF-Signalpeptids in Kombination mit der Expression des PAS-porenbildenden Proteins sezerniert wird. Diese Experimente zeigen auf, ob das PE40/TGF-α-Fusionsprotein und das PE37/TGF-α-Fusionsprotein bei Verwendung des OmpA-Signalpeptids in Kombination mit der Domäne II von PE aus Bakterien sezerniert werden. Weiterhin kann das Listeriolysin-Signalpeptid auch die Sekretion des Endostatins und des chimären Toxin/TGF-α-Fusionsproteins in das Medium sowie in das Zytosol von infizierten Tumorzellen erleichtern. Bei Verwendung des Endothelzellenmigrationshemmungsassays und des Proteinsynthesehemmungsassays kann erwartet werden, dass festgestellt wird, dass beide Proteine, die in das Medium sezerniert werden, biologisch aktiv sind. Das Vorhandensein und die Mengen dieser Proteine können reguliert werden, indem die konstitutiven Promotoren durch Promotoren ersetzt werden, die durch IPTG induziert werden können.
  • Zusätzlich zu dem unten beschriebenen Sekretionssystem können alternative Sekretionssysteme brauchbar sein, wie der E. coli-HlyBD-abhängige Sekretionsweg (Schlor et al., Mol. Gen. Genet. 256 (1997), 306). Alternative Sekretionssignale von anderen Gram-positiven Bakterien, wie das Bacillus sp.-Endoxylanase-Signalpeptid (Choi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 53 (2000), 640; Jeong und Lee, Biotechnol. Bioeng. 67 (2000), 398) können eingeführt werden.
  • (A) Nachweis der Sekretion des Endostatins und des Pseudomonas-Exotoxin/TGF-α-Fusionsproteins aus Bakterien in das Wachstumsmedium
  • E. coli-Stämme (DH5α und BL21 (λDE3)) werden mit BSPT#1-ESi- und BSPT#2-PTi-Plasmid-DNA transformiert. Der L. monocytogenes-Stamm EGDA2 wird einzeln mit den Plasmiden PSPT#3-ESc, BSPT#4-PTc, BSPT#5-ESi und BSPT#6-PTi transformiert. Nach dem Ausplattieren auf geeignete Antibiotika-haltige Platten werden aus jedem Transformationsgemisch einzelne Kolonien selektiert. Diese Kolonien werden unter der bildgebenden Schwachlichtkamera und dem Fluoreszenzmikroskop im Hinblick auf Luciferase- bzw. die GFP-Expression durchgemustert. Für die weiteren Studien werden von jedem Transformationsansatz drei Kolonien mit der intensivsten Lichtemission ausgewählt. Für den Nachweis der Sekretion des Endostatins und des Pseudomonas-Exotoxin/TGF-α-Fusionsproteins aus jedem selektierten Transformanten werden die Zellen bis zur Log-Phase in Minimalmedium gezüchtet. Nach dem Abzentrifugieren der Bakterien passieren die Überstände einen Filter mit einer Porengröße von 0,45 μm, und das bakterienfreie Medium wird für die Fällung der sezernierten Proteine verwendet. Die Fällungsprodukte werden durch Zentrifugieren gesammelt. Die Pellets werden gewaschen, getrocknet und in einem Probenpuffer für die Proteingeltrennung wieder suspendiert. Die Proteine von Aliquoten, die 10 μl Bakterienkultur entsprechen, werden mit den Proteinen aus 200 μl Kulturüberstand nach der Trennung in einem 10% SDS-Polyacrylamidgel verglichen. Die Western Blot-Analyse wird unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers gegen Endostatin (Herstellung der Antikörper gemäß dem Protokoll für die Antikörperherstellung, das von Timpl, Methods Enzymol. 82 (1982), 472 beschrieben wird) und unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen TGF-α (Oncogene Research Products, Cambridge, MA, USA) durchgeführt. Die optimalen Wachstumsbedingungen werden für die Sekretion ermittelt, indem Proben des Wachstumsmediums zu verschiedenen Zeitpunkten während des Wachstums genommen werden. Ein ähnliches Verfahren wurde zuvor verwendet, um sezernierte Proteine in dem Überstand einer Salmonella typhimurium-Kultur zu analysieren (Kaniga et al., J. Bacteriol. 177 (1995), 3965). Durch die Anwendung dieser Verfahren wird die Menge an sezernierten Proteinen in dem Bakterienkulturmedium ermittelt, die von jedem dieser Konstrukte ohne Induktion erzeugt wird. Für die Abschätzung der Zunahme der Menge an sezernierten Proteinen in dem Medium werden Versuche zur Aktivierung des IPTG-abhängigen Promotors durch die Zugabe von IPTG zu der Bakterienkultur in der Log-Phase über 3 bis 6 Stunden durchgeführt, und die sezernierten Proteine werden wie oben beschrieben untersucht.
  • (B) Nachweis der biologischen Aktivität des Endostatins, das von E. coli und L. monocytogenes sezerniert wird, unter Verwendung eines Wanderungshemmungsassays
  • Es ist gezeigt worden, dass Endostatin die VEGF-induzierte (VEGF = "vascular endothelial growth factor") Wanderung der HUVEC-Zellen (HUVEC = humane Nabelschnurvenenendothelzelle, "human umbilical vain endothelial cell") hemmt. Die biologische Aktivität des von Bakterien sezernierten Endostatins kann demnach unter Verwendung des HUVEC-Wanderungsassays, der von Cascade Biologics, Portland, OR, bereitgestellt wird, geprüft werden. Die Hemmung der Zellwanderung wird in 48-Vertiefungen-Chemotaxiskammern (Neuro Probe, Galthersburgs, MD) (Polverine et al., Methods Enzymol. 198 (1991), 440) beurteilt. Der bakterienfreie Überstand von jedem Sekretionskonstrukt wird für eine Vorinkubation über 30 min. zu HUVECs gegeben. Nach der Inkubation werden die HUVECs in der oberen Kammer platziert. Die Wanderung der HUVECs in die untere Kammer, die durch VEGF165 (R&D Systems, Minneapolis, NIN) induziert wird, wird durch die mikroskopische Analyse quantifiziert. Die Konzentration an funktionalem Endostatin in dem Medium ist unmittelbar proportional zum Ausmaß der Hemmung der HUVEC-Wanderung.
  • (C) Prüfung der cytotoxischen Aktivität von sezerniertem rekombinantem PE-Toxin in Tumorzellkulturen
  • Die hemmende Aktivität des chimären Toxins in Säugetierzellen wird auf der Basis der Hemmung der De-novo-Proteinsynthese durch die Inaktivierung von EF-2 gemessen (Carroll und Collier, J. Biol. Chem. 262 (1987), 8707). Aliquote von bakterienfreien Überständen, die bei der Expression verschiedener Konstrukte für die Sekretion von rekombinantem PE in E. coli und in L. monocytogenes erhalten werden, werden zu den C6-Gliomzellen oder den HCTI-16-Dickdarmkarzinomzellen gegeben. Nach der Behandlung mit dem Medium werden die Säugetierzellen mit [3H]-Leucin gepulst, und der Einbau wird in der Proteinfraktion bestimmt. Für die Bestimmung des Vorhandenseins von sezernierten chimären Toxinproteinen in L. monocytogenes-infizierten Säugetierzellen werden die Bakterien aus dem Medium durch eine Gentamicin-Behandlung beseitigt. Die Säugetierzellen, die L. monocytogenes im Zytosol enthalten, werden lysiert, und die freigesetzten Bakterien werden durch Filtration aus dem Lysat entfernt. Das Säugetierzell-Lysat, das die sezernierten chimären Toxine enthält, wird in Proteinsynthesehemmungsexperimenten untersucht. Die Hemmung des [3H]-Leucin-Einbaus in die Tumorzelle ist unmittelbar proportional zur Menge an biologisch aktivem chimärem Toxinprotein in dem Medium und dem Zelllysat.
  • Vergleichsbeispiel 6: Bestimmung des Eintritts, der Lokalisierung und der Verteilung von intravenös injizierten Bakterien in Tumoren in lebenden Tieren
  • (A) Grundprinzip
  • Da nur eine geringe Zahl von intravenös injizierten Bakterien dem Immunsystem entkommt, indem sie in den Tumor eindringen, ist aufgrund der begrenzten Lichtemission in lebenden Tieren ihre unmittelbare Lokalisierung nicht möglich. Ihr Ort kann nur überprüft werden, indem der Tumor herausgeschnitten wird, um die frühen Zentren der Lichtemission zu identifizieren. Bei der Betrachtung der Schnitte zu einem späteren Zeitpunkt können die Bakterien aufgrund der schnellen Replikation in dem gesamten Tumor gesehen werden. Um festzustellen, ob ein Bakterium oder viele Bakterien durch die gleiche Stelle eintreten, kann rot fluoreszierendes Protein verwendet werden, um extrazellulär replizierendes E. coli zu markieren, und das grün fluoreszierende Protein kann für intrazellulär replizierendes L. monocytogenes verwendet werden. Durch die Sichtbarmachung der Verteilung der roten und der grünen Fluoreszenz in Gewebeschnitten können die Eintrittsstellen sowie auch die Replikation und die Lokalisierung von E. coli und von L. monocytogenes individuell und gleichzeitig im zentralen Bereich und im Randbereich des Tumors bestimmt werden. Es kann erwartet werden, dass das Eintrittsmuster und das Verteilungsmuster, die in implantierten Tumoren erhalten werden, die entsprechenden Muster von spontanen Tumoren wiedergeben, und dem gemäß werden die Diagnose und die Proteintherapie auf Bakterienbasis zu einem zuverlässigen Ansatz.
  • Mit den weiter unten in Abschnitt (B) beschriebenen Versuchen können der Eintritt, die Replikation und die Verteilung von lichtemittierenden Bakterien in spontanen Tumoren mit den Verteilungsmustern in implantierten Tumoren verglichen werden. Weiterhin erlauben es Doppelmarkierungsversuche dem Experimentator, die extrazellulär replizierenden E. coli.-Bakterien und die intrazellulär replizierenden L. monocytogenes-Bakterien in den gleichen Tumorschnitten präzise zu lokalisieren. Schließlich kann ermittelt werden (nach einer fünftägigen Besiedlung mit Bakterien), ob die Bakterien gleichmäßig in den Tumoren verteilt sind oder ob es zu einer bevorzugten Lokalisierung im Randbereich des Tumors oder in dem nekrotischen Zentrum kommt. Eine mögliche Verringerung des Bakterieneintritts in spontan vorkommende Tumore aufgrund der Immunkompetenz dieser Tiere kann durch die Erhöhung der Anzahl der intravenös injizierten Bakterien überwunden werden.
  • (B) Intravenöse Injektion von E. coli, das rot fluoreszierendes Protein exprimiert, und von L. monocytogenes, das grün fluoreszierendes Protein exprimiert, in nackte Mäuse und in Nagetiere mit implantierten und spontanen Tumoren
  • E. coli (DH5α), die die DsRed-Expressionskassette (Matz et al., Nat. Biotech. 17 (1999), 969) unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors tragen, werden in diesem Experiment verwendet. Abkömmlinge des L. monocytogenes-EGD-Stamms mit einer in-frame-Deletion in jedem der Virulenzgene wurden einzeln mit der grün-fluoreszierendes-Protein-Kassette markiert, die durch den konstitutiven SOD-Promotor gesteuert wurde.
  • Die Lokalisierung der Bakterien und ihre Verteilung innerhalb des Tumors wird zunächst an nackten Mäusen mit implantiertem C6-Gliomtumor oder HTC116-Dickdarmkarzinomtumor untersucht. C6-Gliom- oder HCT116-Dickdarmkarzinomzellen (5 × 105 in 100 μl) werden subkutan in das rechte Hinterbein der Tiere injiziert. Zwölf Tage nach der Injektion der Tumorzellen werden die Tiere anästhesiert, und die linke Oberschenkelvene wird chirurgisch freigelegt. Lichtemittierende Bakterien (1 × 106 Zellen, erneut in 50 μl Salzlösung suspendiert) werden intravenös injiziert, und der Wundschnitt wird mit chirurgischen Nähten verschlossen. Die Tumore werden dreimal pro Woche unter Verwendung einer Schieblehre vermessen. Das Tumorvolumen wird folgendermaßen berechnet: kleiner Durchmesser × großer Durchmesser × Höhe/2.
  • Die Lokalisierung der Bakterien in dem Tumor wird auf der Basis des GFP oder des RFP unter Verwendung von Gefrierschnitten der Tumorgewebe ebenfalls analysiert. Eine zuverlässige morphologische und histologische Konservierung und ein reproduzierbarer GFP- oder RFP-Nachweis kann erhalten werden, wenn Gefrierschnitte verwendet werden, die nach einem Protokoll zum langsamen Einfrieren von Gewebe erhalten werden (Shariatmadari et al., Biotechniques 30 (2001), 1282). In aller Kürze werden die Tumorgewebe aus den getöteten Tieren entfernt und in eine Petrischale gegeben, die PBS enthalt, in der sie auf die gewünschte Größe zerschnitten werden. Die Proben werden bei Raumtemperatur 2 h in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS gemischt. Sie werden einmal mit PBS gewaschen und bei Raumtemperatur in Tissue-Tek eingebettet und dann 24 h im Dunkeln bei 4 C gehalten und langsam auf –70 C eingefroren. Vor dem Schneiden wird das Gewebe 30 min bei –20 C gehalten. Anschließend werden mit einem Reichert-Jung Cryocut 1800-Kryostat 10 μm und 50 μm dicke Schnitte geschnitten und auf mit Poly-L-Lysin (1%) behandelten Mikroskop-Objektträgern gesammelt. Beim Schneiden wird das Material bei Raumtemperatur gehalten, um mehrere Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden. Die Schnitte werden schließlich in PBS gespült und in PBS gelagert und im Dunkeln bei 4 C aufbewahrt.
  • Für die Beobachtung des Eintritts von lichtemittierendem E. coli und L. monocytogenes aus dem Blutstrom in den Tumor werden 27 nackten Mäusen C6-Tumorzellen und 27 nackten Mäusen HCT116-Dickdarmkarzinomzellen injiziert. Zwölf Tage nach der Tumorentwicklung erhalten 9 Tiere aus der C6-Gruppe und 9 Tiere aus der HCT116-Gruppe eine intravenöse Injektion von E. coli mit dem RFP-Konstrukt. Weitere 9 Tiere aus jeder Gruppe erhalten eine intravenöse Injektion von L. monocytogenes mit dem GFP-cDNA-Konstrukt. Die dritte Gruppe von 9 Tieren aus jedem Tumormodell erhält sowohl E. coli als auch L. monocytogenes (jeweils 1 × 106 Zellen). Fünf Stunden, 25 Stunden und 5 Tage nach der Injektion werden drei Tiere aus jeder Behandlungsgruppe getötet, werden ihre Tumore herausgeschnitten, die dann einzeln wie oben in dem Kyroschnittprotokoll beschrieben weiterverarbeitet werden. Nach dem Einfrieren wird jeder Tumor in zwei Hälften geschnitten. Eine Hälfte des Tumors wird für die Her stellung dicker Schnitte (60–75 μm) verwendet, die unter einem Fluoreszenzstereomikroskop analysiert werden, um die Verteilung der Bakterien in den Schnitten der Tumore, die zu jedem Zeitpunkt des Experiments erhalten werden, zu beobachten. Die interessierenden Bereiche werden identifiziert, in dünne Schnitte zerteilt, präpariert und mit der Laser-Scanning-Zytometrie und dem konfokalen Mikroskop analysiert, worauf die Bildrekonstruktion folgt.
  • In parallel durchgeführten Experimenten werden Tiere mit spontanen Tumoren, wie sie in Tabelle 6 aufgezählt sind, erhalten und in intravenösen Injektionsexperimenten mit E. coli, das das bakterielle lux-Operon trägt, verwendet. Von jedem Tumormodell werden zwei Tiere verwendet, und die Luciferase-Lichtemission wird täglich unter der bildgebenden Schwachlichtkamera beobachtet. Es wird erwartet, dass die spontan auftretenden Tumore ähnlich wie die implantierten Tumore auf der Basis der bakteriellen Luciferase-Expression abgebildet werden können. Zwei der spontanen Tumormodelle, Mäuse mit Adenokarzinomen des Dickdarms und Mäuse mit Adenokarzinomen des Brustgewebes, werden für die Experimente zur bakteriellen Lokalisierung nach der intravenösen Injektion von E. coli, das wie oben beschrieben RFP exprimiert, und L. monocytogenes, das wie oben beschrieben GFP exprimiert, verwendet. Es kann erwartet werden, dass diese Experimente die Bedeutung der Diagnose und des Proteintherapiesystems auf Bakterienbasis hervorheben. Tabelle 6 Tiermodelle mit spontanem Tumor
    Tierart Name des Stamms Tumorbeschreibung Quelle Literaturhinweis
    Maus 129/Sv-Madh3tmIpar Spontanes Adenokarzinom des Dickdarms Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME Zhu et al., Cell 94 (1988), 703
    Maus FVB/N-TgN (UPII-SV40T) 29Xrw Spontanes Adenokarzinom der Blase mit Leber-metastasen Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME Zhang et al., Cancer Res. 59 (1999), 3512
    Maus FVB-neuN (N#202) Spontanes Adenokarzinom des Brustgewebes Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME Guy et al., PNAS USA 89 (1992) 10578
    Ratte F344/CrCr1B R Spontanes Adenokarzinom der Hypophyse Charles River Laboratories, Wilmington, MA Hosokawa et al., Toxicol. Pat hol. 21 (1993), 283
  • Vergleichsbeispiel 7: Nachweis der durch Bakterien vermittelten Ausrichtung auf den Tumor und Therapie mit aus Bakterien sezerniertem Protein in Nagetieren mit implantierten oder spontanen Tumoren
  • (A) Grundprinzip
  • Wie in den vorherigen Beispielen gezeigt wurde, führt die intravenöse Injektion von lichtemittierenden Bakterien zum Eintritt, der Replikation und der Anreicherung nur in den Tumorbereichen in den Tieren. Dieser Vorgang kann durch die bildgebende Darstellung der Lichtemission in Tumoren beobachtet werden. Die Anordnung der Endostatin-Expressionsgenkassette und der Expressionsgenkassette für das chimäre Toxin in cis-Stellung zu einer lichtemittierenden Genkassette sorgt für ein indirektes Nachweissystem in vivo für ihre zeitabhängige und räumliche Zufuhr über Bakterien.
  • Die Endostatin-Genkassette und die Genkassette für das chimäre Toxin werden mit Signalpeptid-codierenden Sequenzen verknüpft, wodurch die Sekretion dieser Proteine in den extrazellulären Raum in dem Tumor oder in das Zytosol der infizierten Tumorzellen erleichtert wird. Für beide Proteine, die von den Bakterien in den extrazellulären Raum des Tumors sezerniert werden, wird erwartet, dass sie ähnlich wie direkt injizierte gereinigte Proteine funktionieren. Beide Proteine, die von L. monocytogenes in das Zytosol der infizierten Tumorzellen sezerniert werden, ähneln dem viralen Zufuhrsystem, über das früher für Endostatin berichtet wurde. Das bakterielle System kann als ein konstitutives Sekretionssystem oder als ein exogen zugeführtes, IPTG-aktivierbares Sekretionssystem in dem Tumor verwendet werden. Durch die Regulation des Expressionsniveaus der therapeutischen Proteine in Bakterien, die den Tumor besiedeln, kann die sezernierte Menge der Proteine, die das Tumorwachstum hemmen, festgelegt werden. Ohne die Zugabe von IPTG wird die Sekretion des hemmenden Proteins durch die intravenös injizierten Bakterien bei einem Minimum gehalten, während sie sich im Blutkreislauf befinden. Dies sorgt für eine zusätzliche Sicherheit für die aufnehmenden tumorösen Tiere während der Zufuhr der Bakterien. Bei Verwendung des BSPT-Systems können der Startpunkt und die Dauer der Therapie durch die Zugabe von IPTG gesteuert werden. Beim Abschluss der Behandlung kann das bakterielle Zufuhrsystem durch die Verabreichung von Antibiotika ähnlich wie bei der Behandlung eines bakteriellen Infekts entfernt werden.
  • (B) Bestimmung der Auswirkung des Endostatins und des Pseudomonas-Exotoxin/TGF-α-Fusionsproteins, die von E. coli und L. Monocytogenes sezerniert werden, auf das Tumorwachstum in Tieren mit implantierten Tumoren
  • Die hemmende Wirkung des Endostatins und die Cytotoxizität des chimären Toxins, die von E. coli und L. monocytogenes in Tumoren sezerniert werden, wird wie folgt ermittelt. Fünfunddreißig nackte Mäuse, die 10 Tage alte C6-Tumore trägen, erhalten wie folgt die Injektion eines bakteriellen Konstrukts: (a) fünf Mäuse eine Injektion von E. coli, die so manipuliert sind, dass sie das Endostatin sezernieren; (b) fünf Mäuse eine Injektion von E. coli, die so manipuliert sind, dass sie das chimäre Toxin sezernieren; (c) fünf Mäuse eine Injektion von L. monocytogenes, die so manipuliert sind, dass sie das Endostatin sezernieren; (d) fünf Mäuse eine Injektion von L. monocytogenes, die so manipuliert sind, dass sie das chimäre Toxin sezernieren; (e) fünf Mäuse eine Injektion von E. coli, die das Endostatin und das chimäre Toxin sezernieren; (f) Kontrollgruppe: fünf Mäuse, denen E. coli injiziert werden, die nur die bakterielle Luciferase exprimieren und fünf Mäuse, denen L. monocytogenes injiziert werden, die GFP exprimieren. Zum Zeitpunkt der Bakterieninjektion wird jedes Tumorvolumen ermittelt. Drei Tage nach der Injektion wird die Replikation der Bakterien in den Tumoren unter einer bildgebenden Schwachlichtkamera oder unter einem Fluoreszenzstereomikroskop beobachtet. Die Lichtemission und das Tumorvolumen werden täglich bis zu 20 Tage nach der Bakterieninjektion gemessen. Zehn Tage nach der Injektion wird von jeder Gruppe ein Tier getötet, und die Konzentration der sezernierten Proteine wird unter Anwendung der Western-Blot-Analyse analysiert. Diese Experimente zeigen eine Hemmung des Tumorwachstums in Endostatin-behandelten Tieren oder eine dramatischere Tumorrückentwicklung in Tieren, die mit chimären Toxinproteinen behandelt werden. Beim Tumorwachstum in Kontrolltieren wird nicht erwartet, dass es durch die Bakterien allein beeinträchtigt wird.
  • In einem Nachfolgeexperiment werden Mäuse mit spontanen Adenokarzinomen des Brustgewebes (Stamm FVB-neuN (N#202), Tabelle 6) verwendet, um den Effekt der sezernierten Proteine auf das Tumorwachstum zu untersuchen. Es wird ein Experimentalschema verwendet, das mit dem für die C6-Tumoranalyse beschriebenen Schema identisch ist. Nach der Beendigung der Tumortherapie wird das Vorhandensein des Endostatins oder des chimären Toxins in dem Tumorgewebe durch Western-Blot-Analyse untersucht. Ein identisches experimentelles Konzept wird verwendet, um den Effekt der IPTG-Induktion auf die Erzeugung des Endostatins und des chimären Toxins in den Bakterien in C6-Tumoren sowie in dem Mausmodell mit spontan auftretendem Brustkrebs zu untersuchen. Es wird angenommen, dass für die erfolgreiche Tumortherapie eine mehrfache IPTG-Induktion der Proteinexpression in Bakterien erforderlich sein könnte.
  • In jeder Phase der Tumorbehandlung kann es erforderlich sein, die Bakterien, die das lichtemittierende und therapeutische Gen enthalten, aus dem Tier zu entfernen. Um dieses Experiment durchzuführen, wird Mäusen mit 12 Tage alten C6-Tumoren E. coli, das die bakterielle Luciferase exprimiert, intravenös injiziert. Drei Tage nach der Injektion wird die antibiotische Therapie durch die zweimal tägliche intraperitoneale Verabreichung von Gentamicin (5 mg/kg Körpergewicht) oder des neu entwickelten Clinafloxacins (CL960) (Nichterlein et al., Zentralbi. Bakterio. 286 (1997), 401) begonnen. Diese Behandlung wird 5 Tage durchgeführt, und die Auswirkungen der Antibiotika auf die Bakterien werden durch die bildgebende Lichtemission der Tiere täglich überwacht.
  • Nach Beendigung der obigen Experimente wird erwartet, dass das Endostatin-Protein und das chimäre Toxin-Protein, die in die Tumore sezerniert werden, die Hemmung des Tumorwachstums und eine messbare Tumorverkleinerung verursachen. Es wird erwartet, dass die Tumorverkleinerung in beiden Gruppen von Nagetieren mit implantierten Tumoren und mit spontan auftretenden Tumoren erreicht wird. Experimente mit der gleichzeitigen Anwendung des sezernierten Endostatin-Proteins und des sezernierten chimären Toxin-Proteins bei der Tumorbehandlung können die erfolgsversprechendsten Ergebnisse liefern. Die Entfernung der manipulierten Bakterien aus dem Tumor durch die Verabreichung von Antibiotika ist eine zusätzliche Sicherheitsmaßnahme innerhalb der bakteriensezernierten Proteintherapie (BSPT).

Claims (48)

  1. Verwendung eines Vaccinia-Virus für die Zubereitung einer Zusammensetzung für den Nachweis eines Tumors, Tumorgewebes, von Krebs oder Metastasen in einem Subjekt, wobei 1) das Virus DNA enthält, die ein nachweisbares Protein oder ein Protein, das imstande ist, ein nachweisbares Signal hervorzurufen, codiert; 2) das Virus imstande ist, in dem Subjekt zu replizieren, nicht pathogen für das Subjekt ist und durch das Immunsystem des Subjekts erkannt wird; und 3) das Virus: a) nur auf Grund des Schutzes des Virus in der tumorösen Umgebung vor dem Entfernen aus dem Subjekt durch das Immunsystem spezifisch in einem Tumor, Tumorgewebe, Krebs oder in Metastasen verbleibt; und/oder b) nicht zwischen einer kanzerösen Zelle oder einem kanzerösen Gewebe und dem nicht kanzerösen Gegenstück dieser Zelle oder dieses Gewebes unterscheiden kann; und/oder c) nicht auf den Tumor gerichtet ist.
  2. Verwendung nach Anspruchs 1, wobei die Zusammensetzung zur systemischen Verabreichung an ein Subjekt ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zusammensetzung zur intravenösen Verabreichung an ein Subjekt ist.
  4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung zur intraperitonealen, subkutanen, intramuskulären oder intradermalen Verabreichung ist.
  5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Tumor, das Tumorgewebe, der Krebs oder die Metastasen Brust-, Prostata-, Blasen-, Gehirn-, Dickdarm-, Lungen-, Eierstock-, Bauchspeicheldrüsen-, Leber- oder Hauttumor, Tumorgewebe, Krebs oder Metastasen sind.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Virus die Sichtbarmachung eines Tumors, Tumorgewebes, von Krebs oder Metastasen erlaubt.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Virus die Sichtbarmachung eines Tumors, Tumorgewebes, von Krebs oder Metastasen außerhalb des Subjekts erlaubt.
  8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Virus den Nachweis eines Tumors, Tumorgewebes, von Krebs oder Metastasen auf der Basis eines Signals erlaubt.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Signal durch Kernspinresonanztomografie (MRI), Single-Photon-Emissions-Computertomografie (SPECT), Positronenemissionstomographie (PET), Szintigrafie, einen β+-Detektor oder einen γ-Detektor erfassbar ist.
  10. Verwendung eines der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Virus die Erfassung eines Tumors, Tumorgewebes, Krebses oder von Metastasen durch die Erfassung von Licht erlaubt.
  11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die DNA ein Protein codiert, das ein Kontrastmittel, ein Chromophor oder eine Verbindung oder einen Liganden für das Sichtbarmachen von Geweben bindet.
  12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die DNA ein fluoreszierendes oder lumineszierendes Protein codiert.
  13. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die DNA eine Luciferase und/oder ein Substrat der Luciferase codiert.
  14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die DNA ein metallbindendes Protein codiert.
  15. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Virus ein rekombinantes Virus ist, das eine rekombinante Konstruktion enthält, die einen Zellrezeptor codiert, der geeignet ist, einen nachweisbaren Liganden zu binden, zum Nachweis eines Tumors, Tumorgewebes, von Krebs oder Metastasen in einem Subjekt.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei der Zellrezeptor ein Transferrin-Rezeptor ist.
  17. Verwendung nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, wobei die Zusammensetzung weiter einen nachweisbaren Liganden enthält, an den der Rezeptor bindet.
  18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei der Ligand ein mit einem Metall markierter Ligand ist oder ein an ein Metall bindender Ligand ist.
  19. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei das Virus selektiv in dem Tumor oder Tumorgewebe angereichert wird, ohne normales Gewebe zu beeinträchtigen.
  20. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei das Virus abgeschwächt ist.
  21. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die Zusammensetzung für den Nachweis eines Tumors, Tumorgewebes, von Krebs oder Metastasen in Echtzeit ist.
  22. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die Zusammensetzung zum Nachweis eines Tumors, Tumorgewebes, von Krebs oder Metastasen innerhalb des gesamten Körpers des lebenden Subjekts ist.
  23. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Zusammensetzung zum Nachweis eines Tumors, Tumorgewebes, von Krebs oder Metastasen im Gehirn oder in der Brust eines Subjekts ist.
  24. Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Virus der LIVP-Stamm des Vaccinia-Virus ist und die DNA, die ein nachweisbares Protein codiert, ein Protein codiert, das imstande ist, Licht zu emittieren.
  25. Verwendung eines Vaccinia-Virus für die Zubereitung einer Zusammensetzung zur Behandlung eines Tumors, Tumorgewebes, von Krebs oder Metastasen in einem Subjekt, wobei: 1) das Virus DNA enthält, die ein nachweisbares Protein oder ein Protein, das imstande ist, ein nachweisbares Signal hervorzurufen, codiert; 2) das Virus imstande ist, in dem Subjekt zu replizieren, nicht pathogen für das Subjekt ist und durch das Immunsystem des Subjekts erkannt wird; 3) die Zusammensetzung für die systemische Verabreichung an ein Subjekt ist; und a) das Virus nur auf Grund des Schutzes des Virus in der tumorösen Umgebung vor dem Entfernen aus dem Subjekt durch das Immunsystem spezifisch in einem Tumor, Tumorgewebe, Krebs oder in Metastasen verbleibt; und/oder b) das Virus nicht zwischen einer kanzerösen Zelle oder einem kanzerösen Gewebe und dem nicht kanzerösen Gegenstück dieser Zelle oder dieses Gewebes unterscheiden kann; und/oder c) sich das Virus in einem Tumor, Tumorgewebe, in Krebs oder Metastasen in dem Subjekt anreichert, aber aus den nicht tumorösen Bereichen des Subjekts durch das Immunsystem entfernt wird; und/oder d) das Virus nicht auf den Tumor gerichtet ist.
  26. Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Zusammensetzung für eine intravenöse Verabreichung an ein Subjekt ist.
  27. Verwendung nach Anspruch 25 oder 26, wobei das Virus ein abgeschwächtes Virus ist.
  28. Verwendung nach einem der Ansprüche 26 bis 27, wobei sich das Virus selektiv in dem Tumor oder Tumorgewebe anreichert, ohne normales Gewebe zu beeinträchtigen.
  29. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 28, wobei das Virus eine DNA enthält, die eine Zusammensetzung codiert, die für die Behandlung eines Tumors geeignet ist.
  30. Die Verwendung nach Anspruch 29, wobei die DNA ein cytotoxisches Protein, ein cytostatisches Protein, einen Inhibitor der Angiogenese, ein die Apoptose stimulierende Protein, ein Protein, das einen Elongationsfaktor hemmt, ein sich an eine ribosomale Untereinheit bindendes Protein, ein nukleotidveränderndes Protein, eine Nuclease, eine Protease, ein Cytokin, ein Enzym oder einen Rezeptor codiert.
  31. Die Verwendung nach Anspruch 29, wobei die zur Behandlung eines Tumors geeignete Zusammensetzung rsCD40L, Fas Ligand, TRAIL, TNF, Anti-GA733-2, Microcin E492, das Diphterietoxin, Pseudomona-Exotoxine, Shiga-Toxin, Endostatin, Glucuronidase, β-Galactosidase, Thymidinkinase, Meerrettichperoxidase, Carboxypeptidase G2, Cytochrom P450, Nitroreductase, Cytosin Deaminase, Carboxylesterase, Tyrosinase oder Verotoxin I ist.
  32. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 31, wobei das Virus die Sichtbarmachung eines Tumors, Tumorgewebes, von Krebs oder Metastasen erlaubt.
  33. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 31, wobei das Virus die Sichtbarmachung eines Tumors, Tumorgewebes, von Krebs oder Metastasen außerhalb des Subjekts erlaubt.
  34. Verwendung nach einem der Ansprüche 26 bis 31, wobei das Virus den Nachweis eines Tumors, Tumorgewebes, von Krebs oder Metastasen auf der Basis eines Signals erlaubt.
  35. Verwendung nach Anspruch 34, wobei das Signal durch Magnetresonanztomografie (MRT), Single-Photon-Emissions-Computertomografie (SPECT), Positronenemissionstomographie (PET), Szintigraphie, einen β+-Detektor oder einen γ-Detektor nachweisbar ist.
  36. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 34, wobei das Virus den Nachweis eines Tumors, Tumorgewebes, Krebses oder Metastasen durch die Erfassung von Licht erlaubt.
  37. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 36, wobei der Tumor, das Tumorgewebe, der Krebs oder die Metastasen, Brust-, Prostata-, Blasen-, Gehirn-, Dickdarm-, Lungen-, Eierstock-, Bauchspeicheldrüsen-, Leber- oder Hauttumor, Tumorgewebe, Krebs oder Metastasen sind.
  38. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 33, wobei die DNA, die ein nachweisbares Protein oder ein Protein, das geeignet ist, ein nachweisbares Signal hervorzurufen, codiert, ein Protein codiert, das ein Kontrastmittel, Chromophor oder eine Verbindung oder einen Liganden zur Sichtbarmachung von Geweben binden kann.
  39. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 33, wobei die DNA, die ein nachweisbares Protein oder ein Protein codiert, das imstande ist, ein nachweisbares Signal hervorzurufen, ein Protein codiert, das imstande ist, Licht zu emittieren oder eine Lichtemission hervorzurufen.
  40. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 33, wobei die DNA, die ein nachweisbares Protein oder ein Protein codiert, das imstande ist, ein nachweisbares Signal hervorzurufen, ein fluoreszierendes oder lumineszierendes Protein codiert.
  41. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 33, wobei die DNA, die ein nachweisbares Protein oder ein Protein codiert, das imstande ist, ein nachweisbares Signal hervorzurufen, eine Luciferase und/oder ein Substrat einer Luciferase codiert.
  42. Verwendung nach Anspruchs 40, wobei das Konstrukt das GFP oder das RFP codiert.
  43. Verwendung nach einem der Ansprüche 26 bis 37, wobei die DNA, die ein nachweisbares Protein oder ein Protein codiert, das imstande ist, ein nachweisbares Signal hervorzurufen, ein metallbindendes Protein codiert.
  44. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 43, wobei das Virus ein rekombinantes Virus ist, das ein rekombinantes Konstrukt enthält, das einen Zellrezeptor codiert, der zur Bindung: a) eines nachweisbaren Liganden zu Nachweis eines Tumors, Tumorgewebes, von Krebs oder Metastasen in einem Subjekt; und/oder b) eines therapeutischen Liganden zur Tumortherapie geeignet ist.
  45. Verwendung nach Anspruch 44, wobei der Zellrezeptor ein Transferrin-Rezeptor ist.
  46. Verwendung nach Anspruch 45 oder Anspruch 47, wobei die Zusammensetzung weiter einen nachweisbaren Liganden enthält, an den der Rezeptor bindet.
  47. Verwendung nach Anspruch 46, wobei der Ligand ein mit einem Metall markierter Ligand ist oder ein an ein Metall bindender Ligand ist.
  48. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 29, wobei das Virus der LIVP-Stamm des Vaccinia-Virus ist und die ein nachweisbares Protein codierende DNA ein Protein codiert, das imstande ist, Licht zu emittieren.
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