DE602005006294T2

DE602005006294T2 - Reinigungsverfahren für bakterielles cytolysin

Info

Publication number: DE602005006294T2
Application number: DE602005006294T
Authority: DE
Inventors: Ralph L. Biemans; Carine Goraj; Emmanuel Mertens; A. Vandercammen
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2004-09-22
Filing date: 2005-09-20
Publication date: 2008-08-14
Anticipated expiration: 2025-09-21
Also published as: GB0421083D0; HRP20080242T3; PT1791860E; CY1107960T1; WO2006032499A1; DE602005006294D1; CA2580113A1; ATE393165T1; JP4934591B2; EP1791860A1; US20070231876A1; PL1791860T3; DK1791860T3; SI1791860T1; EP1791860B1; JP2008513408A; CA2580113C; ES2304724T3

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der bakteriellen Cytolysin-Reinigung und insbesondere ein Verfahren der Reinigung von Pneumolysin. Pneumolysin ist ein Protein aus Streptococcus pneumoniae mit guten antigenen Eigenschaften, das als ein Impfstoffbestandteil gegen S. pneumoniae-Infektion oder Otitis media geeignet ist. Das Verfahren der Erfindung beschreibt einen ungewöhnlichen und vorteilhaften Schritt der Reinigung von Pneumolysin in einem einzelnen chromatographischen Schritt durch Bindung von ihm an eine hydrophobe Wechselwirkungssäule in der Gegenwart eines Detergens und Hochsalzes. Das Verfahren verwendet vorteilhafterweise die Eigenschaft der hohen Affinität der bakteriellen Cytolysine für aromatische Verbindungen, die Cholesterin ähneln, insbesondere, wenn sie in einem aggregierten Zustand vorliegen und daher allgemein für die Reinigung von Mitgliedern in dieser Familie von Toxin anwendbar sein werden. Ein weiterer vorteilhafter Aspekt der Erfindung ist das Herstellen der Probe, die auf die Säule geladen wird, durch ein Verfahren des mechanischen Bruchs und Vorfiltration.
Thiol-aktivierte Cytolysine bilden eine hervortretende Gruppe von bakteriellen Toxinen, von denen Streptolysin O der Prototyp ist (Billington et al., FEMS Microbiol. Lett. (2000), 182; 197–205). Diese Toxine sind für eukaryotische Zellen durch die Bildung von Poren in der Zellmembran lytisch. Oxidierende Wirkstoffe beeinflussen ihre cytolytische Aktivität negativ, während reduzierende Wirkstoffe ihre Aktivität wieder herstellen können. Mitglieder dieser Gruppe zeigen eine 30 bis 60%ige Ähnlichkeit in der primären Aminosäuresequenz und enthalten eine fast invariante Undecapeptid-Sequenz nahe dem C-Terminus. Cholesterin ist der Hauptzielzellrezeptor für diese Toxine. Die Cytolysine binden an Cholesterinenthaltende Membrane und oligomerisieren, um Transmembranporen bis zu 30 nm im Durchmesser und bestehend aus 40 bis 80 Monomer-Untereinheiten zu bilden. Die Bindung von Membrancholesterin induziert eine konformationelle Änderung im Toxin-Monomer, was die darauffolgenden Ereignisse der Oligomerisierung, Membraninsertion und Porenbildung antreibt.
Streptococcus pneumoniae ist der Krankheitserreger von verschiedenen menschlichen Erkrankungen, einschließlich Pneumonie, Bakteriämie, Meningitis, Otitis media und Sinusitis. Manchmal können diese Erkrankungen trotz der Erhältlichkeit von Antibiotika zum Tode führen. Das Auftreten von Antibiotika-resistenten Stämmen von S. pneumoniae hat die Probleme, die durch dieses Pathogen hervorgerufen werden, verschlimmert. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, daß effektive Impfstoffe gegen S. pneumoniae entwickelt werden.
Polyvalente Pneumokokken-Impfstoffe, die gereinigte kapsuläre Polysaccharide enthalten, sind seit mehreren Jahren erhältlich. Ihre Anwendung wird durch schlechte Immunogenität begrenzt, insbesondere bei Hochrisikogruppen, einschließlich Kindern, älteren Menschen und denjenigen mit Sichelzellenanämie, multiplem Myelom, Zirrhose und Alkoholismus. Sie stellen auch einen Serotyp-spezifischen Schutz bereit, und durch die existierenden Formulierungen werden nur 23 von 90 bekannten Serotypen abgedeckt. Dies ergibt einen Schutz gegen 90% der Serotypen, die in der US-Population gefunden werden, aber nur gegen ungefähr 70% der Serotypen, die in den asiatischen Populationen gefunden werden. Kürzlich wurde ein konjugierter 7-valenter Impfstoff erhältlich, der ähnliche Probleme beim Schutz gegen alle Pneumokokken-Stämme aufweist.
Pneumolysin (Ply) ist ein 53 kDa Thiol-aktiviertes Cytolysin, das in allen Stämmen von S. pneumoniae gefunden wird, das bei Autolyse freigesetzt wird und zu der Pathogenese von S. pneumoniae beiträgt. Es ist hochkonserviert, wobei nur wenig Aminosäuresubstitutionen zwischen den Ply-Proteinen von verschiedenen Serotypen auftreten. Der hohe Grad der Konservierung von Pneumolysin und seine Immunogenität machen es zu einem potentiellen Kandidaten als Impfstoffbestandteil. Wildtyp-Ply ist jedoch für einen Einschluß in Impfstoffe für die Verwendung bei Menschen wegen seiner Toxizität ungeeignet. Ply ruft Schaden an den Zellmembranen durch Wechselwirkung mit Membran-gebundenem Cholesterin und Oligomerisierung, um Poren in der Membran zu bilden, hervor. Ein konserviertes Cystein-enthaltendes Motiv, das nahe dem C-Terminus gefunden wird, scheint in die lytische Aktivität verwickelt zu sein. Es wurden Mutationen von Ply vorgeschlagen, um diese Toxizität zu senken ( WO 90/06951 , WO 99/03884 ).
Es wurde ein Zweischrittverfahren für die Reinigung von Pneumolysin durch Lock et al. (Microbial Pathogenesis (1996) 21; 71–86) beschrieben.
Rekombinantes Pneumolysin wurde aus einer E. coli-Kultur unter Verwendung einer Kombination von Ionenaustausch- und Gelfiltrations-Chromatographien gereinigt. Das Verfahren involviert die Schritte der Herstellung eines Extraktes, dem man eine DEAE-Sepharose-Säule, gefolgt von einer Sephacryl S200-HR-Säule hinunterfließen läßt. Dieses Verfahren könnte verwendet werden, um rekombinantes oder natives Pneumolysin zu reinigen.
Kuo et al. beschreibt ein Verfahren der Reinigung von rekombinantem GST-Pneumolysin-Fusionsprotein (Infection and Immunity (1995) 63; 2706–2713). Das Fusionsprotein wird in einer E. coli-Kultur exprimiert, und ein Zelllysat wird auf ein Glutathion-Agarosegel geladen. Dieses Fusionsprotein wird mit Glutathion eluiert und Thrombin kann verwendet werden, um das Fusionsprotein zu spalten. Die Proteine läßt man wieder über eine Glutathion-Agarosesäule fließen, um GST zu entfernen. Das Affinitätsgereinigte Pneumolysin wurde unter Verwendung einer Hydroxylapatit-Säule weiter gereinigt.
Mitchell et al. (BBA (1989) 1007; 67–72) beschreibt ein Verfahren der Reinigung von Pneumolysin unter Verwendung von hydrophober Wechselwirkungs-Chromatographie. Unter den Bedingungen, die sie verwenden (250 mM NaCl) schafft es das Pneumolysin nicht eng an die Säule zu binden, obwohl seine Vorwärtsbewegung verzögert wurde und das Pneumolysin als ein breiter Peak eluierte. Zusätzliche Schritte der Bestimmung, welche Fraktionen reines Pneumolysin enthielten, Konzentration der positiven Fraktionen, erneute Ladung auf die Säule und Elution mit einer kleinen Menge Wasser waren nötig, um das Problem des Pneumolysins, das an das Säulenmaterial nicht eng band, zu überwinden.
Es bleibt ein anhaltender Bedarf für verbesserte Impfstoffe gegen S. pneumoniae. Der Einschluß eines Ply-Bestandteils ist vielversprechend, obwohl die Toxizität des Proteins ein Problem bleibt. Die Entwicklung eines schnellen und effektiven Verfahrens für die Massenreinigung von Pneumolysin ist auch erforderlich. Die Verfahren, die zuvor beschrieben wurden, involvieren die Verwendung von multiplen Reinigungsschritten mit dazwischenliegenden Test- und Konzentrationsschritten. Die vorliegende Erfindung stellt ein effizienteres Reinigungsverfahren bereit, das vorteilhafterweise einen einzelnen Chromatographieschritt verwendet, der in der Lage ist, zur Reinigung von großen Chargen von Pneumolysin verwendet zu werden.
Beschreibung der Figuren
1 – SDS-PAGE-Gele, die die Reinigung von Pneumolysin zeigen.
Tafeln A und B zeigen die Reinigung von Pneumolysin gemäß dem Verfahren aus Beispiel 1. Tafel A zeigt das Gel nach einer Coomassieblau-Färbung. Tafel B zeigt das Gel nach Durchführung eines Western-Blotings unter Verwendung von Anti-E.coli-Antikörpern zur Sondierung auf kontaminierende Proteine.
Die folgenden Proben ließ man auf SDS-PAGE-Gelen laufen: Bahn 1 – Molekulargewicht-Standards, Bahn 2 – Überstand von Zellextrakt, Bahn 3 – Phenyl-Sepharose-Durchlauf, Bahn 4 – Phenyl-Sepharose, erstes Waschen, Bahn 5 – Phenyl-Sepharose zweites Waschen, Bahn 6 – Phenyl-Sepharose-Wäsche mit 0,5 M NaCl, Bahn 7 – Phenyl-Sepharose-Elution mit Niedrigsalzpuffer, Bahn 8 – Pneumolysin nach Denaturierung/Rückfaltungsschritten, Bahn 9 – Pneumolysin nach Sterilisieren der Filtration.
Tafel C zeigt ein Coomassie-gefärbtes Gel, das die Reinigung von Pneumolysin gemäß dem Verfahren aus Beispiel 2 zeigt.
Die folgenden Proben ließ man auf SDS-PAGE-Gelen laufen: Bahn 1 – Molekulargewicht-Standards, Bahn 2 – Fermentor-Brühe, Rannie-behandelt, Bahn 3 – Brühe, Filter-geklärt, Bahn 4 – Filter-geklärte Probe, verdünnt auf OD60, Bahn 5 – Phenyl-Sepharose-Durchfluß, Bahn 6 – Phenyl-Sepharose-Wäsche, Bahn 7 – Phenyl-Sepharose-Wäsche mit 0,5 M NaCl, Bahn 8 – Phenyl-Sepharose-Elution mit niedrigem Salzpuffer, Bahn 9 – Pneumolysin nach Sterilfiltration.
2 – SDS-PAGE-Analyse von GMBS (N-(γ-Maleinimdobutyryloxy)succimidester) modifiziertes Pneumolysin – Coomassieblau-gefärbt.
Die folgenden Proben wurden auf einem SDS-PAGE-Gel laufen gelassen: Bahn 1 – Molekulargewicht-Standards, Bahn 2 – nicht-modifiziertes Pneumolysin, Bahn 3 – PLY, behandelt mit GMBS in einem molekularen Verhältnis von GMBS/Lysin von 4/1, Bahn 4 – PLY, behandelt mit GMBS in einem molekularen Verhältnis von GMBS/Lysin von 4/1 und für 7 Tage bei 37°C inkubiert, Bahn 5 – PLY, behandelt mit GMBS in einem molekularen Verhältnis von GMBS/Lysin von 8/1, Bahn 6 – PLY behandelt mit GMBS in einem molekularen Verhältnis von GMBS/Lysin von 8/1 nach Inkubation von 7 Tagen bei 37°C, Bahn 7 – PLY, behandelt mit Sulfo-NHS-Acetat in einem molekularen Verhältnis von NHS/Lysin von 10/1, Bahn 8 – PLY, behandelt mit NEM, Bahn 9 - PLY, behandelt mit NEM nach 7 Tagen Inkubation bei 37°C.
3 – Toxizität von GMBS-behandeltem Pneumolysin, das intranasal an Mäuse verabreicht wurde. Die mit Rauten markierte Linie zeigt die Überlebensrate von Mäusen an, die mit 2 μg nativem Pneumolysin exponiert wurden. Die mit Quadraten markierte Linie zeigt die Überlebensrate von Mäuse an, die mit 10 μg GMBS-behandeltem Pneumolysin exponiert wurden.
4 – Schutz, der durch GMBS-behandeltes Pneumolysin in Mäusen induziert wurde, die intranasal mit nativem Pneumolysin exponiert wurden. Die mit Rechtecken markierte Linie zeigt die Überlebensrate bei Mäusen, die mit einem Adjuvans alleine geimpft wurden. Die mit Rauten markierte Linie zeigt die Überlebensrate von Mäusen an, die mit nativem Pneumolysin geimpft wurden. Die mit Quadraten markierte Linie zeigt die Überlebensrate für Mäuse an, die mit GMBS-behandeltem Pneumolysin geimpft wurden.
5 – Schutz, der durch Impfung mit PhtD- und GMBS-behandeltem Pneumolysin bei Mäusen induziert wurde, die intranasal mit dem Pneumokokken-Stamm 2 D39 exponiert wurden. Die mit Rechtecken markierte Linie stellt die Überlebensrate für Mäuse dar, die mit Adjuvans alleine geimpft wurden. Die Rauten markierte Linie stellt die Überlebensrate für Mäuse dar, die mit PhtD geimpft wurden. Die mit Rechtecken markierte Linie stellt die Überlebensrate für Mäuse dar, die mit PhtD und GMBS-behandeltem Pneumolysin geimpft wurden.
6 – ELISA-Ergebnisse, die Anti-Polysaccharid-IgG-Antikörper-Niveaus nach Impfung mit reinem 4-valentem Polysaccharid oder 4-valentem Polysacchariden, konjugiert an GMBS-enttoxifizierten Pneumolysin. Tafel A zeigt Niveaus von Anti-PS8-IgG. Tafel B zeigt Niveaus von Anti-PS12F-IgG. Tafel C zeigt Niveaus von Anti-PS19F-IgG. Tafel B zeigt Niveaus von Anti-PS22F-IgG.
7 – Opsono-Phagocytose-GMTs nach Impfung mit reinem 4-valentem Polysaccharid oder 4-valentem Polysacchariden, konjugiert an GMBS-enttoxifizierten Pneumolysin. Tafel A zeigt Ergebnisse eines Anti-Typ-8-Opsonophagocytose-Tests. Tafel B zeigt Ergebnisse eines Anti-Typ-12F-Opsonophagocytose-Tests. Tafel C zeigt Ergebnisse eines Anti-Typ-19F-Opsonophagocytose-Tests. Tafel B zeigt Ergebnisse eines Anti-Typ-22F-Opsonophagocytose-Tests.
Ausführliche Beschreibung
Verfahren
Das Verfahren der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung eines bakteriellen Cytolysins wie Pneumolysin. Ein Cytolysin, zum Beispiel Pneumolysin, wird unter Verwendung von nur einem einzigen Säulenchromatographieschritt gereinigt. Das Protein wird in einer aggregierten Form an eine hydrophobe Wechselwirkungssäule in Gegenwart eines Detergens und Salzes gebunden. Wenige Proteine binden unter diesen Bedingungen an die Säule, was die Reinigung eines Cytolysins in einem einzelnen Schritt erlaubt. Das Verfahren der Erfindung ist insbesondere für eine Massenaufreinigung von Cytolysin anwendbar, da in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eine Zentrifuge während der Herstellung eines Lysats nicht verwendet wird, das auf die Säule beladen wird. Die Verwendung einer Zentrifuge ist oft ein limitierender Schritt im Herstellungsverfahren. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird der Denaturierungs/Rückfaltungsschritt an Aufkonzentrationen von Cytolysin von typischerweise mehr als 100 μg/ml durchgeführt.
Für die Zwecke der Erfindung ist ein lösliches Aggregat eines Cytolysins, vorzugsweise Pneumolysin, eine aggregierte Form des Cytolysins, die nach der Zentrifugation bei 30 000 g für 20 Minuten im Überstand verbleibt. Das lösliche Aggregat wird auf einem hydrophoben Wechselwirkungschromatographiematerial, vorzugsweise Phenyl-Sepharose, in Gegenwart eines Detergens und Hochsalzes, vorzugsweise 1 M, zurückgehalten. Optional ist das lösliche Aggregat kolloidal.
Eine Salzkonzentration schließt die Konzentration aller Salze einschließlich Puffersalze ein, die in einer Lösung oder Suspension vorliegen.
Für die Zwecke der Erfindung haben Niedrigsalzbedingungen eine Leitfähigkeit von weniger als 5 mS/cm, vorzugsweise 1–2 mS/cm. Hochsalzbedingungen haben eine Leitfähigkeit von mehr als 30 mS/cm, vorzugsweise größer als 50 mS/cm, besonders bevorzugt von 60–80 mS/cm.
Das Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, wird an die Säule als ein lösliches Aggregat gebunden. Es ist aus verschiedenen Gründen ungewöhnlich, Aggregate auf eine Säule zu laden, einschließlich Verstopfung von Filtern und Säulen und Verlust an Material. Durch Verwendung eines Detergens, vorzugsweise bei alkalischem pH, das die Größe der Aggregate reduziert, um ein lösliches Aggregat zu bilden, wird jedoch gefunden, daß diese Aggregate unter Detergensbedingungen fest an die Säule binden, aber in einer Reinheit von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, vorzugsweise 90%, 95%, besonders bevorzugt 97%, 98% oder 99%, wie durch SDS-PAGE-Analyse bestimmt wird, ohne nachteilige Beeinflussung der Säulenfilter eluiert werden können. Das Verfahren ergibt vorzugsweise eine Ausbeute von mindestens 100, 200, 500, 700, besonders bevorzugt 1000, 1500, 1700 oder 1900 mg Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin pro Liter Fermentation. Vorzugsweise werden mindestens 1%, 2%, 5%, 7%, 9% oder 10% des Proteins aus der Fermentationskultur als gereinigtes Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, gewonnen.
Das Verfahren nutzt die Fähigkeit des Cytolysins wie Pneumolysin aus, an Cholesterin und andere aromatische Verbindungen zu binden. Diese Bindung ist besonders eng, wenn das Cytolysin aggregiert ist, was es dem Cytolysin erlaubt, in Gegenwart von Detergens zu binden. Das Verfahren kann auf andere Mitglieder der Cytolysin-Familie ausgedehnt werden, da alle Mitglieder die Fähigkeit teilen, an aromatische Verbindungen zu binden und Poren zu bilden. Tatsächlich könnte das Verfahren verwendet werden, um an andere Proteinfamilien, die an Cholesterin oder andere aromatische Verbindungen binden und/oder Poren bilden, vorzugsweise beides, zu reinigen.
Gemäß einer ersten Ausführungsform wird ein Verfahren zur bakteriellen Cytolysin-Reinigung bereitgestellt, umfassend die Schritte:

a) Züchten einer Kultur von Zellen, die bakterielles Cytolysin exprimieren;
b) mechanisches Aufbrechen der Zellkultur, um einen Extrakt zu bilden;
c) Vorfiltrieren des Extrakts;
d) Binden von löslichem aggregiertem bakteriellem Cytolysin, das im Extrakt enthalten ist, in Gegenwart eines Detergens (vorzugsweise aliphatischem Detergens) an ein hydrophobes Wechselwirkungs-Chromatographiemateriel unter Hochsalzbedingungen (vorzugsweise 0,5–2 M Salz);
e) Eluieren von bakteriellem Cytolysin in Gegenwart von Detergens (vorzugsweise aliphatischem Detergens) unter Niedrigsalzbedingungen (vorzugsweise 0–0,2 M Salz).

In einer zweiten Ausführungsform wird ein Verfahren zur bakteriellen Cytolysin-Reinigung bereitgestellt, umfassend die Schritte:

a) Züchten einer Kultur von Zellen, die bakterielles Cytolysin exprimieren;
b) mechanisches Aufbrechen der Kultur von Zellen, um einen Extrakt zu bilden;
c) Vorfiltrieren des Extrakts;
d) Binden von bakteriellem Cytolysin, das im Extrakt enthalten ist, an ein hydrophobes Wechselwirkungs-Chromatographiematerial in Gegenwart einer Lösung, die 0,5–2 M oder 0,7–1,5 M, vorzugsweise 0,8–1,2 M Salz und 0,1%–1,5%, vorzugsweise 0,5–1,2% Detergens enthält;
e) Eluieren von bakteriellem Cytolysin unter Verwendung einer Niedrigsalzlösung (vorzugsweise 0–0,2 M Salz), die 0,1–1,5%, vorzugsweise 0,5–1,2% Detergens enthält.

Bei jeder der obigen Ausführungsformen umfaßt das Verfahren der Erfindung vorzugsweise die weiteren Schritte:

f) Entfernen von Detergens von dem bakteriellen Cytolysin;
g) Löslichmachen des bakteriellen Cytolysin durch Zugabe eines Denaturierungsmittels;
h) Entfernung des Denaturierungsmittels von dem bakteriellen Cytolysin.

Die folgende Beschreibung der Erfindung betrifft jedes der vorstehend aufgeführten Ausführungsformen.
Das Verfahren der Erfindung kann vorteilhaft verwendet werden, um Pneumokokken-Pneumolysin zu reinigen. Andere Cytolysine, die durch das Verfahren der Erfindung gereinigt werden können, beinhalten Pyolysin von A. pyogenes, Cereolysin von B. cereus, Thuringiolysin O von B. thuringiensis, Laterosporolysin von B. latersporus, Bifermentolysin von C. bifermentans, Botukinolysin von C. botulinum, Chauveolysin von C. chauvoel, Histolyticolysin von C. histolyticum, Oedematolysin von C. novyi Typ A, Perfringolysin O von C. perfringens, Septicolysin O von C. septicum, Sordellilysin von C. sordellii, Tetanolysin von C. tetani, Ivanolysin O von L. ivanovi, Listeriolysin O von L. monocytogenes, Seeligerlysin O von L. seeligeri, Alveolysin von P. alvei, Streptolysin O von S. pyogenes, S. canis oder S. equisimilis, Intermedilysin von S. intermedius, Suilysin von S. suis oder Pneumolysin von S. pneumoniae, die Wildtyp oder genetisch modifizierte Toxine mit niedrigen Toxizitätsspiegeln sein können, wie PdA und PdB ( WO 90/06951 , WO 99/03884 ).
Mit Pneumolysin oder Ply wird gemeint: natives Pneumolysin von Pneumokokkus oder rekombinantes Pneumolysin, Wildtyp-Pneumolysin oder Mutanten von Pneumolysin (z. B. diejenigen, die in WO 90/06951 und WO 99/03884 ) beschrieben werden. Gegebenenfalls kann Pneumolysin auch irgendein Fragment von Pneumolysin oder irgendeine Variante von Pneumolysin bedeuten, die wenigstens 70, 80, 90 oder 95% Aminosäuresequenz-Identität mit einer Wildtyp-Pneumolysinsequenz teilt (wie offenbart in Walter et al. 1987, Infect. Immun. 55; 1184–9 oder Mitchell et al. 1990, Nucleic Acids Res. 18; 4010), die noch die Fähigkeit behält, durch die Verfahren der Erfindung gereinigt zu werden, wie durch einen Fachmann einfach bestimmt werden kann.
Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung liegt das gleiche Detergens in den Schritten b) und d), b) und e), d) und e), besonders bevorzugt in den Schritten b), d) und e) vor. Vorzugsweise liegt das gleiche Detergens im Schritt c) wie in den Schritten b) und d), b) und e), oder d) und e), besonders bevorzugt in den Schritten b), d) und e) vor. Das Detergens liegt vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1% bis 1,5% (G/V), besonders bevorzugt von 0,5% bis 1,2% (G/V) oder in etwa 1% (G/V) vor. Für die Zwecke der Erfindung ist ein aliphatisches Detergens als ein im wesentlichen aliphatisches Detergens mit unzureichendem aromatischen Charakter definiert, um die Bindung von Cytolysin an die Säule in Schritt d) zu verhindern. Vorzugsweise wird das Detergens einen oder weniger aromatische Ringe aufweisen, am meisten bevorzugt besitzt es keine aromatischen Ringe. Während Schritt b) ist es für das Detergens, vorteilhaft, größere Aggregate von Cytolysin in kleinere Aggregate aufzubrechen, was für ein lösliches Aggregat sorgt. Während den Schritten d) und e) erhält das Detergens günstigerweise den löslich aggregierten Zustand des Cytolysins, was es ihm erlaubt, an die Säule bei Hochsalzbedingungen mit hoher Affinität zu binden.
Das Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, wird in einer Kultur von bakteriellen Zellen, vorzugsweise S. pneumoniae, E. coli oder alternativ in Hefezellen, Insektenzellen, Säugerzellen oder irgendeinem anderen Expressionssystem, das für seine Expression geeignet ist, exprimiert. Bei Expressionssystemen, die hohe Ausbeuten an Pneumolysin herstellen, aggregiert das Pneumolysin oft von selbst, und das Verfahren der Erfindung ist für seine Reinigung ideal. Vorzugsweise wird das Pneumolysin in hohen Ausbeute exprimiert, so daß es mehr als 2, 3, 4, 5, 7 oder 10% des Gesamtproteins im Expressionssystem ausmacht. Vorzugsweise liegt das Pneumolysin in aggregierter Form vor und/oder ist größtenteils ohne hämolytische Aktivität. Zum Beispiel ist die Expression von E. coli in einem Fermenter unter einem Phagen λ-Promotor oder anderen Promotoren, die eine hohe Expression erlauben, einem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt.
Vorzugsweise wird das Cytolysin aus dem Expressionssystem als ein Aggregat extrahiert. Alternativ kann ein Niederausbeuteexpressionssystem lösliches Cytolysin bereitstellen. In diesem Fall wird der Extrakt, der Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, enthält, auf einen pH unter 7,5 eingestellt, was es dem Cytolysin ermöglicht, über einen Zeitraum von mindestens 8 Stunden, mindestens 24 Stunden zu aggregieren.
Das mechanische Aufbrechen im Schritt b) involviert vorzugsweise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehrere Schritte des mechanischen Aufbrechens der Zellen (gegebenenfalls durch Rannie-Passieren) und/oder Behandlung der Zellen mit Detergens. Wenn mit einem Hochausbeuteverfahren hergestellt, bleibt das Pneumolysin in der Form von Aggregaten, aber die Aggregate sollten klein genug sein, daß sie im Überstand nach Zentrifugation der Probe unter Bedingungen, die für die Pelletierung unlöslicher zellulärerer Abfallprodukte notwendig sind, verbleiben. Vorzugsweise ist das Detergens, das bei der Erfindung verwendet wird, ein aliphatisches Detergens, das keine aromatischen Ringe enthält, vorzugsweise ein ionisches Detergens, besonders bevorzugt ein kationisches oder anionisches Detergens und am meisten bevorzugt ist das Detergens Natriumlauroylsarcosinat. Bevorzugte Detergentien sind in der Lage, Pneumolysin zu solubilisieren, während sie es in der Form von kleinen Aggregaten belassen, die an die hydrophobe Wechselwirkungssäule binden, ohne eine Blockierung von Filtern, die an der. Säule angebracht sind, hervorzurufen. Bevorzugte Detergentien sind in der Lage, die Größe von Pneumolysin-Aggregaten zu reduzieren, was es den Pneumolysin-Aggregaten erlaubt, ausreichend klein zu sein, so daß sie nach der Zentrifugation der Probe bei 30 000 g für 20 Minuten im Überstand verbleiben. Solche löslichen Aggregate sind als solche auf der hydrophoben Wechselwirkungssäule reinigungsfähig. Das Detergens liegt in einer Konzentration zwischen 0,1% und 1,5%, vorzugsweise 0,5 und 1,2% (G/V), besonders bevorzugt in etwa 10% vor. Vorzugsweise ist das Detergens dialysierbar.
Nach mechanischem und/oder Detergensaufschluß der Zellen in Schritt b) beinhaltet das Verfahren der Erfindung einen Vorfiltrationsschritt c) zum Entfernen von großem aggregiertem Material, das die Säule in nachfolgenden Schritten blockieren könnte. Vorzugsweise verwendet der Vorfiltrationsschritt einen Filter mit einer Porengröße mit 0,45 μm, 0,65 μm, 1,2 μm, 2,45 μm, oder 5 μm. Vorzugsweise weist der Filter eine Porengröße von 0,45 bis 2,5 μm oder 0,6 bis 1,2 μm auf. Vorzugsweise ermöglicht das mechanische Aufbrechen und die Vorfiltrationsschritte dem Verfahren der Erfindung die Verwendung einer Zentrifugation zu vermeiden.
Gegebenenfalls enthält das Verfahren der Erfindung einen Vorinkubationsschritt, bei dem die Kultur von Zellen mit Detergens vor dem mechanischen Aufbrechen der Kultur von Zellen inkubiert wird. Der Vorinkubationsschritt involviert die Zugabe des Detergens, wie vorstehend beschrieben, für wenigstens 1, 5, 10, 20, 30, 60 oder 120 Minuten vor dem mechanischen Aufbrechen der Kultur von Zellen.
Vorzugsweise wird Schritt b) und/oder c) bei alkalischem pH durchgeführt, vorzugsweise einem pH von 8 bis 10, 8,5 bis 9,5 oder in etwa 9. Vorzugsweise werden die Schritt f), g) und h) bei alkalischem pH durch geführt, vorzugsweise einem pH von 8 bis 10, 8,5 bis 9,5 oder in etwa 9. Vorzugsweise werden der Schritt d) und/oder e) bei neutralem pH durchgeführt, vorzugsweise einem pH von 6 bis 8, 6,5 bis 7,5 oder in etwa 7. Vorzugsweise wird Schritt b) und/oder c) bei einer Salzkonzentration von 0 bis 0,1 M, besonders bevorzugt 10 bis 50 mM oder 20 bis 30 mM durchgeführt. Vorzugsweise werden die Schritte f), g) und h) bei einer Salzkonzentration von 0 bis 0,1 M, besonders bevorzugt 10 bis 50 mM oder 20 bis 30 mM durchgeführt.
Das Verfahren der Erfindung verwendet hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie, um das Pneumolysin in einem einzelnen Schritt zu reinigen. Das Säulenmaterial, das in Schritt d) verwendet wird, enthält vorzugsweise aromatische Gruppen, vorzugsweise Phenyl-Gruppen, und besonders bevorzugt ist es Phenyl-Sepharose.
Die Lösung, die in Schritt d) und/oder e) während der Behandlung und Elution der Säule verwendet wird, umfaßt ein anionisches Detergens, vorzugsweise ein kationisches oder anionisches Detergens, vorzugsweise ein Detergens, das bei Salzkonzentrationen über 0,5 M löslich ist, am meisten bevorzugt ist das Detergens Natriumlauroylsarcosinat. Das verwendete Detergens ist eines, das die Größe von Cytolysin-, vorzugsweise Pneumolysin-, Aggregaten reduzieren wird, was es dem Cytolysin erlaubt, als ein lösliches Aggregat in der Probe vorzuliegen, so daß es an das hydrophobe Wechselwirkungs-Säulenmaterial bindet, ohne irreversibel an der Säule festzuhängen. Das Detergens liegt in einer Konzentration von vorzugsweise zwischen 0,1% und 1,5%, vorzugsweise 0,5% und 1,2% (G/V), besonders bevorzugt zwischen 0,75% und 1,2%, am meisten bevorzugt in etwa 1% vor.
Die Lösung, die in Schritt d) und/oder e) verwendet wird, enthält ein Salz, vorzugsweise ein Salz, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Natriumchlorid, Magnesiumchlorid, Ammoniumchlorid, Natriumsulfat, Magnesiumsulfat, Ammoniumsulfat, Natriumphosphat, Magnesiumphosphat und Ammoniumphosphat besteht, und ist vorzugsweise bei pH 6 bis 8, vorzugsweise um pH 7 herum gepuffert. Jeder Puffer, der in der Lage ist, den pH zwischen 6 und 9 zu erhalten, kann verwendet werden.
Die Lösung, die verwendet wird, um Pneumolysin an die Säule beim Verfahren der Erfindung zu binden, enthält eine hohe Salzkonzentration, vorzugsweise 0,6 bis 2 M, besonders bevorzugt um 1 M herum. Die Salzkonzentration wird so ausgewählt, daß das Pneumolysin in einer löslichen aggregierten Form vorliegt und in der Lage ist, an das hydrophobe Chromatographiematerial zu binden.
Eine einzelne Säulenreinigung ist oft in der Lage, ein Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, auf eine Reinheit von wenigstens 90, 92, 94, 96, 98 oder 99% zu reinigen. Jedoch kann/können in einigen Ausführungsformen der Erfindung, wo eine kleine Säulengröße verwendet wird oder wo eine große Menge an Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, auf die Säule aufgetragen wird, 1, 2, 3 oder mehrere zusätzliche Durchgänge durch die gleiche Säule unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen verwendet werden, um höhere Reinheitsniveaus zu erreichen.
Gegebenenfalls kann Schritt d) einen Extraschritt des Waschens der Säule in intermediären Salzbedingungen von um 0,5 M Salz herum oder einer Salzkonzentration, die in der Lage ist, jedwede schlecht bindende Unreinheiten zu entfernen, enthalten.
Das Verfahren der Erfindung verwendet einen abnehmenden Salzgradienten, um Pneumolysin von der Säule zu eluieren. Vorzugsweise enthält die Niedrigsalzlösung, die im Zeugen des Salzgradienten in Schritt e) verwendet wird, zwischen 0 bis 0,1 M Salz, besonders bevorzugt 0 bis 40 mM Salz. Alternativ kann eine schrittweise Elution mit dem Niedrigsalzpuffer, der in Schritt e) verwendet wird und zwischen 0–0,2 M Salz, besonders bevorzugt 0–40 mM Salz enthält, verwendet werden.
Optionale Schritte können zum Verfahren der Erfindung hinzugefügt werden, wenn es vorgezogen wird, das Pneumolysin zu denaturieren und es darauffolgend durch Entfernung des Denaturierungsmittels zurückzufalten. Diese optionalen Schritte stellen sicher, daß reines Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, mit einer nativen Struktur und/oder biologischen Aktivität (z. B. Hämolyse von Erythrozyten) erhalten wird. Der erste optionale Schritt f) involviert die Entfernung des Detergens durch Diafiltration, Dialyse oder Verdünnung. Dieser Schritt involviert vorzugsweise Diafiltration/Dialyse gegen einen Puffer von pH 8 bis 10, vorzugsweise um 9 herum, besonders bevorzugt ist der Puffer einer, der in der Lage ist, bei alkalischem pH-Werten zu Puffern, am meisten bevorzugt ist der Puffer Diethanolamin (DEA). Diese Lösung besitzt vorzugsweise eine niedrige Ionenstärke, vorzugsweise 10 bis 50 mM, am meisten bevorzugt um 25 mM herum. Die Diafiltration oder Dialyse wird vorzugsweise bei 4°C durchgeführt, aber wird alternativ bei Raumtemperatur durchgeführt.
Bei einem zweiten optionalen Schritt wird Cytolysin, vorzugsweise. Pneumolysin, denaturiert und durch Zugabe eines Denaturierungsmittels löslich gemacht. Vorzugsweise ist das Denaturierungsmittel, das in Schritt g) verwendet wird, Guanidinhydrochlorid, besonders bevorzugt 5 bis 8 M Guanidinhydrochlorid, am meisten bevorzugt ungefähr 6 M Guanidinhydrochlorid. Das Pneumolysin wird mit Guanidinhydrochlorid für mindestens 10 Minuten, vorzugsweise mindestens 1 Stunde, besonders bevorzugt für ungefähr 1 Stunde inkubiert.
Das Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, wird dann vorzugsweise mit 5 bis 9 M Harnstoff, vorzugsweise ungefähr 8 M Harnstoff, während Schritt g) in Kontakt gebracht. Dies wird durch Diafiltration oder Dialyse des Cytolysins, vorzugsweise Pneumolysins, gegen Harnstoff erreicht. Vorzugsweise werden derselbe Puffer und pH während des Austausches von Denaturierungsmittel beibehalten. Vorzugsweise wird ein Reduktionsmittel (DTT, 2-Mercaptoethanol oder Glutathion) während des Austausches von Denaturierungsmittel zugegeben.
Vorzugsweise involviert Schritt g) das In-Kontakt-Bringen von Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, mit 5 bis 8 M Guanidinhydrochlorid, gefolgt vom Austausch des Guanidinhydrochlorids mit 5 bis 9 M Harnstoff.
Um zu verhindern, daß sich ungeeignete Disulfid-Bindungen bilden, während das Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, denaturiert wird, ist es günstig, sicherzustellen, daß ein Reduktionsmittel während zumindest einem Teil der Schritte g) und h) vorliegen. Ein bevorzugtes Reduktionsmittel ist 0,1 bis 10 mM DTT, vorzugsweise ungefähr 1 mM DTT. Alternativ wird Glutathion oder 2-Mercaptoethanol verwendet. Die bevorzugte Konzentration von Glutathion ist 1 bis 20 mM oder 5 bis 15 mM, besonders bevorzugt 5 bis 10 mM.
Der optionale Schritt h) involviert die Entfernung des Denaturierungsmittels, um Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, vorzugsweise durch Diafiltration oder Dialyse gegen einen Niedrigsalzpuffer von pH 6 bis 10, vorzugsweise um pH 9 herum, zurückzufalten. Vorzugsweise wird das Denaturierungsmittel in einer linearen Art und Weise anstatt einer logarithmischen Art und Weise, die normalerweise mit Dialyse oder Diafiltration assoziiert ist, entfernt. Das heißt, das Denaturierungsmittel wird vom Cytolysin in einer ähnlichen oder konstanten Rate während des Dialyse- oder Diafiltrationsschritts entfernt oder das Denaturierungsmittel wird bei einer langsameren Rate zu Beginn des Diafiltrationsschritts als dieser am Ende ist, entfernt. Dies steht im Gegensatz zu den meisten Verfahren, bei denen das Denaturierungsmittel bei einer schnelleren Rate zu Beginn des Verfahrens entfernt wird. Dies wird entweder durch Durchführen der Diafiltration bei progressiv höher-rezirkulierenden Flußraten oder durch Dialyse gegen Lösungen erreicht, die progressiv weniger Denaturierungsmittel enthalten. Zum Beispiel kann die Diafiltration bei Raten zwischen 500 ml/Stunde und 50 ml/Stunde durchgeführt werden und die Geschwindigkeit der Diafiltration kann bei 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehreren Möglichkeiten erhöht werden. Vorzugsweise wird die Cytolysin-, vorzugsweise Pneumolysin-, Konzentration bei wenigstens 100 μg/ml, vorzugsweise zwischen 100 μg/ml und 1000 μg/ml, besonders bevorzugt um 500 μg/ml herum beibehalten. Gegebenenfalls erfolgt die Diafiltration oder Dialyse gegen einen Puffer, der Propylenglykol bei zwischen 10 bis 30%, vorzugsweise ungefähr 15% enthält. Vorzugsweise wird ein Reduktionsmittel, wie vorstehend beschrieben, während Schritt h) beibehalten. Diafiltration oder Dialyse wird vorzugsweise bei 4°C durchgeführt, aber wird alternativ bei Raumtemperatur durchgeführt. Diese Rückfaltungsverfahren ist auf andere Proteine anwendbar.
Ein weiterer optionaler Schritt i) involviert die Entfernung des Reduktionsmittels, nachdem Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, rückgefaltet ist. Dies wird vorzugsweise durch Diafiltration oder Dialyse gegen einen Niedrigsalzpuffer von pH 7 bis 10, vorzugsweise ungefähr pH 9, erreicht. Gegebenenfalls erfolgt die Diafiltration oder die Dialyse gegen einen Puffer, der Propylenglykol bei zwischen 10 und 30%, vorzugsweise ungefähr 15% enthält. Die Diafiltration oder Dialyse wird vorzugsweise bei 4°C durchgeführt, aber wird alternativ bei Raumtemperatur durchgeführt.
Bei bevorzugten Verfahren der Erfindung wird Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, so rückgefaltet, daß seine hämolytische Aktivität bei über 25%, 50%, 75%, am meisten bevorzugt über 90% von derjenigen des richtig gefalteten Proteins wieder hergestellt wird. Für die Zwecke der Erfindung ist ein "gefaltetes" Protein ein Protein, das die tertiäre Struktur des Proteins, hergestellt durch ein nicht-denaturierendes Verfahren, aufweist. Im Fall von Wildtyp-Pneumolysin wäre die erwartete hämolytische Aktivität des rückgefalteten Pneumolysins 500 000 bis 1 000 000 hämolytische Einheiten/mg Pneumolysin. Im Fall von punktmutierten Pneumolysin mit einer niedrigeren hämolytischen Aktivität wäre die hämolytische Aktivität des rückgefalteten Pneumolysins entsprechend niedriger.
Entgiftung eines Toxins
Das Cytolysin, das durch das Verfahren der Erfindung gereinigt wird, vorzugsweise Pneumolysin, kann einen weiteren optionalen Schritt der Entgiftung durch chemische Behandlung unterworfen werden. Dieser zusätzliche Schritt ist besonders günstig, wenn das Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin an ein Tier oder einen Menschen verabreicht werden soll. Wildtyp- Pneumolysin ist hoch toxisch. Es wurden verschiedene mutierte Pneumolysin-Proteine isoliert, die eine reduzierte Toxizität aufweisen, jedoch behalten diese weiterhin eine Resttoxizität, die problematisch sein kann, wenn das Pneumolysin intern verabreicht wird ( WO 99/03884 , WO 90/06951 ). Alternativ kann es durch Konjugation mit Polysacchariden entgiftet werden ( WO 96/05859 ).
Das Verfahren der Erfindung kann sowohl Wiltyp- wie auch mutiertes Cytolysin, zum Beispiel Pneumolysin, durch chemische Behandlung entgiften. Bevorzugte Ausführungsformen benutzen ein Vernetzungsmittel, das besonders bevorzugt ein oder mehrere Chemikalien enthält, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Formaldehyd, Glutaraldehyd und einem Vernetzungsreagens, das einen N-Hydroxysuccinomidoester und/oder eine Maleimid-Gruppe enthält (z. B. GMBS), besteht.
Die Entgiftungsverfahren selbst sind ein Aspekt der Erfindung und können verwendet werden, um bakterielle Toxine, vorzugsweise Pneumolysin, das durch andere Verfahren hergestellt wird, zu entgiften.
Bei einer Ausführungsform beschreibt das Entgiftungsverfahren der Erfindung die Entgiftung eines bakteriellen Toxins, umfassend die Behandlung des Toxins mit einer chemischen Verbindung, vorzugsweise einem Vernetzungsreagens, das reaktiv, vorzugsweise selektiv reaktiv, am meisten bevorzugt spezifisch reaktiv mit Amin-Gruppen, besonders bevorzugt primären Amin-Gruppen ist.
Für die Zwecke dieser Anmeldung ist ein Vernetzungsreagens als eine Verbindung mit wenigstens zwei reaktiven Gruppen, von denen mindestens eine in der Lage ist, mit mindestens einer Gruppe auf dem Bakterien-Toxin zu reagieren, definiert. Eine weitere reaktive Gruppe ist in der Lage, mit entweder einer Gruppe auf dem Bakterien-Toxin oder einer getrennten Verbindung (zum Beispiel eine Aminosäure, Peptid, Polypeptid, Zucker oder Polysaccharid) zu reagieren.
Vorzugsweise ist die chemische Verbindung oder der Vernetzungsreagens reaktiv, besonders bevorzugt selektiv reaktiv, am meisten bevorzugt spezifisch reaktiv mit Amin- und Sulfhydryl-Gruppen. Vorzugsweise reagiert die chemische Verbindung mit einer primären Amin-Gruppe von Lysin, besonders bevorzugt reagiert das Vernetzungsreagens mit einer primären Amin-Gruppe von Lysin und der Sulfhydryl-Gruppe von Cystein. Dieses Verfahren ist besonders günstig, wenn Pneumolysin entgiftet wird, da die Modifikation von sowohl den Cystein- wie auch Lysin-Resten zu einer synergetischen Abnahme im Hämolysegrad führt, verglichen mit der Rest hämolyseaktivität, wenn das Vernetzungsreagens nur mit Lysin oder Cystein reagiert.
So stellt eine alternative Ausführungsform ein Verfahren zur Entgiftung von bakteriellen Toxinen bereit, umfassend die Modifikation eines Cystein-Restes (optional nahe dem C-Terminus des Toxins), der an der toxische Aktivität des Toxins involviert ist (vorzugsweise die lytische Aktivität), umfassend die Behandlung des Toxins mit einem Vernetzungsreagens (vorzugsweise einem heterobifunktionellen Vernetzungsreagens) das die Sulfhydryl-Gruppe mit einer anderen Aminosäure der Toxins, vorzugsweise mit mehr als 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40 Aminosäuren vom Cystein in der Primärstruktur entfernt, vernetzt. Vorzugsweise enthält die andere Aminosäure eine primäre Amin-Gruppe, und besonders bevorzugt ist die Aminosäure Lysin.
Bei einigen Ausführungsformen behalten über 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder 95% des Toxins ein Molekulargewicht innerhalb von 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% oder 90%, besonders bevorzugt zwischen 1 bis 50%, am meisten bevorzugt zwischen 5 bis 10% seines ursprünglichen Molekulargewichts nach der Behandlung, wie durch SDS-PAGE beurteilt wird. Vorzugsweise wird das Toxin ein geringfügig erhöhtes Molekulargewicht nach der Entgiftungsbehandlung aufgrund von verschiedenen Aminosäuren-Resten aufweisen, die durch kovalente Bindung an die chemische Verbindung modifiziert werden. Das Verfahren der Erfindung involviert jedoch vorzugsweise keine ausgedehnte Konjugation des Toxins, entweder durch kovalente Bindung von ihm an andere Toxinmoleküle, so daß ein Toxin mit einer multimeren quaternären Struktur gebildet wird, oder durch kovalente Bindung des Toxins an andere große Proteine, Polysaccharide oder Lipopolysaccharide. Am meisten bevorzugt werden die Verfahren, Proteine und Produkte, die in WO 96/05859 offenbart werden, nicht von dieser Erfindung abgedeckt.
Das Verfahren der Erfindung kann verwendet werden, um Bakterien-Toxine zu entgiften. Bevorzugte Toxine beinhalten die Thiol-aktivierten Cytolysine wie Pyolysin von A. pyogenes, Cereolysin von B. cereus, Thuringiolysin O von B. thuringiensis, Laterosporolysin von B. latersporus, Bifermentolysin von C. bifermentans, Botukinolysin von C. botulinum, Chauveolysin von C. chauvoel, Histolyticolysin von C. histolyticum, Oedematolysin von C. novyi Typ A, Perfringolysin O von C. perfringens, Septicolysin O von C. septicum, Sordellilysin von C. sordellii, Tetanolysin von C. tetani, Ivanolysin O von L. ivanovi, Listeriolysin O von L. monocytogenes, Seeligerilysin O von L. seeligeri, Alveolysin von P. alvei, Streptolysin O von S. pyrogenes, S. canis oder S. equisimillis, Intermedilysin von S. intermedius, Suilysin von S. suis oder Pneumolysin von S. pneumoniae, die entweder Wildtyp- oder genetisch modifizierte Toxine mit niedrigeren Toxizitätsgraden sein können, wie PdA und PdB ( WO 90/06951 , WO 99/03884 ).
Das Verfahren kann auch verwendet werden, um die Neisseria-Toxine FrpA, FrpC ( WO 92/01460 ), FrpB (Microbiology 142; 3269–3274 (1996); J. Bacteriol. 181; 2895–2901 (1999)) NM-ADPRT (13^th International Pathogenic Neisseria Conference 2002 Masignani et al., S. 135) zu entgiften. FrpA und FrpC enthalten eine Region, die zwischen diesen zwei Proteinen konserviert ist, und ein bevorzugtes Fragment des Toxins wäre ein Polypeptid, das dieses konservierte Fragment enthält, vorzugsweise umfassend die Aminosäuren 227-1004 der Sequenz von FrpA/C.
Das Verfahren der Erfindung kann auch verwendet werden, um Bordetella-Toxine zu entgiften, einschließlich Adenylatcyclase (CyaA) (Glaser (1988), Mol. Microbiol. 2; 19–30), Dermonecrotic-Toxin (Livey (1984), J. Med. Microbiol. 17; 91–103) und Pertussis-Toxin (PT) (Munoz et al. (1981), Infect. Immun. 33; 820–826). Das Verfahren der Erfindung ist auch für die Entgiftung von Tetanus-Toxin (TT) und Diphtherie-Toxin (DT) und Toxin von S. aureus und S. epidermidis, einschließlich Autolysin (AtlE, Amidase und Glucosaminidase), Bone sialo-bindendes Protein (HarA) und Hämolysin ( WO 01/98499 ; WO 02/59148 ; WO 03/11899 , Locus 1, 2, 3, 5, 7, 78, 84).
Die Verfahren der Erfindung führen zu einer Reduktion in dem Grad der Toxizität und/oder hämolytischen Aktivität des Toxins von mindestens 90%, vorzugsweise 95%, 96%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% oder 99,99% (Hämolytische Aktivität wird unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 3 gemessen und Toxizität kann durch das Verfahren aus Beispiel 5 gemessen werden). Natives Pneumolysin weist eine hämolytische Aktivität von 500 000 bis 1 000 000 Einheit pro mg Pneumolysin auf. Einige punktmutierte Varianten von Pneumolysin weisen eine reduzierte Toxizität und hämolytische Aktivität auf. Die Entgiftung einer Pneumolysinvariante könnte nicht in der Lage sein, eine so große Prozentabnahme in der hämolytischen Aktivität aufgrund der niedrigeren Ausgangspunktform, deren hämolytische Aktivität reduziert ist, zu erreichen, jedoch gibt es die Vorstellung, daß der Großteil der verbleibenden hämolytischen Aktivität durch die Verfahren der Erfindung entfernt wird.
Der Entgiftungsschritt des Verfahren der Erfindung stellt vorzugsweise eine Vernetzungsreaktion bereit, die im wesentlichen nicht reversibel ist. Die Reversibilität wird durch Beobachtung des Grades an hämolytischer Aktivität des entgifteten Toxins direkt nach Entgiftung und nach der Inkubation bei einer Temperatur von über 25°C, vorzugsweise über 30°C, besonders bevorzugt über 35°C, am meisten bevorzugt über 37°C für mindestens 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Tage bestimmt. Eine im wesentlichen nicht-reversible Reaktion führt zu einer im wesentlichen nicht-reversiblen Entgiftung und ist als eine Reaktion definiert, bei der der Grad an hämolytischer Aktivität um weniger als 100%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% nach der Inkubation bei einer erhöhten Temperatur, wie oben beschrieben, steigt. Viele Verfahren der Entgiftung, zum Beispiel durch Verwendung von Formaldehydbehandlung, führt zu einer Entgiftung, die nicht stabil ist, sondern die Toxizität über die Zeit erhöht.
Bei einem bevorzugten Entgiftungsschritt des Verfahrens der Erfindung behält über 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder 98% des Toxins eine monomere quaternäre Struktur nach der Vernetzungsreaktion. Viele Vernetzungsreagentien bilden intermolekulare Quervernetzungen (zum Beispiel Formaldehyd und Glutaraldehyd). Dies kann die immunologische Eigenschaften des Toxins beeinflussen, da einige Epitope innerhalb des Aggregats versteckt sein werden. Verfahren der Erfindung involvieren vorzugsweise die einfache Modifizierung von Aminosäureresten, vorzugsweise Sulfhydryl- und/oder primäre Amin-Gruppen von Aminosäuren und/oder die Bildung von hauptsächlich intramolekularen Quervernetzungen. Die resultierende monomere quaternäre Struktur erlaubt es den Epitopen, auf der Oberfläche des Toxins exponiert zu bleiben.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Entgiftungsschrittes ist das Vernetzungsreagens heterobifunktionell. Bevorzugte Vernetzungsreagentien enthalten eine N-Hydroxysuccinimidester-Gruppe, die bevorzugt, besonders bevorzugt spezifisch, mit primären Amin-Gruppen reagiert. Vorzugsweise enthält das Vernetzungsreagens eine Maleimid-Gruppe, die bevorzugt, besonders bevorzugt spezifisch, mit Sulfhydryl-Gruppen reagiert. Bei einem pH um 7 herum reagiert eine Maleimid-Gruppe 1000-fach schneller mit Sulfhydryl-Gruppen als sie es mit Aminen tut. Vorzugsweise enthält das Vernetzungsreagens sowohl eine N-Hydroxysuccinimidester-Gruppe wie auch eine Maleimid-Gruppe. Das Vernetzungsmittel ist vorzugsweise unter Verwendung eines Reduktionsmittels nicht spaltbar, da dies zu einer wichtigen effektiven Entgiftung führt.
Die Entfernung zwischen den reaktiven Gruppen des Vernetzungsreagenzes ist in der Lage, die Wirksamkeit der Entgiftung zu beeinflussen. Vorzugsweise liegt die Entfernung zwischen den Gruppen des Vernetzungsreagenzes, die mit Amin- und Sulfhydryl-Gruppen reagieren, bei dem Verfahren der Erfindung zwischen 1,5 und 20 Å, besonders bevorzugt zwischen 5 und 15 Å, und am meisten bevorzugt bei ungefähr 10 Å. Vorzugsweise werden Aminosäure-Rest aus dem bakteriellen Toxin durch Addition einer Gruppe, die über 5, 7, 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 500 Å lang ist, modifiziert. Vorzugsweise ist die Modifizierungsgruppe zwischen 5 und 100 Å, besonders bevorzugt zwischen 10 und 20 Å groß.
Der Entgiftungsschritt des Verfahrens der Erfindung erlaubt es genügend Resten modifiziert zu werden, so daß die sterische Interferenz und/oder konformationelle Änderung die Funktion des Bakterientoxins inhibieren. Vorzugsweise werden mindestens 5, 7, 10, 12, 14, 15, 20 oder 25 Aminosäurereste des bakteriellen Toxins modifiziert. Wo nicht-umgesetzte Maleimid-Gruppen auf dem Vernetzungsreagens vorliegen, kann eine Ellman-Reaktion verwendet werden, um die Anzahl von Vernetzungsmolekülen, die an jedes Molekül von Toxin gebunden sind, (indirekt) zu schätzen (Ellman 1959, Arch. Biochem. Biophys. 82: 70).
Bevorzugte Vernetzungsreagentien sind SMPT, Sulfo-LC-SMPT, Sulfo-KMUS, LC-SMCC, KMUA, Sulfo-LC-SPDP, LC-SPDP, SMPB, Sulfo-SMPB, SMPH, Sulf-SMCC, SMCC, SIAB, Sulfo-SIAB, GMBS (N-(γ-Maleirnidobutyryloxy)succimimidester), Sulfo-GMBS, MBS, Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, EMCA, EMCS, BMPS, SPDP, SBAP, BMPA, AMAS, SATP und SIA (Pierce).
Bei einem bevorzugten Verfahren der Erfindung wird das Toxin mit der chemischen Verbindung oder dem Vernetzungsreagenz unter pH-Bedingungen zwischen 5,0 und 9,0, vorzugsweise 6,5 bis 8,0, am meisten bevorzugt 7,0 bis 7,8 behandelt. Bei Behandlungen, bei denen die Reaktion einer Maleimid-Gruppe mit einer Sulfhydryl-Gruppe gefördert wird, liegt der bevorzugte pH der Reaktion bei 6,0 und 8,0, besonders bevorzugt 6,5 und 7,5. Die bevorzugte Konzentration von Salzen während der Reaktion liegt zwischen 100 mM und 1 M, besonders bevorzugt 150 mM und 500 mM, am meisten bevorzugt zwischen 200 mM und 300 mM. Die Erfinder haben jedoch herausgefunden, daß es manchmal vorzuziehen ist, die Reaktion bei einer Niedrigsalzkonzentration durchzuführen, wobei kein Natriumchlorid oder anderes Salz zugefügt wird. Wo die Reaktion bei einem pH von zwischen 7,6 und 7,8 ausgeführt wird, kann die Reaktion wahlweise ohne die Zugabe eines Salzes durchgeführt werden. Ähnlich kann die Verwendung von höheren Verhältnissen von GMBS zu Toxin ohne die Zugabe von Salzen bei pH-Werten zwischen 7,0 und 8,0 durchgeführt werden.
Vorzugsweise wird ein 50- bis 500-facher, besonders bevorzugt 130- bis 350- oder 350- bis 900-facher, am meisten bevorzugt ein ungefähr 210-facher molarer Überschuß der chemischen Verbindung oder des Vernetzungsreagenzes zu jedem Toxin verwendet. Pneumokokken-Pneumolysin enthält 31 Lysin-Rest. Daher ist ein 248-facher molarer Überschuß der chemischen Verbindung oder des Vernetzungsreagenzes über Pneumolysin äquivalent zu einem 8-fachen molarer Überschuß der chemischen Verbindung oder des Vernetzungsreagenzes zu jedem Lysin-Rest. Vorzugsweise wird ein 2- bis 20-faches, besonders bevorzugt ein 4- bis 15- oder 15- bis 30-faches, am meisten bevorzugt ein ungefähr 8-faches molares Verhältnis von chemischer Verbindung oder Vernetzungsreagens zu Lysin-Resten bei den Verfahren der Erfindung verwendet.
Die Behandlung mit Vernetzungsreagens schreitet für mindestens 15 Minuten, vorzugsweise für mindestens 30 Minuten, am meisten bevorzugt für ungefähr 1 Stunde zwischen 4°C und 40°C, vorzugsweise zwischen 15°C und 25°C, am meisten bevorzugt bei Raumtemperatur fort. Das Verfahren der Erfindung kann weiter einen Abschreckungsschritt umfassen, der eine Verbindung verwendet, der eine Sulfhydryl-Gruppe enthält, vorzugsweise weist der Quencher ein Molekulargewicht von über 50, 100 oder 120 auf, besonders bevorzugt ist der Quencher eine Aminosäure wie Cystein. Alternativ können die Gruppen mit einem Peptid oder Polysaccharid-Anteil umgesetzt werden, der in der Lage ist, mit Maleimid zu reagieren, zum Beispiel einem Peptid, das einen Cystein-Rest enthält. Dies ist besonders geeignet, wenn nicht-umgesetzte Maleimid-Gruppe vor dem Abschreckungsschritt vorhanden sind.
Der Entgiftungsschritt ist für die Verwendung bei bakteriellen Toxinen geeignet, wie oben beschrieben wurde. Vorzugsweise ist das bakterielle Toxin von Streptococcus pneumoniae, am meisten bevorzugt ist das Toxin Pneumolysin. Das Pneumolysin ist ein natives oder rekombinantes Protein oder ein Protein, das genetisch manipuliert wurde, um seine Toxizität zu reduzieren (wie oben beschrieben wurde). Fusionsproteine von Toxinen, vorzugsweise Pneumolysin, oder Fragmente von Toxinen, vorzugsweise Pneumolysin, können unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung entgiftet werden.
So wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein Toxin (wie Pneumolysin) mit einem Vernetzungsreagens entgiftet, das vorzugsweise heterobifunktionell ist und Gruppen aufweist, die mit Lysin- und Cystein-Resten reagieren, und das eine bestimmte Größe besitzt, wobei am meisten bevorzugt die reaktiven Gruppen 10 bis 10 Å voneinander entfernt liegen, so daß entweder eines oder vorzugsweise beides des folgenden auftritt:

a) zwischen 5 und 30, vorzugsweise ungefähr 12 bis 14 Aminosäure-Reste des Toxins werden durch ein Vernetzungsmolekül modifiziert, das kovalent vorzugsweise an ein Lysin oder einen Arginin-Rest bindet (vorzugsweise wie indirekt durch eine Ellman-Reaktion gemessen wird), wobei das andere Ende (vorzugsweise mit Cystein) gequenscht wurde und/oder
b) eine Cystein-Seitenkette, die in die toxische Aktivität des Toxins (vorzugsweise zum C-Terminus des Toxins hin) involviert ist, wird mit einer anderen Seitenkette des Toxins (vorzugsweise an einen Lysin- oder Arginin-Rest), der vorzugsweise mehr als 2, 5, 10, 20, 30 oder 40 Aminosäuren vom Cystein-Rest in der Primärsequenz des Toxins entfernt liegt, vernetzt.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Toxin (vorzugsweise Pneumolysin) mit einer monofunktionellen chemischen Verbindung entgiftet, die vorzugsweise mit Aminosäuren, die eine primäre Amin-Gruppe enthalten, besonders bevorzugt Lysin, reagieren, und die eine bestimmte Größe aufweist, am meisten bevorzugt 10 bis 100 Å, so daß das Toxin mit zwischen 5 und 30, besonders bevorzugt ungefähr 14 chemischen Verbindung, gebunden an Aminosäurereste, bedeckt ist.
Polysaccharid-Konjugate
Ein Problem, das mit dem Polysaccharid-Ansatz für Impfstoffe vergesellschaftet ist, ist die Tatsache, daß Polysaccharide per se schwache Immunogene sind. Um dies zu überwinden, können Polysaccharide mit Protein-Trägern konjugiert sein, die Bystander-T-Zell-Hilfe bereitstellen. Das Verfahren der Erfindung kann günstig einen weiteren Schritt der Konjugation des Cytolysins, vorzugsweise Pneumolysins, mit einem bakteriellen Polysaccharid, zum Beispiel einem Lipooligosaccharid oder vorzugsweise einem kapsulären Polysaccharid, enthalten.
Ein bevorzugtes Konjugat umfaßt Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, das durch das Verfahren der Erfindung erhalten wurde, konjugiert an kapsuläre Polysaccharide, die von Streptococcus pneumoniae stammen. Die kapsulären Pneumokokken-Polysaccharid-Antigene werden vorzugsweise aus den Serotypen 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F und 33F (am meisten bevorzugt aus den Serotypen 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F und 23F) oder Gemischen aus zwei oder mehr der besagten Konjugate (4, 7, 9, 11, 13 oder 23) ausgewählt.
Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, gereinigt durch das Verfahren der Erfindung, wird auch vorzugsweise mit kapsulären Polysacchariden aus anderen Bakterienstämmen konjugiert. Solche Polysaccharide können zum Beispiel aus H. influenzae, H. influenzae Typ B (Hib), N. meningitidis, Streptococci oder S. pneumoniae (z. B. den Gruppen B Streptococcus, S. pyogenes, etc.), Staphylococcus (z. B. S. aureus, S. epidermidis), E. coli, Enterococcus (z. B. E. faecalis und E. faecium) etc. isoliert werden. Vorzugsweise stammen die Polysaccharide von H. influenzae Typ B (Hib) und/oder den N. meningitidis-Gruppen A, C, W135 und/oder Y. Bevorzugte Lipooligosaccharide schließen solche von N. meningitidis (Immunotypen L2, L3, L4 und/oder L6), M. catarrhalis und H. influenzae ein.
Das Polysaccharid kann durch jedes bekannte Verfahren an Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, gebunden werden (zum Beispiel durch Likhite, US-Patent 4,372,945 und durch Armor et al., US-Patent 4,474,757 ). Vorzugsweise wird CDAP-Konjugation durchgeführt ( WO 95/08348 ). Um die Immunogenität zu steigern, können die Polysaccharide mit einem Adjuvans versehen und/oder lyophilisiert sein. Die Polysaccharide der Erfindung können in Originalgröße vorliegen oder nach der Reinigung in kleinere Polysaccharide oder Oligosaccharide verkleinert werden.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung kann das Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, mit jedem der vorstehend beschriebenen Polysaccharide oder Oligosaccharide kombiniert werden, ohne das Cytolysin an das Polysaccharid oder Oligosaccharid zu konjugieren, um eine immunogene Zusammensetzung oder Impfstoff zu bilden.
Das Verfahren der Erfindung umfaßt vorzugsweise einen weiteren Schritt der Formulierung von Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, zu einem Impfstoff.
Der Begriff "Polysaccharid" schließt die Form voller Länge von Polysacchariden ein, die aus dem Organismus isoliert wurden, und umfaßt kapsuläre Polysaccharide, Lipopolysaccharide und Lipooligosaccharide. Es umfaßt ebenfalls größenveränderte Polysaccharide und Oligosaccharide.
Die Begriffe "umfassend", "umfassen" und "umfaßt" sind hier von den Erfindern beabsichtigt optional austauschbar mit den Begriffen "bestehend aus", "bestehen aus" bzw. "besteht aus" in jedem Fall zu sein.
Proteine und immunogene Zusammensetzungen
Weiter beschrieben ist Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, gereinigt durch das Verfahren der Erfindung. Dieses beinhaltet ein Pneumolysin-bakterielles kapsuläres Polysaccharid-Konjugat, das durch das Verfahren der Erfindung hergestellt wird.
Weiter beschrieben ist eine immunogene Zusammensetzung, die Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin oder Pneumolysin-bakterielles kapsuläres Polysaccharid, das durch das Verfahren der Erfindung erhalten wird (wie oben beschrieben wurde) umfaßt.
Die immunogene Zusammensetzung umfaßt vorzugsweise weiter ein oder mehrere Mitglieder der Pneumokokken-Cholin-bindenden Proteinfamilie, vorzugsweise Cholin-bindendes Protein A oder ein immunogenes Fragment davon und/oder ein oder mehrere Mitglieder der Polyhistidintriaden-Familie (einschließlich Fusionsproteine davon), vorzugsweise PhtA, PhtB, PhtD oder PhtE oder ein immunogenes Fragment davon.
Die Cholin-bindende Proteinfamilie (CbpX) betreffend, wurden die Mitglieder dieser Familie ursprünglich als Pneumokokken-Proteine identifiziert, die durch Cholin-Affinitätschromatographie gereinigt werden konnten. Alle diese Cholin-bindenden Proteine sind nicht-kovalent an Phosphorylcholin-Anteile von Zellwand-Teichonsäure und Membran-assoziierte Lipoteichonsäure gebunden. Strukturell besitzen sie in der gesamten Familie einige Regionen gemeinsam, obwohl die exakte Natur der Proteine (Aminosäuresequenz, Länge, etc.) variieren kann. Im allgemeinen umfassen Cholin-bindende Proteine eine N-terminale Region (N), konservierte Wiederholungsregionen (R1 und/oder R2), eine Prolin-reiche Region (P) und eine konservierte Cholin-Bindungsregion (C), die aus multiplen Wiederholungen besteht, die ungefähr eine Hälfte des Proteins umfaßt. Wie in dieser Anmeldung verwendet, wird der Begriff "Cholin-bindende Proteinfamilie (CbpX)" aus der Gruppe ausgewählt, die aus Cholin-Bindungsproteinen besteht, wie in WO 97/41151 identifiziert wird, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD und CbpG. CbpA wird in WO 97/41151 offenbart. CbpD und CbpG werden in WO 00/29434 offenbart. PspC wird in WO 97/09994 offenbart. PbcA wird in WO 98/21337 offenbart. SpsA ist ein Cholin-Bindungsprotein, das in WO 98/39450 offenbart wird. Vorzugsweise werden die Cholin-Bindungsproteine aus der Gruppe ausgewählt, die aus CbpA, PbcA, SpsA und PspC besteht.
Ferner beschrieben werden CbpX-Verkürzungen, worin "CbpX" wie oben definiert ist, und sich "Verkürzungen" auf CbpX-Proteine beziehen, denen 50% oder mehr der Cholin-Bindungsregion (C) fehlen. Vorzugsweise mangelt es solchen Proteinen an der gesamten Cholin-Bindungsregion. Besonders bevorzugt fehlt es solchen Protein-Verkürzungen an (i) der Cholin-Bindungsregion und (ii) auch einem Teil der N-terminalen Hälfte des Proteins, das mindestens eine Wiederholungsregion (R1 oder R2) beibehält. Noch mehr bevorzugt besitzt die Verkürzung zwei Wiederholungsregionen (R1 und R2), besonders bevorzugt behält die Verkürzung die Prolin-reiche Region (P) bei. Beispiele solcher Verkürzungen sind NR1xR2 und R1xR2, wie in WO 99/51266 oder WO 99/51188 veranschaulicht wird, und NR1XR2P, es werden jedoch andere Cholin-Bindungsproteine, denen es an einer ähnlichen Cholin-Bindungsregion mangelt, innerhalb des Umfangs dieser Erfindung überlegt.
Die LytX-Familie ist eine Familie von Membran-assoziierten Proteinen, die mit Zelllyse vergesellschaftet sind. Die N-terminalen Domänen umfassen Cholin-Bindungsdomäne(n), jedoch besitzt die LytX-Familie nicht all die Eigenschaften, die in der CbpA-Familie gefunden werden, wie oben angemerkt wurde, und so wird die LytX-Familie als unterschiedlich von der CbpX-Familie betrachtet. Im Gegensatz zu der CbpX-Familie enthält die C-terminale Domäne die katalytische Domäne der LytX-Proteinfamilie. Die Familie umfaßt LytA, B und C. Im Hinblick auf die LytX-Familie wird LytA in Ronda et al., Eur. J. Biochem. 164: 621–624 (1987) offenbart. LytB wird in WO 98/18930 offenbart und wird auch als Sp46 bezeichnet. LytC wird auch in WO 98/18930 offenbart und wird auch als Sp91 bezeichnet. Ein bevorzugtes Mitglied dieser Familie ist LytC.
Weiter beschrieben werden LytX-Verkürzungen, worin "LytX" wie oben definiert ist und "Verkürzungen" sich auf LytX-Proteine beziehen, denen es an 50% oder mehr der Cholin-Bindungsregion mangelt. Vorzugsweise fehlt es solchen Proteinen an der gesamten Cholin-Bindungsregion. Ein Beispiel für solche Verkürzungen kann im Beispielsabschnitt dieser Erfindung gefunden werden.
Weiter beschrieben werden CbpX-verkürzte-LytX-verkürzte chimäre Proteine (oder Fusionen). Vorzugsweise umfaßt dies NR1xR2 (oder R1xR2, oder NR1XR2P) von CbpX und dem C-terminalen Teil (C-Term, sprich fehlen der Cholin-Bindungsdomäne) von LytX (z. B. LytCCterm oder Sp91Cterm). Besonders bevorzugt wird CbpX aus der Gruppe ausgewählt, die aus CbpA, PbcA, SpsA und PspC besteht. Noch weiter bevorzugt ist es CbpA. Vorzugsweise ist LytX LytC (auch bezeichnet als Sp91).
Ferner beschrieben wird ein PspA oder PsaA oder Verkürzungen, denen es an der Cholin-Bindungsdomäne (C) mangelt, wahlweise als ein Fusionsprotein mit LytX exprimiert. Vorzugsweise ist LytX LytC.
Die Pht(Polyhistidintriaden)-Famlie umfaßt die Proteine PhtA, PhtB, PhtD und PhtE. Die Familie wird durch eine Lipidierungssequenz, zwei Domänen, die durch eine Prolin-reiche Region getrennt werden, und verschiedene Histidin-Triaden, die möglicherweise in die Metall- oder Nukleosidbindung oder enzymatische Aktivität involviert sind, (3–5) superspiralisierte Regionen, einen konservierten N-Terminus und einen heterogenen C-Terminus charakterisiert. Sie liegt in allen Stämmen der getesteten Pneumokokken vor. Homologe Proteine wurden auch in anderen Streptokokken und Neisserien gefunden. Bevorzugte Mitglieder der Familie umfassen PhtA, PhtB und PhtD. Besonders bevorzugt umfaßt sie PhtA oder PhtD. Es wird jedoch verstanden, daß die Begriff Pht A, B, D und E sich auf Proteine beziehen, die Sequenzen besitzen, die in den Zitaten unten offenbart werden, wie auch natürlich auftretenden (und Menschen-gemachte) Varianten davon, die eine Sequenzhomologie aufweisen, die mindestens 90% identisch zu den Proteinen ist, auf die verwiesen wird. Vorzugsweise ist sie mindestens 95% identisch und am meisten bevorzugt ist sie zu 97% identisch.
Die immunogene Zusammensetzung kann Fusionsproteine von Histidintriadenproteinen mit einschließen. Diese schließen Fusionsproteine mit einem Histidintriadenprotein oder einem Fragment davon, gebunden an ein zweites Histidintriadenprotein oder einem Fragment davon, ein. Bevorzugte Fusionsproteine enthalten i) PhtD oder ein Fragment davon, gebunden an PhtE oder ein Fragment davon, oder ii) PhtB oder ein Fragment davon, gebunden an PhtE oder ein Fragment davon.
Im Hinblick auf die PhtX-Proteine wird PhtA in WO 98/18930 offenbart und wird auch als Sp36 bezeichnet. Wie oben angemerkt wurde, ist es ein Protein aus der Polyhistidintriadenfamilie und weist das Typ-II-Signalmotiv von LXXC auf.
PhtD wird in WO 00/37105 offenbart und wird aus als Sp036D bezeichnet. Wie oben angemerkt wurde, ist es auch ein Protein aus der Polyhistidintriadenfamilie und weist das Typ-II-LXXC-Signalmotiv auf. PhtB wird in WO 00/37105 offenbart und wird auch als Sp036B bezeichnet. Ein anderes Mitglied der PhtB-Familie ist das C3-abbauende Polypeptid, wie in WO 00/17370 offenbart wird. Dieses Protein stammt auch aus der Polyhistidintriadenfamilie und weist das Typ-II-LXXC-Signalmotiv auf. Ein bevorzugtes immunologisch funktionelles Äquivalent ist das Protein Sp42, das in WO 98/18930 offenbart wird. Eine PhtB-Verkürzung (ungefähr 79 kD) wird in WO 99/15675 offenbart, die auch für ein Mitglied der PhtX-Familie gehalten wird.
PhtE wird in WO 00/30299 offenbart und wird als BVH-3 bezeichnet. Um eine immunogene Zusammensetzung zu erzeugen, die in der Lage ist, eine Immunreaktion gegen mehr als ein Pathogen hervorzurufen, das bei Otitis media involviert ist, ist es für immunogene Zusammensetzungen der Erfindung vorteilhaft, weiter ein Antigen von einem oder mehr (2, 3, 4, 5, 6) aus S. pneumoniae, nicht-typisierbarem Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, RSV, Parainfluenzavirus und/oder Influenzavirus zu umfassen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Kombinationsimpfstoffe, die Schutz gegen eine Reihe von verschiedenen Pathogenen bereitstellen. Viele pädiatrische Impfstoffe werden als Kombination gegeben, um die Anzahl von Injektionen, die ein Kind erhalten muß, zu reduzieren. So können für pädiatrische Impfstoffe andere Antigene von anderen Pathogenen mit den Impfstoffen der Erfindung formuliert werden. Zum Beispiel können die Impfstoffe der Erfindung mit dem gutbekannten "trivalenten Kombinationsimpfstoff", der Diphtherie-Toxid (DT), Tetanus-Toxid (TT) und Pertussis-Bestandteil [typischerweise entgiftetes Pertussis-Toxoid (PT) und filamentöses Hämagglutinin (FHA) mit optional Pertactin (PRN) und/oder Agglutinin 1 + 2] umfaßt, zum Beispiel der vermarktete Impfstoff INFANRIX-DTPa^TM (SmithKline Beecham Biologicals), der DT-, TT-, PT-, FHA- und PRN-Antigene enthält, oder mit einem ganzzelligen Pertussis-Bestandteil, zum Beispiel wie er durch SmithKline Beechem Biologicals s. a. als Trianrix^TM vermarktet wird, formuliert werden (oder verabreicht separat oder aber zur gleichen Zeit). Der kombinierte Impfstoff kann auch ein anderes Antigen umfassen, wie zum Beispiel Hepatitis B Oberflächen-Antigen (HBsAg), Poliovirus-Antigene (zum Beispiel inaktiviertes trivalentes Poliovirus-IPV), Moraxella catarrhalis äußere Membranproteine, Proteine von nicht-typisierbarem Haemophilus influenzae, N. meningitidis B äußere Membran-Proteine.
Beispiele für bevorzugte Moraxella catarrhalis-Protein-Antigene, die in einem Kombinationsimpfstoff (insbesondere für die Prävention von Otitis media) eingeschlossen werden könne, sind: OMP106 [ WO 97/41731 (Antex) & WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA und/oder LbpB [ WO 98/55606 (PMC)]; TbpA und/oder TbpB [ WO 97/13785 und WO 97/32980 (PMC)]; CopB [M.E. Helminen et al. (1993), Infect. Immun. 61: 2003–2010]; UpsA1 und/oder UspA2 [ WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR ( PCT/EP 99/03824 ); PilQ ( PCT/EP 99/03823 ); OMP 85 ( PCT/EP 00/01468 ); lipo06 ( GB 9917977.2 ; lipo10 ( GB 9918208.1 ); lipo11 ( GB 9918302.2 ); lipo18 ( GB 9918038.2 ); P6 ( PCT/EP 99/03038 ); D15 ( PCT/EP99/03822 ); OmplA1 ( PCT/EP99/06781 ); Hly3 ( PCT/EP 99/03257 ); und OmpE. Beispiele für Antigene von nicht-typisierbarem Haemophilus influenzae, die in einem Kombinationsimpfstoff (insbesondere für die Prävention von Otitis media) eingeschlossen werden können, beinhaltet: Fimbrin-Protein [( US 5766608 – Ohio State Research Foundation)] und Fusionen, umfassend Peptide davon [z. B. LB1(f)-Peptidfusionen; US 5843464 (OSU) oder WO 99/64067 ]; OMP26 [ WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [ EP 281673 (State University of New York)]; TbpA und/oder TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 ( WO 94/12641 ); Protein D ( EP 594610 ); P2 und P5 ( WO 94/26304 ).
Andere Kombinationen, die überlegt werden, sind das Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, der Erfindung in Kombination mit viralen Antigenen, zum Beispiel von Influenza (attenuiert, gespalten oder Untereinheit [z. B. Oberflächenglycoproteinneuroaminidase (NA) und Hämagglutinin (HA). Siehe z. B. I. Chaloupka et al., Eur. Journal Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 15: 121–127], RSV (z. B. F- und G-Antigene oder F/G-Fusionen, siehe z. B. A.C. Schmidt et al., J. Virol., Mai 2001, S. 4594–4603), Parainfluenza-Virus 3 (PIV3) (z. B. HN- und F-Proteine, siehe Schmidt et al., siehe oben), Varicella (z. B. attenuiert, Glycoprotein I–V etc.) und irgendein (oder alle) Bestandteil(e) von MMR (Masern, Mumps, Röteln).
Impfstoffe
Ferner beschrieben wird ein Impfstoff, umfassen Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin oder ein Pneumolysin-bakterielles kapsuläres Polysaccharid-Konjugat, erhalten durch das Verfahren der Erfindung, und einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten und gegebenenfalls ein Adjuvans.
Ein Impfstoff kann die immunogene Zusammensetzungen, die oben beschrieben werden, und einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten umfassen.
Impfstoffe sind in der Lage, eine schützende Immunreaktion gegen S. pneumonie-Infektion und/oder Otitis media zu erzeugen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung schließt ein Verfahren der Herstellung eines Impfstoffs durch Nehmen eines Cytolysins, vorzugsweise Pneumolysin, das durch das Verfahren der Erfindung hergestellt wurde, und Formulierung von ihm als ein Impfstoff mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten und gegebenenfalls mit einem oder mehreren der weiteren Antigene, die oben beschrieben werden, ein.
Ferner beschrieben wird ein Verfahren der Behandlung oder Prävention von bakterieller Infektion, vorzugsweise Streptococcus pneumoniae-Infektion oder Otitis media, das die Verabreichung des Impfstoffes oder der immunogenen Zusammensetzung umfaßt.
Ferner beschrieben wird die Verwendung des Cytolysins, vorzugsweise Pneumolysin und/oder Pneumolysin-bakteriellem kapsulärem Polysaccharid-Konjugat, von denen jedes durch ein Verfahren der Erfindung erhalten wird, bei der Herstellung eines Impfstoffs für die Behandlung oder Prävention von bakterieller Infektion, vorzugsweise Streptococcus pneumoniae-Infektion oder Otitis media.
Die Impfstoffe sind vorzugsweise mit einem Adjuvans versehen. Geeignete Adjuvantien beinhalten ein Aluminiumsalz wie Aluminiumhydroxidgel (Alaun) oder Aluminiumphosphat, aber sie können auch ein Salz von Calcium, Magnesium, Eisen oder Zink sein oder sie können eine unlösliche Suspension von acyliertem Tyrosin oder acylierten Zuckern, kationisch oder anionisch derivatisierten Polysacchariden, oder Polyphosphazenen sein.
Es wird bevorzugt, daß das Adjuvans so ausgewählt wird, daß es ein bevorzugter Induktor eines TH1-Reaktionstyps ist. Solche hohen Spiegel an Cytokinen vom Th1-Typ tendieren dazu, die Induktion von Zell-vermittelten Immunreaktionen auf ein gegebenes Antigen zu favorisieren, während hohe Spiegel an Cytokinen vom Th2-Typ dazu tendieren, die Induktion von humoralen Immunreaktionen auf das Antigen zu favorisieren.
Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, daß die Unterscheidung von Th1- und Th2-Typ-Immunreaktionen nicht absolut ist. In der Realität wird ein Individuum eine Immunreaktion unterstützen, die als prädominant Th1 oder prädominant Th2 beschrieben wird. Es ist jedoch oft bequem, die Cytokinfamilie in Begriffen zu betrachten, wie sie in Maus-CD4 + veT-Zell-Klone durch Mosmann und Coffman beschrieben werden (T.R. Mosmann und R.L. Coffman (1989) TH1 und TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, S. 145–173). Traditionell werden Th1-Typ-Reaktionen mit der Produktion von INF-γ- und IL-2-Cytokinen durch T-Lymphozyten in Zusammenhang gebracht. Andere Cytokine, die oft direkt mit der Induktion von Th1-Typ-Immunreaktionen assoziiert sind, werden nicht durch T-Zellen produziert, wie IL-12. Im Gegensatz dazu sind Th2-Typ-Reaktion mit der Sezernierung von IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 assoziiert. Geeignete Adjuvans-Systeme, die eine überwiegende Th1-Reaktion fördern, beinhalten: Monophosphoryl-Lipid A oder ein Derivat davon, insbesondere 3-des-O- acyliertes Monophosphoryl-Lipid A (3D-MPL) (für seine Herstellung siehe GB 2220211 A ); und eine Kombination aus Monophosphoryl-Lipid A, vorzugsweise 3-des-O-acyliertes Monophosphoryl-Lipid A zusammen mit entweder einem Aluminiumsalz (zum Beispiel Aluminiumphosphat oder Aluminiumhydroxid) oder einer Öl-in-Wasser-Emulsion. Bei solchen Kombinationen sind das Antigen und 3D-MPL in den gleichen Teilstrukturen enthalten, was eine effizientere Abgabe von antigenen und immunstimulierenden Signalen erlaubt. Studien haben gezeigt, daß 3D-MPL in der Lage ist, die Immunogenität eines Alaunadsorbierten Antigens weiter zu steigern [Thoelen et al., Vaccine (1998); 16: 708–14; EP 689454-B1 ].
Ein verstärktes System involviert die Kombination eines Monophosphoryl-Lipid A und eines Saponin-Derivats, insbesondere die Kombination von QS21 und 3D-MPL, wie in WO 94/00153 offenbart wird, oder eine weniger reaktogene Zusammensetzung, bei der QS21 mit Cholesterol gequencht wird, wie in WO 96/33739 offenbart wird.
Eine besonders wirksame Adjuvans-Formulierung die QS21, 3D-MPL und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion beinhaltet, wird in WO 95/17210 beschrieben und ist eine bevorzugte Formulierung.
Vorzugsweise umfaßt der Impfstoff zusätzlich eine Saponin, besonders bevorzugt QS21. Die Formulierung kann auch eine Öl-in-Wasser-Emulsion und Tocopherol umfassen ( WO 95/17210 ).
Die vorliegende Erfindung beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung einer Impfstoff-Formulierung, die das Mischen eines Cytolysins zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten wie 3D-MPL umfaßt.
Unmethylierte CpG-haltige Oligonukleotide ( WO 96/02555 ) sind auch bevorzugte Induktoren einer TH1-Reaktion und sind für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Impfstoff, wie er hier beschrieben wird, für die Verwendung in der Medizin beschrieben. Beschrieben wird ein Verfahren der Prävention oder Linderung von Pneumonie bei einem älteren Menschen (über 55 Jahre alt), das die Verabreichung einer sicheren und effektiven Menge eines Impfstoffes der Erfindung und gegebenenfalls eines Th1-Adjuvanzes an den älteren Patienten umfaßt.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren der Prävention oder Linderung von Otitis media bei Säuglingen (bis zu 24 Monate) oder Kleinkindern (typischerweise 24 Monate bis 5 Jahre) beschrieben, das die Verabreichung einer sicheren und effektiven Menge eines Impfstoffs, der ein Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, gegebenenfalls mit einem oder mehreren der weiteren Antigene, die oben beschrieben werden, und gegebenenfalls einem Th1-Adjuvans umfaßt, an den Säugling oder das Kleinkind umfaßt.
Die Impfstoffzubereitungen können verwendet werden, um einen Säuger (vorzugsweise einen menschlichen Patienten), der für eine Infektion empfänglich ist, mit Hilfe der Verabreichung des Impfstoffes über einen systemischen oder mukosalen Weg zu schützen oder zu behandeln. Diese Verabreichungen können Injektion über die intramuskulären, intraperitonealen, intradermalen oder subkutanen Wege oder über mukosale Verabreichung an die oralen/alimentären, respiratorischen, urogenitalen Trakte beinhalten. Die intranasale Verabreichung von Impfstoffen für die Behandlung von Pneumonie oder Otitis media wird bevorzugt (da die nasopharyngial Trägerschaft von Pneumokokken effektiver verhindert werden kann, wodurch die Infektion in ihrem frühsten Stadium abgeschwächt wird). Obwohl der Impfstoff als eine Einzeldosis verabreicht werden kann, können auch Bestandteile davon zusammen zur gleichen Zeit oder zu verschiedenen Zeiten gemeinsam verabreicht werden (zum Beispiel wenn Polysaccharide in einem Impfstoff vorliegen, können diese getrennt zur gleichen Zeit oder 1 bis 2 Wochen nach der Verabreichung der bakterielle Proteinkombination für die optimale Koordination der Immunreaktionen unter Rücksichtnahme aufeinander verabreicht werden). Zusätzlich zu einem einzelnen Weg der Verabreichung, können zwei verschiedene Verabreichungswege verwendet werden. Zum Beispiel können virale Antigene ID (intradermal) verabreicht werden, während bakterielle Proteine IM (intramuskulär) oder IN (intranasal) verabreicht werden können. Wenn Polysaccharide vorliegen, können sie IM (oder ID) verabreicht werden und bakterielle Proteine können IN (oder ID) verabreicht werden. Zusätzlich können Impfstoffe IM für die Erstdosen und IN für Auffrischungsdosen verabreicht werden.
Die Menge von Konjugat-Antigen in jeder Impfstoffdosis wird als eine Menge ausgewählt, die eine immunprotektive Reaktion ohne signifikante Nebenwirkungen in typischen Impfstoffen induziert. Eine solche Menge wird abhängig vom spezifischen Immunogen, das verwendet wird, und wie es angeboten wird, variieren. Der Gehalt von Protein-Antigenen im Impfstoff wird typischerweise im Bereich von 1 bis 100 μg, vorzugsweise 5 bis 50 μg, am typischsten im Bereich von 5 bis 25 μg liegen. Wenn Polysaccharide eingeschlossen werden, wird im allgemeinen erwartet, daß jede Dosis 0,1 bis 100 μg Polysaccharid, vorzugsweise 0,1 bis 50 μg, besonders bevorzugt 0,1 bis 10 μg, von denen 1 bis 5 μg im am meisten bevorzugten Bereich liegen, umfaßt.
Optimale Mengen von Bestandteilen für einen bestimmten Impfstoff können durch Standardstudien, die die Beobachtung von geeigneten Immunreaktionen bei Individuen involvieren, sichergestellt werden. Nach einer anfänglichen Impfung können die Individuen eine oder mehrere Auffrischungsimmunisierungen in adäquaten Zeiträumen erhalten. Typischerweise wird ein Impfstoff Antigen (Proteine), ein Adjuvans und Exzipienten oder einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen.
Die Impfstoffherstellung wird allgemein in Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (Hrsg. M.F. Powell & M.J. Newman) (1995), Plenum Press New York) beschrieben. Die Verkapselung mit Liposomen wird durch Fullerton, US-Patent 4,235,877 beschrieben.
Obwohl die Impfstoffe auf irgendeinem Weg verabreicht werden können, bildet die Verabreichung der beschriebenen Impfstoffe in die Haut (ID) eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Menschliche Haut umfaßt eine äußere "hornige" Haut, die das Stratum corneum genannt wird, die über der Epidermis liegt. Unter dieser Epidermis liegt eine Schicht, die Dermis genannt wird, die wiederum über dem subkutanen Gewebe liegt. Forscher haben gezeigt, daß die Injektion eines Impfstoffes in die Haut und insbesondere die Dermis, eine Immunreaktion stimuliert, die auch mit einer Anzahl von zusätzlichen Vorteilen assoziiert sein kann. Die intradermale Impfung mit den Impfstoffen, die hier beschrieben werden, bildet eine bevorzugtes Merkmal.
Die konventionelle Technik der intradermalen Injektion, das "Mantous-Verfahren", umfaßt die Schritte der Hautreinigung und dann die Straffung mit einer Hand, und dann wird die Nadel in einem Winkel von 10 bis 15° eingeführt, wobei der Anschliff der schmalen Gauge-Nadel (26–31 Gauge) nach oben zeigt. Nachdem der Anschliff der Nadel eingeführt wird, wird der Schaft der Nadel gesenkt und weiter vorgeführt, während ein leichter Druck ausgeübt wird, um sie unter die Haut zu befördern. Die Flüssigkeit wird dann sehr langsam injiziert, wodurch ein Bläschen oder eine Ausbeulung auf der Hautoberfläche gebildet wird, gefolgt vom langsamen Herausziehen der Nadel.
In allerletzter Zeit wurden Vorrichtungen beschrieben, die spezifisch entwickelt wurden, um flüssige Wirkstoffe in oder über die Haut zu verabreichen, zum Beispiel die Vorrichtungen, die in WO 99/34850 und EP 1092444 beschrieben werden, auch die Jet-Injektionsvorrichtungen, die zum Beispiel in WO 01/13977 ; US 5,480,381 , US 5,599,302 , US 5,334,144 , US 5,993,412 , US 5,649,912 , US 5,569,189 , US 5,704,911 , US 5,383,851 , US 5,893,397 , US 5,466,220 , US 5,339,163 , US 5,312,335 , US 5,503,627 , US 5,064,413 , US 5,520,639 , US 4,596,556 , US 4,790,824 , US 4,941,880 , US 4,940,460 , WO 97/37705 und WO 97/13537 beschrieben werden. Alternative Verfahren der intradermalen Verabreichung der Impfstoffzubereitungen können konventionelle Spritzen und Nadeln oder Vorrichtungen, die für die ballistische Übertragung von festen Impfstoffen entwickelt wurden ( WO 99/27961 ), oder transdermale Pflaster ( WO 97/48440 ; WO 98/28037 ), oder verabreicht auf die Oberfläche der Haut (transdermale oder transkutane Übertragung WO 98/20734 ; WO 98/28037 ) mit einschließen.
Wenn die Impfstoffe an die Haut verabreicht werden sollen, oder konkreter in die Dermis, liegt der Impfstoff in einem niedrigen flüssigen Volumen vor, insbesondere einem Volumen von zwischen ungefähr 0,05 ml und 0,2 ml.
Der Gehalt von Antigenen in den Haut- oder intradermalen Impfstoffen kann ähnlich den konventionellen Dosen sein, die bei intramuskulären Impfstoffen gefunden werden. Dementsprechend können die Protein-Antigene, die in den intradermalen Impfstoffen vorliegen, im Bereich von 1 bis 100 μg, vorzugsweise 5 bis 50 μg liegen. Ähnlich wird von der Menge an Polysaccharid-Konjugat-Antigen, wenn es vorliegt, in jeder Impfstoffdosis im allgemeinen erwartet, daß sie 0,1–100 μg Polysaccharid, vorzugsweise 0,1–50 μg, vorzugsweise 0,1–10 μg umfaßt, und zwischen 1 und 5 μg liegen kann. Es ist jedoch eine Eigenschaft von Haut- oder intradermalen Impfstoffen, daß die Formulierungen "low dose" sein können. Demgemäß liegen die Protein-Antigene in den "low dose"-Impfstoffen vorzugsweise mit so wenig wie 0,1 bis 10 μg, vorzugsweise 0,1 bis 5 μg pro Dosis vor; und die Polysaccharid-Konjugatantigene können, wenn sie vorliegen, im Bereich von 0,01 bis 1 μg, und vorzugsweise zwischen 0,01 bis 0,5 μg Polysaccharid-Dosis vorliegen.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "interdermale Übertragung" die Übertragung des Impfstoffs an die Region der Dermis in die Haut. Der Impfstoff wird jedoch nicht notwendigerweise ausschließlich in der Dermis lokalisiert sein. Die Dermis ist die Schicht in der Haut, die zwischen ungefähr 1,0 und ungefähr 2,0 mm von der Oberfläche der menschlichen Haut lokalisiert ist, aber es gibt eine bestimmte Variationsbreite zwischen Individuen und in verschiedenen Körperteilen. Im allgemeinen kann erwartet werden, daß man die Dermis erreicht, indem man 1,5 mm unter die Oberfläche der Haut geht. Die Dermis ist zwischen dem Stratum corneum und der Epidermis an der Oberfläche und der subkutanen Schicht darunter lokalisiert. Abhängig von der Art der Übertragung kann der Impfstoff letztendlich ausschließlich oder hauptsächlich innerhalb der Dermis lokalisiert sein oder kann letztendlich innerhalb der Epidermis und der Dermis verteilt sein.
Die immunogenen Zusammensetzungen und Impfstoffe können in verschiedenen Tiermodellen oder mit menschlichen Seren beurteilt werden. Zur Veranschaulichung können die folgenden Tiermodelle verwendet werden, um Pneumokokken-Infektionen zu beurteilen. C3H/HeJ-Mäuse (6 bis 8 Wochen alt) können s. c. mit 15 μg Protein, das mit 50 μl CFA als Adjuvans versehen wurde, immunisiert werden, gefolgt von einer Auffrischung mit 15 μg Protein mit IFA 3 bis 4 Wochen später. Um passiven und aktiven Schutz von systemischer Infektion zu zeigen, können den Mäusen intraperitoneal Immunseren oder Proteine vor der Exposition durch intraperitoneale Injektion mit 15 bis 90 LD50-Pneumokokken in der Woche 8 bis 10 verabreicht werden. Zusätzlich können Proteine in einem Maus-Nasopharynx-Besiedlungsmodell (Wu et al., Microbial. Pathogenesis 1997; 23: 127–137) getestet werden.
Zusätzlich zu Mäusen sind Säuglingsratten gegenüber Besiedlung und Infektion mit S. pneumoniae anfällig. In passiven protektiven Studien kann die Verabreichung von Maus-Immunseren (100 μl i. p. oder 10 μl i. n.) vor der Exposition mit intranasaler Verabreichung von S. pneumoniae (10 μl) bei 2–5 Tage alten Säuglingsratten durchgeführt werden. Die Besiedlung kann durch Plazierung von Nasenspülungen (20–40 μl instilliert, 10 μl entnommen) bestimmt werden.
Günstige Wechselwirkungen zwischen den Protein-(oder Protein und Polysaccharid)-Bestandteilen des Kombinationsimpfstoffs können durch Verabreichung einer Dosis von jedem Protein (oder Protein und Polysaccharid) im Impfstoff, die bei einem monovalenten Impfstoff subprotektiv sein würden, gezeigt werden. Die gesteigerte protektive Wirksamkeit des Kombinationsimpfstoffs im Vergleich zu monovalenten Impfstoffen kann einer günstigen Wechselwirkung zwischen den Bestandteilen zuzuschreiben sein.
Die Erfindung wird in den begleitenden Beispielen veranschaulicht. Die Beispiele werden unter Verwendung von Standardtechniken, die gut bekannt und Routine für Fachleute auf dem Gebiet sind, durchgeführt, außer wo es anders ausführlich beschrieben wird. Die Beispiele sollen veranschaulichen, aber die Erfindung nicht begrenzen.
Beispiele
Beispiel 1 – Reinigung von Pneumolysin
Pneumolysin wurde rekombinant in einer E. coli-Kultur exprimiert. Nach 18-stündiger Inkubation der E. coli-Kultur durch Steigerung der Temperatur auf 39,5°C wurden die E. coli durch Zentrifugation bei 17 000 g für 1 Stunde pelletiert. Die Pellets wurden in 25 mM Diethanolamin, pH 9,0, erneut suspendiert und die E. coli wurden mechanisch unter Verwendung eines Durchganges bei 500 PSI in einem Rannie-Apparat aufgebrochen. Es wurde 1% Natriumlauroylsarcosinat (SLS) zu den aufgebrochenen E. coli zugegeben, und die Mischung wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur vor der Zentrifugation bei 30 000 g für 20 Minuten inkubiert, so daß der Zelldebris pelletiert wurde. Der Überstand wurde 2,5-fach verdünnt, um bei 20 mM Phosphat, pH 7,0, enthalten 1M NaCl und 1% SLS, zu enden, und wurde dann auf eine Phenyl-Sepharose-HP-Säule geladen, die in demselben Puffer (20 mM Phosphat, pH 7,0, enthaltend 1 M NaCl und 1% SLS = Äquilibrierungspuffer) äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit 4 Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer gewaschen, gefolgt von 2 Säulenvolumen 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, enthalten 0,5 M NaCl und 1% SLS. Pneumolysin wurde durch Anwendung eines Niedrigsalzpuffer, der 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 1% SLS, enthielt, eluiert. Fraktionen, die Pneumolysin enthielten, wurden unter Verwendung von SDS-PAGE-Analyse identifiziert, gepoolt und der Puffer wurde unter Verwendung von Diafiltration mit 25 mM Diethanolamin, pH 9,0, ausgetauscht.
Das Pneumolysin wurde durch Denaturierung durch Zugabe von festem Guanidinhydrochlorid bis zu einer 6 M Endkonzentration und Inkubation für eine Stunde löslich gemacht. Es wurde dann gegen 8 M Harnstoff in 25 mM Diethanolamin, pH 9,0, enthaltend 1 mM DTT, diafiltriert. Pneumolysin wurde durch Diafiltration gegen 20 mM Boratpuffer, pH 9,0, enthaltend 1 mM DTT, rückgefaltet. Nach der Renaturierung wurde DTT durch Diafiltration gegen 20 mM Boratpuffer, pH 9,0, entfernt.
Die erreichte Reinheit des Pneumolysins wurde durch Durchlaufen einer SDS-PAGE und Färbung mit Coomassie-Brilliantblau analysiert. Ein separates Gel wurde durch Western-Blotting unter Verwendung eines Antikörpers gegen E. coli analysiert, um den Spiegel von E. coli-Proteinen, die im gereinigten Pneumolysin-Präparat verbleiben, nachzuweisen. Die biologische Aktivität des gereinigten Pneumolysins wurde unter Verwendung eines In-vitro-Hämolyse-Tests beurteilt.
Ergebnisse
Wie in 1 gezeigt, war das oben beschriebene Verfahren in der Lage, eine hocheffiziente Reinigung von Pneumolysin nach einem einzelnen Chromatographieschritt zu erzeugen. Das Coomassie-Blau-gefärbte Gel in Tafel A zeigt, daß die Elution der Säule mit einem Niedrigsalzpuffer, der kein zusätzliches Natriumchlorid enthielt, in der Lage war, eine 53 kDa-Bande, korrespondierend zu Pneumolysin, von der Säule in einer hochgereinigten Form zu eluieren. Man glaubt, daß die viel schwächere Bande von ungefähr 45 kDa auch Pneumolysin ist, da diese zweite Bande an Anti-Pneumolysin-Antikörper bindet (Ergebnisse nicht gezeigt) und es auch nicht gelingt, an die Anti-E. coli-Antikörper zu binden, wie in Tafel B gezeigt wird. Der Western-Blot von Tafel B ist ein hochsensibles Verfahren des Nachweises von jedweden kontaminierenden Proteinen, die im gereinigten Pneumolysin verbleiben. Dieses Verfahren war dazu in der Lage, sehr wenig Kontaminanten nachzuweisen und diejenigen, die vorlagen, lagen in einem niedrigen Spiegel vor, der sich unter der Nachweisgrenze der Coomassie-Färbung befand. Das Pneumolysin wurde daher auf einen Reinheitsgrad von 98–100% gereinigt.
Die Ausbeute des Reinigungsverfahrens war auch mit einem typischen Durchlauf gut, der ungefähr 1900 mg Pneumolysin pro Liter Fermentation ergab. Es wurden ungefähr 10% des Proteins aus der Fermentationskultur als gereinigtes Pneumolysin gewonnen.
Die Aktivität des Pneumolysins wurde in einem Hämolyse-Test bestimmt, nachdem das Pneumolysin mit Guanidinhydrochlorid/Harnstoff behandelt und durch Entfernung des Denaturierungsmittels rückgefaltet worden war. Häymolytische Aktivität wurde in Verdünnungen des gereinigten Pneumolysin bis runter auf Konzentrationen von 1,3 ng/ml nachgewiesen, was zeigt, daß die hämolytische Aktivität wieder hergestellt worden war. Dies entspricht zwischen 500 000 und 1 000 000 hämolytischer Einheiten pro mg Wildtyp-Pneumolysin.
Beispiel 2 – Reinigung von Pneumolysin unter Weglassen der Zentrifugation
Pneumolysin wurde rekombinant in einer E. coli-Kultur exprimiert. Nach 18-stündiger Inkubation der E. coli-Kultur durch Steigerung der Temperatur auf 39,5°C wurde die Kultur auf 20°C abgekühlt und Natriumlauroylsarcosinat (SLS) zur Kultur in einer Endkonzentration von 1% zugegeben. Die Kultur wurde in Gegenwart von SLS für 30 Minuten inkubiert. Diethanolamin (DEA) wurde zur Kultur zugegeben, um eine Endkonzentration von 25 mM und einen pH von 9 zu ergeben. Die Kultur wurde mechanisch unter Verwendung von 4 Durchgängen bei 1000 PSI in einem Rannie-Apparat aufgebrochen. Die Kultur wurde auf OD₆₀₀ von 60 verdünnt und durch Passieren durch einen 0,65 μm Tiefenfilter (zum Beispiel einem Millistock COHC-Filter) vorfiltriert. Die filtrierte Kultur wurde 2-fach in einem Puffer, enthaltend 1% SLS, 2 M NaCl und mit einem pH von 7,0, verdünnt. Die filtrierte Kultur wurde auf eine Phenyl-Sepharose-HP-Säule (Amersham) geladen, die in 20 mM Phosphat, pH 7,0, enthaltend 1 M NaCl und 1% SLS (Äquilibrierungspuffer) äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit 4 Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer gewaschen, gefolgt von 2 Säulenvolumen 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 0,5 M NaCl und 1% SLS. Pneumolysin wurde durch Anwendung eines Niedrigsalzpuffers (kein NaCl), der 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 1% SLS, enthielt, eluiert. Ein Einsäulenschritt ermöglichte das Herstellen von Pneumolysin in einer Reinheit von wenigstens 90%. Wo höhere Reinheitsgrade benötigt werden, kann das Pneumolysin durch eine Gel-Filtrationssäule passiert werden. Fraktionen, die Pneumolysin enthielten, wurde unter Verwendung von SDS-PAGE-Analyse identifiziert, gepoolt und der Puffer wurde unter Verwendung von Diafiltration mit 25 mM Diethanolamin, pH 9,0, ausgetauscht.
Das Pneumolysin wurde durch Denaturierung durch Zugabe von festem Guanidinhydrochlorid bis zu einer Endkonzentration von 6 M und Inkubation für eine Stunde löslich gemacht. Es wurde dann gegen 8 M Harnstoff in 25 mM Diethanolamin, pH 9,0, enthaltend 1 mM DTT, diafiltriert. Pneumolysin wurde durch Diafiltration gegen 20 mM Boratpuffer, pH 9,0, enthaltend 1 mM DTT, rückgefaltet. Die letzte Diafiltration wurde mit einer Flußrate von 100 ml/min für die erste Stunde, 200 ml/min für die zweite Stunde, 300 ml/min für die dritte Stunde und 400 ml/min für weitere 2 bis 3 Stunden durchgeführt. Nach der Renaturierung wurde DTT durch Diafiltration gegen 20 mM Boratpuffer, pH 9,0 entfernt. Reines, aktives Pneumolysin wurde entweder bei 4°C gelagert oder bei –20°C oder darunter eingefroren.
Die erreichte Reinheit des Pneumolysins wurde durch Durchlaufen einer SDS-PAGE und Färbung mit Coomassie-Brilliantblau analysiert. Die Ausbeute an Pneumolysin unter Verwendung dieses Verfahrens war ungefähr 1000 mg/l der Fermentation. Eine Analyse auf einer HR400-Gelfiltrationssäule zeigte, daß 90 bis 95% des Pneumolysins monomer vorlag. Ein In-vitro-Hdmolyse-Test zeigte, daß die hämolytische Aktivität beibehalten wurde, was zeigt, daß eine korrekte Rückfaltung des Pneumolysins erreicht wurde.
Beispiel 3 – Entgiftung von S. pneumoniae-Pneumolysin unter Verwendung von GMBS
Gereinigtes Pneumolysin wurde durch Modifikation von Sulfhydryl und primären Amin-Gruppen unter Verwendung des NHS-Ester-Maleimid-Vernetzungsreagenzes GMBS (N-(γ-Maleimidobutyryloxy)succinimidester) entgiftet. Pneumolysin wurde bei einer Konzentration von 1,0 mg/ml gegen 50 mM Boratpuffer, pH 9,0, dialysiert. Der GMBS wurde anfänglich im DMSO aufgelöst und wurde zu Pneumolysin in einem 248-fachen molaren Überschuß von GMBS zugegeben. Die Behandlung wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur fortgeführt. Überschüssiger GMBS und Nebenprodukte wurden durch Dialyse gegen 100 mM Natriumphosphat, pH 6,8, entfernt. Weitere Maleimid-Gruppen wurden durch Reaktion mit 0,6 mg/ml Cystein für 2 Stunden bei Raumtemperatur gelöst. Um überschüssiges Cystein zu entfernen, wurde diese Probe gegen 2 mM Natriumphosphat, pH 7,15, dialysiert.
Beispiel 4 – Entgiftung von S. pneumoniae-Pneumolysin unter Verwendung von GMBS
Gereinigtes Pneumolysin wurde durch Modifikation von Sulfhydryl- und primären Amin-Gruppen unter Verwendung des NHS-Ester-Maleimid-Vernetzungsreagenzes GMBS (N-(γ-Maleimidobutyryloxy)succinimidester) entgiftet. Pneumolysin wurde in einer Konzentration von 0,5 mg/ml durch Zugabe von K₂PO₄ in einen Puffer von pH 7,5 gegeben und NaCl wurde auf 250 mM zugegeben. Der GMBS wurde anfänglich in DMSO aufgelöst und wurde zu Pneumolysin in einem 248-fachen molaren Überschuß von GMBS zugegeben. Die Behandlung wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur fortgeführt. Überschüssiger GMBS und Nebenprodukte wurden durch Diafiltration unter Verwendung einer 30 kD-Membran gegen 2 mM Natriumphosphat, pH 7,15, entfernt. Der pH wurde dann auf 6,8 durch Zugabe von NaH₂PO₄ eingestellt. Weitere Maleimid-Gruppen wurden durch Reaktion mit 0,6 mg/ml Cystein für zwei Stunden bei Raumtemperatur gelöscht. Um überschüssiges Cystein zu entfernen, wurde die Probe gegen 2 mM Natriumphosphat, pH 7,15, dialysiert und auf 1 mg/ml aufkonzentriert.
Beispiel 5 – Entgiftung von S. pneumoniae-Pneumolysin unter Verwendung von GMBS
Gereinigtes Pneumolysin wurde zunächst gegen 50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2, dialysiert. Das heterobifunktionelle Vernetzungsreagens GMBS (N-[γ-Maleimidobutyryloxy]succinimidester, Pierce) wurde in DMSO bei 10 mg/ml gelöst. Eine Teilprobe, die der ausgewählten Menge an GMBS gleichte, wurde zu 1 ml von Pneumolysin (1 mg/ml) zugegeben. Nach 60 Minuten bei Raumtemperatur wurde das aktivierte Pneumolysin entweder auf einer PD10-Säule (Amersham) entweder durch Gelfiltration (Toyopearl HW-40, XK 16/40, Elution mit 100 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,8) oder entweder durch Dialyse gereinigt, um überschüssiges Reagens und GMBS-Nebenprodukte zu entfernen. Der Grad an Derivatisierung von PLY wurde durch Bewerten der Maleimid-Funktionen unter Verwendung des Ellman-Tests (Aitken und Leuromonth S. 487–488, The Protein protocols handbook Hrsg.: J.M. Walter (1996)) gemessen. Die Maleimid-Funktionen wurden durch eine Lösung von Cystein als ein Endschritt des Entgiftungsverfahrens gelöscht (Cystein bei 4 mg/ml (Merck), inkubiert während 60 Minuten bei Raumtemperatur). Um überschüssiges Cystein zu entfernen, wurde die Probe gegen 100 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,8, dialysiert. Die Probe wird dann durch eine sterilisierende 0,22 μm-Membran filtriert.
Beispiel 6 – Charakterisierung von entgiftetem Pneumolysin Hämolytische Aktivität
Es wurde ein hämolytischer Test verwendet, um die verbleibende Toxizität von entgiftetem Pneumolysin zu beurteilen. Serielle 2-fach-Verdünnungen von Pneumolysin wurden mit roten Blutkörperchen vom Schaf inkubiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand auf Immunplatten übertrage, und freigesetztes Hämoglobin wurde unter Verwendung von optischer Dichteablesung bei 405 nm gemessen. Die Ergebnisse wurden als ng/ml Pneumolysin, korrespondierend zum Mittelpunkt der OD-Kurve, ausgedrückt. Der Test wurde nach Inkubation des entgifteten Pneumolysins bei 37°C für 7 Tage wiederholt, um die Umkehrbarkeit der Entgiftung zu beobachten.
Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, war die Behandlung mit GMBS in der Lage, die hämolytische Aktivität von PLY wesentlich zu reduzieren, wobei eine bis 3000-fache Reduktion in der hämolytischen Aktivität erreicht wurde. Höhere molare Verhältnisse von GMBS/Lysin waren in der Lage, eine bessere Entfernung der hämolytischen Aktivität hervorzurufen, wobei Verhältnisse von 4/1 und 5/1 in diesem Experiment optimal waren. Es wurde geschätzt, daß diese Behandlung zu einer Modifikation von ungefähr 14 Lysin-Resten führte. Wo weniger Lysin-Reste modifiziert wurden, war die Reduktion an hämolytischer Aktivität geringer.
ELISA
Die Antigenität des entgifteten Pneumolysins wurde durch ELISA beurteilt. Die ELISA-Platten wurden mit einem Meerschweinchen-Anti-Pneumolysin-Antikörper beschichtet. Die Proben, die Verdünnungen von Pneumolysin enthielten, wurden auf den Platten für 1 Stunde bei Raumtemperatur inku biert. Nach dem Waschen wurde das gebundene Pneumolysin unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern gegen Pneumolysin, konjugiert an Meerrettichperoxidase, nachgewiesen. Nach Waschen der Platten wurde eine Substratreaktion verwendet, um die Menge von an jede Vertiefung gebundenem Pneumolysin zu beurteilen.
Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, führte die Behandlung mit GMBS zu einigem Verlust an Antigenität, wie durch ELISA beurteilt wurde. Es könnten jedoch ELISA-Anzeigewerte von ungefähr 66% von denjenigen, die durch unbehandeltes PLY abgegeben werden, erreicht werden, was zeigt, daß noch viele Antikörper das modifizierte Pneumolysin erkennen konnten.
SDS-PAGE-Analyse

Man ließ die entgifteten Pneumolysin-Proteine auf eine SDS-PAGE (Novex 4–20% Polyacrylamid-Gel, Invitrogen) laufen und es wurde Coomassie-Brilliantblau verwendet, um die Proteine sichtbar zu machen. Wie in 2 gezeigt wird, führte die Behandlung mit GMBS zu einem leichten Anstieg im Molekulargewicht von PLY von 53 kDa zu ungefähr 56 kDa. Diese Steigerung ist aus der Modifikation von zahlreichen Aminosäure-Resten mit GMBS zurückzuführen. Ein kleiner Prozentsatz von PLY wird zu multimeren Formen konvertiert, wie durch das Auftreten von straffen Banden mit einem Molekulargewicht von ungefähr 110 kDa und 170 kDa gesehen, jedoch verbleibt das meiste des PLY in einer im Grunde monomeren Form. Die Inkubation des PLY bei 37°C für 7 Tage führte nicht zu irgendeiner wesentlichen Änderung beim Auftreten des PLY auf einer SDS-PAGE, was zeigt, daß das modifizierte PLY keinen Abbau oder darauffolgender kovalent gebundener Multimer-Bildung unterworfen ist. Tabelle 1: Versuche zur PLY-Entgiftung durch GMBS

Versuch	GMBS-Überschuß (GMBS/Lysin	Maleimid-Funktionen	Verhältnis ELISA/LOWRY		Hämolytischer Titer ng/ml
			4°C	7D 37°C	4°C	7D 37°C
			%
1	/ 1/1 1,5/1 2/1 3/1 4/1 5/1	/ 8 8,5 9,4 11,8 13,5 14,2	95 63 69 76 56 66 67	56 87 / / / / /	1,7 186 48 309 530 6308 4284	4,2 111 / / / / /
2	4/1 8/1	13,8 17,6	26,2 23,9	24,8 38,0	NH NH	NH NH
3	4/1	11,3	89	46	1598	6309

Die Versuche wurden für 1 mg PLY (1 mg/ml) realisiert, mit der Ausnahme des letzten Tests, für den 3 mg behandelt wurden (PLY bei 0,68 mg/ml).
Beispiel 7 – Reaktogenitätsevaluierung von entgiftetem Pneumolysin bei Ratten
Gruppen von drei OFA-Ratten wurden einmal durch intramuskuläre (Tibialis) Impfung mit Kochsalzlösung, Pneumolysin oder GMBS-entgiftetem Pneumolysin immunisiert. 3 Tage nach der Immunisierung wurden alle Ratten getötet und die Tibialis wurden für die histologische Untersuchung präpariert. Die Tibialis wurden in Formalin fixiert und in 2 mm-Abschnitte geschnitten, die dehydriert und in Paraffin eingebettet wurden. Es wurden 7 μm-Abschnitte geschnitten und unter Verwendung des Trichrom-Masson-Verfahrens gefärbt, bevor sie mikroskopisch untersucht wurden.
Die Reaktogenität wurde unter Verwendung von vier Kriterien beurteilt: Degeneration/Nekrose, endomysiale Entzündung, Hämorrhagie und Aponeurose-Entzündung. Jedem dieser histologischen Kriterien wurde eine Punktzahl für jeden Muskel von jeder Gruppe zugewiesen und eine mittlere Läsionspunktzahl wurde dann für jede Gruppe berechnet. Eine Punktzahl von 0 = normal, 1 = minimal, 2 = gering, 3 = mäßig, 4 = deutlich und 5 = schwer.
Ergebnisse
Die Histologie von Schnitten wurde untersucht. Die mittleren Bewertungen für Degeneration/Nekrose, endomysiale Entzündung, Hämorrhagie und Aponeurose-Entzündung werden in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

Beimpfung Degeneration/Nekrose Endomysiale Entzündung Hämorrhagie Aponeurose-Entzündung

NaCl 0 0,5 0 0

Ply 3,6 3,8 3,0 1,4

GMBS-Ply 0,6 1,3 1,3 0,4
Ein Vergleich der histologischen Bewertungen für natives und entgiftetes Pneumolysin zeigt, daß GMBS ein besonders effektives Vernetzungsreagens ist, um es für die Entgiftung von Pneumolysin zu verwenden, wobei es eine starke Abnahme bei der Degeneration/Nekrose, endomysialen Entzündung, Hämorrhagie und Aponeurose-Entzündung hervorruft.
Beispiel 8 – Evaluierung der Toxizität von mit GMBS behandeltem Pneumolysin bei Mäusen
Gruppen von 20 OF1-Mäusen wurden intranasal mit entweder nativem Pneumolysin oder GMBS-behandeltem Pneumolysin exponiert und die Mäuse wurden für die nachfolgenden 9 Tage beobachtet.
Wie in 3 gezeigt wird, führte die Exposition mit 2 μg nativem Pneumolysin sehr schnell zum Tod von allen Mäusen in dieser Gruppe. Das Pneumolysin rief Läsionen durch das gesamte respiratorische System hervor, die zu Atmungsschwierigkeiten und dem Tode führten. Im Gegensatz dazu wies das GMBS-behandelte Pneumolysin eine wesentlich reduzierte Toxizität bei allen Mäusen, die mit 2 μg, 5 μg oder 10 μg des mit GMBS behandelten Pneumolysins geimpft wurden, die die Exposition überlebten, auf.
Beispiel 9 – Schutzstudien, die entgiftetes Pneumolysin verwenden
Gruppen von 20 OF1-Mäusen wurden 3-mal intramuskulär an den Tagen 0, 14 und 28 mit 5 μg Pneumolysin und 50 μg Aluminiumphosphat und 5 μg MPL als Adjuvans immunisert. Kontrollmäuse wurden mit Adjuvans alleine immunisiert.
Das Pneumolysin wurde entweder nicht behandelt oder unter Verwendung der GMBS-Behandlung, die oben beschrieben wird, entgiftet.
Am Tag 42 wurde den Mäusen eine intranasale, tödliche Exposition mit 2 μg nativem Pneumolysin verabreicht. Das Überleben der Mäuse über die nachfolgenden 9 Tage wurde beobachtet.
Ergebnisse
Das letale Expositionsmodell führte zu 90% Mortalität bei den Kontrollmäusen (4). Die Immunisierung mit GMBS-entgiftetem Pneumolysin rief einen sehr guten Schutz mit nur 5% an sterbenden Mäusen während der nachfolgenden 9 Tage hervor. Dies war vergleichbar mit dem Schutz, der nach Impfung mit nativem Pneumolysin erreicht wird, wonach 10% der Mäuse starb.
Beispiel 10 – Evaluierung von entgiftetem Pneumolysin in Kombination mit PhtD in einem letalen Maus-Expositionsmodell
Gruppen von 20 OF1-Mäusen wurden intramuskulär mit a) Adjuvans alleine oder b) 1 μg PhtD und Adjuvans oder c) 1 μg PhtD und 5 μg GMBS-entgiftetem Pneumolysin und Adjuvans immunisiert. Das verwendete Adjuvans bestand aus 50 μg Aluminiumphosphat und 5 μg MPL und die Immunisierungen fanden am Tag 0 und am Tag 14 statt. Die Mäuse wurden mit einer intranasalen letalen Dosis von 5·10⁵ KBE vom Serotyp 2 S. pneumoniae-Stamm D39 exponiert und das Überleben wurde für die nächsten 10 Tage beobachtet.
Ergebnisse
Wie in 5 gezeigt wird, führte die Exposition mit Stamm D39 zu 75% Letalität nach 10 Tagen in Kontrollmäusen. Die Immunisierung mit PhtD alleine stellte keinen signifikanten Schutz bereit, wobei 70% der Mäuse in dieser Gruppe nach 10 Tagen starben (p = 0,29). Die Immunisierung mit PhtD zusammen mit GMBS-entgiftetem Pneumolysin ergab einen signifikant besseren Schutz mit einer Letalität, die auf 50% reduziert war (p = 0,04).
Beispiel 11 – Entgiftung von Pneumolysin unter Verwendung von Formaldehyd
Ein Vorrat von gereinigtem Pneumolysin wurde bei einer Konzentration von ungefähr 0,4 mg/ml in 25 mM Kaliumphosphat-Puffer mit 50 mN Lysin und 0,1% Formaldehyd (G/V) gegeben. Der pH wurde auf 7,0 eingestellt und das Gemisch wurde für 21 Tage bei 40°C inkubiert. Unreagiertes Formaldehyd, Lysin und andere Nebenprodukte mit niedrigem Molekulargewicht wurden durch Diafiltration gegen 2 mM Natriumphosphat, pH 7,15, entfernt.
Beispiel 12 – Konjugation von GMBS-entgiftetem Pneumolysin
GMBS-behandeltes Pneumolysin (±3 mg/ml in 20 mM Borat-Puffer) wurde gegen 2 mM Phosphat-Puffer, pH 6,8, mit 150 mM NaCl diafiltriert, um eine Konzentration zwischen 15 und 20 mg/ml zu erreichen. Die Diafiltration wurde auf einer Centramat-Membran (0,09 m², 10 kDa Ausschluß) durchgeführt.
Die Aktivierung und Vernetzung wurde bei 25°C durchgeführt. S. pneumoniae PS19F wurde auf 9 mg/ml in 2 M NaCl verdünnt und der pH auf 6,0 durch Zugabe von 0,05 N HCl eingestellt. Zum Zeitpunkt 0 wurde eine Cyanodiaminopyridiniumtetrafluorborat (CDAP)-Lösung (100 mg/ml in Acetonitril/Wasser für Injektion: 50/50 (V/V)) manuell zugegeben, um ein CDAP/PS19F-Verhältnis von 1,5 (G/G) zu erhalten. Nach 1,5 Minuten wurde der pH auf pH 9,0 durch Zugabe von 0,1 M NaOH erhöht. GMBS-behandeltes Pneumolysin (15 mg/ml) wurde dann hinzugegeben, um ein dPLY/PS-Verhältnis von 3 zu erhalten. Die Lösung wurde für 240 min unter pH-Regulation stehengelassen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 M Glycin (Verhältnis Gly/PS (G/G)) gestoppt. Die Lösung wurde für 30 min vor der Aufreinigung auf Sephacryl-S400HR stehengelassen. Das Konjugat hatte ein dPLY/PS-Verhältnis von 2,62/1 (G/G).
Ein ähnlicher Ansatz wurde ebenfalls verwendet, um GMBS-behandeltes Pneumolysin an PS8, PS12F und PS22F zu konjugieren. Die resultierenden Konjugate hatten entsprechend ein dPLY/PS-Verhältnis von 1,61, 1,45 und 1,36.
Beispiel 13 – Immunogenität von S. pneumoniae-kapsulären Polysacchariden, konjugiert an GMBS-entgiftetes Pneumolysin als ein Trägerprotein
Gruppen von 40 weiblichen Balb/c-Mäusen wurden durch den intramuskulären Weg an den Tagen 0, 14 und 28 mit tetravalentem Polysaccharid (PS)-Formulierungen, enthaltend Pneumokokken-Kapseln PS8, 12F, 19F und 22F immunisiert (Dosis: 0,1 μg/PS).
Zwei Formulierungen, gebildet aus entweder einfachem PS oder an GMBS-entgifteten Pneumolysin konjugiertes PS, wurden an die Mäuse verabreicht. Beide Impfstoff-Formulierungen wurden mit einer Öl-in-Wasser-Emulsion, enthaltend MPL und QS21, ergänzt.
Anti-PS-ELISA-IgG-Spiegel und Opsonophagocytose-Titer wurden in Seren, die am Tag 42 gesammelt wurden, unter Verwendung des ELISA- und Opsonophagocytose-Tests im wesentlichen in WO 02/22167 beschrieben gemessen. Im Fall des Opsonophagocytose-Tests wurden die Serumproben gegen die S. pneumoniae-Serotypen 8, 12F, 19F und 22F getestet. Für den ELISA wurden die Vertiefungen mit 10 bis 40 μg/ml des benötigten kapsulären Polysaccharids beschichtet.
Ergebnisse
Eine starke Verbesserung der IgG-Reaktion wurde für alle PS in Mäusen, die mit an GMBS-entgifteten Pneumolysin konjugierten PS immunisiert wurden, im Vergleich zu Mäusen, denen einfaches PS gegeben wurde, beobachtet (6). Die Opsonophagocytose-Aktivität (OPA) der Anti-PS-Antikörper war ebenfalls verstärkt (7).

Claims

Verfahren zur Reinigung eines bakteriellen Cytolysins, umfassen die folgenden Schritte: a) Züchten einer Kultur von Zellen, die bakterielles Cytolysin exprimieren; b) mechanisches Aufbrechen der Kultur von Zellen, um einen Extrakt zu bilden; c) Vorfiltrieren des Extrakts; d) Binden von löslichen aggregierten bakteriellen Cytolysin, enthaltend in dem Extrakt, in Gegenwart eines Detergens an ein hydrophobes Wechselwirkungs-Chromatographiemateriel unter Hochsalzbedingungen (vorzugsweise 0,6–2 M Salz); e) Eluieren des bakterielle Cytolysin in Gegenwart eines Detergens unter Niedrigsalzbedingungen (vorzugsweise 0–0,2 M Salz).
Verfahren gemäß Anspruch 1, ferner umfassend die folgenden Schritte: f) Entfernung des Detergens vom bakteriellen Cytolysin; g) Löslichmachen des bakteriellen Cytolysins durch Zugabe eines Denaturierungsmittels; h) Entfernung des Denaturierungsmittels vom bakteriellen Cytolysin;
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das bakterielle Cytolysin Pneumokokken-Pneumolysin ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Schritt b) in Gegenwart eines Detergens durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Kultur von Zellen in einem Vorinkubationsschritt mit Detergens inkubiert wird, bevor die Kultur von Zellen mechanisch aufgebrochen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Vorinkubationsschritt mehr als 10 Minuten dauert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Schritt b) und/oder c) bei einem pH von 8 bis 10 durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei Schritt b) und/oder c) bei einer Salzkonzentration von 0 bis 0,1 M durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Vorfiltrieren eine Filtergröße zwischen 0,45 und 2,5 μm verwendet.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 9, wobei dasselbe Detergens in den Schritten d) und e) vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei dasselbe Detergens in den Schritten b), d) und e) vorliegt.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Detergens in einer Konzentration von zwischen 0,1 und 2% (G/V) vorliegt.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei kein Zentrifugationsschritt vorliegt.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographiematerial, das in Schritt d) verwendet wird, aromatische Gruppen enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei das hydrophobe Chromatographie-Material Phenyl-Sepharose ist.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das in der im Schritt b), c), d) und/oder Schritt e) verwendeten Lösung vorliegenden Detergens ein aliphatisches Detergens ist.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei das aliphatische Detergens ein Detergens ist, das in der Lage ist, die Größe der Pneumolysin-Aggregate zu reduzieren, um die Pneumolysin-Aggregate löslich zu machen.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Detergens Natriumlauroylsarcosinat ist.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Hochsalzbedingungen gemäß Schritt d) zwischen 0,6 M und 2 M Salz enthalten.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die in Schritt d) und/oder e) verwendete Lösung ein Salz enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Natriumchlorid, Magnesiumchlorid, Ammoniumchlorid, Natriumsulfat, Magnesiumsulfat, Ammoniumsulfat, Natriumphosphat, Magnesiumphosphat und Ammoniumphosphat besteht.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei Schritt d) und/oder Schritt e) bei einem pH von zwischen 6 und 8, vorzugsweise bei ungefähr 7, durchgeführt werden.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die in Schritt e) verwendeten Bedingungen 0 bis 0,1 M Salz enthalten.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die in Schritt e) verwendeten Bedingungen 0 bis 40 mM Salz enthalten.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei Schritt f) das Entfernen des Detergens durch Diafiltration oder Dialyse involviert.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei die Diafiltration/Dialyse gegen einen Niedrig-Salzpuffer von pH 8 bis 10, vorzugsweise ungefähr pH 9, erfolgt.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 2 bis 25, wobei Schritt g) das Denaturieren des bakteriellen Cytolysins durch Zugabe eines Denaturierungsmittels und Schritt h) das neuerliche Falten des bakteriellen Cytolysins durch graduelle Entfernung des Denaturierungsmittels involviert.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 2 bis 26, wobei das in Schritt g) verwendete Denaturierungsmittel Guanidinhydrochlorid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei 5 bis 8 M Guanidinhydrochlorid verwendet wird.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 26 bis 28, wobei das bakterielle Cytolysin mit 5 bis 9 M Harnstoff während Schritt g) kontaktiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei Schritt g) das Kontaktieren des bakteriellen Cytolysins mit 5 bis 8 M Guanidinhydrochlorid, gefolgt von einem Austausch des Guanidinhydrochlorids gegen 5 bis 9 M Harnstoff involviert.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 26 bis 30, wobei ein Reduktionsmittel während mindestens einem Teil der Schritte g) und h) vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei das Reduktionsmittel 0,1 bis 10 mM DTT, vorzugsweise ungefähr 1 mM DTT, ist.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 2 bis 32, wobei in Schritt h) das bakterielle Cytolysin so zurückgefaltet wird, daß seine hämolytische Aktivität bei über 50% von derjenigen des richtig gefalteten Proteins wieder hergestellt wird.
Verfahren gemäß den Ansprüche 2 bis 33, wobei Schritt h) das Entfernen des Denaturierungsmittels durch Diafiltration oder Dialyse involviert.
Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei Schritt h) das Entfernen des Denaturierungsmittels in einer linearen Weise involviert.
Verfahren gemäß Anspruch 34 oder 35, wobei Schritt h) eine Diafiltration bei progressiv höheren Flußraten involviert.
Verfahren gemäß Anspruch 34 oder 35, wobei Schritt h) eine Dialyse gegen Lösungen involviert, die progressiv weniger Denaturierungsmittel enthalten.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 34 bis 37, wobei die Diafiltration oder Dialyse gegen eine Lösung von pH 7 bis 9 erfolgt.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, umfassend einen weiteren Schritt der Entgiftung des bakteriellen Cytolysins durch chemische Behandlung.
Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei die chemische Behandlung die Verwendung eines Vernetzungsmittels involviert.
Verfahren gemäß Anspruch 40, wobei das Vernetzungsreagens ein oder mehrere Chemikalien enthält, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus: Formaldehyd, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinomidoestern und GMBS.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, umfassend einen weiteren Schritt der Konjugation des bakteriellen Cytolysins an ein bakterielles Polysaccharid.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, umfassend einen weiteren Schritt der Formulierung des bakteriellen Cytolysins in eine Impfstoffzusammensetzung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, umfassend einen weiteren Schritt der Formulierung des bakteriellen Cytolysins mit einem oder mehreren von: Cholin-Bindungsprotein A oder einem immunogenen Fragment davon, oder PhtA, PhtB, PhtD oder PhtE oder einem immunogenen Fragment davon, oder einem Antigen von nicht-typisierbarem Haemophilus influenzae (NtHi), oder einem Antigen von Moraxella catarrhalis oder einem Antigen von RSV oder einem Antigen von Parainfluenza-Virus oder einem Antigen von Influenza-Virus.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, umfassend einen weiteren Schritt der Formulierung des bakteriellen Cytolysins mit einem Adjuvans, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: einem Aluminiumsalz wie Aluminiumhydroxid-Gel (Alaun) oder Aluminiumphosphat, einem Salz von Calcium, Magnesium, Eisen oder Zink, einer unlöslichen Suspension von acylierten Zuckern, kationisch oder anionisch derivatisierten Polysacchariden, Polyphosphazenen, MPL oder einem Derivat davon, 3D-MPL, Saponin, QS21 und nicht-methyliertes CpG-enthaltendes Oligonukleotid.