DE60133569T2

DE60133569T2 - Thermoplaste auf der basis von sojabohnen als biomaterialien

Info

Publication number: DE60133569T2
Application number: DE60133569T
Authority: DE
Inventors: Matteo Brighton SANTIN; Luigi Nicolais; Luigi Ambrosio
Original assignee: University of Brighton
Current assignee: University of Brighton
Priority date: 2000-08-02
Filing date: 2001-08-01
Publication date: 2009-06-04
Anticipated expiration: 2021-08-02
Also published as: AU2001278579B2; JP2004518771A; CA2456006C; EP1325060B1; GB0018953D0; ES2305094T3; US20040081698A1; WO2002010261A1; PT1325060E; DE60133569D1; HK1058049A1; AU7857901A; ATE391743T1; JP4869539B2; NZ524503A; EP1325060A1; CA2456006A1

Description

Diese Erfindung betrifft auf Sojabohnen basierende, wärmehärtbare Biomaterialien. Sie werden durch ein Verfahren hergestellt, das das Wärmehärten von entfettetem Sojabohnen-Tofu umfasst. Die Biomaterialien sind in verschiedenen biomedizinischen Anwendungen, einschließlich Knochenfüllstoffen, Wundverbänden und zeitweiligen Sperren zur Verhinderung von nachchirurgischem Gewebsanhaften verwendbar.
HINTERGRUND
Die Herstellung von neuen bioabbaubaren Materialien, sowohl von synthetischen als auch natürlichen Quellen, ist ein wichtiges Ziel bei biomedizinischen Anwendungen, bei denen das Implantat eine zeitweilige Funktion im Körper ausüben muss Gewebeeinwachsen und Arzneistoffabgabe sind gewöhnlich mit der Verwendung von vollständig abbaubaren Biomaterialien verbunden, sofern nicht eine längere Stützwirkung erforderlich ist¹. Jedoch wurde das ideale bioabbaubare Material aufgrund von zwei Hauptnachteilen noch nicht gefunden: (a) die schwierige Modulation der Abbauzeit; (b) die möglichen toxischen Wirkungen der Abbauprodukte.
Der Abbau der Materialien basiert im Allgemeinen auf drei Hauptereignissen: (1) der spontanen Hydrolyse der chemischen Bindungen, die die Polymerstruktur stützen; (2) der mechanischen Wirkung, die durch das Einwachsen in umgebende Gewebe ausgeübt wird; (3) der entzündlichen Reaktion, die durch das Fremdmaterial ausgelöst wird.
Die Modulation des Abbaus ist häufig sehr schwierig zu erhalten, da sie durch die individuelle Variabilität der Pati enten beeinflusst werden kann. Zum Beispiel ist der Gewebeeinwuchs bei jungen Patienten schneller als die Geweberegeneration von älteren Patienten und Patienten mit besonderen Krankheiten können veränderte entzündliche Reaktionen erzeugen. Die Toxizitätsprobleme, die häufig mit den Abbauprodukten von synthetischen Materialien verbunden sind, werden teilweise durch die Anwendung von natürlichen Polymeren umgangen². Diese Materialien bringen jedoch andere Arten von Nachteilen, wie die Reinigungskosten, und Risiken von übertragbaren Krankheiten oder Allergien, die mit ihrer Anwendung verbunden sind, hervor.
Das ideale bioabbaubare Polymer sollte ein Polymer sein, das sich durch spontane Hydrolyse zu natürlichen und kompatiblen Molekülen abbaut. Zusätzlich sollte das, der Oberfläche ausgesetzte Material die Anhaftung von Gewebezellen unterstützen, um Gewebeeinwuchs zu erleichtern. Eine verminderte Immunreaktion sollte mit sowohl Materialimplantation als auch ihrem Abbauprozess gekuppelt sein.
Poly(milchsäure), Poly(glycolsäure) und Poly(lactid-coglycolid) sind eine spezielle Klasse von aliphatischem Polyester, der aus Milch- und Glycolsäure synthetisiert werden kann³. Der Vorteil der Anwendung dieser Klasse von Biomaterialien besteht darin, dass, obwohl synthetisch, sie in Moleküle abbauen, die normalerweise durch den Körpermetabolismus erzeugt werden und deshalb nicht schädlich sind. Weiterhin werden diese Materialien leicht zu Filmen und Fäden sowie in Mikro- und Nanopartikel verarbeitet. Der physikalisch-chemische Abbau von den Poly(lactid-co-glycolid)-Copolymeren kann auch durch den Prozentsatz von den zwei Monomeren und dem Molekulargewicht des Endpolymers moduliert werden.
Diese Klasse von Polymeren kann als die besten bioabbaubaren Materialien bezüglich Biokompatibilität betrachtet werden, obwohl sie teuer sind und eine entzündliche Reaktion hervorrufen, die mehr oder weniger, in Abhängigkeit von ihrem Molekulargewicht, gefördert werden kann. Weiterhin unterstüt zen diese Materialien nicht das Zellwachstum, sofern sie nicht in geeigneter Weise funktionalisiert sind, und einige Studien schlagen einen bestimmten Grad an Cytotoxizität vor, wenn Poly(milchsäure) zu Zellkulturen bei relativ hohen Konzentrationen gegeben wird³.
Trotzdem werden auf Poly(milchsäure) und Poly(glycolsäure) basierende Produkte als die besten bioabbaubaren Biomaterialien auf dem Markt für verschiedene biomedizinische Anwendungen angesehen. Zum Beispiel werden bioabbaubare Nahtmaterialien und bioabbaubare Sperren in der Dentalpraxis aus diesen Polymeren erhalten.
Sojabohnenproteine wurden kürzlich unter den natürlichen und bioabbaubaren Polymeren eingeschlossen, die zu Filmen für Technikanwendungen verarbeitet werden können. Ein Patent hat die Herstellung von Thermokunststoffen aus Sojabohnenproteinen beansprucht⁴, und erst kürzlich wurde deren Anwendung als Biomaterialien vorgeschlagen⁵.
Wenn seine Ölkomponente entzogen wurde, ist Sojabohnenmehl ein natürlicher Verbundwerkstoff, der hauptsächlich aus Proteinen und Kohlenhydraten aufgebaut ist. Die Herstellung der Sojabohnenmilch aus dem vermahlenen Mehl und dessen Verarbeiten in Käse der verschiedenen Textur durch Calciumlösungen wurde in der Nahrungsindustrie untersucht, um die Gesundheit unterstützende Produkte bereitzustellen⁶. Gemäß unserem Wissen wurde kein Bericht über die Herstellung von Thermokunststoffen und wärmehärtbaren Materialien aus Sojabohnenkäse (Tofu) und dessen Verwendung auf dem biomedizinischen Gebiet veröffentlicht. Basierend auf den Fertigkeiten und Kenntnissen der Nahrungsmittelindustrie, können die Verfahren für die Herstellung und die Sterilisierung von auf Tofu basierenden Thermokunststoffen und wärmehärtbaren Materialien leicht auf die Herstellung der neuen Biomaterialien angewendet werden^6,7.
DIE ERFINDUNG
Diese Erfindung basiert auf dem Auffinden, dass Filme von einem Material vom Sojabohnentyp eine Hemmung der entzündlichen Reaktion einleiten können und sie deshalb in der physiologischen Umgebung, hauptsächlich auf der Grundlage von ihrer Hydrolyse, abbauen. Die Thermokunststoffe und wärmehärtbaren Materialien, die aus dem entfetteten, extrafesten Tofu hergestellt werden, sind auch in der Lage, eine schnelle Bildung (2 Tage) von einer Mineralphase mit einer chemischen Zusammensetzung, ähnlich zu dem Knochenhydroxylapatit, zu induzieren, wenn in physiologischen Puffer mit einer Salzzusammensetzung, ähnlich zu jener der Knochenexsudate, inkubiert wird. Dieses Mineralisierungsverfahren geht dem Filmabbau voraus, der nur nach 3 Tagen Inkubation beginnt, und geht der Bildung einer Porosität, die gleichmäßig durch die exponierte Oberfläche verteilt ist, voraus. Obwohl die Erfinder diese Effekte nur in vitro gezeigt haben, erlaubt die Übereinstimmung der aus verschiedenen experimentellen Verfahren erhaltenen Daten, ein ähnliches Verhalten in vivo vorauszusagen. Die Möglichkeit, sowohl die Chemie, als auch die Morphologie, der Materialien zu modifizieren, wird auch in der vorliegenden Erfindung beansprucht, was eine Reihe von Ansätzen bietet, um dieselben für viele biomedizinische Anwendungen geeignet zu machen. Diese Modifizierungen zielen darauf, die Abbauzeit des Materials, durch Variieren ihrer Porosität und Oberflächenchemie, zu modulieren, sowie die Biokompatibilität des Materials und die mechanischen Eigenschaften zu verbessern. Die Hemmung der entzündlichen Zellaktivierung durch die Thermokunststoffe, die wärmehärtbaren Materialien und deren Abbauprodukte zeigt an, dass der Abbau des Materials in vivo nur durch seine spontane Hydrolyse und durch den Gewebeeinwuchs, beide durch die exponierte Oberfläche des Implantats geleitet, beeinflusst wird. Die Thermokunststoffe, die aus Tofu hergestellt werden, begünstigen auch Zellanhaftung und Proliferation. Die aus Tofu hergestellten Thermokunststoffe können deshalb sowohl als Mo nolith als auch Beschichtungsmaterial verwendet werden, um die Bildung von neuen Geweben und die Hemmung der Implantat-bedingten Entzündung anzuregen.
Die auf Tofu basierenden oder abgeleiteten wärmehärtbaren Produkte der vorliegenden Erfindung sind Biomaterialien. Wie durch den Fachmann verständlich, ist ein Biomaterial ein nicht lebensfähiges Material, das in einer medizinischen Vorrichtung verwendet wird, die vorgesehen ist, mit biologischen Systemen in Wechselwirkung zu treten.
Die erfindungsgemäßen wärmehärtbaren Biomaterialien können durch ein Verfahren hergestellt werden, das Wärmehärten von entfettetem Sojatofu umfasst. In einer Ausführungsform des Verfahrens wird Sojabohnenquark (Tofu) aus entfetteter Sojamilch durch ein Koagulierungsverfahren (zum Beispiel ein Calcium-induziertes Koagulationsverfahren) hergestellt. Der entfettete Tofu kann geformt oder in die gewünschte Form und Größe geschnitten werden und dann bei einer erhöhten Temperatur inkubiert oder alternativ bei einer erhöhten Temperatur Autoklauen-behandelt werden, bis das Wärmehärten vollständig ist.
Die Hauptanwendungsgebiete für diese Materialien werden das Wundheilen, Skelett und dentale Osteointegration, postchirurgisches Gewebsanhaften und Arzneistofffreisetzung sein. Spezieller können die wärmehärtbaren Biomaterialien als Komponenten von Wundverbänden, zeitweilige Sperren zur Verhinderung von nachchirurgischem Gewebsanhaften, Füllstoffe oder Beschichtungsmaterialien mit osteointegrativem Potential (d. h. die in den Knochen integriert werden können) und entzündungshemmenden Mitteln verwendet werden.
Die Erfindung wird nun weiterhin durch die nachstehenden Beispiele und mit Bezug auf die beigefügten Figuren erläutert:
1 zeigt eine Raster-Elektronenmikroskopie von kompaktem Tofu-Thermokunststoff in einem trockenen Zustand (a) Bruchoberfläche (Vergrößerung × 12 000); (b) exponierte Oberfläche (Vergrößerung × 3 000).
2 zeigt eine Raster-Elektronenmikroskopie von einem Tofu-Thermokunststoff, gequollen in PBS und bei verschiedenen Druckwerten Autoklauen-behandelt. (a) 1 psi (0,1 bar) Bruchoberfläche; (b) 9 psi (0,6 bar) Bruchoberfläche; (c) 14 psi (1 bar) Bruchoberfläche; (d) 1 psi (0,1 bar) exponierte Oberfläche; (e) 9 psi (0,6 bar) exponierte Oberfläche; (f) 14 psi (1 bar) exponierte Oberfläche, Vergrößerung × 12 000.
3 zeigt Raster-Elektronenmikroskopie von PBS-gequollenem und gefriergetrocknetem Tofu-Thermokunststoff, Vergrößerung × 12 000.
4 zeigt die Wasseraufnahme von thermoplastischen Tofufilmen nach Inkubation in physiologischer Lösung. Die Versuche wurden dreifach ausgeführt.
5 zeigt ein Profil von thermoplastischem Tofufilmabbau in physiologischem Puffer. Die Versuche wurden dreifach ausgeführt.
6 zeigt eine Raster-Elektronenmikroskopie des Abbauens von Tofu-Thermokunststoffen nach 7 Tagen in physiologischem Puffer. (a) unter Abbauen von Polymerhaut; (b) darunter liegende Materialmasse. Vergrößerung × 200.
7 zeigt Cryo-Raster-Elektronenmikroskopie von thermoplastischer Tofufilmoberfläche. (a) Kontrollfilm; (b) 2-Tage-Inkubation in simulierender Körperflüssigkeit bei 37°C. Vergrößerung × 3 000.
8 zeigt dispersive Element-Röntgen-Analyse von Tofu-Thermokunststofffilmen. (a) Kontrolle; (b) 2-Tage-Inkubation in simulierter Körperflüssigkeit bei 37°C.
9 zeigt adsorbierte Anteile von Proteinen, die in den Wundheilungsprozess einbezogen sind. (a) C3-Fragment von komplementärem System; (b) Fibrinogen; (c) Immunoglobuline; (d) Fibronectin. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von n = 6 ausgedrückt. Der Stern zeigt Material an, das signifikant verschieden von Tofu bei p < 0,05 ist; ein Doppelstern zeigt Material an, das signifikant verschieden von Tofu bei p < 0,01 ist.
10 zeigt die Wirkung von Tofu-Thermokunststoffen und deren Extrakten auf die Erzeugung von freien Radikalen von einkernigen Zellen. Die Kontrolle ist die spontane Aktivierung der Zellen, die während des Versuchs erhalten wird. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von n = 6 ausgedrückt. Die Proben waren signifikant verschieden von den Kontrollzellen bei p < 0,01.
11 zeigt Anhaftung von Monozyten/Makrophagen auf Tofufilmen, die durch Raster-Elektronenmikroskopie analysiert werden. (a) isolierte rundförmige Zellen; (b) Zellkluster; (c) isolierte ausgebreitete Zellen. Balken = 3 μm.
12 zeigt Anhaftung und Proliferation von 3T3 murinen Fibroblasten auf, auf Sojabohnen basierenden Thermokunststoffen. (a) Kontrolle 6 h; (b) Tofu 6 h; (c) Kontrolle 24 h; (d) Tofu 6 h; (e) Kontrolle 48 h; (f) Tofu 48 h. Die Versuche wurden dreifach ausgeführt.
13 zeigt 3T3 murine Fibroblasten-Verteilung auf Tofu basierenden Thermokunststoffen nach einer Inkubationszeit von 24 h.
BEISPIEL 1: Herstellung von kompakten Probenstücken bei hoher Temperatur.
VERFAHREN
Scheiben von entfettetem extrahartem Sojabohnen-Käse, der durch herkömmliche Koagulationsverfahren mit CaCl₂-Lösungen (10–40 mM)⁸ hergestellt wird, oder erhalten aus kommerziellem Tofu, werden durch ein scharfes Blatt mit einer gleichförmigen Dicke (1,0 cm) geschnitten.
Die erhaltenen Filme werden in einem Ofen bei 90°C bis zur vollständigen Wärmehärtung inkubiert.
In einem alternativen Verfahren wurde Wärmehärten durch Mikrowellensintern erhalten.
Das Verfahren ist auch auf die Herstellung von Probenstücken mit anderer Morphologie durch die Herstellung des Sojabohnenkäses in geeigneten Formen anwendbar. Würfel, Scheiben, Membranen oder extrudierte Fasern können so erhalten werden. Mikropartikel können auch durch Zerkrümeln von entweder frischem Tofu oder dessen Thermokunststoffen in einem Mischer hergestellt werden. In dem ersten Fall unterliegt das zerkrümelte Material Wärmehärten, wie in diesem Beispiel und in Beispiel 2 berichtet.
Die gemäß diesem Verfahren hergestellten Probenstücke wurden mit Gold Sputter-beschichtet und durch Raster-Elektronenmikroskopie bei × 3 000 und × 12 000, 5 kV, analysiert.
ERGEBNISSE
Starre Filme von 1,0 ± 0,2 mm Dicke werden erhalten. Die Morphologie der Filmbruchoberfläche scheint sehr kompakt mit einer sichtbaren Rauhigkeit nur bei hoher Vergrößerung zu sein (1a). Die exponierte Oberfläche zeigte eine Rauhigkeit, worin Berge und Täler bereits bei 3000-facher Vergrößerung sichtbar waren (1b).
BEISPIEL 2: Herstellung von expandierten Tofu-Gelen bei verschiedenen Drücken.
VERFAHREN
Tofuscheiben wurden in Phosphat-gepufferte Salzlösung pH 7,2 (PBS) für 24 Stunden bei Raumtemperatur getaucht und bei verschiedenen Temperaturen (100, 115, 121°C) Autoklavenbehandelt. Jeder Temperaturwert entsprach einem anderen Druck (100°C = 1 psi (0,1 bar); 115°C = 9 psi (0,6 bar); 121°C = 14 psi (1 bar)). Die Gel-Scheiben wurden für 5 Minuten bei der Härtungstemperatur gehalten, und der Druck des Autoklaven wurde dann schrittweise gesenkt. Die Filme wurden schließlich über Nacht gefriergetrocknet.
Das gleiche Verfahren wurde auf die frischen Tofukäse-Probenstücke angewendet⁸.
In einem alternativen Verfahren wurden die feuchten Filme über Nacht gefriergetrocknet.
Alle Probenstücke wurden mit Gold Sputter-beschichtet und durch Raster-Elektronenmikroskopie bei × 12 000, 5 kV, analysiert.
ERGEBNISSE
Durch die übernommen Autoklauen-Behandlungsverfahren wurden Gele von verschiedener Porosität erhalten. Die Porendichte erhöhte sich mit dem Erhöhen der Autoklaven-Behandlungstemperatur und dem Druck, auf sowohl die Bruch- und exponierten Oberflächen, jedoch die exponierten Oberflächen waren weniger porös als die Brüche (2a–f). Kein Unterschied wurde bezüglich Porendurchmesser (ca. 200 nm) bei verschiedenen Autoklaven-Behandlungsbedingungen gefunden.
Die exponierte Oberfläche von den PBS-gequollenen und Autoklaven-behandelten Materialien verlor die Rauhigkeitsmorphologie, die in der trockenen Kontrolle beobachtet wird (1b), möglicherweise als eine Folge des Quellungsverfahrens.
Das einfache Gefriertrocknen der Filme erzeugte eine andere Morphologie, wo keine Pore sichtbar war, jedoch die Rauhigkeit der exponierten Oberfläche wurde durch die Bildung von herausragenden Kugeln erhöht (3).
Poröse Probenstücke von verschiedenen Größen und verschiedenen Morphologien können, wie in Beispiel 1 berichtet, erhalten werden (d. h. Würfel, Membranen, Teilchen, Stäbe, Scheiben).
BEISPIEL 3: Herstellung von Polypeptid-funktionalisierten Tofu-Thermokunststoffen.
VERFAHREN
Von Tofu abgeleitete Thermokunststoffe wurden durch Pfropfen von spezifischen, bioaktiven Peptiden auf die Soja bohnenpolymere, durch die Reaktion von Aldehyden mit Aminogruppen von den Sojabohnenproteinen (Schiff'sche Rasenbildung), funktionalisiert. Die Filme wurden in eine 0,25%ige (Gewicht/Volumen) Glutaraldehydlösung in Phosphatpuffer, enthaltend verschiedene Konzentrationen der bioaktiven Peptide, für 1 Stunde bei Raumtemperatur getaucht. Alternativ wurde 0,38%iger (Gewicht/Volumen) Formaldehyd als Kupplungsreagenz verwendet. In beiden von den Protokollen wurde ein Schritt der Reduktion der C=N-Doppelbindungen durch 10 mM CNBr ausgeführt.
Alternativ kann Pfropfen über Disulfidbrücken oder über Alkohol-Veresterung oder durch andere klassische biochemische Verfahren erreicht werden.
Alle Peptide mit spezifischen Zellrezeptorfunktionen, Calciumbindungseigenschaften sowie Wachstumsfaktoren sind in diese Erfindung als Funktionalisierungsmoleküle von den von Tofu abgeleiteten Thermokunststoffen eingeschlossen.
BEISPIEL 4: Tofu-Thermokunststoff/wärmehärtende Verbundwerkstoffmaterialien.
VERFAHREN
Die Synthese von Verbundwerkstoff-Biomaterialien, die auf Tofu-Thermokunststoffen basieren, wird auf Techniken, wie Vermischen, einander Durchdringen des Polymernetzwerks und Pfropfen mit biokompatiblen synthetischen und natürlichen Polymeren, die auf die Tofu-Thermokunststoffe übertragen werden können, basieren:

(i) Erhöhte Plastizität (niedrige Glasübergangstemperatur) bei einem trockenen Zustand;
(ii) Erhöhte Hydrophobizität;
(iii) Erhöhte Hydrophilizität (erhöhte Quelleigenschaften in einer wässrigen Umgebung);
(iv) Physikalisches und chemisches Vernetzen;
(v) Physikalische und biologische (Osteointegrations-) Eigenschaften. (i) und (ii) Extrafeste Tofukäsepaste wird bei 90°C, mit 1% (Gewicht/Volumen) geschmolzenem Polycaprolacton, bei verschiedenen Molekulargewichten vermischt. (iii) Von Tofu abgeleitete, poröse Thermokunststoffe, hergestellt wie in Beispiel 2 berichtet, werden durch hydrophile Materialien, wie Polyethylenglycol, Poly(vinylalkohol), Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), Alginat, Chitosan, durch das Quellen der Tofu-Thermokunststoffe von Beispielen 1 und 2 in Wasser oder Alkohol-Additiv-Lösungen, einander durchdringen. Nach der Durchdringung wird ein weiterer Entwässerungsschritt ausgeführt, um physikalische Wechselwirkung zwischen den zwei Komponenten des Verbundwerkstoffmaterials zu erlauben. Die Entwässerung wird bei verschiedenen Temperaturen gemäß der Stabilität des Additivs ausgeführt. Die erhaltenen Probenstücke können, wie in Beispiel 3 berichtet, funktionalisiert sein. (iv) Physikalisches Vernetzen kann unter Einführen von hydrophoben Domänen in die Paste, entweder wie in Punkt (i) beschrieben oder wie in Beispiel 3 beschrieben, erhalten werden. Alternativ können Salzbrücken unter Einführen von Molekülen von entgegen gesetzten Ladungen erzeugt werden. In dem ersten Fall können Elends von frischem Tofukäse mit synthetischen und natürlichen Polymeren in der Lage sein, hydrophobe Wechselwirkungen zu bilden, oder Wasserstoffbinden wird, wie in Punkten (i) und (iii) berichtet, ausgeführt. Das Pfropfen von Monoaldehyden, die hydrophobe, hydrophile oder geladene Gruppen tragen kann, wie in Beispiel 3 berichtet, ausgeführt werden. (v) Das Vermischen der Tofupaste mit Hydroxylapatit und Calciumphosphaten bei verschiedenen Verhältnissen kann vor dem Wärmehärten ausgeführt werden, um die osteoin tegrativen Eigenschaften der auf Tofu basierenden Thermokunststoffe und wärmehärtenden Produkte zu erhöhen.

BEISPIEL 5: Tofu-Thermokunststoff/wärmehärtbare Biomaterialien für Wundverbände und andere Anwendungen.
VERFAHREN
Auf Tofu basierende Schwämme mit verschiedener Porosität werden, wie in Beispielen 1, 2 und 4 berichtet, hergestellt. Rechtwinklige (1,0 cm × 0,5 cm), kompakte Proben wurden in Phosphatpuffer bei 37°C inkubiert und deren Gewicht wurde zu verschiedenen Zeiten nach Entfernung des Überschusses an Puffer von der Oberfläche durch Kapillarität bestimmt.
Nach vollständigem Quellen wurden die Probenstücke auf ihre mechanischen Eigenschaften durch Instron gemäß ISO-Standards getestet.
ERGEBNISSE
Filme mit einer niedrigen Porosität und einer Dicke von 1,0 mm haben eine relativ schnelle Relaxationszeit und erlauben, Wundextrudate über lange Zeiträume (ungefähr 24 h) (4) zu adsorbieren.
Die Wasseraufnahme kann durch Verändern der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Schwämme, wie in Beispielen 1, 2 und 4 berichtet, moduliert werden.
Die mechanischen Eigenschaften der feuchten Thermokunststofffilme werden in Tabelle 1 zusammengefasst. Die guten elastischen Eigenschaften von diesem Material bei feuchten Bedingungen sind verbessert. Tabelle 1. Mechanische Eigenschaften von feuchten Tofu-Thermokunststofffilmen.

Parameter Mittelwert (Bereich)

Proben-Nummer Belastung bei Bruch (MPa) Dehnung bei Bruch (mm/mm) Modul (MPa)

3 0,921 (0,842–1,068) 0,905 (0,796–0,992) 3,643 (3,140–3,957)
BEISPIEL 6: Tofu-Thermokunststoff/wärmehärtbare Biomaterialien als bioabbaubare Sperren zur Verhinderung von nachchirurgischem Gewebsanhaften und anderen Anwendungen.
VERFAHREN
Auf Tofu basierende bioabbaubare Filme, die als eine zeitweilige Sperre zur Verhinderung von nachchirurgischem Gewebsanhaften und anderen Anwendungen wirken, worin der Abbau erforderlich ist, können durch die in Beispielen 1, 2 und 3 beschriebenen Herstellungsverfahren erhalten werden. Die Membranen als solche oder modifiziert mit speziellen funktionellen Gruppen, wie in Beispielen 3 und 4 berichtet, können auch in der Dentalpraxis, ästhetischen Chirurgie und anderen Arten von Anwendungen angewendet werden, wo das Wachstum von weichen und Knochengeweben moduliert werden muss.
Rechtwinklige (1,0 cm × 0,5 cm) Probenstücke wurden in Phosphatpuffer für 9 Tage bei 37°C inkubiert. Die Probenstücke wurden bei verschiedener Zeit nach Entfernung des Überschusses an Puffer von der Oberfläche durch Kapillarität gewogen.
Nach 7 Tagen Inkubation in Puffer wurden die Probenstücke in desionisiertem Wasser gewaschen, über Nacht gefriergetrocknet, mit Gold Sputter-beschichtet und durch Raster-Elektronenmikroskopie bei × 200, 5 kV, analysiert.
ERGEBNISSE
Die Kompaktfilme, die gemäß den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erzeugt wurden, zeigten einen langsamen und spontanen Abbau in einer wässrigen Umgebung (5). Der durch die spontane Hydrolyse induzierte Abbau war sehr langsam, was für 30% von dem Probenstückgewicht nach 9 Tagen ausmacht.
Der Abbau des Films nach 7 Tagen führte zu der Bildung von einem stark porösen, Gel-artigen Film (6a), der sich leicht von der Masse des Materials entfernen ließ, welches einen anderen Grad an Porosität zeigte (6b). Beide von den erhaltenen Porositätsgraden waren in dem Bereich, der für Gewebeeinwuchs erforderlich war (100–500 μm).
Der intrinsisch langsame Bioabbau von den Tofu-Thermokunststoffen von verschiedenen Morphologien lässt auch dessen Anwendung als eine Sperre zur langsamen Abgabe von Antibiotika und Arzneistoffen vermuten.
BEISPIEL 7: Tofu-Thermokunststoff-/wärmehärtbare Produkte als osteointegrative Biomaterialien.
VERFAHREN
Das Vorliegen von relativ hohen Mengen an Calcium, das als Koagulationsmittel bei der Herstellung von Tofukäse verwendet wird (Beispiel 1), die modulierte Porosität der Hydro-Gele (Beispiel 2) und deren Funktionalisierung mit bioaktiven Peptiden (Beispiel 3) lässt die Verwendung von diesen Materialien als ein Substrat für Osteointegration vermuten.
Kompakte Tofufilme wurden in einer Pufferlösung mit einer Salzzusammensetzung, die die Knochenexsudate simuliert, für 2 Tage, 37°C, inkubiert. Kontrollscheiben wurden in PBS für die gleiche Zeitlänge inkubiert. Die Probenstücke wurden in desionisiertem Wasser gewaschen und gefroren. Die Probe der wässrigen Phase wurde in einer Cryostat-Zubereitungskammer sublimiert, und das getrocknete Material mit Palladium Sputter beschichtet und in gefrorenem Zustand durch Cryo-Raster-Elektronenmikroskopie analysiert. Die Morphologie wurde bei × 3 000, 5 kV, analysiert; die Elementaranalyse wurde bei 15 kV ausgeführt.
ERGEBNISSE
Die Bildung einer konsistenten Mineralphase auf der Oberfläche von einem nicht modifizierten Thermokunststoff-Tofufilm war immer nach 2 Tagen Inkubation in simuliertem Körperflüssigkeitspuffer sichtbar (7b). Bei den gleichen experimentellen Bedingungen zeigte ein starkes osteointegratives Material, wie Polyactive^® (CAM, Niederlande), nicht beliebig nachweisbare Mineralisierung (Daten nicht gezeigt).
Die Elementaranalyse erlaubte die Charakterisierung der Mineralphase als Calciumphosphat, worin das Ca/P-Verhältnis 1,05 war (8 b). Ungeachtet des Filmherstellungsverfahrens wurden nicht nachweisbare Phosphor- und Calciumpeaks in der Kontrolle gefunden (8a). Die Peaks von den Kohlenstoff- und Sauerstoffatomen, die für die organischen Sojabohnenpolymere typisch sind, nahmen ab, wenn das Material in simulierender Körperflüssigkeit inkubiert wurde, was deutlich anzeigt, dass die gebildete Mineralphase eine signifikante Dicke erreicht hatte (8a und b).
Die Kontrollprobenstücke (7a), die einem PBS-Medium ausgesetzt waren, zeigten eine Veränderung der Oberflächenmorphologie, die relativ glatter geworden war, als das getrocknete Material (1b), in ähnlicher Weise zu den Druck-ausgedehnten Materialien (2d–f).
BEISPIEL 8: Anti-Entzündungseigenschaften von Tofu-Thermokunststoffen.
VERFAHREN
Vorher in physiologischer Lösung benetzte und dann mit Humanplasma für 30 Minuten bei 37°C, statistische Bedingungen, konditionierte Tofufilme wurden durch Enzym-Gebundenes Immuno-Assay (ELISA) für die Adsorption von Proteinen mit einer Schlüsselrolle in dem Wundheilungsprozess analysiert. Die Ergebnisse wurden mit jenen verglichen, die von zwei synthetischen Materialien, Polystyrol (PST) und Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (PHEMA), mit vollständig verschiedenen physikochemischen Oberflächeneigenschaften erhalten wurden.
Der Effekt von auf Tofu basierenden Thermokunststoffen und deren Abbauprodukte auf die Entzündungszellen wurde auch bewertet. Einkernige Zellen (10⁵/ml), getrennt von humanem peripherem Blut durch Boyum-Verfahren⁹, wurden zu 3 ml Phosphatpuffer, worin die gequollenen, rechteckigen (1,0 cm × 0,5 cm) Probenstücke vorher angeordnet wurden, gegeben. Die Wirkung der Abbauprodukte wurde auch durch Zusetzen zu dem Puffer von 100 μl des Inkubationsmediums, worin der Filmabbau für 3 Tage ausgeführt wurde, bewertet. In beiden Fällen wurde vorher Luminol 1,0 mM zu dem Inkubationsmedium gegeben. Chemilumineszenz, die durch die Erzeugung der freien Radikale durch die Zellen induziert wurde, wurde für 1 Stunde kontinuierlich nachgewiesen.
In einem alternativen Verfahren wurden einkernige Zellen (10⁵), in Gegenwart von einer Materialscheibe von 1,7 cm Durchmesser, die vorher mit Humanplasma für 20 Stunden bei 37°C, 95% Luft, 5% CO₂, konditioniert wurde, inkubiert. Die Überstände wurden abgezogen, bei 1 000 G zentrifugiert, um die Kontamination von nicht gebundenen Zellen zu vermeiden, und durch einen ELISA-Kit auf Interleukin-1β getestet.
In einem ähnlichen Versuch wurden die Zellen, die an dem Plasma-konditionierten Material anhaften, an der Oberfläche mit 2,5% (Gewicht/Volumen) Glutaraldehydlösung in PBS fixiert. Nach dem Fixieren wurde das Material schrittweise durch Inkubation in Ethanol/PBS-Lösungen durch ansteigende Alkoholkonzentration (25%, 50%, 75%, auf das Volumen) entwässert. Zwei Endschritte in absolutem Ethanol wurden schließlich ausgeführt. Alle Schritte dauerten 15 Minuten bei 4°C. Die Pro benstücke wurden über Nacht gefriergetrocknet, mit Gold Sputter-beschichtet und durch Raster-Elektronenmikroskopie bei verschiedenen Vergrößerungen, 5 kV, analysiert.
ERGEBNISSE
ELISA zeigte, dass auf Tofu basierende Thermokunststoffoberfläche gebundene Anteile von C3-Fragment von dem Ergänzungssystem mit Anteilen signifikant niedriger als PST waren (9a). Fibronectin adsorbierte auch mit Anteilen, die signifikant niedriger als PST waren (9d), während signifikanter Unterschied gefunden wurde, wenn die Anteile von Immunoglobulinen (IgG) bewertet wurden (9c). Ein signifikanter Unterschied von Fibrinogen wurde bezüglich der zwei synthetischen Materialien gefunden (9b).
Die Aktivierung von einkernigen Zellen, die aus dem peripheren Humanblut isoliert wurden, wurde auch beeinflusst.
Tofufilme, deren Oberfläche mit Humanplasma vorkonditioniert wurde, induzierten eine sehr niedrige Produktion von Interleukin-1β, verglichen mit PST und PHEMA (Tabelle 2). Tabelle 2. Material-induzierte Synthese von Interleukin-1β durch einkernige Zellen. Versuche wurden dreifach ausgeführt.

Probe (n = 3) IL-1β-Konzentration Mittelwert (pg/ml) Wertbereich

Tofu 56,2 23,2–89,2

PHEMA 256,9 220,7–276,1

PST 331,0 179–545
Die Bewertung der Erzeugung von freien Radikalen durch die einkernigen Zellen durch ein Chemilumineszenzverfahren zeigte, dass Tofu-Thermokunststoffe sowie deren Abbauprodukte signifikant die spontane Aktivierung von einkernigen Zellen unterdrückte (10). Die Inkubation der Monozyten mit den Tofuextrakten, die von den Abbauversuchen in physiologischer Lösung abgeleitet sind, zeigte eine noch stärkere inhibitorische Wirkung auf die Erzeugung der freien Radikale.
Schließlich wurde die Anhaftung der Monozyten/Makrophagen an von Tofu abgeleiteten Thermokunststofffilmen auch auf rundförmigen Zellen mit einer glatten Oberfläche beschränkt, was deren ruhenden Zustand anzeigt (11a–c). Die Anhaftung der Zellen war schlecht mit nur winzigen Pseudopodia etablierenden Kontakten mit der Oberfläche des Materials (11a und 11b). Nur spärlich wurde eine gute Zellverteilung beobachtet (11c), jedoch zeigten die Makrophagen noch eine glatte Oberfläche, typisch für nichtaktive Zellen.
BEISPIEL 9: Tofu-Thermokunststoffe als Stütze für Gewebetechnik
VERFAHREN
Thermokunststoff-Tofuscheiben (1 cm Durchmesser, im trockenen Zustand) wurden mit 90%igem Ethanol für 15 Minuten desinfiziert. Die Probenstücke wurden für 1 Stunde in Zellkultur-Wachstumsmedium, angereichert mit 10%igem (Volumen/Volumen) fötalem Rinderserum, ins Gleichgewicht gebracht und 3T3 Mausfibroblasten (2,5 × 10⁵) wurden auf jede Scheibe geimpft. Die Zellanhaftung/Proliferation wurde bei 6 h, 24 h und 48 h Inkubationszeit bei 37°C, 95% Luft, 5% CO₂, gestoppt. Für jede Inkubationszeit wurden Kontrollen in Gewebekulturplatten (TOP) ebenfalls ausgeführt. Anhaftende Zellen wurden fixiert und, wie in dem vorangehenden Beispiel berichtet, entwässert, und Proben wurden mit Gold Sputter-beschichtet und durch Raster-Elektronenmikroskopie bei verschiedener Vergrößerung bei 5 keV analysiert.
ERGEBNISSE
12a und b zeigen den Anhaftungsgrad und die Proliferation der Fibroblasten an dem TOP (a) und auf Sojabohnen basierendem Thermokunststoff (b) nach 6 Stunden Inkubation. Ein schlechter Grad an Zellausbreitung wurde an den auf Tofu basierenden Materialien nachgewiesen; die Fibroblasten schienen noch rund geformt und nur winzige Lamellipodia stellten Kontakte mit der Oberfläche her. Umgekehrt war das Ausbreiten der Zellen auf dem TOP nach der gleichen Zeitlänge bereits vollständig.
Jedoch bei 24 Stunden und 48 Stunden erreichten die Fibroblasten einen Verbreitungsgrad auf den Tofu-Thermokunststoffen (12 d und f), der mit jenem der Kontrolle vergleichbar ist (c und e). Die Zellen bildeten zusammenfließende Schichten mit einer neuen extrazellularen Matrix, die die Oberfläche des Biomaterials bedeckt. Einige Gebiete von isolierten Zellen erlaubten den hohen Grad an Ausbreitung, der durch die Zellen von auf Tofu basierenden Biomaterialien nach 24 Stunden erreicht wurde, hervorzuheben (13).
LITERATURSTELLEN

1. Santin, M., Huang, S. J., Iannace, S., Ambrosio, L., Nicolais, L., Peluso, G. 1996 Synthesis and characterization of a new interpenetrated poly(2-hydroxyethylmethacrylate)gelatin composite polymer. Biomaterials 17: 1459–1467.
2. Kim, H. J., Lee, H. C., Oh, J. S., Shin, B. A., Oh, C. S., Park, R. D., Yang, K. S., Cho, C. S. 1999 Polyelectrolyte complex composed of chitosan and sodium alginate for wound dressing application. J. Biomat. Sci.-Polymer Herausg. 10: 543–556.
3. Jalil, R., Nixon, J. R. 1990 Biodegradable poly(lactic acid) and poly(lactide-co-glycolide) microcapsule: problems associated with preparative techniques and release properties J. Microencapsulation 7, 297–325.
4. Patent Nr. US 5 523 293 , 1996.
5. Vaz, C. M., Foseen, M., Cunha, A. M., Reis, R. L., Casein and soybean thermoplastic Proteins as alternative biodegradable polymers for biomedical applications. Sixth World Biomaterials Congress, Kamuela, USA, 15.–20. Mai 2000, Abstract 429.
6. Patent Nr. US 006042851A , 1998.
7. Patent Nr. US 5 674 548 , 1997.
8. Saio, K., Watanabe, T. 1973 Food use of soybean 7S and 11S Proteins. Extraction and functional properties of their fractions. Journal of Food Science 38, 1139–1144.
9. Boyum A. 1968 Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blond. Scand J Clin Lab Innest; 21: 77–89.

Claims

Verwendung eines kompakten oder porösen wärmehärtbaren Produkts, hergestellt aus entfettetem Sojatofu, als Biomaterial.
Verwendung eines kompakten oder porösen wärmehärtbaren Produkts, hergestellt aus entfettetem Sojatofu für die Herstellung eines Biomaterials.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Biomaterial in der Form von oder zur Verwendung in einem Wundverband ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Biomaterial in der Form oder zur Verwendung in einer zeitweiligen Sperre zur Verhinderung von nachchirurgischem Gewebsanhaften ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Biomaterial in der Form von oder zur Verwendung in einem Füllstoff oder Beschichtungsmaterial mit osteointegrativem Potenzial ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Biomaterial oder ein Abbauprodukt davon in der Form von oder zur Verwendung in einem entzündungshemmenden Mittel ist.