JP4869539B2 - 大豆ベース熱硬化性生体材料 - Google Patents
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Description
【０００１】
背景
合成および天然の両方を源とする新規な生物生分解性材料の生産は、移植片が体内で一時的に機能しなければならない生物医学的な用途で、重要な目的である。組織内殖および薬剤送達は、通常、保護された足場作用を必要としない以外は、完全な分解性生体材料の使用と関連する1。しかし、理想的な生分解性材料は、2つの主要な欠点：（a）分解時間の調節が困難；（b）分解産物の起こりうる毒性作用のために未だ達成されていない。
【０００２】
材料の分解は、通常、3つの主な事象：（1）ポリマー構造を維持する化学結合の自然加水分解；（2）周辺組織の内殖で発揮される機械的な作用；（3）外来材料によって誘発される炎症反応に基づいている。
分解の調節は、個体の変異性に影響されるため、時として生ずることが大変困難である。例えば、若い対象組織の成長は、古い組織の再生よりもむしろ速やかで、特定の疾患の患者は、異常な炎症反応を生じることができる。
毒性の課題は、時として、天然ポリマーの使用で部分的に回避される合成材料の分解産物と関連している2。しかし、その他の欠点、例えば精製費用、および伝染病またはアレルギーなどの欠点を有するこれらの材料は、これらの使用と関連している。
【０００３】
理想的な生分解性ポリマーは、自然加水分解を通して、天然の融和性分子に分解されるポリマーであるべきである。加えて、表面が曝露された材料は、組織内殖を促進する組織細胞の付着を維持するべきである。軽減された免疫反応は、材料移植とその分解方法との両方に関連すべきである。
【０００４】
ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)およびポリ(ラクチド-コ-グリコライド)は、乳酸およびグリコール酸から合成されえる脂肪族ポリエステルのある特定の種類である3。この種類の生体材料を使用する利点は、例え合成であっても、それらは、人体の代謝で通常生産される分子に分解し、それ故無害であることである。さらに、これらの材料は、容易に、薄膜および糸に加工され、ならびに、微細な、および大きな粒子に加工される。ポリ(ラクチド-コ-グリコライド)コポリマーの物理化学的な分解は、二つのモノマーの比率および最終ポリマーの分子量を通しても調節される。
この種類のポリマーは、生体適合性の点から最良の生分解性材料とみなされているが、それらは、高価であり、分子量に応じて、多少公言されている炎症反応を誘発する。さらに、これらの材料は、それらが適切により機能化されなければ細胞成長を維持せず、幾つかの研究は、ポリ(乳酸)を比較的高い濃度で細胞培養物に添加した場合、一定の細胞毒性を示唆している3。
【０００５】
にもかかわらず、ポリ(乳酸)およびポリ(グリコール酸)ベースの生産物は、幾つかの生物医学的な用途の市場で、最良な生分解性生体材料とみなされている。例えば、生分解性縫合材料および生分解性バリアは、歯科診療で、これらのポリマーから得られる。
大豆タンパク質は、近年、技術用途として、薄膜に加工できる天然の生分解性ポリマーの中に含まれている。特許は、大豆タンパク質由来の熱可塑性物質の生産4を請求しており、ごく最近は、生体材料としてのそれらの使用が示唆されている5。
【０００６】
油成分を除くと、大豆粉は、タンパク質および炭水化物で主に構成される天然の複合物である。すりつぶした粉からの豆乳の生産と、カルシウム溶液で様々な歯ごたえのチーズに加工することは、健康栄養製品を提供する食品産業で、大いに調査されている。我々の知見で、大豆チーズ(豆腐)からの熱可塑性物質の生産、および生物医学分野でのそれらの使用について発表している報告はない。食品産業のノウハウによれば、豆腐ベース熱可塑性物質の生産および消毒の方法は、新規な生体材料の製造に容易に適用できる6、7。
【０００７】
発明
この発明は、大豆タイプ材料の薄膜が、主として、それらの加水分解に基づいた生理環境で、炎症反応の抑制を誘導し、その結果分解するという発見を基にしている。脱脂された特に固い豆腐から製造される熱可塑性物質は、骨滲出物のものと類似した塩組成を有する生理バッファーでインキュベートすると、骨ハイドロキシアパタイトと類似した化学組成を有するミネラル相の速やかな形成(2日間)も誘導することができる。このミネラル化の方法は、インキュベートからわずか3日後に始まる薄膜生分解より先に起こり、曝露面を通して一様に分散される多孔性の形成を進行させる。本発明者らは、これらの作用をインビトロでのみ立証したが、様々な実験方法から得たデータの一致から、インビボで類似した性質が予見できる。材料の化学および形態の両方を修正できる可能性も、多くの生物医学的な用途に適したこれら熱可塑性物質を作製する一連の方法を提供する本発明で請求される。これら修正は、多孔性および表面化学を変化させる材料の分解時間を調節することと、材料の生体適合性および機械特性を改善させることが目的である。熱可塑性物質およびそれらの分解産物による炎症細胞活性の抑制は、インビボでの材料の分解は、移植片の曝露面で導かれる、その自然加水分解および組織内殖によってのみ影響されるとの予測と一致している。大豆ベース熱可塑性物質は、細胞の付着および増殖も助長する。それ故、豆腐ベース熱可塑性物質を、新たな組織の形成および移植関連炎症の抑制を促進するモノリス、およびコーティング材料として使用することができる。
【０００８】
これら材料の主な用途範囲は、創傷治療、骨および歯の骨統合、術後の組織癒着ならびに薬剤送達である。
そこで、本発明は、次の実施例および添付図に対する言及でさらに立証されるであろう。
図1は、乾燥状態での緻密な豆腐熱可塑性物質の走査電子顕微鏡、(a)破断面(倍率×12,000)；(b)曝露面(倍率×3,000)を表す。
図2は、PBSで膨張され、様々な圧力値でオートクレーブされた豆腐熱可塑性物質の走査電子顕微鏡を表す。(a)1 Psi(0.1 Bar)、破断面；(b)9 Psi(0.6 Bar)、破断面；(c)14 Psi(1 Bar)、破断面；(d)1 Psi(0.1 Bar)、曝露面；(e)9 Psi(0.6 Bar)、曝露面；(l)14 Psi(1 Bar)、曝露面。倍率×12,000。
図3は、PBS膨張し、凍結乾燥された豆腐熱可塑性物質の走査電子顕微鏡を表す。倍率×12,000。
図4は、生理溶液でインキュベートした後の豆腐熱可塑性薄膜の水分吸収を示している。実験は、3回行った。
図5は、生理バッファーでの豆腐熱可塑性薄膜の分解の概略を示している。実験は、3回行った。
図6は、生理バッファー中で7日後の豆腐熱可塑性物質の分解の走査電子顕微鏡を表す。(a) 分解性ポリマー皮膚；(b)基礎材料塊。倍率×200。
図7は、豆腐熱可塑性薄膜表面の凍結走査電子顕微鏡を表す。(a)対照薄膜；(b) 37℃、擬似体液で2日間インキュベート。倍率×3,000。
【０００９】
図8は、豆腐熱可塑性薄膜の元素分散X線解析を表す。(a)対照；(b) 37℃、擬似体液で2日間インキュベート。
図9は、創傷治療過程に関わるタンパク質の吸収レベルを示す。(a)補体系のC3フラグメント；(b)フィブリノゲン；(c)免疫グロブリン；(d)フィブロネクチン。データは、n=6からの平均±標準偏差として表す。星印は、P<0.05で豆腐と著しく異なる材料を指す；二重星印は、P<0.01で豆腐と著しく異なる材料を指す。
図10は、単核細胞による遊離ラジカル生産における豆腐熱可塑性物質および該抽出物の影響を示す。対照は、実験の間に得られた細胞の自然活性である。データは、n=6からの平均±標準偏差として表す。サンプルは、P<0.01で対照細胞と著しく異なった。
図11は、走査電子顕微鏡で解析された豆腐薄膜上の単核細胞/マクロファージの付着を示す。(a) 単離された円形細胞；(b)細胞クラスター；(c)単離された分散細胞。バー=3μm。
図12は、大豆ベース熱可塑性物質上の3T3マウス繊維芽細胞の付着および増殖を表す。(a)対照6時間；(b)豆腐6時間；(c)対照24時間；(d)豆腐6時間；(e)対照48時間；(f)豆腐48時間。実験は、3回行った。
図13は、インキュベート24時間後の豆腐ベース熱可塑性物質上で分散する3T3マウス繊維芽細胞を表す。
【００１０】
実施例1：高温での緻密な標本の製造
方法
CaCl2溶液(10〜40mM)を使って従来の凝固法8で製造するか、または市販の豆腐から得た脱脂大豆の特に固いチーズのスライスを、尖った刃で均一な厚み(1.0cm)に切る。
得られた薄膜を、完全に熱硬化するまで、90℃でオーブンでインキュベートする。
代替法では、マイクロ波焼成によって熱硬化させた。
方法は、適切な鋳型での大豆チーズの製造によって様々な形態を有する標本の製造にも適用できる。その結果、キューブ、ディスク、膜または押し出し繊維を得ることができる。微粒子を、新鮮な豆腐またはその熱可塑性物質のいずれかを配合機で砕くことでも製造できる。最初の場合、砕いた材料を、実施例1および2で報告したように熱硬化にかけた。
この方法によって製造した標本を金でスパッタコートし、5kVで、×3,000および×12,000で、走査電子顕微鏡により解析した。
【００１１】
結果
1.0±0.2mmの厚みの硬い薄膜を得た。薄膜破断面の形態は、高倍率でのみ目視できる粗さを有する大変緻密なものであった(図1a)。曝露面は、尖端および溝が、×3000倍率で既に目視できる粗さを表した(図1b)。
【００１２】
実施例2：様々な圧での膨張した豆腐ゲルの製造
方法
豆腐スライスを、室温で、リン酸バッファー生理食塩水pH7.2(PBS)に24時間浸し、様々な温度(100、115；121℃)でオートクレーブした。各温度値は、各々の圧に対応した(100℃=1 Psi(0.1 Bar)；115℃=9 Psi(0.6 Bar)；121℃=14 Psi(1 Bar))。ゲルスライスを、固定温度で5分間保ち、そしてオートクレーブ圧を徐々に減少させた。最後に、薄膜を一晩凍結乾燥させた。
同様な方法を、新鮮な豆腐チーズ標本に適用した。
代替法では、湿った薄膜を一晩凍結乾燥させた。
標本の全てを金でスッパタ-コートし、走査電子顕微鏡で12,000、5kVで解析した。
【００１３】
結果
適用したオートクレーブ法で、様々な多孔性のゲルを得た。孔密度は、オートクレーブ温度、ならびに破断および曝露面の圧の増加で増大したが、曝露面は、破断面ほど多孔性は高くなかった(図2a〜f)。孔の直径(約200nm)に関して、各々のオートクレーブ条件で違いはみられなかった。
PBS膨張し、オートクレーブした材料の曝露面が、乾燥対照(図1b)で観察された粗い形態を喪失しているのは、膨張処理の結果であろう。
薄膜の単純な凍結乾燥は、孔が見られない様々な形態を製造したが、曝露面の粗さが、突き出したビーズの形成によって増大された(図3)。
様々なサイズおよび形態の多孔性標本(言い換えれば、キューブ、膜、粒子、棒、ディスク)を、実施例1で報告されているように得ることができる。
【００１４】
実施例3：ポリペプチド機能化豆腐熱可塑性物質の製造
方法
豆腐由来熱可塑性物質は、大豆タンパク質のアミノ基とアルデヒドの反応で、特異的な生物活性ペプチドを大豆タンパク質にグラフト化することで機能化された(シッフ塩基形成)。薄膜を、様々な濃度の生物活性ペプチドを含む0.25％(W/V)グルタルアルデヒド溶液のリン酸緩衝液に、室温で1時間浸した。あるいは、0.38％(W/V)ホルムアルデヒドをカップリング試薬として使用した。両方のプロトコルで、10mM CNBrによってC=Nの二重結合を還元する方法を行った。
別に、グラフト化を、ジスルフィド架橋またはアルコールエステル化を通して、あるいは他の従来の生化学的な方法を使って達成することができる。
この発明で、特異的な細胞受容体機能、カルシウム結合特性および成長因子を有する全てのペプチドが、豆腐由来熱可塑性物質の機能性分子として含まれる。
【００１５】
実施例4：豆腐熱可塑性複合材料
方法
豆腐熱可塑性物質を基にした複合生体材料の合成は、例えば、豆腐熱可塑性物質に授与できる生物融和性の合成および天然のポリマーを使った混合、ポリマー網の浸透ならびにグラフト化のような技術に基づいている：
(i)乾燥状態で増大される可塑性(低ガラス転移温度)；
(ii)増大される疎水性；
(iii)増大される親水性(水性環境で増加される膨張特性)；
(iv)物理化学的架橋；
(v)物理生物的(骨統合)特性
【００１６】
(i)および(ii) 豆腐チーズの特に固いペーストを、90℃で、様々な分子量の1％(W/V)溶解ポリカプロラクトンと混合した。
(iii) 実施例2で報告したように製造した豆腐由来多孔性熱可塑性物質を、水またはアルコール添加溶液中での実施例1および2の豆腐熱可塑性物質の膨張を介して、親水性材料、例えばポリエチレングリコール、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、アルギン酸塩、キトサンで浸透させる。浸透に続く更なる乾燥工程を、複合材料の2つの成分間で物理的相互作用させるために行う。乾燥を、添加剤の安定性によって、様々な温度で行う。得られた標本は、実施例3で報告したように、機能化され得る。
(iv) 物理的な架橋は、 (i)項で示した、または実施例3で示したいずれかのように、ペースト中に疎水性ドメインを導入することで得ることができる。あるいは、塩橋は、逆の電荷の分子を導入して生じることができる。初めの場合、新鮮な豆腐チーズと、疎水性相互作用または水素結合を形成しえる合成および天然のポリマーとの混合を、(i)および(iii)項で報告したように行う。疎水性、親水性または電荷基を持つモノアルデヒドのグラフト化も実施例3で報告したように行うことができる。
(v) 熱硬化前に、様々な比率での豆腐ペーストと、ヒドロキシアパタイトおよびリン酸カルシウムとの混合を、豆腐-ベース熱可塑性物質の骨統合特性を増大させるために行うことができる。
【００１７】
実施例5：創傷ドレッシングおよび他の用途での豆腐熱可塑性生体材料
方法
様々な多孔性を有する豆腐ベーススポンジを、実施例1、2および4で報告したように製造した。長方形(1.0cm×0.5cm)の緻密なサンプルを、37℃で、リン酸バッファーでインキュベートし、毛細管現象で表面から余分なバッファーを取り除いた後、様々な時間で、それらの重量を測定した。
完全に膨張した後、標品を、ISO基準に従ったInstronで機械特性について試験した。
【００１８】
結果
1.0mmの厚みの低多孔性薄膜は、比較的速やかな弛緩時間を有し、長時間(約24時間)創傷滲出物を吸収することができる(図4)。
水の吸収は、実施例1、2および4で報告したように、スポンジの物理化学的な特性を変化させることで調節できる。
湿った熱可塑性薄膜の機械特性を表1に要約する。
この材料の良好な弾力特性は、湿った状態で強調される。
【００１９】
【表１】
【００２０】
実施例6：術後の組織癒着防止のための生分解性バリアおよび他の用途としての豆腐熱可塑性生体材料
方法
術後の組織癒着防止のための一時的なバリア、および分解を要するその他の用途として機能する豆腐-ベース生分解性薄膜は、実施例1、2および3で記載の製造方法で得られる。膜自体、または実施例3および4で報告されているような特異的な官能基で修飾された膜は、歯科診療、美容手術、ならびに軟組織および骨組織の成長が調節されなければならない他の種の用途でも適用されえる。長方形(1.0cm×0.5cm)の標品を、37℃で、リン酸バッファーで9日間インキュベートした。標品を、毛細管現象で表面から余分なバッファーを取り除いた後、様々な時間で計量した。
バッファーでインキュベート7日後、標品を脱イオン水で洗浄し、一晩凍結乾燥させ、金でスパッタコートし、×200、5kVで、走査電子顕微鏡により解析した。
【００２１】
結果
実施例1で記載の方法に従って製造された緻密な薄膜は、水性環境で緩やかな自然分解を示す(図5)。自然加水分解で誘導される分解は大変緩やかで、9日後の標品の30重量％の根拠となる。
7日後の薄膜の分解は、様々な程度の多孔性を示す材料の塊(図6b)から容易に取り除かれる高多孔性ゲル様薄膜(図6a)の形成につながる。得られた両方の多孔性の程度は、組織内殖で必要とされる範囲内である(100〜500μm)。
様々な形態の豆腐熱可塑性物質の本質的に緩やかな生分解は、抗生物質および薬剤の緩やかな送達用担体としての使用も示唆している。
【００２２】
実施例7：骨統合生体材料としての豆腐熱可塑性物質
方法
豆腐チーズの製造で凝固剤として使用される比較的多量のカルシウムの存在 (実施例1)、ヒドロゲルの調節された多孔性(実施例2)、生物活性ペプチドでのその機能化(実施例3)は、骨統合用の基材としてのこれら材料の使用を示唆する。
緻密な豆腐薄膜を、37℃で、骨滲出物に似せた塩組成を有するバッファー液で2日間インキュベートした。対照ディスクをPBSで同じ長さの時間インキュベートした。標品を脱オン水で洗浄し、凍結させた。サンプルの水相を低温槽調製チェンバーで昇華させ、そして、乾燥した材料をパラジウムでスパッタコートし、凍結状態で、凍結走査電子顕微鏡で解析した。形態を×3,000、5kVで解析し；元素分析を15kVで行った。
【００２３】
結果
修飾されていない豆腐熱可塑性薄膜の表面での堅実なミネラル相の形成が、擬似体液バッファーでのインキュベート2日後に既に目でみられる(図7b)。同一の実験条件で、効力のある骨統合材料、例えばポリアクティブ(登録商標)(CAM、オランダ)は、検出可能なミネラル化を全く示さなかった(データ示さず)。
【００２４】
元素分析により、Ca/P率が1.05であるリン酸カルシウムとしてミネラル相を特徴付けることができた(図8b)。薄膜の製造方法に関わらず、検出可能なリンおよびカルシウムのピークは、対照ではみられなかった(図8a)。有機大豆ポリマーに典型的な炭素および酸素原子のピークは、材料を擬似体液でインキュベートした場合に低下し、形成されたミネラル相が著しい厚みに達することを明確に示した(図8aおよびb)。
PBS培地に曝露された対照標品(図7a)は、圧-膨張材料(図2d〜f)と類似した乾燥材料(図1b)よりも比較的滑らかな表面形態の変化を示した。
【００２５】
実施例8：豆腐熱可塑性物質の抗炎症特性
方法
前もって生理溶液で湿らせ、37℃で、静止した状態で30分間ヒト血漿で調製した豆腐薄膜を、創傷治療過程で鍵となる役割を有するタンパク質の吸収について、酵素結合免疫アッセイ(ELISA)で解析した。結果を、全く異なる物理化学的な表面特性を有する2つの合成材料、ポリスチレン(PST)およびポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)(PHEMA)から得た結果と比較した。
炎症細胞での豆腐ベース熱可塑性物質およびその分解産物の影響も評価した。Boyumの方法9により、ヒト抹消血液から分離させた単核細胞(105/ml)を、前もって膨張した長方形(1.0cm×0.5cm)の標品を入れた3mlのリン酸バッファーに加えた。分解産物の影響を、薄膜分解を3日間行った100μlのバッファー培地に加えても評価した。
【００２６】
両方の場合、1.0mMのルミノールを、前もって培地に加えた。細胞による遊離ラジカルの生産で誘導される化学蛍光を、連続して1時間検出した。
別の方法で、単核細胞(105)を、前もってヒト血漿で調製した直径1.7cmの材のディスクの存在下で、37℃、95％大気、5％ CO2で20時間インキュベートした。上清を回収し、非結合細胞の汚染を避けるため、1,000gで遠心分離させ、インターロイキン-1β用のELISAキットで試験した。
【００２７】
類似した実験で、血漿調製化材料に付着する細胞を、2.5％(W/V)グルタルアルデヒドのPBS溶液によって表面に固定した。固定後、材料を、濃度を増加させたアルコール(25容量％、50容量％、75容量％)のエタノール/PBS溶液でインキュベートして徐々に脱水させた。最後に、最終2工程を無水アルコールで行った。全ての工程は、4℃で15分続けた。標品を一晩凍結乾燥させ、金でスパッタコートし、5kVで、様々な倍率で、走査電子顕微鏡で解析した。
【００２８】
結果
ELISAは、豆腐-ベース熱可塑性物質表面が、PSTより著しく低いレベルで、補体系のC3フラグメントのレベルに結合することを示した(図9a)。フィブロネクチンは、PSTよりも著しく低いレベルでも吸収する(図9d)が、免疫グロブリン(IgG)のレベルを評価すると、著しい違いがみられた(図9c)。2つの合成材料について、フィブリノゲンの著しい減少がみられた(図9b)。
末梢ヒト血液から単離した単核細胞の活性化も影響した。表面をヒト血漿で前-調製した豆腐薄膜は、PSTおよびPHEMAと比べ、インターロイキン-1βの大変低い生産を誘導した(表2)。
【００２９】
【表２】
【００３０】
化学蛍光法を使った単核細胞による遊離ラジカル生産の評価は、豆腐熱可塑性物質およびその分解産物が、単核細胞の自然活性を著しく抑制していることを示した(図10)。単核白血球と、生理溶液での分解実験から得た豆腐抽出物とインキュベートしたものは、遊離ラジカル生産に対し、いっそう強い抑制効果を示した。
また、最後に、豆腐由来熱可塑性薄膜での単核白血球/マクロファージの付着は、滑らかな表面を有する円形細胞に限定され、それらの静止状態を示した(図11a〜c)。細胞の付着は、材料の表面との接触を形作るごく小さな偽足を使った貧弱なものであった(図11aおよび11b)。ごくまれに、良好な細胞拡散が得られた(図11c)が、マクロファージは、典型的な非活性細胞の滑らかな表面を依然として示した。
【００３１】
実施例9：組織工学用の足場としての豆腐熱可塑性物質
方法
豆腐熱可塑性物質のディスク(乾燥状態で直径1cm)は、90％エタノールで15分間消毒する。標品を10％(v/v)胎児ウシ血清で強化した細胞培養成長培地に、1時間平衡化し、3T3マウス繊維芽細胞(2.5×105)を各々のディスクに蒔いた。細胞付着/増殖を、37℃、95％大気、5％ CO2で、6時間、24時間および48時間のインキュベート時間で止めた。各々のインキュベート時間について、組織培養プレート(TCP)での対照も行った。付着細胞を固定し、先の実施例で記載のように乾燥させ、サンプルを金でスパッタコートして走査電子顕微鏡によって、5keVで、異なる倍率で解析した。
【００３２】
結果
図12aおよびbは、インキュベート6時間後のTCP(a)および大豆ベース熱可塑性物質(b)上の繊維芽細胞の付着および増殖の程度を表す。不十分な程度の細胞拡散が豆腐ベース材料で検出された；繊維芽細胞は、依然として円形状の外観で、ごく小さな薄片状の足(lamellipodia)が表面との接触を形づくった。逆に、TCPでの細胞の拡散は、同じ長さの時間後、すでに達成されていた。
しかし、繊維芽細胞は、24時間および48時間で、豆腐熱可塑性物質に対し、対照(図12cおよびe)に匹敵する程度の拡散(図12dおよびｆ)に達した。細胞は、生体材料の表面を覆う新たな細胞外マトリクスを有する合流層を形成した。24時間後に豆腐ベース生体材料上で細胞により達成される高度の拡散を増強できる単離細胞領域はほとんどなかった。
【００３３】
参考文献
1.Santin,M,Huang,S.J.,Iannace,S.,Ambrosio,L.,Nicolais,L.,Peluso,G.1996 Synthesis a nd characterization of a new interpenetrated poly(2-hydroxylmethacrylate)-gelati n composite polymer.Biomaterials 17:1459-1467.
2.Kim,H.J.,Lee,H.C.,Oh,J.S.,Shin,B.A.,Oh,C.S.,Park,R.D.,Yang,K.S.,Cho,C.S.1999 Pol yelectrolyte complex composed of chitosan and sodium alginate for wound dressing application.J.Biomat.Sci.-Polymer Ed 10:543-556.3.Jalil,R.,Nixon.J.R.1990 Biodegradable poly(lactic acid) and poly(lactide-co-glyc olide) microcapsule:problems associated with preparative techniques and release properties J.Microencapsulation 7,297-325.
4.特許番号US5523293,1996.
5.Vaz,C.M.,Froseen,M.,Cunha,A.M.,Reis,R.L.,Casein and soybean thermoplastic protei n as alternative biodegradable polymers for biomedical applications.Sixth Wo rld Biomaterials Congress,Kamuela,USA,15-20 May,2000,Abstract 429.
6.特許番号US006042851A,1998.
7.特許番号US5674548,1997.
8.Saio,K,Watanabe,T.1973 Food use of soybean 7S and 11S proteins.Extraction and fu nctional properties of their fractions.Jornal of Food Science 38,1139-1 144.
9.Boyum A.1968 Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.Sc and J Clin Lab Invest;21:77-89.
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、乾燥状態での緻密な豆腐熱可塑性物質の走査電子顕微鏡、(a)破断面(倍率×12,000)；(b)曝露面(倍率×3,000)を表す。
【図２】 図2は、PBSで膨張され、様々な圧力値でオートクレーブされた豆腐熱可塑性物質の走査電子顕微鏡を表す。(a)1 Psi、破断面；(b)9 Psi、破断面；(c)14 Psi、破断面；(d)1 Psi、曝露面；(e)9 Psi、曝露面；(l)14 Psi、曝露面。倍率×12,000。
【図３】 図3は、PBS膨張し、凍結乾燥された豆腐熱可塑性物質の走査電子顕微鏡を表す。倍率×12,000。
【図４】 図4は、生理溶液でインキュベートした後の豆腐熱可塑性薄膜の水分吸収を示している。実験は、3回行った。
【図５】 図5は、生理バッファーでの豆腐熱可塑性薄膜の分解の概略を示している。実験は、3回行った。
【図６】 図6は、生理バッファー中で7日後の豆腐熱可塑性物質の分解の走査電子顕微鏡を表す。(a) 分解性ポリマー皮膚；(b)基礎材料塊。倍率×200。
【図７】 図7は、豆腐熱可塑性薄膜表面の凍結走査電子顕微鏡を表す。(a)対照薄膜；(b) 37℃、擬似体液で2日間インキュベート。倍率×3,000。
【図８】 図8は、豆腐熱可塑性薄膜の元素分散X線解析を表す。(a)対照；(b) 37℃、擬似体液で2日間インキュベート。
【図９】 図9は、創傷治療過程に関わるタンパク質の吸収レベルを示す。(a)補体系のC3フラグメント；(b)フィブリノゲン；(c)免疫グロブリン；(d)フィブロネクチン。データは、n=6からの平均±標準偏差として表す。星印は、P<0.05で豆腐と著しく異なる材料を指す；二重星印は、P<0.01で豆腐と著しく異なる材料を指す。
【図１０】 図10は、単核細胞による遊離ラジカル生産における豆腐熱可塑性物質および該抽出物の影響を示す。対照は、実験の間に得られた細胞の自然活性である。データは、n=6からの平均±標準偏差として表す。サンプルは、P<0.01で対照細胞と著しく異なった。
【図１１】 図11は、走査電子顕微鏡で解析された豆腐薄膜上の単核細胞/マクロファージの付着を示す。(a) 単離された円形細胞；(b)細胞クラスター；(c)単離された分散細胞。バー=3μm。
【図１２】 図12は、大豆ベース熱可塑性物質上の3T3マウス繊維芽細胞の付着および増殖を表す。(a)対照6時間；(b)豆腐6時間；(c)対照24時間；(d)豆腐6時間；(e)対照48時間；(f)豆腐48時間。実験は、3回行った。
【図１３】 図13は、インキュベート24時間後の豆腐ベース熱可塑性物質上で分散する3T3マウス繊維芽細胞を表す。
背景
合成および天然の両方を源とする新規な生物生分解性材料の生産は、移植片が体内で一時的に機能しなければならない生物医学的な用途で、重要な目的である。組織内殖および薬剤送達は、通常、保護された足場作用を必要としない以外は、完全な分解性生体材料の使用と関連する1。しかし、理想的な生分解性材料は、2つの主要な欠点：（a）分解時間の調節が困難；（b）分解産物の起こりうる毒性作用のために未だ達成されていない。
【０００２】
材料の分解は、通常、3つの主な事象：（1）ポリマー構造を維持する化学結合の自然加水分解；（2）周辺組織の内殖で発揮される機械的な作用；（3）外来材料によって誘発される炎症反応に基づいている。
分解の調節は、個体の変異性に影響されるため、時として生ずることが大変困難である。例えば、若い対象組織の成長は、古い組織の再生よりもむしろ速やかで、特定の疾患の患者は、異常な炎症反応を生じることができる。
毒性の課題は、時として、天然ポリマーの使用で部分的に回避される合成材料の分解産物と関連している2。しかし、その他の欠点、例えば精製費用、および伝染病またはアレルギーなどの欠点を有するこれらの材料は、これらの使用と関連している。
【０００３】
理想的な生分解性ポリマーは、自然加水分解を通して、天然の融和性分子に分解されるポリマーであるべきである。加えて、表面が曝露された材料は、組織内殖を促進する組織細胞の付着を維持するべきである。軽減された免疫反応は、材料移植とその分解方法との両方に関連すべきである。
【０００４】
ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)およびポリ(ラクチド-コ-グリコライド)は、乳酸およびグリコール酸から合成されえる脂肪族ポリエステルのある特定の種類である3。この種類の生体材料を使用する利点は、例え合成であっても、それらは、人体の代謝で通常生産される分子に分解し、それ故無害であることである。さらに、これらの材料は、容易に、薄膜および糸に加工され、ならびに、微細な、および大きな粒子に加工される。ポリ(ラクチド-コ-グリコライド)コポリマーの物理化学的な分解は、二つのモノマーの比率および最終ポリマーの分子量を通しても調節される。
この種類のポリマーは、生体適合性の点から最良の生分解性材料とみなされているが、それらは、高価であり、分子量に応じて、多少公言されている炎症反応を誘発する。さらに、これらの材料は、それらが適切により機能化されなければ細胞成長を維持せず、幾つかの研究は、ポリ(乳酸)を比較的高い濃度で細胞培養物に添加した場合、一定の細胞毒性を示唆している3。
【０００５】
にもかかわらず、ポリ(乳酸)およびポリ(グリコール酸)ベースの生産物は、幾つかの生物医学的な用途の市場で、最良な生分解性生体材料とみなされている。例えば、生分解性縫合材料および生分解性バリアは、歯科診療で、これらのポリマーから得られる。
大豆タンパク質は、近年、技術用途として、薄膜に加工できる天然の生分解性ポリマーの中に含まれている。特許は、大豆タンパク質由来の熱可塑性物質の生産4を請求しており、ごく最近は、生体材料としてのそれらの使用が示唆されている5。
【０００６】
油成分を除くと、大豆粉は、タンパク質および炭水化物で主に構成される天然の複合物である。すりつぶした粉からの豆乳の生産と、カルシウム溶液で様々な歯ごたえのチーズに加工することは、健康栄養製品を提供する食品産業で、大いに調査されている。我々の知見で、大豆チーズ(豆腐)からの熱可塑性物質の生産、および生物医学分野でのそれらの使用について発表している報告はない。食品産業のノウハウによれば、豆腐ベース熱可塑性物質の生産および消毒の方法は、新規な生体材料の製造に容易に適用できる6、7。
【０００７】
発明
この発明は、大豆タイプ材料の薄膜が、主として、それらの加水分解に基づいた生理環境で、炎症反応の抑制を誘導し、その結果分解するという発見を基にしている。脱脂された特に固い豆腐から製造される熱可塑性物質は、骨滲出物のものと類似した塩組成を有する生理バッファーでインキュベートすると、骨ハイドロキシアパタイトと類似した化学組成を有するミネラル相の速やかな形成(2日間)も誘導することができる。このミネラル化の方法は、インキュベートからわずか3日後に始まる薄膜生分解より先に起こり、曝露面を通して一様に分散される多孔性の形成を進行させる。本発明者らは、これらの作用をインビトロでのみ立証したが、様々な実験方法から得たデータの一致から、インビボで類似した性質が予見できる。材料の化学および形態の両方を修正できる可能性も、多くの生物医学的な用途に適したこれら熱可塑性物質を作製する一連の方法を提供する本発明で請求される。これら修正は、多孔性および表面化学を変化させる材料の分解時間を調節することと、材料の生体適合性および機械特性を改善させることが目的である。熱可塑性物質およびそれらの分解産物による炎症細胞活性の抑制は、インビボでの材料の分解は、移植片の曝露面で導かれる、その自然加水分解および組織内殖によってのみ影響されるとの予測と一致している。大豆ベース熱可塑性物質は、細胞の付着および増殖も助長する。それ故、豆腐ベース熱可塑性物質を、新たな組織の形成および移植関連炎症の抑制を促進するモノリス、およびコーティング材料として使用することができる。
【０００８】
これら材料の主な用途範囲は、創傷治療、骨および歯の骨統合、術後の組織癒着ならびに薬剤送達である。
そこで、本発明は、次の実施例および添付図に対する言及でさらに立証されるであろう。
図1は、乾燥状態での緻密な豆腐熱可塑性物質の走査電子顕微鏡、(a)破断面(倍率×12,000)；(b)曝露面(倍率×3,000)を表す。
図2は、PBSで膨張され、様々な圧力値でオートクレーブされた豆腐熱可塑性物質の走査電子顕微鏡を表す。(a)1 Psi(0.1 Bar)、破断面；(b)9 Psi(0.6 Bar)、破断面；(c)14 Psi(1 Bar)、破断面；(d)1 Psi(0.1 Bar)、曝露面；(e)9 Psi(0.6 Bar)、曝露面；(l)14 Psi(1 Bar)、曝露面。倍率×12,000。
図3は、PBS膨張し、凍結乾燥された豆腐熱可塑性物質の走査電子顕微鏡を表す。倍率×12,000。
図4は、生理溶液でインキュベートした後の豆腐熱可塑性薄膜の水分吸収を示している。実験は、3回行った。
図5は、生理バッファーでの豆腐熱可塑性薄膜の分解の概略を示している。実験は、3回行った。
図6は、生理バッファー中で7日後の豆腐熱可塑性物質の分解の走査電子顕微鏡を表す。(a) 分解性ポリマー皮膚；(b)基礎材料塊。倍率×200。
図7は、豆腐熱可塑性薄膜表面の凍結走査電子顕微鏡を表す。(a)対照薄膜；(b) 37℃、擬似体液で2日間インキュベート。倍率×3,000。
【０００９】
図8は、豆腐熱可塑性薄膜の元素分散X線解析を表す。(a)対照；(b) 37℃、擬似体液で2日間インキュベート。
図9は、創傷治療過程に関わるタンパク質の吸収レベルを示す。(a)補体系のC3フラグメント；(b)フィブリノゲン；(c)免疫グロブリン；(d)フィブロネクチン。データは、n=6からの平均±標準偏差として表す。星印は、P<0.05で豆腐と著しく異なる材料を指す；二重星印は、P<0.01で豆腐と著しく異なる材料を指す。
図10は、単核細胞による遊離ラジカル生産における豆腐熱可塑性物質および該抽出物の影響を示す。対照は、実験の間に得られた細胞の自然活性である。データは、n=6からの平均±標準偏差として表す。サンプルは、P<0.01で対照細胞と著しく異なった。
図11は、走査電子顕微鏡で解析された豆腐薄膜上の単核細胞/マクロファージの付着を示す。(a) 単離された円形細胞；(b)細胞クラスター；(c)単離された分散細胞。バー=3μm。
図12は、大豆ベース熱可塑性物質上の3T3マウス繊維芽細胞の付着および増殖を表す。(a)対照6時間；(b)豆腐6時間；(c)対照24時間；(d)豆腐6時間；(e)対照48時間；(f)豆腐48時間。実験は、3回行った。
図13は、インキュベート24時間後の豆腐ベース熱可塑性物質上で分散する3T3マウス繊維芽細胞を表す。
【００１０】
実施例1：高温での緻密な標本の製造
方法
CaCl2溶液(10〜40mM)を使って従来の凝固法8で製造するか、または市販の豆腐から得た脱脂大豆の特に固いチーズのスライスを、尖った刃で均一な厚み(1.0cm)に切る。
得られた薄膜を、完全に熱硬化するまで、90℃でオーブンでインキュベートする。
代替法では、マイクロ波焼成によって熱硬化させた。
方法は、適切な鋳型での大豆チーズの製造によって様々な形態を有する標本の製造にも適用できる。その結果、キューブ、ディスク、膜または押し出し繊維を得ることができる。微粒子を、新鮮な豆腐またはその熱可塑性物質のいずれかを配合機で砕くことでも製造できる。最初の場合、砕いた材料を、実施例1および2で報告したように熱硬化にかけた。
この方法によって製造した標本を金でスパッタコートし、5kVで、×3,000および×12,000で、走査電子顕微鏡により解析した。
【００１１】
結果
1.0±0.2mmの厚みの硬い薄膜を得た。薄膜破断面の形態は、高倍率でのみ目視できる粗さを有する大変緻密なものであった(図1a)。曝露面は、尖端および溝が、×3000倍率で既に目視できる粗さを表した(図1b)。
【００１２】
実施例2：様々な圧での膨張した豆腐ゲルの製造
方法
豆腐スライスを、室温で、リン酸バッファー生理食塩水pH7.2(PBS)に24時間浸し、様々な温度(100、115；121℃)でオートクレーブした。各温度値は、各々の圧に対応した(100℃=1 Psi(0.1 Bar)；115℃=9 Psi(0.6 Bar)；121℃=14 Psi(1 Bar))。ゲルスライスを、固定温度で5分間保ち、そしてオートクレーブ圧を徐々に減少させた。最後に、薄膜を一晩凍結乾燥させた。
同様な方法を、新鮮な豆腐チーズ標本に適用した。
代替法では、湿った薄膜を一晩凍結乾燥させた。
標本の全てを金でスッパタ-コートし、走査電子顕微鏡で12,000、5kVで解析した。
【００１３】
結果
適用したオートクレーブ法で、様々な多孔性のゲルを得た。孔密度は、オートクレーブ温度、ならびに破断および曝露面の圧の増加で増大したが、曝露面は、破断面ほど多孔性は高くなかった(図2a〜f)。孔の直径(約200nm)に関して、各々のオートクレーブ条件で違いはみられなかった。
PBS膨張し、オートクレーブした材料の曝露面が、乾燥対照(図1b)で観察された粗い形態を喪失しているのは、膨張処理の結果であろう。
薄膜の単純な凍結乾燥は、孔が見られない様々な形態を製造したが、曝露面の粗さが、突き出したビーズの形成によって増大された(図3)。
様々なサイズおよび形態の多孔性標本(言い換えれば、キューブ、膜、粒子、棒、ディスク)を、実施例1で報告されているように得ることができる。
【００１４】
実施例3：ポリペプチド機能化豆腐熱可塑性物質の製造
方法
豆腐由来熱可塑性物質は、大豆タンパク質のアミノ基とアルデヒドの反応で、特異的な生物活性ペプチドを大豆タンパク質にグラフト化することで機能化された(シッフ塩基形成)。薄膜を、様々な濃度の生物活性ペプチドを含む0.25％(W/V)グルタルアルデヒド溶液のリン酸緩衝液に、室温で1時間浸した。あるいは、0.38％(W/V)ホルムアルデヒドをカップリング試薬として使用した。両方のプロトコルで、10mM CNBrによってC=Nの二重結合を還元する方法を行った。
別に、グラフト化を、ジスルフィド架橋またはアルコールエステル化を通して、あるいは他の従来の生化学的な方法を使って達成することができる。
この発明で、特異的な細胞受容体機能、カルシウム結合特性および成長因子を有する全てのペプチドが、豆腐由来熱可塑性物質の機能性分子として含まれる。
【００１５】
実施例4：豆腐熱可塑性複合材料
方法
豆腐熱可塑性物質を基にした複合生体材料の合成は、例えば、豆腐熱可塑性物質に授与できる生物融和性の合成および天然のポリマーを使った混合、ポリマー網の浸透ならびにグラフト化のような技術に基づいている：
(i)乾燥状態で増大される可塑性(低ガラス転移温度)；
(ii)増大される疎水性；
(iii)増大される親水性(水性環境で増加される膨張特性)；
(iv)物理化学的架橋；
(v)物理生物的(骨統合)特性
【００１６】
(i)および(ii) 豆腐チーズの特に固いペーストを、90℃で、様々な分子量の1％(W/V)溶解ポリカプロラクトンと混合した。
(iii) 実施例2で報告したように製造した豆腐由来多孔性熱可塑性物質を、水またはアルコール添加溶液中での実施例1および2の豆腐熱可塑性物質の膨張を介して、親水性材料、例えばポリエチレングリコール、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、アルギン酸塩、キトサンで浸透させる。浸透に続く更なる乾燥工程を、複合材料の2つの成分間で物理的相互作用させるために行う。乾燥を、添加剤の安定性によって、様々な温度で行う。得られた標本は、実施例3で報告したように、機能化され得る。
(iv) 物理的な架橋は、 (i)項で示した、または実施例3で示したいずれかのように、ペースト中に疎水性ドメインを導入することで得ることができる。あるいは、塩橋は、逆の電荷の分子を導入して生じることができる。初めの場合、新鮮な豆腐チーズと、疎水性相互作用または水素結合を形成しえる合成および天然のポリマーとの混合を、(i)および(iii)項で報告したように行う。疎水性、親水性または電荷基を持つモノアルデヒドのグラフト化も実施例3で報告したように行うことができる。
(v) 熱硬化前に、様々な比率での豆腐ペーストと、ヒドロキシアパタイトおよびリン酸カルシウムとの混合を、豆腐-ベース熱可塑性物質の骨統合特性を増大させるために行うことができる。
【００１７】
実施例5：創傷ドレッシングおよび他の用途での豆腐熱可塑性生体材料
方法
様々な多孔性を有する豆腐ベーススポンジを、実施例1、2および4で報告したように製造した。長方形(1.0cm×0.5cm)の緻密なサンプルを、37℃で、リン酸バッファーでインキュベートし、毛細管現象で表面から余分なバッファーを取り除いた後、様々な時間で、それらの重量を測定した。
完全に膨張した後、標品を、ISO基準に従ったInstronで機械特性について試験した。
【００１８】
結果
1.0mmの厚みの低多孔性薄膜は、比較的速やかな弛緩時間を有し、長時間(約24時間)創傷滲出物を吸収することができる(図4)。
水の吸収は、実施例1、2および4で報告したように、スポンジの物理化学的な特性を変化させることで調節できる。
湿った熱可塑性薄膜の機械特性を表1に要約する。
この材料の良好な弾力特性は、湿った状態で強調される。
【００１９】
【表１】
実施例6：術後の組織癒着防止のための生分解性バリアおよび他の用途としての豆腐熱可塑性生体材料
方法
術後の組織癒着防止のための一時的なバリア、および分解を要するその他の用途として機能する豆腐-ベース生分解性薄膜は、実施例1、2および3で記載の製造方法で得られる。膜自体、または実施例3および4で報告されているような特異的な官能基で修飾された膜は、歯科診療、美容手術、ならびに軟組織および骨組織の成長が調節されなければならない他の種の用途でも適用されえる。長方形(1.0cm×0.5cm)の標品を、37℃で、リン酸バッファーで9日間インキュベートした。標品を、毛細管現象で表面から余分なバッファーを取り除いた後、様々な時間で計量した。
バッファーでインキュベート7日後、標品を脱イオン水で洗浄し、一晩凍結乾燥させ、金でスパッタコートし、×200、5kVで、走査電子顕微鏡により解析した。
【００２１】
結果
実施例1で記載の方法に従って製造された緻密な薄膜は、水性環境で緩やかな自然分解を示す(図5)。自然加水分解で誘導される分解は大変緩やかで、9日後の標品の30重量％の根拠となる。
7日後の薄膜の分解は、様々な程度の多孔性を示す材料の塊(図6b)から容易に取り除かれる高多孔性ゲル様薄膜(図6a)の形成につながる。得られた両方の多孔性の程度は、組織内殖で必要とされる範囲内である(100〜500μm)。
様々な形態の豆腐熱可塑性物質の本質的に緩やかな生分解は、抗生物質および薬剤の緩やかな送達用担体としての使用も示唆している。
【００２２】
実施例7：骨統合生体材料としての豆腐熱可塑性物質
方法
豆腐チーズの製造で凝固剤として使用される比較的多量のカルシウムの存在 (実施例1)、ヒドロゲルの調節された多孔性(実施例2)、生物活性ペプチドでのその機能化(実施例3)は、骨統合用の基材としてのこれら材料の使用を示唆する。
緻密な豆腐薄膜を、37℃で、骨滲出物に似せた塩組成を有するバッファー液で2日間インキュベートした。対照ディスクをPBSで同じ長さの時間インキュベートした。標品を脱オン水で洗浄し、凍結させた。サンプルの水相を低温槽調製チェンバーで昇華させ、そして、乾燥した材料をパラジウムでスパッタコートし、凍結状態で、凍結走査電子顕微鏡で解析した。形態を×3,000、5kVで解析し；元素分析を15kVで行った。
【００２３】
結果
修飾されていない豆腐熱可塑性薄膜の表面での堅実なミネラル相の形成が、擬似体液バッファーでのインキュベート2日後に既に目でみられる(図7b)。同一の実験条件で、効力のある骨統合材料、例えばポリアクティブ(登録商標)(CAM、オランダ)は、検出可能なミネラル化を全く示さなかった(データ示さず)。
【００２４】
元素分析により、Ca/P率が1.05であるリン酸カルシウムとしてミネラル相を特徴付けることができた(図8b)。薄膜の製造方法に関わらず、検出可能なリンおよびカルシウムのピークは、対照ではみられなかった(図8a)。有機大豆ポリマーに典型的な炭素および酸素原子のピークは、材料を擬似体液でインキュベートした場合に低下し、形成されたミネラル相が著しい厚みに達することを明確に示した(図8aおよびb)。
PBS培地に曝露された対照標品(図7a)は、圧-膨張材料(図2d〜f)と類似した乾燥材料(図1b)よりも比較的滑らかな表面形態の変化を示した。
【００２５】
実施例8：豆腐熱可塑性物質の抗炎症特性
方法
前もって生理溶液で湿らせ、37℃で、静止した状態で30分間ヒト血漿で調製した豆腐薄膜を、創傷治療過程で鍵となる役割を有するタンパク質の吸収について、酵素結合免疫アッセイ(ELISA)で解析した。結果を、全く異なる物理化学的な表面特性を有する2つの合成材料、ポリスチレン(PST)およびポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)(PHEMA)から得た結果と比較した。
炎症細胞での豆腐ベース熱可塑性物質およびその分解産物の影響も評価した。Boyumの方法9により、ヒト抹消血液から分離させた単核細胞(105/ml)を、前もって膨張した長方形(1.0cm×0.5cm)の標品を入れた3mlのリン酸バッファーに加えた。分解産物の影響を、薄膜分解を3日間行った100μlのバッファー培地に加えても評価した。
【００２６】
両方の場合、1.0mMのルミノールを、前もって培地に加えた。細胞による遊離ラジカルの生産で誘導される化学蛍光を、連続して1時間検出した。
別の方法で、単核細胞(105)を、前もってヒト血漿で調製した直径1.7cmの材のディスクの存在下で、37℃、95％大気、5％ CO2で20時間インキュベートした。上清を回収し、非結合細胞の汚染を避けるため、1,000gで遠心分離させ、インターロイキン-1β用のELISAキットで試験した。
【００２７】
類似した実験で、血漿調製化材料に付着する細胞を、2.5％(W/V)グルタルアルデヒドのPBS溶液によって表面に固定した。固定後、材料を、濃度を増加させたアルコール(25容量％、50容量％、75容量％)のエタノール/PBS溶液でインキュベートして徐々に脱水させた。最後に、最終2工程を無水アルコールで行った。全ての工程は、4℃で15分続けた。標品を一晩凍結乾燥させ、金でスパッタコートし、5kVで、様々な倍率で、走査電子顕微鏡で解析した。
【００２８】
結果
ELISAは、豆腐-ベース熱可塑性物質表面が、PSTより著しく低いレベルで、補体系のC3フラグメントのレベルに結合することを示した(図9a)。フィブロネクチンは、PSTよりも著しく低いレベルでも吸収する(図9d)が、免疫グロブリン(IgG)のレベルを評価すると、著しい違いがみられた(図9c)。2つの合成材料について、フィブリノゲンの著しい減少がみられた(図9b)。
末梢ヒト血液から単離した単核細胞の活性化も影響した。表面をヒト血漿で前-調製した豆腐薄膜は、PSTおよびPHEMAと比べ、インターロイキン-1βの大変低い生産を誘導した(表2)。
【００２９】
【表２】
化学蛍光法を使った単核細胞による遊離ラジカル生産の評価は、豆腐熱可塑性物質およびその分解産物が、単核細胞の自然活性を著しく抑制していることを示した(図10)。単核白血球と、生理溶液での分解実験から得た豆腐抽出物とインキュベートしたものは、遊離ラジカル生産に対し、いっそう強い抑制効果を示した。
また、最後に、豆腐由来熱可塑性薄膜での単核白血球/マクロファージの付着は、滑らかな表面を有する円形細胞に限定され、それらの静止状態を示した(図11a〜c)。細胞の付着は、材料の表面との接触を形作るごく小さな偽足を使った貧弱なものであった(図11aおよび11b)。ごくまれに、良好な細胞拡散が得られた(図11c)が、マクロファージは、典型的な非活性細胞の滑らかな表面を依然として示した。
【００３１】
実施例9：組織工学用の足場としての豆腐熱可塑性物質
方法
豆腐熱可塑性物質のディスク(乾燥状態で直径1cm)は、90％エタノールで15分間消毒する。標品を10％(v/v)胎児ウシ血清で強化した細胞培養成長培地に、1時間平衡化し、3T3マウス繊維芽細胞(2.5×105)を各々のディスクに蒔いた。細胞付着/増殖を、37℃、95％大気、5％ CO2で、6時間、24時間および48時間のインキュベート時間で止めた。各々のインキュベート時間について、組織培養プレート(TCP)での対照も行った。付着細胞を固定し、先の実施例で記載のように乾燥させ、サンプルを金でスパッタコートして走査電子顕微鏡によって、5keVで、異なる倍率で解析した。
【００３２】
結果
図12aおよびbは、インキュベート6時間後のTCP(a)および大豆ベース熱可塑性物質(b)上の繊維芽細胞の付着および増殖の程度を表す。不十分な程度の細胞拡散が豆腐ベース材料で検出された；繊維芽細胞は、依然として円形状の外観で、ごく小さな薄片状の足(lamellipodia)が表面との接触を形づくった。逆に、TCPでの細胞の拡散は、同じ長さの時間後、すでに達成されていた。
しかし、繊維芽細胞は、24時間および48時間で、豆腐熱可塑性物質に対し、対照(図12cおよびe)に匹敵する程度の拡散(図12dおよびｆ)に達した。細胞は、生体材料の表面を覆う新たな細胞外マトリクスを有する合流層を形成した。24時間後に豆腐ベース生体材料上で細胞により達成される高度の拡散を増強できる単離細胞領域はほとんどなかった。
【００３３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、乾燥状態での緻密な豆腐熱可塑性物質の走査電子顕微鏡、(a)破断面(倍率×12,000)；(b)曝露面(倍率×3,000)を表す。
【図２】 図2は、PBSで膨張され、様々な圧力値でオートクレーブされた豆腐熱可塑性物質の走査電子顕微鏡を表す。(a)1 Psi、破断面；(b)9 Psi、破断面；(c)14 Psi、破断面；(d)1 Psi、曝露面；(e)9 Psi、曝露面；(l)14 Psi、曝露面。倍率×12,000。
【図３】 図3は、PBS膨張し、凍結乾燥された豆腐熱可塑性物質の走査電子顕微鏡を表す。倍率×12,000。
【図４】 図4は、生理溶液でインキュベートした後の豆腐熱可塑性薄膜の水分吸収を示している。実験は、3回行った。
【図５】 図5は、生理バッファーでの豆腐熱可塑性薄膜の分解の概略を示している。実験は、3回行った。
【図６】 図6は、生理バッファー中で7日後の豆腐熱可塑性物質の分解の走査電子顕微鏡を表す。(a) 分解性ポリマー皮膚；(b)基礎材料塊。倍率×200。
【図７】 図7は、豆腐熱可塑性薄膜表面の凍結走査電子顕微鏡を表す。(a)対照薄膜；(b) 37℃、擬似体液で2日間インキュベート。倍率×3,000。
【図８】 図8は、豆腐熱可塑性薄膜の元素分散X線解析を表す。(a)対照；(b) 37℃、擬似体液で2日間インキュベート。
【図９】 図9は、創傷治療過程に関わるタンパク質の吸収レベルを示す。(a)補体系のC3フラグメント；(b)フィブリノゲン；(c)免疫グロブリン；(d)フィブロネクチン。データは、n=6からの平均±標準偏差として表す。星印は、P<0.05で豆腐と著しく異なる材料を指す；二重星印は、P<0.01で豆腐と著しく異なる材料を指す。
【図１０】 図10は、単核細胞による遊離ラジカル生産における豆腐熱可塑性物質および該抽出物の影響を示す。対照は、実験の間に得られた細胞の自然活性である。データは、n=6からの平均±標準偏差として表す。サンプルは、P<0.01で対照細胞と著しく異なった。
【図１１】 図11は、走査電子顕微鏡で解析された豆腐薄膜上の単核細胞/マクロファージの付着を示す。(a) 単離された円形細胞；(b)細胞クラスター；(c)単離された分散細胞。バー=3μm。
【図１２】 図12は、大豆ベース熱可塑性物質上の3T3マウス繊維芽細胞の付着および増殖を表す。(a)対照6時間；(b)豆腐6時間；(c)対照24時間；(d)豆腐6時間；(e)対照48時間；(f)豆腐48時間。実験は、3回行った。
【図１３】 図13は、インキュベート24時間後の豆腐ベース熱可塑性物質上で分散する3T3マウス繊維芽細胞を表す。
Claims (6)
- 大豆脱脂豆腐から製造した緻密または多孔性の熱硬化性物質の生体材料としての使用。
- 大豆脱脂豆腐から製造した緻密または多孔性の熱硬化性物質を含む生体材料。
- 請求項２に記載の生体材料を含む創傷ドレッシング。
- 請求項２に記載の生体材料を含む、術後の組織癒着を避けるための一時的なバリア。
- 請求項２に記載の生体材料を含む、骨統合能を有する充填剤またはコーティング材料。
- 請求項２に記載の生体材料またはその分解産物を含む抗炎症剤。
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