JPH0759841A

JPH0759841A - 細胞侵入性医用材料

Info

Publication number: JPH0759841A
Application number: JP5210275A
Authority: JP
Inventors: Mikio Koide; 幹夫小出; Takeshi Uematsu; 健植松; Ko Oyamada; 香小山田
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1993-08-25
Filing date: 1993-08-25
Publication date: 1995-03-07

Abstract

(57)【要約】【構成】再構成された繊維化アテロコラーゲン溶液にア
スコルビン酸及び銅を添加した後、前記再構成された繊
維化アテロコラーゲン溶液を濃縮して得るコラーゲンマ
トリックスからなる細胞侵入性医用材料。【効果】細胞・組織に対する親和性が良好で、また安定
性が高い。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、人工皮膚、人工血管、
人工骨等に適用できる細胞侵入性医用材料に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体組織に何らかの異常が生じた場合、
自己の他部位の組織あるいは、親族などの免疫原性の少
ない個体からの同種移植が好ましいが、その様な供給が
困難な場合には人工物をもってそれに代替するという発
想は古くから存在した。しかし、当然免疫拒絶反応の対
象となるケースが多く、そのため組織や免疫系細胞から
不感作であるような、いわゆる組織反応が低い物質を求
める努力が続けられている。ポリウレタンを代表とする
合成高分子をより疎水化させる方向の研究などはその一
例である。また、これとは全く正反対に、免疫反応を引
き起こす前に速やかに物質が組織と同化してしまうこと
により器官としての機能を付与するという考え方があ
る。人工物としては、生体由来材料であるコラーゲン等
を選択し、線維芽細胞を早期に侵入させて、結合組織様
の組織を構築させて目的の組織を覆わせて免疫反応を免
れる考え方で、後者の方がより理想に近い形である。

【０００３】コラーゲンを用いた人工材料は生体由来材
料であるため、確かに細胞組織に対する親和性は大きい
と考えられるものの、生体内でコラゲナーゼにより容易
に分解・吸収されるものである。そこで利用するにあた
っては、適当な方法で架橋を導入し、物性面の強化を図
る工夫が成されたものが用いられる。架橋の方法として
は、加熱による脱水架橋、薬品を用いる化学架橋等を採
用したものが開発されている。このうち熱脱水架橋は薬
品処理に比べ安全性が高いが、物性的にコラゲナーゼ、
酵素に対する耐性が化学的架橋に対し低いため、通常化
学架橋を熱架橋と併用させたり、または化学的架橋単独
で用いる方法が選択されており、こうした架橋を導入し
た人工材料を用いる場合、上記以外に物性面で性質が著
しく向上する等の優れた効果を奏するものである。

【０００４】例えば１１０℃の温度で真空下に２４時間
置いて熱的な架橋を導入した場合、該人工材料の検体で
はコラゲナーゼ３ｕｎｉｔ／ｍｌ中に３７℃下で静置す
ると１日以内に該人工材料中のコラーゲンが溶解するの
に対し、イソシアネート系の薬品を用いた化学的架橋の
みを施した該人工材料の検体ではコラゲナーゼ１００ｕ
ｎｉｔ／ｍｌ中に３７℃下で７日経過しても形態に変化
が見られない。しかしながら、前記人工材料を人工皮膚
として使用する場合、強固な架橋を導入すると、導入前
にコラーゲンが有していた細胞、組織に対する親和性が
大幅に低下し、細胞侵入が阻止される傾向が出現する。
また、生体的反応を利用する架橋が試みられており、コ
ラーゲン溶液を風乾して得られたフィルムをリボースで
架橋する方法が検討されている（夏目徹他、人工臓
器１８（１），７２〜７５（１９８９））。

【０００５】その他の先行技術としては、蛋白質および
／またはペプチドを含有する溶液にトランスグルタミナ
ーゼを添加して得られた膜は、引張強度、伸度、柔軟
性、酸素透過性、水蒸気透過性、生体適合性に優れてい
ることが、開示されている（特開昭６２−７４３６０
号）。一方、細胞侵入性の良好なコラーゲン−変性コラ
ーゲンマトリックスを形成してなる前記コラーゲンを用
いた人工材料も開発されており（特開平１−２３０３６
６号）、早期に好中球やマクロファージが湿潤し、さら
に線維芽細胞が侵入することができる。しかしながら、
当該人工材料では開放創と同様に創収縮を生じる欠点を
有している。つまり、これらの人工材料において、物性
面の強化と細胞、組織に対する親和性という生物学的性
能の向上とは両立が困難な相反する事象であり、双方を
満足する細胞侵入性材料が強く望まれていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、コラーゲンに架橋を施して物理的強度を保持しなが
ら、早期に好中球やマクロファージが浸潤し、更に線維
芽細胞が侵入しやすいコラーゲンマトリックスを提供す
ることである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は生体内に埋入ま
たは創傷面に被覆した際に生体内の分解酵素に対して抵
抗性を有し、一定期間必要な機械的強度を保持し、かつ
細胞，組織に対する親和性が良好で増殖した細胞が容易
にその内部に入り込みやすい医用材料を提供することに
ある。

【０００８】上記目的は以下の構成による本発明のより
達成される。（１）再構成された線維化アテロコラーゲン溶液にアス
コルビン酸及び銅を添加させた後、前記再構成された線
維化アテロコラーゲン溶液を濃縮することにより得られ
るコラーゲンマトリックスからなる細胞侵入性医用材
料。（２）前記線維化アテロコラーゲンは、牛真皮由来のコ
ラーゲンを原料とし、プロクターゼ又はペプシンにより
分子末端の抗原基のテロペプチドを除去したアテロコラ
ーゲンに中性緩衝液を加えることにより、再構成された
線維化アテロコラーゲンである上記（１）記載の細胞侵
入性医用材料。

【０００９】（３）再構成された線維化アテロコラーゲ
ンに添加されるアスコルビン酸及び銅イオンの割合が、
前記再構成した線維化アテロコラーゲン１００重量部に
対してアスコルビン酸０.１〜１０重量部、銅イオン０.
０１〜１.０重量部である上記（１）記載の細胞侵入性
医用材料。（４）アテロコラーゲンの酸性溶液にｐＨ７〜８の中性
緩衝液を加えて、３７℃で１〜８時間加温して得られる
線維状のコラーゲン溶液にアスコルビン酸と銅を添加
し、５分間以上処理して得られる（１）記載の細胞侵入
性医用材料。

【００１０】また、本発明は下記の構成により達成され
る。（５）水蒸気透過調節層と細胞侵入性層からなる人工皮
膚であって、前記細胞侵入性層は、線維化アテロコラー
ゲン溶液にアスコルビン酸及び銅を添加させた後、前記
線維化アテロコラーゲン容液を濃縮し、更に変性アテロ
コラーゲンを添加させることにより得られるコラーゲン
マトリックスからなる細胞侵入性基材からなることを特
徴とする人工皮膚。（６）水蒸気透過調節層と細胞侵入性層からなる人工皮
膚であって、前記細胞侵入性層は、線維化アテロコラー
ゲン・ヘパリン複合体溶液にアスコルビン酸及び銅を添
加させた後、前記線維化アテロコラーゲン・ヘパリン複
合体溶液を濃縮し、更に変性アテロコラーゲンを添加さ
せることにより得られるコラーゲンマトリックスからな
る細胞侵入性基材からなることを特徴とする人工皮膚。

【００１１】（７）水蒸気透過調節層と細胞侵入性層か
らなる人工皮膚であって、前記細胞侵入性層は、線維化
アテロコラーゲン・ヘパリン複合体溶液にアスコルビン
酸及び銅を添加させた後、前記線維化アテロコラーゲン
・ヘパリン複合体溶液を濃縮し、更に変性アテロコラー
ゲンを含有させることにより得られるコラーゲンマトリ
ックスからなる細胞侵入性基材からなり、前記細胞侵入
性層と水蒸気透過調節層に連続した２.０ｍｍ以上の貫
通孔があることを特徴とする上記（６）記載の人工皮
膚。（８）前記水蒸気透過調節層はシリコーンエラストマー
である上記（５）〜（７）記載の人工皮膚。（９）前記変性コラーゲンは、牛真皮由来のコラーゲン
を原料とし、抗原基を除去し、それを４０〜９０℃の温
度範囲で熱変性させることにより得られる熱変性アテロ
コラーゲンである上記（５）〜（７）記載の人工皮膚。

【００１２】本発明の細胞侵入性医用材料は、アテロコ
ラーゲンの酸性溶液に中性緩衝液を添加して得られる再
構成された線維化アテロコラーゲン溶液に、アスコルビ
ン酸及び銅を添加した後、前記溶液を濃縮した懸濁液と
して使用するものであり、更に前記濃縮した懸濁液を凍
結乾燥してスポンジの状態でも使用可能である。濃縮す
る方法としては、特に限定しないが、具体的には遠心分
離、透析等が挙げられる。

【００１３】本発明において、細胞侵入性医用材料を懸
濁液として用いる場合、溶液を３０００rpmで１０分間
程遠心分離を行い２層に分離させ、下層の初期のコラー
ゲン濃度より約１０倍位濃縮されたものを使用する。本
発明において、アスコルビン酸及び銅は特に限定しない
が、アスコルビン酸及び銅を一つの溶液にしたもの、ま
たは各々の溶液を用いることが好ましい。また、本発明
において銅とは特に限定しないが、溶解性を考慮して、
塩化銅、硫酸銅等の銅化合物を用いることが好ましい。

【００１４】本発明において、再構成された線維化アテ
ロコラーゲンは、特に限定しないが牛真皮由来のコラー
ゲンを原料として用いることが好ましく、該コラーゲン
をプロクターゼ又はペプシンにより分子末端の抗原基の
テロペプチドを除去したアテロコラーゲンに中性緩衝液
を加えることにより得られるものが好ましい。本発明に
おいて、再構成された線維化アテロコラーゲンにアスコ
ルビン酸及び銅イオンを添加する割合は、前記再構成し
た線維化アテロコラーゲン１００重量部に対してアスコ
ルビン酸０.１〜１０重量部、銅イオン０.０１〜１.０
重量部であることが好ましい。

【００１５】本発明において、細胞侵入性医用材料の精
製方法は、アテロコラーゲンの酸性溶液にｐＨ７〜８の
中性緩衝液を加えて、３７℃で１〜８時間加温して得ら
れる線維状のコラーゲン溶液にアスコルビン酸と銅を添
加して５分間以上処理して得ることが好ましい。酸性溶
液としては特に限定しないが、塩酸溶液等が挙げられ、
中性緩衝液としては特に限定しないが、りん酸緩衝液等
が挙げられる。

【００１６】本発明の細胞侵入性医用材料の使用形態の
一例としては人工皮膚が挙げられる。前記人工皮膚は、
本発明の細胞侵入性医用材料からなる細胞侵入性層と、
該細胞侵入性層の表皮面に水蒸気透過調節層が設けられ
てなる。前記人工皮膚において細胞侵入性層は、線維化
アテロコラーゲン・ヘパリン複合体溶液にアスコルビン
酸及び銅を添加した後、前記線維化アテロコラーゲン・
ヘパリン複合体を濃縮し、更に変性アテロコラーゲンを
添加させることにより得られるコラーゲンマトリックス
からなる細胞侵入性基材であってもよい。前記変性コラ
ーゲンとしては、牛真皮由来のコラーゲンを原料とし、
抗原基を除去し、それを４０〜９０℃の温度範囲で熱変
性させることにより得られる熱変性アテロコラーゲンが
挙げられる。前記人工皮膚において、水蒸気透過調節層
は、連続した２.０ｍｍ以上の貫通孔を有することが好
ましく、材質としてははシリコーンエラストマー等が挙
げられる。

【００１７】また、本発明において濃縮した懸濁液の状
態の細胞侵入性医用材料は、凍結乾燥してスポンジの状
態で使用すると、何と驚くべきことに、蒸留水あるいは
生理食塩水中に浸してもスポンジは崩れることはなかっ
た。これはアスコルビン酸−銅を添加することにより、
コラーゲンの架橋が起こったものと思われる。更に凍結
後も架橋が進行して、凍結乾燥して得られたコラーゲン
スポンジにも架橋が導入されていると思われる。同様な
反応は特開昭５３−３２９９６に開示されており、コラ
ーゲン溶液にグルタルアルデヒド等のなめし用剤を添加
し、０〜−２０℃で凍結し、該凍結スラリーを溶かすと
コラーゲン性スポンジが得られることが示されている。

【００１８】本発明との大きな相違点は、グルタルアル
デヒド等のなめし剤はコラーゲンを架橋するが、なめし
剤自身がコラーゲン分子の橋かけ剤として使用される
が、本発明のアスコルビン酸−銅はコラーゲンの分子内
あるいは分子間の架橋を促進する触媒として働き、コラ
ーゲンと直接結合していない。このことは線維化アテロ
コラーゲン溶液にアスコルビン酸−銅を処理した後、コ
ラーゲン溶液を濃縮した時の上澄み液中に添加したアス
コルビン酸と銅濃度のほぼ同量が存在することからもわ
かる。

【００１９】一方、アテロコラーゲンを酸性溶液に溶か
し、中性緩衝液を添加する前にアスコルビン酸−銅を添
加するとコラーゲンは線維化がおこらなかった。また銅
溶液だけを添加してもコラーゲンは線維化がおこらない
ことから、分子状のコラーゲンと銅が結合することによ
り、線維化がおこらなかったものと思われる。したがっ
て、本発明は、アテロコラーゲンの酸性溶液にｐＨ７〜
８の緩衝液を加えて、３７℃で１〜８時間加温して得ら
れる線維状のコラーゲン溶液にアスコルビン酸と銅を添
加して５分間以上処理して得られることを特徴とする。
また、本発明の細胞侵入性医用材料は上記人工皮膚以外
にも人工骨，人工軟骨にも使用することができる。以
下、実施例を示し、本発明を更に詳細に説明する。

【００２０】

【実施例】

（実施例１）アテロコラーゲン粉末（高研（株）製）を
０.３（ｗ／ｖ）％となるようにpH３塩酸溶液に溶解さ
せた。この溶液を４℃の恒温槽に入れ攪拌しながら、り
ん酸緩衝液を加え、終濃度が０.２(w/v)％アテロコラー
ゲン、３０mM Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１００mM ＮａＣｌである
コラーゲン溶液を調製した。次いで、３７℃の恒温槽に
４時間浸漬し、線維化アテロコラーゲンを得た。この溶
液に塩化第２銅溶液（最終濃度：１０μＭ）とアスコル
ビン酸溶液（最終濃度：１ｍＭ）を添加し、６０分間攪
拌した。更に上記のコラーゲン溶液を３０００rpm，１
０分間遠心分離を行うことにより、最終濃度が２.５
（ｗ／ｖ）％になるまで濃縮し、細胞侵入性医用材料を
得た。

【００２１】得られた細胞侵入性医用材料について、電
気泳動を行った。未処理のコラーゲンに比べてα，β，
γ成分が減少し、γ成分より高分子量の高架橋成分が増
加した。更に凍結乾燥して得られたコラーゲンスポンジ
を生理食塩水に浸してもスポンジは崩れず形状を保持し
ていた。

【００２２】（実施例２）上記実施例１と同様な方法で
得られた線維化アテロコラーゲンに塩化第２銅溶液とア
スコルビン酸を最終濃度がそれぞれ１０μMと１００μM
になるように添加し、３０００rpm，１０分間遠心分離
を行うことにより、最終濃度が２.５（ｗ／ｖ）％にな
るまで濃縮し、細胞侵入性医用材料を得た。。また上記
の方法で電気泳動を行った結果、実施例１と同様にコラ
ーゲンのα，β，γ成分が減少し、高架橋成分が増加し
た。更に凍結乾燥して得られたコラーゲンスポンジを生
理食塩水に浸してもスポンジは崩れず形状を保持してい
た。

【００２３】（比較例１）アテロコラーゲン粉末（高研
(株)製）を０.３(w/v)％となるようにpH３塩酸溶液に溶
解させた。この溶液を４℃の恒温槽に入れながらりん酸
緩衝液（最終濃度：３０mM Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１００mM Ｎ
ａＣｌ）、アスコルビン酸（最終濃度：１mM）と塩化第
２銅（最終濃度：１０μM）を添加し、次いで３７℃の
恒温槽に４時間浸漬したが、コラーゲンは線維化せず、
白濁にならなかった。上記と同様な方法で電気泳動を行
なった結果、α，β，γ成分が減少し、γ成分より高分
子量の高架橋成分が多少増加した。更に凍結乾燥して得
られたコラーゲンスポンジを生理食塩水に浸したら、ス
ポンジは崩れて形状は保持できなかった。

【００２４】（試験例１）ラット皮膚欠損創への移植試
験上記の実施例１〜２と比較例１で得られたマトリックス
をラット背部皮膚に移植した。Ｗｉｓｔａｒラット（１
８０〜２２０ｇ）をネンブタール麻酔下で除毛し、イソ
ジン消毒したラット背部に皮下筋膜を創面とする全創皮
膚欠損創を生検用パンチ（φ＝６mm，トレパン）で作製
し、止血乾燥した後、検体を創面に埋めこみ、その上に
オプサイト（スミスアンドネフュー社製）をのせ、
更にエラスチコン等の伸縮性絆創膏で胴巻きにし、圧迫
固定した。経時的に観察すると、１日目ではいずれも創
面は閉鎖していないが、３日目の観察では比較例１だけ
が閉鎖していたが、創面は非常に拘縮していた。

【００２５】（実施例３）アテロコラーゲン粉末（高研
(株)製）を４℃の温度下でpH３.０の希塩酸に溶解して
０.３〜０.４(w/v)％に調製した。この溶液を４℃に維
持しつつ攪拌しながらpH７.４のりん酸緩衝液を加え、
最終濃度が０.２(w/v)％（３０mM Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１０
０mM ＮａＣｌ）であるコラーゲン溶液とした。次いで
３７℃の恒温槽内に４時間放置し、線維化アテロコラー
ゲン溶液を調製した。更にこの溶液に塩化第２銅溶液
（最終濃度：１０μM）とアスコルビン酸溶液（最終濃
度：１mM）を添加し、６０分間攪拌した。この溶液を無
菌条件下で３０００rpm，１０分間遠心分離を行うこと
により、濃度２.５(w/v)％にまるまで濃縮した。

【００２６】一方、０.３〜０.４(w/v)％となるよう再
溶解し、これを６０℃の恒温槽内に３０分間放置して熱
変性させ変性アテロコラーゲン（ＨＡＣ）溶液とした。
上記ＦＣ１００重量部に対してＨＡＣが１０重量部とな
るように混合した。この溶液をステンレスパットに注入
し、−３０℃以下で急速冷却して十分凍結させた後、−
４０℃／０.１トール未満の真空下で凍結乾燥した。次
にテフロン板上に６７％のメディカルサイラステックス
シリコーン（接着シリコーンタイプＡ、ダウコーニング
株式会社製）のヘキサン溶液を精密被覆用具（アプリケ
ーター）を用いて塗布して製膜し、塗布した直後にその
湿層上に上記のコラーゲンマトリックスを載せ、室温で
１０分間放置した後、６０℃で少なくとも１時間、オー
ブンで硬化させて人工皮膚を作製した。

【００２７】（実施例４）アテロコラーゲン粉末（高研
(株)製）を４℃の温度下でpH３.０の希塩酸に溶解して
０.３〜０.４(w/v)％に調製した。この溶液を４℃に維
持しつつ攪拌しながらｐＨ７.４のりん酸緩衝液を加
え、最終濃度が１６μg/mlになるようにヘパリン−ナト
リウム溶液（ブタ小腸粘膜由来）を加えた。その後、３
７℃で４時間加熱処理してコラーゲン・ヘパリン複合体
の懸濁液を得た。更にこの溶液に塩化第２銅溶液（最終
濃度：１０μM）とアスコルビン酸溶液（最終濃度：１m
M）を添加し、１０分間攪拌した。この溶液を無菌条件
下で３０００rpm，１０分間遠心分離を行うことによ
り、濃度２.５(w/v)％になるまで濃縮した。

【００２８】一方、０.３〜０.４(w/v)％となるよう再
溶解し、これを６０℃の恒温槽内に３０分間放置して熱
変性させ変性アテロコラーゲン（ＨＡＣ）溶液とした。
上記ＦＣ・Ｈｐ１００重量部に対してＨＡＣが１０重量
部となるように混合した。この溶液をステンレスパット
に注入し、−３０℃以下で急速冷却して十分凍結させた
後、−４０℃／０.１トール未満の真空下で凍結乾燥し
た。次にテフロン板上に６７％のメディカルサイラステ
ックスシリコーン（接着シリコーンタイプＡ、ダウコー
ニング株式会社製）のヘキサン溶液を精密被覆用具（ア
プリケーター）を用いて塗布し製膜し、塗布した直後に
その湿層上にコラーゲンマトリックスを載せ、室温で１
０分間放置した後、６０℃で少なくとも１時間硬化させ
て人工皮膚を作製した。

【００２９】（実施例５）実施例４と同様な方法で作製
した人工皮膚に生検用パンチ（φ＝３mm，トレパン）を
用いて１.５cmの等間隔で貫通孔を作り、人工皮膚を得
た。

【００３０】（比較例２）比較例１と同様な方法で作製
したコラーゲンマトリックスを、予めテフロン板上で成
膜したシリコーン上に載せ、人工皮膚を得た。

【００３１】（試験例２）人工皮膚のラット皮膚欠損創
への移植試験上記の実施例３〜５と比較例２で得られた人工皮膚をラ
ット背部皮膚に移植して試験した。Ｗｉｓｔａｒラット
（２００〜４００ｇ）をネンブタール麻酔下で除毛し、
イソジン消毒したラット背部皮膚に皮下筋膜を創面とす
る２０×２０mmの全創皮膚欠損創を作製し、止血乾燥し
た後、生食を含ませた検体を貼付した。シリコーン膜辺
縁を縫合糸で１６ケ所結紮固定した。その上にソルフレ
ン（テルモ（株）製）を４枚重ね、更にエラスチコン等
の伸縮製絆創膏で胴巻きにし、圧迫固定した。移植後４
週間後の肉眼による観察によると、実施例３〜５のマト
リックスではほとんど拘縮しないのに対して、比較例２
では収縮がおこり、創が閉鎖していた。

【００３２】

【発明の効果】本発明の細胞侵入性医用材料は生体成分
であるコラーゲンからなることから、生体特に皮膚部位
に優れた親和性を有し、更にアスコルビン酸−銅で処理
することによって生体への安定性が増大し、創傷，熱
傷，褥瘡等により皮膚が損傷を受けた際に、損傷面に適
応すると、早期に線維芽細胞が誘導され、損傷部位の早
期治癒に有効である。また、本発明はアスコルビン酸−
銅で処理した線維化アテロコラーゲンと熱変性アテロコ
ラーゲンを含有したマトリックスの創傷接触層と水蒸気
透過調節層とが積層されている人工皮膚として用いた場
合、創傷，熱傷，褥瘡により皮膚が損傷を受けた際に、
損傷面に適用され、真皮成分の欠損部位の治癒に有効で
ある。

【００３３】また本発明に係わる人工皮膚は細胞侵入性
が良好で、アスコルビン酸−銅で処理した線維化アテロ
コラーゲン・ヘパリンと熱変性アテロコラーゲンを含有
したマトリックスの創傷接触層と水蒸気透過調節層とが
積層されている人工皮膚からなり、創傷，熱傷，褥瘡等
により皮膚が損傷を受けた際に、損傷面に適用され、真
皮成分の欠損部位の治癒に有効である。更に、本発明の
人工皮膚は創傷治癒層が細胞侵入性を有するので、創面
に適用された際に、線維芽細胞が早期に創傷接触層に侵
入し、更に真皮様の結合組織を構築するので創傷の治癒
が促進され、更に移植して一定の期間保持した後、上層
の水蒸気透過調節層を剥がして、自家植皮を移植して生
着することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】再構成された線維化アテロコラーゲン溶
液にアスコルビン酸及び銅を添加させた後、前記再構成
された線維化アテロコラーゲン溶液を濃縮することによ
り得られるコラーゲンマトリックスからなる細胞侵入性
医用材料。