DE60125420T2

DE60125420T2 - Zusammensetzungen enthaltend phospholipase c inhibitoren und verfahren zur erhöhung parazellulärer permeabilität der epithelbarriere und endothelbarriere

Info

Publication number: DE60125420T2
Application number: DE60125420T
Authority: DE
Inventors: R. Dhiren Raleigh THAKKER; D. Peter Chapel Hill WARD
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; University of North Carolina System
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; University of North Carolina System
Priority date: 2000-10-10
Filing date: 2001-10-10
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2021-10-11
Also published as: EP1379235A2; ES2276847T3; DE60143975D1; EP1754480B1; WO2002030408A2; ATE348622T1; EP1754480A3; CA2425215C; AU2002224354A1; ATE496619T1; US7713949B2; DK1754480T3; EP1754480A2; DK1379235T3; CA2425215A1; WO2002030408A3; EP1379235B1; MXPA03002934A; US20020115641A1; JP2004532795A

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und ihre Verwendung hinsichtlich einer Erhöhung der Bioverfügbarkeit und Gehirn-Penetration eines therapeutischen Mittels. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und ihre Verwendung hinsichtlich einer Erhöhung der parazellulären Permeabilität, um dadurch die Bioverfügbarkeit eines therapeutischen Mittels in einem Individuum zu erhöhen.
Tabelle der Abkürzungen

TEER

transepithelialer elektrischer Widerstand

SD

Standardabweichung

EC_10x

Konzentration einer die parazelluläre Permeabilität erhöhenden Verbindung, die den Mannitfluss um ein Zehnfaches erhöht

IC₅₀(PLC)

Konzentration einer die parazelluläre Permeabilität erhöhenden Verbindung, die zu einer 50%igen Abnahme einer ATP-stimulierten Akkumulation von [³H]- Inositphospaten führt

MDCK

Madin-Darby-Nierenepithelzellen

PLC

Phospholipase C

SAR

Struktur-Aktivitäts-Beziehung

Ωcm²

Ohm × Quadratzentimeter

EC₅₀

Konzentration einer die parazelluläre Permeabilität erhöhenden Verbindung, die zu einer 50%igen Verringerung von TEER erforderlich ist

U-73,122

N-Alkylsuccinimid-Derivat eines Steroids (Struktur dargestellt in 2B)

PKC

Proteinkinase C

MLCK

Myosin-Leichtketten-Kinase

CNS

Zentralnervensystem

3-NC

3-Nitrocumarin

Technischer Hintergrund
Die Entdeckung und die Entwicklung von Arzneimitteln, die, zusätzlich dazu, dass sie sehr wirksam und selektiv sind, oral bioverfügbar sind, stellen für die Pharmaindustrie eine große Herausforderung dar. Verbindungen, die sich leicht in der Lipid-Doppelschicht einer Zellmembran verteilen können, werden im Allgemeinen leicht absorbiert (transzellulärer Weg). Im Gegensatz dazu, sind hydrophile Verbindungen weitgehend unfähig, die Zellmembran zu durchdringen. Ihr Weg durch das Epithel über den interzellulären Weg (parazellulärer Weg) wird durch die Gegenwart von interzellulären Bändern, die als Tight Junctions bekannt sind, stark eingeschränkt. Somit stellt das Darmepithel ein wesentliches Hindernis für die Absorption von oral verabreichten hydrophilen therapeutischen Mitteln dar.
Die Tight Junctions sind hochspezialisierte Multiproteinkomplexe, die sowohl aus Transmembran- als auch Cytosolproteinen bestehen. Denkar, B. M. and Nigam S. K. (1998) Am. J. Physiol. 274:F1-F9; Fanning, A. S., et al., J. Soc. Nephrol. 10:1337-1345 (1999). Das Öffnen der Tight Junctions wird offenbar durch komplexe intrazelluläre Signalisierungsmechanismen reguliert. Anderson, J. M., et al., J. Cell Biol. 106:1 141-1149 (1998); Sakakibara, A., et al., J. Cell. Biol. 137:1393-1401 (1997). Viele Signalpfade wurden mit der Regulation der parazellulären Permeabilität in Verbindung gebracht (z.B. Tyrosinkinasen, Calcium, Proteinkinase C (PKC)). Anderson, J. M., and Van Italle, C. M., Am. J. Phys. 269:G467-G475 (1995); Collares-Buzato, C. B., et al., Eur. J. Cell Biol. 76:85-92 (1998); Mullin, J. M., et al., Am. J. Physiol. 275:C544-C554 (1998); Tai, Y. H., et al., J. Membr. Biol. 149:71-79 (1996). Die mit dieser Regulation im Zusammenhang stehenden molekularen Mechanismen wurden bisher jedoch noch nicht gänzlich erforscht.
Bis heute wurden mehrere absorptionserhöhende Mittel identifiziert, die die Absorption von Arzneimittelkandidaten über das Darmepithel durch Modulation der Tight Junctions erhöhen. Den meisten dieser Mittel fehlt allerdings Wirksamkeit und Selektivität zur Einwirkung auf die Tight Junctions, und somit müssen sie in Mengen verabreicht werden, die in vivo millimolare (mM) Konzentrationen erzeugen. Derartige Konzentrationen können zu Zytotoxizität und unerwünschten Nebenwirkungen führen. Zudem ist ihre Wirkungsweise unbekannt oder wird schlecht verstanden, und häufig wirken diese Mittel über mehrere Mechanismen. Daher stehen für die klinische Anwendung keine pharmazeutisch verträglichen Absorptionsverstärker zur Verfügung.
Benötigt wird demnach ein absorptionserhöhendes Mittel, das Wirksamkeit und Selektivität hinsichtlich einer erhöhten parazellulären Permeabilität aufweist. Eine weitere Charakterisierung der Tight-Junction-Regulation und eine Benennung von Mitteln, die die Tight-Junction-Regulation beeinflussen, stellt somit ein in der Technik lang gehegtes und anhaltendes Bedürfnis dar.
Dong-Zhou Liu, et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, November 1999, Vol. 88(11), S. 1161-1168, offenbaren Dodecylphosphocholin zur Erhöhung der parazellulären Permeabilität. Die Verwendung eines Alkylphosphocholins mit einem geradkettigen Alkyl mit 14 bis 20 Kohlenstoffen wird nicht offenbart. Ferner offenbart diese zitierte Literatur nicht die Verwendung der Alkylphosphocholine als Arzneimittel bei einem Individuum.
Aus WO-A-0211666 sind verzweigte Phosphocholine bekannt, geradkettige Phosphocholine werden jedoch nicht erwähnt. Die Verwendung verzweigter Phosphocholine zur Erhöhung der parazellulären Permeabilität für hydrophile Verbindungen wird beschrieben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend eine Phospholipase-C-inhibierende Menge eines Phospholipase-C-Inhibitors und einen pharmazeutisch verträglichen Träger in einer wirksamen Menge, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Erhöhung der parazellulären Permeabilität an einer Absorptionsstelle in einem Individuum, wobei der Phospholipase-C-Inhibitor aus einem Alkylphosphocholin mit einem geradkettigen Alkyl mit 14 bis 20 Kohlenstoffen ausgewählt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend

a) ein therapeutisches Mittel, das leicht in Wasser löslich ist, und das die Lipid-Doppelschicht einer Zellmembran in einem Individuum schwer durchdringen kann;
b) einen Phospholipase-C-Inhibitor in einer Phospholipase-C-inhibierenden Menge, und
c) einen pharmazeutisch verträglichen Träger

Die Verwendung der Zusammensetzung im Hinblick auf eine Erhöhung der parazellulären Permeabilität an einer Absorptionsstelle in einem Individuum wird beschrieben. Die Verwendung umfasst: (a) Verabreichung einer wirksamen Menge des Phospholipase-C-Inhibitors an ein Individuum zu einem Zeitpunkt, zu dem eine erhöhte parazelluläre Permeabilität gewünscht ist; und (b) Erhöhung der parazellulären Permeabilität in dem Individuum an einer Absorptionsstelle durch die Verabreichung der wirksamen Menge des Phospholipase-C-Inhibitors.
Die Verwendung der Zusammensetzung hinsichtlich der Erhöhung der Absorption eines hydrophilen Arzneimittels in einem Individuum wird ebenfalls beschrieben. Die Verwendung umfasst: (a) Verabreichung einer wirksamen Menge des Phospholipase-C-Inhibitors an das Individuum zu einer Zeit vor oder in Verbindung mit der Verabreichung des hydrophilen Arzneimittels an das Individuum, wobei erhöhte parazelluläre Permeabilität an einer Absorptionsstelle in dem Individuum hervorgerufen wird; und (b) Erhöhung der Absorption des hydrophilen Arzneimittels an einer Absorptionsstelle in dem Individuum durch die Verabreichung einer wirksamen Menge des Phospholipase-C-Inhibitors.
Eine Zusammensetzung und ihre Herstellung sind ebenfalls offenbart. Die Formulierung umfasst: (a) ein therapeutisches Mittel, das leicht in Wasser löslich ist und das die Lipid-Doppelschicht einer Zellmembran in einem Individuum schwer durchdringen kann; (b) eine wirksame Menge des Phospholipase-C-Inhibitors; und (c) einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Dementsprechend besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung einer neuen Zusammensetzung und ihrer Verwendung zur Modulation der parazellulären Permeabilität. Das Ziel wird durch die vorliegende Erfindung vollständig oder teilweise erreicht.
Ein Ziel der Erfindung ist vorstehend genannt, andere Ziele werden im Laufe der Beschreibung zusammen mit den begleitenden Figuren und Laborbeispielen offenbar, wie nachstehend optimal beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung des Transports durch das Darmepithel. Moleküle überqueren das Darmepithel in das Blut hauptsächlich auf drei Wegen: durch passive Diffusion über die Zellmembranen (transzellulärer Weg); durch passive Diffusion zwischen benachbarten Zellen (parazellulärer Weg); oder durch trägervermittelten Transport (trägervermittelter Weg).
2A ist eine Strukturformel, Formel 1, für die Alkylphosphocholine, die zur erfindungsgemäßen Analyse der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen hergestellt wurden. Sechs Alkylphosphocholine mit 10, 12, 14, 16, 18 oder 20 Methyleneinheiten in ihrer Alkylkette, d.h. n = 9, 11, 13, 15, 17 oder 19, wurden synthetisiert oder erworben. Wie in 2A gezeigt, kann n jedoch auch 8, 10, 12, 14, 16 oder 18 sein.
2B ist eine Strukturformel, Formel 2, für den spezifischen PLC-Inhibitor U-73.122, 1-[6-[[(17-β)-3-Methoxyestra-1,3,5(10)-trien-17-yl]amino]hexyl]-)1N-pyrrol-2,5-dion, und sein inaktives Analogon, U-73,343, 1-[6-[[(17-β)-3-Methoxyestra-1,3,5(10)-trien-17-yl]amino]hexyl]-)-2,5-pyrrolidindion. U-73,122 enthält eine Doppelbindung, die eingerahmt ist, während U-73,343 an Stelle der Doppelbindung eine Einfachbindung enthält.
3 ist ein Graph, der die Wirkung von Alkylphosphocholinen und U-73,122 auf den TEER in MDCK-Zellen zeigt. Die Verbindungen wurden apikal verabreicht. TEER wurde nach einer 30-minütigen Inkubation mit der Verbindung bei 37°C gemessen. Die Messpunkte stellen Mittelwert ± SD (n = 3) dar. Symbole. die die Verbindungen darstellen, sind Δ C 12. + C 16, und X U-73,122. Die Einfügung zeigt die zeitliche Wirkung der Behandlung mit 30 μM C16 auf den TEER über MDCK-Monolayer.
4 ist ein Graph, der die Wirkung von Alkylphosphocholinen und U-73,122 auf den Mannitfluss in MDCK-Zellen zeigt. Die Verbindungen und [¹⁴C]-Mannit wurden apikal verabreicht. Die Transportgeschwindigkeiten wurden durch Messen der [¹⁴C]-Mannit-Menge. die sich auf der basolateralen Seite (1,5 ml) während des 30- und 60-minütigen Behandlungsintervalls mit Verbindung oder Vehikel angereichert hat, dokumentiert. Die Messpunkte stellen Mittelwert ± SD (n = 3) dar. Symbole, die die Verbindungen darstellen, sind Δ C12, + C16. und X U-73,122.
5 ist ein Graph, der die Wirkung von Alkylphosphocholinen und U-73,122 auf die ATP-stimulierte PLC-Aktivität in MDCK-Zellen zeigt. MDCK-Monolayer wurden 24 h bei 37 °C mit [³H]-Myoinosit markiert. Dann wurden die MDCK-Zellen 30 min bei 37 °C mit der Verbindung behandelt. Die Inositphosphat-Produktion wurde 15 min mit 100 μM ATP stimuliert. [³H]-Inositphosphate wurden durch Chromatographie isoliert. Anschließend wurde die Menge an [³H]-Inositphosphaten mit Hilfe einer Flüssigkeitsszintillationszählung in einem Tri Carb 4000-Spektralphotometer von Packard Instrument Company of Meriden, Connecticut, USA bestimmt. Die Messpunkte stellen Mittelwert ± SD (n = 3) dar. Symbole, die die Verbindungen darstellen, sind Δ C 12, + C 16, und X U-73,122.
6A ist ein Graph, der die Korrelation (r = 0,98, p < 0,05) zwischen den IC₅₀(PLC) und EC_10x-Werten für Alkylphosphocholine, 3-NC und U-73,122 zeigt. Der eingerahmte Messpunkt stellt U-73,122 dar, und der Messpunkt von 3-NC ist mit NC markiert.
6B ist ein Graph, der die Korrelation (r = 0,95, p < 0,05) zwischen den IC₅₀(PLC)- und EC_10x-Werten für Alkylphosphocholine, 3-NC, und U-73,122 zeigt. Die Messpunkte stellen Mittelwert ± SD von drei dreimal durchgeführten Experimenten dar. Der eingerahmte Messpunkt stellt U-73,122 dar, und der Messpunkt von 3-NC ist mit NC markiert.
7A ist eine Strukturformel und ein Balkendiagramm, die die Wirkung von U-73,122 und U-73,343 auf den TEER (nicht ausgefüllter Balken) und eine ATP-stimulierte PLC-Aktivität darstellen (ausgefüllter Balken).
7B ist eine Strukturformel und ein Balkendiagramm, die die Wirkung von 3-Nitrocumarin und 7-Hydroxy-3-Nitrocumarin auf den TEER (nicht ausgefüllter Balken) und eine EGF-stimulierte PLC-Aktivität beschreiben (ausgefüllter Balken).
8 zeigt ein Balkendiagramm, das die Wirkung von 3-NC, HPC oder U-73,122 auf die Aktivität von PLC-β (ausgefüllter Balken) und PLC-γ (nicht ausgefüllter Balken) beschreibt. MDCK-Monolayer wurden 24 h bei 37 °C mit [³H]-Myoinosit markiert. Dann wurden die MDCK-Zellen 30 min bei 37 °C mit 3-NC, HPC oder U-73,122 behandelt. Die Inositphosphat-Produktion wurde 15 min mit 100 μM ATP oder 20 ng/ml EGF stimuliert. um PLC-β, bzw. PLC-γ zu aktivieren. Die [³H]-Inositphosphate wurden durch Chromatographie isoliert. Die Menge an [³H]-Inositphosphaten wurde dann mit Hilfe einer Flüssigkeitsszintillationszählung in einem Packard-Tri Carb 4000-Spektralphotometer bestimmt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Es werden hier neue Absorptionsverstärker offenbart, die die parazelluläre Permeabilität des Darmepithels über einen bislang nicht charakterisierten Mechanismus – d.h. Hemmung der biologischen Aktivität des Phospholipase C Enzyms (PLC) – modulieren. Bei einer Ausführungsform wurden die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR) für die Fähigkeit von Alkylphosphocholinen, die parazelluläre Permeabilität zu erhöhen und die PLC-Aktivität zu hemmen, bestimmt. Die Fähigkeit von Alkylphosphocholinen, die parazelluläre Permeabilität zu erhöhen und die PLC in Madin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK-Zellen), ein in vitro Epithelzellmodell für Transportexperimente, zu hemmen, waren signifikant korreliert (p < 0,05). Um die Beteiligung einer PLC-Hemmung an der Regulation der parazellulären Permeabilität zu bestätigen, wurden selektive PLC-Inhibitoren (z.B. U-73,122 und 3-Nitrocumarin), deren Fähigkeit, die Tight Junction-Permeabilität zu modulieren, bis zur Offenbarung der hier vorgestellten vorliegenden Erfindung, unbekannt war, hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die parazelluläre Permeabilität zu erhöhen, evaluiert, wie in den Laborbeispielen ausführlich beschrieben. Diese PLC-Inhibitoren erwiesen sich als sehr wirksame Verstärker der parazellulären (Tight Junction) Permeabilität. Ferner korrelierte die Fähigkeit der PLC-Inhibitoren, die parazelluläre Permeabilität zu erhöhen und die PLC zu hemmen, signifikant (p<0,05) mit der Fähigkeit von Alkylphosphocholinen, diese Parameter zu verändern.
Die Ergebnisse zeigen, dass die parazelluläre Permeabilität durch PLC-Hemmung erhöht werden kann. Somit kann ein Inhibitor der biologischen Aktivität des Enzyms PLC (nachstehend als "Phospholipase C-Inhibitor" oder als "PLC-Inhibitor" bezeichnet) selektiv die parazelluläre Permeabilität durch Modulation der Tight Junctions erhöhen. Dementsprechend können PLC-Inhibitoren als selektive und sehr wirksame Absorptionsverstärker für hydrophile Arzneimittel, die bei oraler Verabreichung schlecht über das Darmepithel absorbiert werden, eingesetzt werden. Drei Klassen von Verbindungen sind für die Verwendung als Absorptionsverstärker, die über PLC-Hemmung wirken, bevorzugt – Alkylphosphocholine, 3-Nitrocumarine und C-17-N-Alkylsuccinimidoderivate von Steroiden.
Hydrophile Arzneimittel, die sich im systemischen Blutkreislauf befinden, können wegen der sogenannten "Blut-Hirn-Schranke" nicht in das Gehirn vordringen. Diese Schranke wird von dem hochspezialisierten Endothel gebildet, das die Wände der Kapillaren auskleidet, die das Gehirn mit Blut versorgen. Die Blut-Hirn-Schranke ist ebenfalls durch die Gegenwart von Tight Junctions gekennzeichnet. Erfindungsgemäß können PLC-Inhibitoren auch als Verstärker des Vordringens hydrophiler Verbindungen, die die Blut-Hirn-Schranke nur schwer überqueren können, in das Zentralnervensystem (ZNS) dienen.
A. Definitionen
Es wird angenommen, dass die folgenden Begriffe in der Fachwelt anerkannte Bedeutungen besitzen. Allerdings werden hier die folgenden Definitionen ausgeführt, um die Erklärung des vorliegenden erfinderischen Gegenstandes zu erleichtern.
Wie hier und in den Ansprüchen verwendet, soll sich der Begriff "Absorptionsstelle" auf eine Stelle beziehen, an der Verbindungen, Moleküle oder andere Substanzen in das Kreislaufsystem oder in die Gewebe eines Individuums absorbiert werden. In der Tat kann eine Absorptionsstelle jede Stelle einschließen, an der Tight Junctions vorkommen, und es ist erwünscht, die parazelluläre Permeabilität an der Tight Junction zu modulieren, um die Absorption einer Substanz zu erleichtern. Derartige Substanzen können sowohl Arzneimittelverbindungen als auch endogene Verbindungen oder Moleküle einschließen. Repräsentative Absorptionsstellen umfassen das Darmepithel, an dem eine Aufnahme in das Kreislaufsystem erfolgt, und das hochspezialisierte Endothel, das die Wände der Kapillaren auskleidet, die das Gehirn mit Blut versorgen, die sog. Blut-Hirn-Schranke, an der eine Absorption in das Gewebe des Zentralnervensystems (ZNS) stattfindet.
Wie hier und in den Ansprüchen verwendet, soll sich der Begriff "parazelluläre Permeabilität" auf die Fähigkeit einer Verbindung, eines Moleküls oder einer anderen Substanz beziehen, über einen interzellularen Weg ein Gewebe, wie z.B. das Epithelgewebe, das den Dann auskleidet, zu passieren. Tight Junctions sind hochspezialisierte Multiproteinkomplexe, die für Moleküle, die das Epithel über einen parazellulären Weg passieren, eine wirksame Barriere darstellen. Trotz laufender Bestrebungen der Fachwelt, wurde die Regulation von Tight Junctions bislang nicht gut charakterisiert. Somit erfüllt die erfindungsgemäße Charakterisierung eines Aspekts der Regulation von Tight Junctions ein in der Fachwelt seit langem bestehendes Anliegen.
Der Begriff "hydrophiler Wirkstoff' soll sich auf ein Arzneimittel beziehen, das leicht in Wasser löslich ist und das somit die Lipid-Doppelschicht einer Zellmembran in einem Individuum schwer durchdringen kann. Der Durchtritt derartiger Verbindungen durch das Epithelgewebe auf einem interzellularen Weg (d.h. ein parazellulärer Weg) wird auch durch die Gegenwart von Tight Junctions stark eingeschränkt.
Wie hier und in den Ansprüchen verwendet, soll sich der Begriff "Bioverfügbarkeit" auf eine Menge eines Wirkstoffs relativ zu der verabreichten Gesamtdosis beziehen, wie ein therapeutisches Mittel oder Arzneimittel, das in das Kreislaufsystem eines Individuums oder in das Gewebe eines Individuums nach Verabreichung, wie hier offenbart, aufgenommen wird, z.B. orale, bukkale, nasale, parenterale, rektale oder transdermale Verabreichung oder Verabrei chung in einer Form, die geeignet ist, das Kolonepithel zu kontaktieren, oder Verabreichung in einer Form, die zur Inhalation oder Insufflation (entweder über den Mund oder die Nase) geeignet ist, um z.B. das Lungenalveolarepithel zu kontaktieren.
Wie hier und in den Ansprüchen verwendet, werden die Begriffe "Phospholipase C-Inhibitor" und "PLC-Inhibitor" als synonym verwendet und beziehen sich auf jede Substanz, jedes Molekül oder jede Verbindung, die eine inhibierende Aktivität auf ein PLC-Enzym aufweist, einschließlich der bis jetzt identifizierten Isoformen von PLC, PLC-β (Beta) und PLC-γ (gamma), sowie bislang unbekannter PLC Isoformen, die im Folgenden benannt werden, jedoch nicht darauf beschränkt. Die Anmelder wünschen nicht, auf eine bestimmte Theorie bezüglich der Funktionsweise festgelegt zu werden, dennoch wird davon ausgegangen. dass ein PLC-Inhibitor entweder durch eine direkte Hemmung der PLC oder durch eine indirekte Hemmung der PLC, wie durch Unterbrechung eines G-Protein-gekoppelten Signalpfades, wirken kann. Mehrere repräsentative PLC-Inhibitoren sind hier offenbart.
In Einhaltung der seit langem bestehenden Patentrechtskonvention bedeuten die in dieser Anmeldung einschließlich in den Ansprüchen verwendeten Begriffe "ein" und "einer/eine" "ein oder mehrere".
B. Allgemeine Überlegungen
Epithel- und Endothelschichten fungieren als Barrieren, um distinkte Kompartimente in einem vielzelligen Organismus oder einem Individuum aufrecht zu erhalten. Dies wird durch interzelluläre Bänder erreicht, die die Bewegung großer Makromoleküle sowie, zu einem geringeren Ausmaß, kleiner Moleküle zwischen den Epithelzellen oder über die parazellulären Wege einschränken. Sogar die Ionen-Bewegung durch das Epithel wird verlangsamt, wodurch ein transepithelialer elektrischer Widerstand (TEER) erzeugt wird. Der parazelluläre Ausstrom von Makromolekülen von einem Kompartiment zum anderen wird durch die Bildung von Tight Junctions verhindert. Diamond, J., "The Epithelial Junction: Bridge, Gate and Fence", Physiologist 20:10-18 (1977).
Die Barrierefunktion der Tight Junction ist jedoch nicht statisch. Beispielsweise passieren viele hydrophile Nährstoffe das Epithel leicht über den parazellulären Weg. Ballard, S. T., et al., Annu. Rev. Nutr. 15:35-55 (1995). Darum steuert die Tight Junction die parazelluläre Permeabilität dynamisch, was nahe legt, dass die Epithelzellen die Funktion der Tight Junction zu regulieren vermögen.
Die Tight Junction ist eine komplexe Struktur, die sowohl Transmembran- als auch Zytosolproteine einschließt. Denkar, B. M. and Nigam, S. K. (1998) Am. J. Physiol. 274:F1-F9; Fanning, A. S., et al., J. Soc. Nephrol. 10:1337-1345 (1999). Viele dieser Proteine (z.B. Occludin, ZO-1, ZO-2 und ZO-3) sind phosphoryliert, was nahe legt, dass diese Proteine die Endpunkte verschiedener Signalkaskaden darstellen. Anderson, J. M., et al., J. Cell Biol. 106:1141-1149 (1998); Sakakibara, A., et al., J. Cell. Biol. 137:1393-1401 (1997). Viele Signallisierungspfade wurden mit der Regulation der parazellulären Permeabilität in Verbindung gebracht (z.B. Tyrosinkinasen, Calcium, Proteinkinase C (PKC). Anderson, J. M., and Van Italle, C. M., Am. J. Phys. 269:G467-G475 (1995): Collares-Buzato, C. B., et al., Eur. J. Cell Biol. 76:85-92 (1998); Mullin, J. M., et al., Am. J. Physiol. 275:C544-C554 (1998); Tai, Y. H., et al., J. Membr. Biol. 149:71-79 (1996). Bis zur Offenbarung der vorliegenden Erfindung waren die mit dieser Regulation im Zusammenhang stehenden molekularen Mechanismen jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt.
Moleküle überqueren das Darmepithel hauptsächlich auf drei Wegen in das Blut, die in 1 schematisch dargestellt sind. Erstens können Moleküle die Zellmembranen durch passive Diffusion passieren (transzellulärer Weg); zweitens durch passive Diffusion zwischen benachbarten Zellen (parazellulärer Weg); oder drittens durch trägervermittelten Transport (trägervermittelter Weg). Lipophile Moleküle überqueren die Zellmembran leicht über den transzellulären Weg. Andererseits können sich hydrophile Moleküle, die von einem Träger nicht erkannt werden, nicht in der hydrophoben Membran verteilen, und müssen daher die Epithelbarriere über den parazellulären Weg überwinden. Der Transport von hydrophilen Molekülen über den parazellulären Weg wird jedoch durch das Vorhandensein der Tight Junctions stark eingeschränkt.
Viele geeignete therapeutische Mittel sind hydrophil und werden somit auf oralem Weg, der besonders begünstigte Weg der Arzneimittel-Abgabe, nicht zuverlässig abgegeben. Das hydrophile Breitbandantibiotikum Cefoxitin weist beispielsweise bei Tieren aufgrund der schlechten Dann-Permeabilität eine orale Bioverfügbarkeit von weniger als 5 % auf und ist derzeit nur als eine i. v. Formulierung auf dem Markt. Enalaprilat, ein Angiotensin-Umwand lungsenzym-Inhibitor, wird ebenfalls schlecht absorbiert. Dieses hydrophile Arzneimittel ist ebenfalls nur als eine i. v. Formulierung auf dem Markt.
C. Therapeutische Verwendung
Die Verwendung der Zusammensetzung hinsichtlich einer Erhöhung der parazellulären Permeabilität an einer Absorptionsstelle in einem Vertebraten wird erfindungsgemäß bereitgestellt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Verwendung die Verabreichung einer wirksamen Menge eines PLC-Inhibitors an ein Individuum zu einem Zeitpunkt, zu dem eine erhöhte parazelluläre Permeabilität gewünscht ist; und die Erhöhung der parazellulären Permeabilität in dem Individuum an einer Absorptionsstelle durch die Verabreichung der wirksamen Menge des PLC-Inhibitors.
Der PLC-Inhibitor wird aus einem Alkylphosphocholin mit einem geradkettigen Alkyl von 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Methylengruppen ausgewählt. Die Absorptionsstelle umfasst vorzugsweise Darmepithel. Alternativ kann sie auch die Blut-Hirn-Schranke umfassen.
Die Verwendung der Zusammensetzung hinsichtlich Erhöhung der Absorption eines hydrophilen Arzneimittels in einem Individuum ist ebenfalls offenbart. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Verwendung die Verabreichung einer wirksamen Menge des PLC-Inhibitors an ein Individuum zu einem Zeitpunkt vor oder in Verbindung mit der Verabreichung eines hydrophilen Arzneimittels an das Individuum, wodurch an einer Absorptionsstelle in dem Individuum erhöhte parazelluläre Permeabilität erzeugt wird; und die Erhöhung der Absorption des hydrophilen Arzneimittels an der Absorptionsstelle in dem Individuum durch die Verabreichung der wirksamen Menge des Phospholipase C-Inhibitors.
Der PLC-Inhibitor wird aus einem Alkylphosphocholin mit einem geradkettigen Alkyl mit 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Methylengruppen ausgewählt. Die Absorptionsstelle umfasst vorzugsweise Darmepithel. Alternativ kann sie auch die Blut-Hirn-Schranke umfassen.
Wie hier verwendet, bezieht sich eine "wirksame" Menge oder Dosis auf eine Menge oder Dosis, die bei einer Mehrheit einer Population von Individuen wirksam ist oder in einen wirksamen Bereich fällt und die dazu ausreicht, die PLC-Aktivität zu modulieren und/oder zu einer verbesserten Absorption in einem Individuum zu führen. Zusätzlich wurden erfindungsgemäß Verbindungen, die selektive und starke PLC-Inhibitoren sind, identifiziert, und der erste Beweis, dass derartige Verbindungen dazu verwendet werden können, die parazelluläre Permeabilität zu modulieren, wurde erbracht. Somit können die Verbindungen erfindungsgemäß in Dosierungen verabreicht werden, die im Gegensatz zu millimularen Konzentrationen mikromolare (μM) in vivo Konzentrationen bereitstellen. Repräsentative in vivo Konzentrationen können von weniger als 1 μM bis zu etwa 100 μM reichen, und können intermediäre Konzentration, wie z.B. 2, 4, 5, 10, 25, 50 oder 75 μM umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Somit werden unerwünschte Nebenwirkungen, wie z.B. Zytotoxizität, die mit einer nicht-spezifischen Aktivität und größeren millimolaren Konzentrationen verbunden sind, mit den erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen vermieden.
Somit wählt ein Fachmann nach dem Durchlesen der Offenbarung der hier vorliegenden Erfindung eine wirksame Dosis für ein Individuum aus, wobei er die spezielle Formulierung und die für diese Zusammensetzung zu verwendenden Verabreichungsweise sowie Größe und Gewicht des Individuums, Schwere der Symptome und Stadium des zu behandelnden Leidens berücksichtigt.
Eine Dosiseinheit kann z.B. ein bis vier Mal am Tag verabreicht werden. Vorzugsweise wird eine wirksame Menge des PLC-Inhibitors an ein Individuum zu einem Zeitpunkt vor oder in Verbindung mit der Verabreichung eines hydrophilen Arzneimittels an das Individuum verabreicht. Bei Verabreichung des PLC-Inhibitors in Verbindung mit der Verabreichung eines hydrophilen Arzneimittels an das Individuum, ist es bevorzugt, den PLC-Inhibitor und das hydrophile Arzneimittel an das Individuum als Einzelformulierung zu verabreichen. Die Dosis hängt von dem Verabreichungsweg und von der Formulierung der die Verbindung oder die Verbindungen enthaltenden Zusammensetzung ab. Weiterhin ist es dem Fachmann nach dem Durchlesen der Offenbarung der hier vorliegenden Erfindung bekannt, dass es notwendig sein könnte, an der Dosierung routinemäßig. je nach Kombination der eingesetzten Mittel, Alter und Gewicht des Individuums und Schwere des zu behandelnden Krankheitszustands, Anpassungen oder Änderungen vorzunehmen.
Dem medizinische Fachpersonal sind derartige Anpassungen oder Änderungen sowie eine Evaluierung dahingehend, wann und wie derartige Anpassungen bzw. Änderungen durchgeführt werden, bekannt. Evaluierungsparameter und -techniken können je nach Individuum und Schwere der Erkrankung variieren. Besonders geeignete Evaluierungstechniken umfas sen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Tests, die in den hier dargestellten Laborbeispielen offenbart sind.
Das in der vorliegenden Erfindung bei ihren vielen Ausführungsformen behandelte Individuum ist erwünschterweise ein Mensch, dennoch solle es selbstverständlich sein, dass die Prinzipien der Erfindung zeigen, dass die Erfindung bei allen Vertebratenarten, einschließlich Säugetieren, die in dem Begriff "Individuum" mit umfasst sein sollen, wirksam ist. In diesem Zusammenhang wird ein Säugetier so verstanden, dass jede Säugetierart, bei der eine erhöhte parazelluläre Permeabilität erwünscht ist, insbesondere landwirtschaftlich genutzte und domestizierte Säugetierarten, eingeschlossen ist.
Die erfindungsgemäße Verwendung ist besonders bei der Behandlung von warmblütigen Vertebraten geeignet. Darum betrifft die Erfindung vorzugsweise Säugetiere und Vögel.
Spezieller wird eine Behandlung für Säuger, wie Menschen, sowie für diejenigen Säugetiere, die aufgrund ihres Gefährdungsstatus von Bedeutung sind (wie der Sibirische Tiger), die für den Menschen von wirtschaftlicher Bedeutung sind (Tiere, die für den menschlichen Verzehr auf Farmen gezüchtet werden) und/oder von sozialer Bedeutung sind (Zoo- oder Haustiere), z.B. Karnivore, außer dem Menschen (wie Katzen und Hunde), Schweine (Jungschweine, Schlachtschweine und Wildschweine), Wiederkäuer (wie Rindvieh, Ochsen, Schafe, Giraffen, Hirsche, Ziegen, Bisons und Kamele), und Pferde (z.B. Rennpferde), in Betracht gezogen. Ebenso wird eine Behandlung für Vögel, einschließlich der gefährdeten oder in Zoos lebenden (z. B. Strauße) Vogelarten, sowie Geflügel, und noch spezieller domestiziertes Geflügel, d.h. Hausgeflügel wie Truthähne, Hühner, Enten, Gänse, Perlhühner und dergleichen, da sie auch für den Menschen von wirtschaftlicher Bedeutung sind, in Betracht gezogen. Somit wird eine Behandlung für Nutzvieh, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Hausschweine (Jungschweine, Schlachtschweine), Wiederkäuer, Pferde, Hausgeflügel und dergleichen in Betracht gezogen.
D. PLC-Inhibitorverbindungen
Bevorzugte Alkylphosphocholine umfassen eine Verbindung der Formel 2, wie in 2A ausgeführt, wobei n = 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 ist. Repräsentative Verfahren zur Synthese von Phosphocholinen sind in den U.S. Patentschriften Nr. 5,208,223 und 5,144,045 offenbart.
Es wurde festgestellt, dass Hexadecylphosphocholin (C16) die PLC in Zell-Assays und biochemischen Assays hemmt. Berkovic, D., et al., J. Exp. Ther. Onc. 1:302-311 (1996); Pawelcyzk, T. and Lowenstein, J. M., Biochem. Pharm. 45:493-497 (1999). Es wurde festgestellt, dass C16, das Strukturmerkmale aufweist, die eine lange Alkylkette und eine zwitterionische Funktionalität einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind, die parazelluläre Permeabilität durch MDCK-Zellmonolayer sehr wirksam erhöhen kann. Somit wurden C16-Analoge mit variierenden Kettenlängen von 10 bis 20 Methyleneinheiten (2A, Formel 1) synthetisiert. Die Wirksamkeiten dieser Analogen wurde gemessen. Ein Zusammenhang zwischen PLC-Hemmung und Änderungen in der parazellulären Permeabilität wurde eindeutig entwickelt.
Weitere PLC-Inhibitoren sind 3-Nitrocumarine, die nicht in den Umfang der Erfindung fallen und die 3-Nitrocumarinester und -ether umfassen, wobei sich die Ester- oder die Etherbindung an der Position 6 des 3-Nitrocumarin-Kerns befindet. Repräsentative Ether-Analoge umfassen 7-Hydroxy-heptanoxy-3-nitrocumarin und 6-Hydroxyhexaoxy-3-nitrocumarin. Repräsentative Esterderivate umfassen Heptanoyl- und Hexanoyl-3-nitrncumarine. Weitere repräsentative 3-Nitrocumarine sind in nachstehender Tabelle 1 ausgeführt und umfassen das eigentliche 3-Nitrocumarin, 6-Hydroxy-3-nitrocumarin, 6-Acetoxy-3-nitrocumarin, 6-Octanoyl-3-nitrocumarin, 6-(10-Undecenoyl)-3-nitrocumarin und 6-(8-Hydroxy-octanoxy)-3-nitrocumarin. Die Derivate können unter Verwendung der Standard-Syntheseverfahren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, die bei Perrella et al., Journal of Medicinal Chemistry (1994) 37 (14):2232-2237 offenbarten, synthetisiert werden. Tabelle 1 – Substituierte 3-Nitrocumarine (Formel 3)*

*Zusätzlich sind auch die gleichen Derivate (in Tabelle 1 beispielhaft dargestellt) von 3-Cyanocumarin, 3-Halogencumarinen (3-F, 3-Cl, 3-I), 3-Acetoxycumarin, und Cumarin-3-sulfonsäure erwähnt. Somit wird eine weitere Substituentengruppe, R4, in Position 3 der vorstehenden Formel 3 bereitgestellt, d.h. das Kohlenstoffatom, das mit einer Nitrogruppe, vorstehend, substituiert ist. Somit kann R4 eine Nitrogruppe (-NO₂), eine Cyanogruppe (-CN), ein Halogen, wie -F, -Cl, oder -I, eine Acetoxygruppe, d.h. OCOCH₃ ^- oder eine Sulfonsäuregruppe, d.h. -SO₃H umfassen.

Weitere PLC-Inhibitoren sind N-Alkylsuccinimidoderivate von Steroiden, die nicht im Umfang der Erfindung liegen, und eine Struktur der Formel 1, wie in 2B ausgeführt, umfassen. R1 ist vorzugsweise eine Methylenkette, die von einer bis zehn Methylengruppen reicht, d.h. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Methylengruppen, und R2 wird vorzugsweise aus den Gruppen -OCH3, -OH und H ausgewählt, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Weitere PLC-Inhibitorzusammensetzungen, die eingesetzt werden können, jedoch nicht im Umfang der Erfindung liegen, umfassen die Liposom-Zusammensetzungen, die in der U.S. Patentschrift Nr. 5,942,246, ausgegeben an Mayhue et al. am 24. August 1999, offenbart sind, die Hispidospermidin-Zusammensetzungen, die in der U.S. Patentschrift Nr. 5,430,050, ausgegeben an Smith et al. am 4. Juli 1995, offenbart sind, und die PLC-inhibierenden Peptide, die in der U.S. Patentschrift Nr. 5,580,956, ausgegeben an Saito et al. am 3. Dezember 1996, offenbart sind. Weitere geeignete Phospholipase-Inhibitoren, die jedoch nicht im Umfang der Erfindung liegen, umfassen die Alphahydroxyphosphonatverbindungen, die in der U.S. Patentschrift Nr. 5,519,163, ausgegeben an Gibbs et al. am 2 Mai 1996, offenbart sind.
E. Pharmazeutische Formulierungen
Eine bevorzugtes Arzneimittel umfasst erfindungsgemäß ein hydrophiles Arzneimittel; eine wirksame Menge des PLC-Inhibitors; und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Stärker bevorzugt wird der PLC-Inhibitor aus einem Alkylphosphocholin mit einem geradkettigen Alkyl von 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Methylengruppen ausgewählt.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die die orale Bioverfügbarkeit eines hydrophilen Arzneimittels für ein Individuum, das dessen bedarf, verbessert, wird ebenfalls bereitgestellt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren: Bereitstellen eines hydrophilen Arzneimittels; Bereitstellen einer wirksamen Menge des PLC-Inhibitors; und Vermischen des hydrophilen Arzneimittels und der wirksamen Menge des PLC-Inhibitors mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wodurch eine Zusammensetzung hergestellt wird, die die orale Bioverfügbarkeit des hydrophilen Arzneimittels erleichtert.
Der PLC-Inhibitor wird aus einem Alkylphosphocholin mit einem geradkettigen Alkyl mit 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Methylengruppen ausgewählt.
Formulierungs- und Dosisherstellungsverfahren wurden bereits allgemein in der Technik beschrieben, siehe z.B. diejenigen, die beschrieben sind in der U.S. Patentschrift Nr. 5,326,902, ausgegeben an Seipp et al. am 5. Juli 1994, in der U.S. Patentschrift Nr. 5,234,933, ausgegeben an Marnett et al. am 10. August 1993, und in der PCT-Veröffentlichung WO 93/25521 von Johnson et al., veröffentlicht am 23. Dezember 1993.
Für die vorstehend beschriebenen Zwecke können die identifizierten Substanzen normalerweise systemisch oder partiell verabreicht werden, in der Regel durch orale oder parenterale Verabreichung. Die zu verabreichenden Dosen sind durch Alter, Körpergewicht, Symptom, die gewünschte. die parazelluläre Permeabilität erhöhende Wirkung, den Verabreichungweg und die Behandlungsdauer etc. vorgegeben. Ein Fachtherapeut erkennt entsprechende Verfahren und Techniken zur Bestimmung des entsprechenden Dosierungsregimes für eine wirksame Therapie. Ein zusätzlicher Leitfaden wird auch in den hier nachstehend dargestellten Laborbeispielen bereitgestellt. Verschiedene Zusammensetzungen und Verabreichungsformen werden bereitgestellt und sind allgemein aus der Technik bekannte. Weitere Zusammensetzungen zur Verabreichung umfassen Suppositorien, die einen oder mehrere der Wirkstoff(e) umfassen und nach bekannten Verfahren hergestellt werden können.
Somit kann eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung mit einem oder mehreren physiologisch verträglichen Trägern oder Exzipienten formuliert werden. Somit können die erfindungsgemäßen Verbindungen zur erfindungsgemäßen Verwendung zur oralen, bukkalen, parenteralen, rektalen oder transdermalen Verabreichung, zur Verabreichung in einer Form, die zum Kontakt mit dem Colonepithel geeignet ist, oder zur Verabreichung in einer Form, die zur Inhalation oder Insufflation (entweder über den Mund oder die Nase), um beispielsweise das Lungenalveolarepithel zu kontaktieren, geeignet ist, formuliert werden. Eine Verabreichung kann auch durch alle anderen wirksamen Verfahren erfolgen.
Zur oralen Verabreichung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen z.B. die Form von Tabletten oder Kapseln einnehmen, die nach einem herkömmlichen Verfahren mit pharmazeutisch verträglichen Exzipienten, wie Bindemittel (z.B. vorgelierte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon, Hydroxypropylmethylcellulose); Füllstoffe (z.B. Lactose, mikrokristalline Cellulose oder Calciumhydrogenphosphat); Gleitmittel (z.B. Magnesiumstearat, Talk oder Kieselsäure); Zerfallshilfen (z.B. Kartoffelstärke oder Natriumstärkeglycollat); oder Netzmit tel (z.B. Natriumlaurylsulfat), hergestellt werden. Die Tabletten können durch aus der Technik gut bekannte Verfahren überzogen werden.
Flüssigpräparate zum oralen Verabreichung können die Form von beispielsweise Lösungen, Sirupen oder Suspensionen einnehmen, oder sie können als Trockenprodukt zur Aufbreitung in Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel dargereicht werden. Solche Flüssigpräparate können durch herkömmliche Verfahren mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen, wie Suspendiermittel (z.B. Sorbitsirup, Cellulosederivate oder gehärtete Speisefette); Emulgatoren (z.B. Lecithin oder Akaziengummi); nichtwässrige Vehikel (Mandelöl, Ölester, Ethylalkohnl oder fraktionierte Pflanzenöle); und Konservierungsstoffe (z.B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure) hergestellt werden. Gegebenenfalls können die Präparate auch Puffersalze, Aromastoffe, Farb- und Süßungsmittel enthalten. Die Präparate zum oralen Verabreichung können formuliert sein, um eine entsprechende kontrollierte Freisetzung der aktiven Verbindung zu ergeben. Zur bukkalen Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Lutschpastillen einnehmen, die auf herkömmliche Weise formuliert werden.
Die erfindungsgemäßen Verabreichungsverfahren können die parenterale Verabreichung durch Injektion, wie z.B. durch Bolusinjektion oder Dauertropfinfusion, umfassen. Formulierungen zur Injektion können in Dosierungseinheitsform dargereicht werden, z.B. in Ampullen oder in Mehrfachdosisbehältern, mit oder ohne Zusatz eines Konservierungsmittels. Eine injizierbare Formulierung kommt insbesondere zur Verwendung bei der Abgabe eines therapeutischen Mittels über die Blut-Hirn-Schranke an das Zentralnervensystem in Betracht.
Die bei den Verfahren eingesetzten Zusammensetzungen können solche Formen, wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln, einnehmen und können Formulierungshilfen, wie Suspendier-, Stabilisierungs-, und/oder Dispergiermittel, enthalten. Alternativ kann der Wirkstoff in Pulverform zur Aufbereitung vor Gebrauch mit einem geeigneten Vehikel, z. B. steriles pyrogenfreies Wasser, vorliegen. Die Verbindungen können auch zu Rektalzusammensetzungen formuliert werden, wie Suppositorien oder Bleibeklistiere, die z. B. die herkömmlichen Suppositoriengrundlagen, wie Kakaobutter oder andere Glyceride, enthalten. Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als Präparate zur Implantation oder Injektion formuliert werden. Somit können die Verbindungen beispielsweise mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Mate rialien (z.B. als Emulsion in einem verträglichen Öl) oder Ionenaustauscherharzen, oder als wenig lösliche Derivate, z.B. als ein wenig lösliches Salz, formuliert werden.
Laborbeispiele
Die folgenden Laborbeispiele wurden zur Erläuterung der bevorzugten Ausführungsweisen der Erfindung eingeschlossen. Bestimmte Aspekte der folgenden Laborbeispiele werden im Hinblick auf Techniken und Verfahren beschrieben, die von den vorliegenden Erfindern als bei der Durchführung der Erfindung gut arbeitend festgestellt oder erachtet wurden. Diese Laborbeispiele werden durch die Verwendung der Standard-Laborpraktiken der Erfinder erläutert. Angesichts der vorliegenden Offenbarung und des allgemeinen technischen Wissensstandes wird den Fachleuten klar, dass die folgenden Laborbeispiele nur beispielhaft sein sollen.
Materialien und Methoden für die Laborbeispiele
Reagentien
Der MDCK-Epithelzelllinienstamm II wurde von der American Type Culture Collection über das Lineberger Comprehensive Cancer Center (University of North Carolina (UNC) at Chapel Hill, Chapel Hill, Nordkarolina, USA) erhalten. N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES) wurde vom Lineberger Comprehensive Cancer Center (UNC at Chapel Hill) erhalten. Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) wurde von der Firma Mediatech in Hernford, Virginia, USA, erhalten. Die Zellkultur-Reagentien wurden von der Firma Gibco BRL in Grand Island, New York, USA, erhalten. Die TRANSWELL^TM-Multiwellplatten und Einsätze (12 Vertiefungen/Platte, 3 μm Porengröße und 1,0 cm² Fläche, Polycarbonat) wurden von der Firma Costar in Cambridge, Massachusett, USA, erhalten. [¹⁴C]-Mannit und [³H]-Myoinosit wurden von der Firma American Radiolabeled Chemicals in St. Louis, Missouri, USA, erhalten. Dodecylphosphocholin wurde von der Firma Avanti Polar Lipids in Alabaster, Alabama, USA, bezogen. AG1-X8-Formatsäulen wurden von der Firma Bio-Rad Laboratories in Hercules, Kalifornien, USA, erhalten. Alle anderen Verbindungen und Reagentien wurden von der Firma Sigma Chemical Company in St. Louis, Missouri, USA, erhalten.
Zellkultur
Für die Transportstudien wurden MDCK-Zellen, die aus normalen proximalen Nierenepithelzellen eines Cockerspanielrüden, der ein Modell für Transportexperimente ist, stammten (Cho, M.J., et al. (1989) Pharm. Res. 6:71-77) auf TRANSWELL^TM Multi-Well-Platten kultiviert. Jede Vertiefung wurde mit 200000 Zellen beimpft. Die Zellen wurden dann in Zellmedien (MEM mit 1 % Antibiotikum, angereichert mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1% NEAA) kultiviert und bei 37 °C und 5 % CO₂ gehalten. Die konfluenten Zellen wurden vier Tage kultiviert, wobei sie sich, wie durch die Entwicklung eines stabilen TEER angezeigt, zu Epithelzellen-Monolayern differenzierten.
Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER)
Der TEER (angegeben in Ω·cm²) dient als Maß der funktionellen Integrität von Tight Junctions. Der TEER wurde mit einem Epithel-Voltohmmeter EVOM (World Precision Instruments, Sarasota in Florida, USA) und einer Endohm-l2 Elektrode (World Precision Instruments, Sarasota in Florida, USA) gemessen. Die TEER-Werte der MDCK-Zellen, die einen funktionellen Monolayer bildeten, lagen zwischen 150–250 Ω·cm².
Mannit alsparazellulärer Marker
Mannit, eine hydrophile Verbindung, kann die Epithelmembran nur schwer passieren und muss das Epithel auf dem parazellulären Weg überqueren. Daher ist der Mannitfluss durch das Epithel eine Wiedergabe der Permeabilität des parazellulären Weges. Der Nachweis von Mannit erfolgt durch radioaktive [³H]- oder [¹⁴C]-Markierung.
Bestimmung der Wirkung von Alkylphosphocholinen auf den TEER
Die Experimente wurden durch die Zugabe von 0,5 ml HBSS, angereichert mit 10 mM HEPES (pH 7,4; Transportpuffer), enthaltend Verbindung oder Vehikel, zur apikalen Seite der TRANSWELL^TM Multiwellplatte gestartet. Die Zellmonolayer wurden bei 37 °C inkubiert, und die TEER-Werte nach 30 Minuten gemessen. Die Ergebnisse aus jedem Experiment wurden auf die Reaktion des Vehikels normalisiert und als Mittelwerte ± SD von drei dreimal durchgeführten Experimenten angegeben.
Die Wirkung von Alkylphosphocholinen auf TEER wurde für mehrere Konzentrationen bewertet, und die Konzentration, die zu einer 50%igen Abnahme des TEER gegenüber der unbehandelten Kontrolle führte, wurde als EC₅₀ definiert (Liu, D.Z., et al. (1999) J. Pharm. Sci. 88:1161-1168; Liu, D.Z., et al. (1999) J. Pharm. Sci. 88:1169-1174).
Bestimmung der Wirkung von Alkylphosphocholinen auf den Mannittransport
Die Integrität der Tight Junctions von Zellmonolayern wurde durch Messen des TEER vor dem Experiment dokumentiert. Die Transportexperimente wurden gestartet, indem die apikalen Medien durch 0,5 ml Transportpuffer, enthaltend Verbindung oder Vehikel und [¹⁴C]-Mannit, ersetzt wurden. Die Konzentration von [¹⁴C]-Mannit betrug 25 μM (55 mCi/mmol). Die Transportgeschwindigkeiten wurden durch Messung der während der zwei 30-minütigen Intervalle auf der basolateralen Seite akkumulierten Menge von [¹⁴C]-Mannit aufgezeichnet. Die transportierte Menge von radioaktiv markiertem [¹⁴C]-Mannit wurde durch Flüssigkeitszintillationszählung in einem Packard-Tri Carb-Spektralphotometer, Serie 4000, das von der Firma, Packard Instrument Company of Meriden, Connecticut verfügbar war, bestimmt. Alle Transportexperimente wurden unter Sinkbedingungen durchgeführt (die Transportexperimente waren so ausgelegt, dass zu jeder gegebenen Zeit weniger als 10 % der Gesamtmenge an [¹⁴C]-Mannit auf der basolateralen Seite vorhanden waren). Die Wirkung der Alkylphosphocholine auf den Transport von [¹⁴C]-Mannit wurde auf den Transport von [¹⁴C]-Mannit in den Vehikel-behandelten Zellen normalisiert und als Mittelwert ± SD von drei dreimal durchführten Experimenten angegeben. Die EC_10x wurde durch die Konzentration an Verbindung bestimmt, die gegenüber der Vehikel-behandelten Kontrolle zu einer 10-fachen Zunahme des Mannitflusses führt.
Bestimmung der PLC-Aktivität durch Zell-Assay
Die PLC-Aktivität in den MDCK-Zellen wurde durch eine Anpassung eines veröffentlichten Verfahrens (Schachter, J.B., et al. (1997) Neuropharm. 36:1181-1187) bestimmt. Die MDCK-Zellen wurden beimpft, und zwar 400000 Zellen/Vertiefung auf einer 12-Loch Multi-Well-Platte, und anschließend für vier Tage kultiviert. Die MDCK-Zellmonolayer wurden dann für 24 h bei 37 °C mit [³H]-Myoinosit markiert (1,6 μCi/Vertiefung in 0,4 ml inositfreiem Medium). Die Untersuchungen wurden begonnen, indem die aus dem Inkubator entnommene markierten Zellen sofort mit 100 μl 250 mM HEPES (pH 7,3), der 100 mM LiCl mit oder ohne Verbindung enthielt, angereichert wurden. Anschließend wurden die Zellen für 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Nach Abschluss der Inkubation wurde sofort ATP (Endkonzentration: 100 μM) oder EGF (20 ng/ml) zugesetzt.
Die Zellen wurden dann 15 Minuten bei 37 °C inkubiert, um eine Akkumulation von [³H]-Inositphosphaten zu ermöglichen. Die Inkubationen wurden durch das Absaugen der Medien und Zugabe von 1 ml siedender 10 mM EDTA (pH 8,0) beendet. Der Überstand wurde zur chromatographischen Isolierung der [³H]-Inositphosphate auf AGI-X8-Formiatharz-Säulen aufgegeben (Berridge, M.J., et at. (1983) Biochem. J. 212:473-482). Die Menge der [³H]-Inositphosphate wurde mit Hilfe einer Flüssigkeitsszintillationszählung in einem Spektralphotometer (Packard Tri Carb 4000) gemessen. Die Messwerte aus jedem Experiment wurden auf die Reaktion normalisiert, die mit 100 μM ATP oder 20 ng/ml EGF beobachtet wurde, und wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung von drei dreimal durchgeführten Experimenten angegeben. Die IC₅₀(PLC) wurde durch die Konzentration der Verbindung bestimmt, die zu einer 50%igen Abnahme der ATP- oder EGF-stimulierten Akkumulation von [³H]-Inositphosphaten führt.
Synthese von Alkylphosphocholinen mit unterschiedlicher Alkylkettenlännge
Die Alkylphosphocholine wurden durch Phosphorylierung von Alkohol mit 2-Bromoethyldichlorphosphat (Hirt, R., and Berchtold, R. (1958) Pharma. Acta. Helv. 33:349-356), und anschließende Substitution von Brom durch Trimethylamin (Hanson, W.J., et al. (1982) Lipids 17:453-459; Surles, J.R., et al. (1993) Lipids 28:55-57) synthetisiert.
Datenauswertung
Der t-Test nach Student für ungepaarte Daten wurde zur Bestimmung signifikanter Unterschiede (p < 0,05) zwischen dem Mittelwert ± SD von unbehandelten und behandelten MDCK-Zellmonolayern verwendet. Die Beziehung zwischen PLC-Aktivität und Zunahme der parazellulären Permeabilität wurde durch lineare Regressionsanalyse untersucht und die Korrelation durch den Pearson'schen Korrelationskoeffizienten ausgedrückt.
Laborbeispiel 1
Wirkung von Alkylphosphocholinen auf den TEER über MDCK-Zellen
Die Wirkung von Alkylphosphocholinen auf den TEER wurde durch eine 10- und eine 30-minütige Behandlung der MDCK-Zellmonolayer evaluiert. Nach 10 Minuten reduzierten die meisten Verbindungen (bei nichttoxischen Konzentrationen) der Alkylphosphocholinreihe den TEER nicht signifikant (p > 0,05). Nach 30 Minuten verminderten alle Alkylphosphocholine den TEER in einer konzentrationsabhängigen Weise (3, zum Zwecke der Übersicht lichkeit sind nur die C12- und C16-Verbindungen dieser Reihe gezeigt). Zum Beispiel ist die Wirkung von 30 μM C 16 auf den TEER um 10 Minuten verzögert, TEER sinkt dann innerhalb von zwei Stunden kontinuierlich auf weniger als 10 % der Kontrollwerte ab (Einfügung in 3). Zur Vermeidung von potentiellen unspezifischen Wirkungen durch Langzeitbehandlungen mit Alkylphosphocholinen wurde die kürzeste Behandlungszeit (d.h. die 30-minütige Behandlung), die zu einer signifikanten Zunahme der parazellulären Permeabilität führte, für weitere Experimente ausgewählt.
Alle Alkylphosphocholine dieser Reihe verminderten den TEER in einer konzentrationsabhängigen Weise, derart, dass bei maximalen Konzentrationen alle Alkylphosphocholine den TEER auf weniger als 20 % der Kontrollwerte reduzierten (3). Die Wirksamkeit von Alkylphosphocholinen, die der Konzentration von Alkylphosphocholinen entsprach, die den TEER um 50 % (EC₅₀) reduzierte, variierte deutlich (Tabelle 2). Interessanterweise riefen kleine Variationen in der Alkylkette signifikante Änderungen (p < 0,05) der EC₅₀ dieser Verbindungen hervor. C16 und C12 unterscheiden sich beispielsweise durch vier Methylengruppen in ihrer Alkylkette, allerdings unterscheiden sich ihre jeweiligen EC₅₀-Werte etwa um das 25-Fache. Um zu bestätigen, dass Alkylphosphocholine die parazelluläre Permeabilität durch MDCK-Zellmonolayer erhöhen, wurde anschließend die Fähigkeit der Alkylphosphocholine zur Erhöhung des Mannitflusses bestimmt.
Laborbeispiel 2
Wirkung von Alkylphosphocholinen auf den Mannitfluss durch MDCK-Zellen
Der Einfluss von Alkylphosphocholinen auf den Mannitfluss durch MDCK-Zellmolayer wurde auch in Abhängigkeit der Zeit dokumentiert. Eine Behandlung dieser Verbindungen für weniger als 30 Minuten erhöhte den Mannitfluss durch MDCK-Zellmonolayer nicht signifikant (p < 0,05). Dieses Ergebnis entspricht dem bevorzugten Schritt einer Behandlung mit Alkylphosphocholinen für eine vorgegebene Zeit (z.B. 30-min-Behandlung), bevor sich der TEER über MDCK-Zellmonolayer signifikant verringert (p < 0,05). Daher wurde die Messung des Mannitflusses unmittelbar nach einer 30-minütigen Alkylphosphocholin-Behandlung gestartet und unmittelbar vor einer 60-minütigen Alkylphosphocholin-Behandlung beendet (d.h. die Messung umfasste einen Zeitraum zwischen 30 und 60 Minuten).
Die Alkylphosphocholine erhöhten den Mannitfluss in einer konzentrationsabhängigen Weise (4, zum Zwecke der Übersichtlichkeit sind nur die C12- und C16-Verbindungen dieser Reihe gezeigt). Die maximale Wirkung dieser Verbindungen auf die Mannit-Permeabilität konnte nicht erhalten werden, da Alkylphosphocholine bei hohen Konzentrationen keine sättigungsfähige Reaktion hervorriefen. Deshalb wurde die Fähigkeit dieser Verbindungen, die parazelluläre Permeabilität zu erhöhen, mit der Konzentration einer Verbindung, die zu einer 10-fachen Erhöhung (EC_10x) des Mannitflusses führte, verglichen (Liu, D.Z., et al. (1999) J. Pharm. Sci. 88:1161-1 168; Liu, D.Z., et al. (1999) J. Pharm. Sci. 88:1169-1174).
Der gegenüber dem Kontrollwert 10-fach erhöhte Mannittluss entspricht 50 % des mit EDTA erhaltenen maximalen Mannitflusses (Liu, D.Z., et al. (1999) J. Pharm. Sci. 88: 1169-1174). Die EC_10x der Alkylphosphocholine ist in Tabelle 2 zusammengefasst. Die EC_10x dieser Verbindungen entspricht gut den für Alkylphosphocholine erzielten EC_10x-Werten.
Laborbeispiel 3
Wirkung von Alkylphosphocholinen auf die PLC-Aktivität in MDCK-Zellen
Zur Bestimmung der Fähigkeit der Alkylphosphocholine, die PLC-Aktivität zu hemmen, wurde die Fähigkeit dieser Verbindungen bestimmt, die ATP-vermittelten Zunahmen der Spiegel von Inositphosphaten zu hemmen. Die Abstände zwischen den Zählungen aus den basalen und ATP-stimulierten Spiegeln von [³H]-Inositphosphaten aus MDCK-Zellmonolayern waren jedoch für eine zuverlässige Bestimmung der Fähigkeit von Alkylphosphocholinen, die PLC-Aktivität zu hemmen, sehr gering (ungefähr 1,5-fach). Zur Erhöhung dieses Abstandes wurden MDCK-Zellen eingesetzt, die mit einem Plasmid transfiziert waren, das den P2Y₂-Rezeptor kodierte. Der P2Y₂-Rezeptor ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, der die PLC aktiviert (Pawelczyk, T., and Lowenstein, J.M. (1993) Biochem. Pharm. 45:493-497). Der Abstand zwischen den Zählungen aus den basalen und ATP-stimulierten Spiegeln von [³H]-Inositphosphaten aus MDCK-Monolayern, die P2Y₂-Rezeptoren exprimieren, nahm um etwa eine dreifache Differenz zu (die Zählungen aus den basalen und ATP-stimulierten Spiegeln von [³H]-Inositphosphaten reichten von 200 bis 400 bzw. 700 bis 1200 cmp).
Um zu bestimmen, ob eine PLC-Hemmung mit der Fähigkeit der Alkylphosphocholine, die parazelluläre Permeabilität in MDCK-Zellen zu erhöhen, einhergeht, wurde auch die Fähigkeit von Alkylphosphocholinen gemessen, eine ATP-stimulierte Zunahme der Inositphosphatproduktion zu reduzieren (5, zum Zwecke der Übersichtlichkeit sind nur die C12- und C6-Verbindungen dieser Reihe gezeigt). Die Wirksamkeit von Alkylphosphocholinen, die der Konzentration von Alkylphosphocholinen entsprach, die die PLC-Aktivität um 50 % hemmte (ICs₅₀(PLC)), variierte (Tabelle 2). Das volle Ausmaß der PLC-Hemmung von diesen Verbindungen variierte ebenfalls. Beispielsweise ist C10, der am wenigsten wirksame Verstärker der parazellulären Permeabilität in dieser Reihe, nicht in Tabelle 2 angeführt, da C10 die ATP-stimulierte Erhöhung der Inositphosphatproduktion nicht um 50 % reduzieren konnte. Außerdem betrug das volle Ausmaß der PLC-Hemmung aus der Behandlung mit C12 50 %. Dieses Ergebnis ist nicht überraschend, da C10 und C12 die am wenigsten wirksamen Verstärker der parazellulären Permeabilität in dieser Reihe sind.
Ebenfalls wurde bestimmt, ob die Fähigkeit von Alkylphosphocholinen, die parazelluläre Permeabilität zu erhöhen (d.h. EC_50x und EC₅₀), mit ihrer Fähigkeit, PLC zu hemmen (d.h. ECs₅₀(PLC)), korrelierte. Im Allgemeinen waren Alkylphusphocholine, die weniger wirksame Verstärker der parazellulären Permeabilität waren, auch weniger unwirksame Inhibitoren der PLC (Tabelle 2). Diese Feststellung wurde durch die Bestimmung einer signifikant (p < 0,001) positiven Korrelation zwischen EC_10x und IC₅₀(PLC) (6A) und zwischen EC₅₀ und IC₅₀(PLC) (6B) bestätigt. Die Messpunkte beider Korrelationen variierten nicht auffallend (r > 0,94 für beide Korrelationen). Darum weisen diese Korrelationen darauf hin, dass die Fähigkeit von Alkylphosphocholinen, die parazelluläre Permeabilität zu erhöhen, mit der Fähigkeit dieser Verbindungen, die PLC-Aktivität zu hemmen, zusammenhängt.
Mit abnehmender Wirksamkeit der Alkylphosphocholine wird der Abstand zwischen ihrer Wirksamkeit hinsichtlich der parazellulären Permeabilitätserhöhung (d.h. EC₅₀ und EC_10x) und hinsichtlich der PLC Hemmung (d.h. IC₅₀(PLC)) größer (Tabelle 2). Beispielsweise unterscheiden sich die IC₅₀(PLC) und die EC_10x für C16, den wirksamsten Verstärker in der Alkylphosphncholinreihe, marginal, wohingegen sich die IC₅₀(PLC) und die EC_50x für C12, einen der am wenigsten wirksamen Verstärker in der Alkylphosphocholinreihe, deutlich unterscheiden (Tabelle 2). Diese Beziehung wird auch in den Korrelationen zwischen IC₅₀(PLC) und EC_10x, und IC₅₀(PLC) und EC₅₀ erläutert, wobei diese Korrelationen auf einer loglog-Skala linear sind. Darum weisen diese Korrelationen darauf hin, dass die Fähigkeit der weniger wirksamen Verstärker, die parazelluläre Permeabilität zu erhöhen, weniger von der Fähigkeit des Verstärkers, die PLC zu hemmen, und mehr von anderen unspezifischen Effekten (d.h. lytische Effekte auf die Zellmembran und verringerte Lebensfähigkeit der Zelle) abhängig wird.
Referenzlaborbeispiel 4
Wirkung von strukturell nicht verwandten PLC-Inhibitoren auf die parazelluläre Permeabilität durch MDCK-Zellen
Zur weiteren Ermittlung, ob eine erhöhte parazelluläre Permeabilität das Ergebnis einer PLC-Hemmung ist, wurde die Fähigkeit selektiver PLC-Inhibitoren (z.B. U-73,122 und 3-Nitrocumarin) (siehe bezüglich der Strukturen 7A, bzw. 7B), die parazelluläre Permeabilität zu erhöhen, bestimmt. Die Fähigkeit dieser selektiven PLC-Inhibitoren, die parazelluläre Permeabilität zu erhöhen, ist bislang noch nie gezeigt worden. Ebenfalls bestimmt wurde, ob U-73,122 und 3-Nitrocumarin mit der Fähigkeit von Alkylphosphocholinen, PLC zu hemmen und die parazelluläre Permeabilität in MDCK-Zellmonolayern zu erhöhen, signifikant (p < 0,05) korrelieren würde.
Um sicherzustellen, dass die Erhöhung der parazelluläre Permeabilität von einer PLC-Hemmung abhängt, wurde die Fähigkeit des selektiven PLC-Inhibitors U-73,122 (Bleasdale, J.E., et al. (1989) Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukot. Res. 19:590-593), den TEER zu reduzieren und den Mannitfluss zu erhöhen, bestimmt. U-73,122 reduziert den TEER und erhöhte den Mannitfluss über MDCK-Monolayer sehr wirksam (3, 4 und Tab. 2). Andererseits reduzierte die negative Kontrollverbindung U-73,343 weder den TEER noch die ATP-stimulierte PLC-Aktivität (7A). Dieser Unterschied in der Aktivität zwischen diesen beiden Verbindungen ist bemerkenswert, wenn man bedenkt, dass sie sich in der Struktur um eine Doppelbindung unterscheiden (2B). Nach Kenntnis der vorliegenden Miterfinder ist U-73,122 einer der wirksamsten Verstärker der parazellulären Permeabilität. Ferner wurde auch die Fähigkeit eines weiteren, strukturell nicht verwandten PLC-Inhibitors, 3-Nitrocumarin, die parazelluläre Permeabilität zu erhöhen, nachgewiesen. Er ist etwa so wirksam wie C16-Alkylphosphocholin im Hinblick auf die Hemmung von PLC (IC₅₀(PLC)) und die Erhöhung der parazellulären Permeabilität (EC₅₀ und EC_10x) (Tab. 2). Dieses Ergebnis bestätigt, dass die PLC-Hemmung mit der Erhöhung der parazellulären Permabilität in MDCK-Zellen zusammenhängt.
Schließlich wurde bestimmt, ob die Fähigkeit von U-73,122 und 3-Nitrocumarin, die parazelluläre Permeabilität zu erhöhen und PLC zu hemmen, mit der Fähigkeit von Alkylphosphucholinen, diese Parameter zu verändern, korrelieren würde. Bereits früher veröffentlichte Konzentrationen von U-73,122 (Lockhart, L.K., and McNicol, A.J. (1999) Pharm. Exp. Ther. 289:721-728) hemmten die PLC-Aktivität in MDCK-Zellen um 50 % (5 und Tab. 2). Die EC₅₀- und EC_10x- und die IC₅₀(PLC)-Werte für U-73,122 und 3-Nitrocumarin korrelierten signifikant (p < 0,05) mit den Werten für Alkylphosphocholine (6A und 6B). Dieser Beweis entwickelt die Beteiligung von PLC an der Regulierung der parazellulären Permeabilität. Tabelle 2 Zusammenfassung der Werte für EC₅₀, EC_10x, und IC₅₀(PLC) für Alkylphosphocholine, 3-Nitrocumarin und U-73,122 in MDCK-Zellen*

* Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD von drei dreimal durchgeführten Experimenten dargestellt.

Laborbeispiel 5
Isoenzymfamilien-selektive Hemmung von PLC-β durch U-73,122 und HPC
Es wurde bereits beschrieben, dass U-73,122 selektive die PLC-β-Isoenzymfamilie hemmt (Thompson et al. 1991). Auch die vorliegende Offenbarung zeigt, dass HPC deshalb ein Inhibitor von PLC-β ist, da HPC ein sehr wirksamer Inhibitor der ATP-stimulierten PLC-β-Aktivität ist (5). Daher wurde in diesem Laborbeispiel die Selektivität von HPC und U-73,122 für PLC-β gegenüber einem anderen PLC-Isoenzym, PLC-γ, bestimmt. U-73,122 und HPC hemmten die ATP-stimulierte PLC-β-Aktivität; sie hatten jedoch keine Wirkung auf die EGF-stimulierte PLC-γ-Aktivität (8). Wie zuvor beschrieben, sind diese Verbindungen sehr wirksame Verstärker der Tight Junction-Permeabiliät über MDCK-Zellmonolayer. Daher geht eine Hemmung von PLC-β mit der Zunahme der Tight Junction-Permeabiliät über MDCK-Zellmonolayer einher.
Laborbeispiel 6
Die Isoenzymfamilien-selektive Hemmung von PLC-γ ist mit einer erhöhten Tight Junction-Permeabilität verbunden
In diesem Beispiel wurde festgestellt, dass ein bekannter Inhibitor von PLC-γ, 3-Nitrocumarin (3-NC (Perrella et al., Journal of Medicinal Chemistry (1994) 37 (14):2232-2237), ein selektiver Inhibitor von PLC-γ ohne inhibitorische Aktivität gegenüber PLC-β in den MDCK-Zellmonolayern ist (8). Diese Verbindung erhöhte die Tight Junction-Permeabiliät und hemmte eine EGF-stimulierte PLC-γ-Aktivität (7B), was nahe legt, dass eine Hemmung von PLC-γ auch mit einer erhöhten Tight Junction-Permeabiliät einhergeht. Das strukturell ähnliche Analoge zu 3-NC, 7-Hydroxy-3-nitrocumarin (OH-3-NC) (7B), von dem bereits berichtet wurde, dass es die PLC nicht hemmt (Perrella et al., Journal of Medicinal Chemistry (1994) 37 (14):2232-2237), erhöhte auch bei einer Konzentration von 500 μM die Tight Junction-Permeabiliät nicht (7B), was nahe legt, dass die Fähigkeit von 3-NC, die Tight Junction-Permeabiliät zu erhöhen, durch Hemmung von PLC-γ erfolgt.
Der Beweis für die Beteiligung des PLC-abhängigen Weges an der Regulation der parazellulären Permeabilität verdichtet sich. Die Offenbarung der vorliegenden Erfindung ist jedoch die erste, die eine direkte Verbindung zwischen einer PLC-Hemmung und der parazellulären Permeabilität entwickelte. Ferner wurde einer der wirksamsten Verstärker der parazellulären Permeabilität (d.h. U-73,122) identifiziert. Somit stellt die vorliegende Erfindung eine Aufklärung des Mechanismus hinter der Fähigkeit von Mitteln, die parazelluläre Permeabilität zu erhöhen, bereit und hat neue Einsichten in die Regulation der Tight Junctions geschaffen.
Literaturhinweise
Die nachstehend sowie die in der Beschreibung zitierten Druckschriften sind hier so weit durch Bezugnahme eingeschlossen, als sie die Methodenlehre, die Techniken und/oder die hier eingesetzten Zusammensetzungen ergänzen, erklären und einen Hintergrund liefern.

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PCT-Veröffentlichung Wo 93/25521

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend einen Phospholipase-C-Inhibitor in einer Phospholipase-C inhibierenden Menge und einen pharmazeutisch verträglichen Träger in einer wirksamen Menge zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der parazellulären Permeabilität an einem Absorptionsort in einem Individuum, wobei der Phopholipase-C-Inhibitor ausgewählt wird aus einem Alkylphosphocholin mit einem geradkettigen Alkyl mit 14-20 Kohlenstoffen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Absorptionsort intestinales Epithel oder die Blut-Hirn-Schranke umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Phospholipase-C-Inhibitor zur oralen, bukkalen, rektalen oder transdermalen Verabreichung formuliert wird, oder in eine Form gebracht wird, die geeignet ist, das Colonepithel zu kontaktieren, oder in eine Form gebracht wird, die geeignet ist zur Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation.
Verwendung einer Zusammensetzung mit a) einem therapeutischen Mittel, das leicht in Wasser löslich ist und dass die Lipid-Doppelschicht einer Zellmembran in einem Individuumn schwer durchdringen kann; b) einen Phospholipase-C-Inhibitor in einer Phospholipase-C inhibierenden Menge, und c) einen pharmazeutisch verträglichen Träger in einer wirksamen Menge zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Absorbtion des hydrophilen Wirkstoffs durch Erhöhung der parazellulären Permeabilität an einer Absorbtionsstelle in einem Individuum durch Verabreichung des Phospholipase-C-Inhibitors an das Individuum zur einem Zeitpunkt vor oder in Verbindung mit der Verabreichung des hydrophilen Wirkstoffs an das Individuum, wobei der Phospholipase-C-Inhibitor ausgewählt wird aus einem Alkylphosphocholin mit einem geradkettigen Alkyl von 14-24 Kohlenstoffen.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Absorptionsort intestinales Epithel umfasst, oder wobei der Absorptionsort die Blut-Hirn-Schranke umfasst.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Phospholipase-C-Inhibitor zur oralen, bukkalen, rektalen oder transdermalen Verabreichung formuliert wird, oder in eine Form gebracht wird, die geeignet ist, das Colonepithel zu kontaktieren, oder in eine Form gebracht wird, die geeignet ist zur Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation.
Zusammensetzung, umfassend: a) ein therapeutisches Mittel, das leicht in Wasser löslich ist und dass die Lipid-Doppelschicht einer Zellmembran in einem Individuum schwer durchdringen kann; b) einen Phospholipase-C-Inhibitor in einer Phospholipase-C inhibierenden Menge, und c) einen pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei der Phospholipase-C-Inhibitor ausgewählt wird aus einem Alkylphosphocholin mit einem geradkettigen Alkyl von 14-20 Kohlenstoffen.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, welche die orale Verfügbarkeit eines Therapeutikums für ein Individuum, welches es benötigt, verbessert, wobei das Therapeutikum leicht in Wasser löslich ist und es für das Therapeutikum schwierig ist, die Lipid-Doppelschicht einer Zellmembran in dem Individuum zu überwinden, wobei das Verfahren umfasst: a) Bereitstellen des Therapeutikums; b) Bereitstellen eines Phospholipase-C-Inhibitors; und c) Vermischen des hydrophilen Wirkstoffs und einer den Phospholilpase-C-Inhibitor inhibierenden Menge an Phospholipase-C mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei der Phospholipase-C-Inhibitor ausgewählt wird aus einem Alkylphosphocholin mit einem geradkettigen Alkyl von 14-20 Kohlenstoffen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Zusammensetzung zur oralen, bukkalen, rektalen oder transdermalen Verabreichung formuliert wird, oder in einer Form vorliegt, die geeignet ist, das Colonepithel zu kontaktieren, oder in einer Form vorliegt, die geeignet ist zur Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation.