JP2004532795A - 上皮および内皮バリアの傍細胞性浸透を促進するための組成物および方法 - Google Patents
上皮および内皮バリアの傍細胞性浸透を促進するための組成物および方法 Download PDFInfo
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Abstract
【選択図】図1
Description
関連出願の相互参照
本願は、2001年10月10日出願の米国仮出願番号60/239,328に基づき、その優先権を主張する(当該文献は引用によりすべて本明細書に含める)。
【0002】
技術分野
本発明は、治療薬の生体利用性(bioavailability)および脳への浸透(brain penetration)を促進するための組成物および方法に関する。より特に、本発明は、特定の浸透を促進し、それにより対象中の治療薬の生体利用性を促進する組成物および方法に関係する。
【0003】
略語の表
【表1】
【0004】
背景技術
効能および選択性に加え、経口生体利用性がある薬物の発見および開発が、医薬産業での重要な挑戦を提起している。細胞膜の脂質二重層中に容易に分配し得る化合物は、一般的に容易に吸収される(経細胞経路)。対照的に、親水性化合物は、実質的に細胞膜を通過できない。細胞間経路(傍細胞経路)を介する上皮の通過もまた、緊密接合として知られる細胞間接合の存在により厳密に制限される。そのため、腸管上皮は、経口投与される親水性治療薬の吸収に対する有意なバリアを保有する。
【0005】
緊密接合は、膜貫通および細胞質性タンパク質の両方からなる高度に特殊化(specialized)されたマルチプロテイン複合体である(Denkar, B. M. and Nigam, S. K. (1998) AM. J. Physiol. 274: F1−F9; Fanning, A. S., et al., J. Soc. Nephrol. 10: 1337−1345 (1999))。緊密接合の開口は、複合体細胞内シグナリング機構により制御されているように思われる(Anderson, J. M., et al., J. Cell Biol. 106: 1141−1149(1998); Sakakibara, A., et al., J. Cell. Biol. 137: 1393−1401 (1997))。多くのシグナリング経路は、傍細胞性浸透の調節に含まれる(例えば、チロシンキナーゼ、カルシウム、プロテインキナーゼC(PKC))(Anderson, J. M., and Van Italle, C. M., Am. J. Phys. 269: G467−475 (1995); Collares−Buzato, C. B., et al., Eur. J. Cell Biol. 76: 85−92 (1998); Mullin, J. M. et al., Am. J. Physiol. 275: C544−C554 (1998); Tai, Y. H., et al., J. Membr. Biol. 149: 71−79 (1996))。しかし、この調節に付随する分子機構は、完全に解明されたわけではない。
【0006】
今日までに、幾つかの吸収エンハンサーが同定されており、それは緊密接合の調節により腸管上皮を通過する薬物候補(drug candidate)の吸収を改善するものである。しかし、殆どのこれらの薬剤は、緊密接合の作用の為、効能および選択性が消失し、その為、インビボ濃度でミリモーラー(mM)を生ずる量を投与しなければならない。その濃度により、細胞毒および望ましくない副作用を生じ得る。加えて、作用の機構は、周知でないか殆ど理解されておらず、しばしば、これらの薬剤は複数の機構を介し作用する。ここで、医薬的許容される吸収エンハンサー(absorption enhancer)は臨床的使用に利用できない。
【0007】
従って、必要なものは、傍細胞性浸透の促進の為の効能および選択性を示す吸収エンハンサーである。更に、緊密接合調節の特性、および緊密接合調節に影響する薬剤の同定は、長年、考えられており、当分野ではずっと追求されてきた。
【0008】
本発明の要約
対象の吸収部位での傍細胞性浸透を促進する方法を開示する。当該方法は、(a)有効量のホスホリパーゼCインヒビターを、促進された傍細胞性浸透が望ましいときに対象に投与すること;および(b)有効量のホスホリパーゼCインヒビターの投与を介する吸収部位での、対象における傍細胞性浸透を促進することを含む。
【0009】
対象における親水性薬物の吸収を促進する方法をも開示する。当該方法は、(a)有効量のホスホリパーゼCインヒビターを対象に、親水性薬物を当該対象に投与する前か当該投与と共に投与し、それにより促進された傍細胞性浸透が当該対象の吸収部位で生じること;および(b)当該対象の吸収部位での親水性薬物の吸収を有効量のホスホリパーゼCインヒビターの投与を介し促進することを含む。
【0010】
組成物および当該同一物の製造方法もまた開示する。当該製剤は、(a)親水性薬物;(b)ホスホリパーゼC阻害物の有効量;および(c)医薬的許容される担体が含まれる。
【0011】
従って、新規組成物および傍細胞性浸透を調節するための方法をを提供することが本発明の目的である。当該目的は、本発明によりその全てまたはその一部が達成される。
【0012】
本発明の目的は上述の通りであり、その他の目的は、最善の記載をした添付図面および実施例と合わせて以下の記載を見れば明らかとなる。
【0013】
図面の簡単な説明
図1は、腸管上皮を通過する輸送の概略図である。分子は、三つの経路により、細胞膜を通過する受動拡散(経細胞経路)により;隣接細胞間の受動拡散(傍細胞経路)により;または担体仲介輸送(担体仲介経路)により、腸管上皮を通過し主に血液中に輸送される。
【0014】
図2Aは、本発明による構造活性関係分析のために製造したアルキルホスホコリンの構造式、式1である。六つのアルキルホスホコリンを合成または獲得し、それらは、アルキル鎖中、10、12、14、16、18、または20のメチレン単位を含み、すなわち、n=9、11、13、15、17または19となる。しかし、図2Aに示すように、nは8、10、12、14、16または18ともなり得る。
【0015】
図2Bは、特定のPLCインヒビターU−73,122、1−[6−[[(17β)−3−メトキシエストラ−1,3,5(10)−トリエン−17−イル]アミノ]ヘキシル]−)1H−ピロール−2,5−ジオン、およびその不活性類似体、U−73,343、1−[6−[[(17β)−3−メトキシエストラ−1,3,5(10)−トリエン−17−イル]アミノ]ヘキシル]−)−2,5−ピロリジンジオンの構造式、式2である。U−73,122は、ボックス内に二重結合を含むが、U−73,343は、二重結合の代わりに一重結合を含む。
【0016】
図3は、MDCK細胞中でTEERにおけるアルキルホスホコリンおよびU−73,122の効果を示したグラフである。化合物は、上端に投与した。TEERは、当該化合物と共に、37℃での30分間のインキュベーション後に測定した。データの点は、平均±SD(n=3)を示す。化合物を示すシンボルは、△:C12、+:C16および×:U−73,122である。当該挿入図は、MDCK単層を通過するTEERにおける30μM C16の処置時間の効果である。
【0017】
図4は、MDCK細胞中のマンニトール流入におけるアルキルホスホコリンおよびU−73,122の効果を示すグラフである。化合物および[14C]−マンニトールを上端に投与した。輸送速度は、化合物またはビヒクルによる30分から60分間隔の処置の間に基底部側(1.5mL)に蓄積する[14C]−マンニトールの量を測定することにより、モニターした。データの点は、平均±SD(n=3)を示す。化合物を示すシンボルは、△:C12、+:C16および×:U−73,122である。
【0018】
図5は、MDCK細胞中のATP−刺激性PLC活性におけるアルキルホスホコリンおよびU−73,122の効果を示すグラフである。MDCK単層は、24時間37℃で、[3H]−ミオ−イノシトールで標識した。次いで、MDCK細胞を30分間37℃で、化合物で処理した。イノシトールホスフェート産物は100μM ATPで15分間刺激した。[3H]−イノシトールホスフェートはクロマトグラフィーで単離した。次いで、[3H]−イノシトールホスフェートの量は、コネチカット州のメリデンにあるPackard Instrument Companyから購入したPackard Tri Carb 4000 Series spectrophotometerで液体シンチレーションカウンティングにより測定した。データの点は、平均±SD(n=3)を示す。化合物を示すシンボルは、△:C12、+:C16および×:U−73,122である。
【0019】
図6Aは、アルキルホスホコリン、3−NC、およびU−73,122のIC50(PLC)とEC10x値の間の相関関係(r=0.98、p<0.05)を示すグラフである。ボックス中に含まれるデータの点は、U−73,122を示し、3−NCのデータの点は、NCと標識する。
【0020】
図6Bは、アルキルホスホコリン、3−NC、およびU−73,122のIC50(PLC)とEC10x値の間の相関関係(r=0.95、p<0.05)を示すグラフである。データの点は、3回の実験での3つの値での平均±SDを示す。ボックス中に含まれるデータの点は、U−73,122を示し、3−NCのデータの点は、NCと標識する。
【0021】
図7Aは、構造式、およびTEER(白)およびATP−刺激性PLC活性(黒)におけるU−73,122およびU−73,343の効果を示す棒グラフである。
【0022】
図7Bは、構造式、およびTEER(白)およびEGF−刺激性PLC活性(黒)における3−ニトロクマリンおよび7−ヒドロキシ−ニトロクマリンの効果を示す棒グラフである。
【0023】
図8は、PLC−β(黒)およびPLC−γ(白)の活性における3−NC、HPCまたはU−73,122の効果を示す棒グラフである。MDCK単層は、24時間37℃で、[3H]−ミオ−イノシトールで標識した。次いで、MDCK細胞を30分間37℃で、3−NC、HPCまたはU−73,122で処理した。イノシトールホスフェート産物を、100μM ATPまたは20ng/ml EGFで15分間刺激し、それぞれPLC−βおよびPLC−γの活性をそれぞれ活性化させた。[3H]−イノシトールホスフェートをクロマトグラフィーで単離した。次いで、[3H]−イノシトールホスフェートの量は、Packard Tri Carb 4000 Series spectrophotometerで液体シンチレーションカウンティングにより測定した。
【0024】
本発明の詳細な説明
本明細書では、従来特性解析されていない機構、すなわち、酵素ホスホリパーゼC(PLC)の生物学的活性の阻害を介する腸管上皮の傍細胞性浸透を調節することにより作用する新規吸収エンハンサーを開示する。ある実施態様では、構造活性関係(SAR)は、傍細胞性浸透を増加し、PLC活性を阻害するアルキルホスホコリンの能力として決定した。Madin Darby canine kidney(MDCK)細胞における傍細胞性浸透を増加し、PLCを阻害するアルキルホスホコリンの能力、輸送実験のインビトロ上皮細胞モデルは、有意に(p<0.05)相関した。傍細胞性浸透の調節におけるPLC阻害の改善を確認する為、選択性PLCインヒビター(例えば、U−73,122および3−ニトロクマリン)(それらの化合物の、緊密接合浸透を調節する能力は、本明細書で示す本発明の開示前では知られてはいなかった)を、実施例で詳細に記載するような傍細胞性浸透を増加する能力として評価した。これらPLCインヒビターは、傍細胞性(緊密接合)浸透の強力なエンハンサーとなることが証明された。更に、傍細胞性浸透を増加し、PLCを阻害するPLCインヒビターの能力は、これらのパラメーターを変えるアルキルホスホコリンの能力と有意に(p<0.05)相関した。
【0025】
これらの結果は、傍細胞性浸透がPLC阻害により増加し得ることを示す。その為、酵素PLC(本明細書では、「ホスホリパーゼCインヒビター」または「PLCインヒビター」という)の生物学的活性のインヒビターは、緊密接合の調節により、傍細胞性浸透を選択的に増加し得る。相応じて、PLCインヒビターは、経口投与する際に腸管上皮を通して殆ど吸収されない親水性薬物の選択的および強力な吸収エンハンサーとして使用し得る。三つのクラスの化合物が、PLC阻害−アルキルホスホコリン、3−ニトロクマリン、およびステロイドのC−17 N−アルキルスクシンイミド誘導体を介し作用する吸収インヒビターとしての使用に好ましい。
【0026】
体循環内にある親水性薬物は、「いわゆる」血液脳関門の存在のため、脳には入ることができない。この関門は、脳に血液を供給する毛管の壁を覆う高度に特殊化した内皮により形成される。当該血液脳関門はまた、緊密接合の存在により特徴付けられる。本発明により、PLCインヒビターはまた、血液脳関門を容易には通過できない親水性化合物の中枢神経系(CNS)の浸透のエンハンサーとしての役割をし得る。
【0027】
A.定義
以下の語句は、当分野でよく認識されている意味を有すると考えられる。しかし、以下の定義は、本発明主題の解釈を容易ならしめるため示したものである。
【0028】
本明細書および特許請求の範囲で使用するとき、「吸収部位」なる語句は、化合物、分子または他の物質が対象の循環系または組織中に吸収される部位をいう。実のところ、吸収部位は、緊密接合が存在する任意の部位を含み得、そして、物質の吸収を促進する緊密接合での傍細胞性浸透を調節することが好ましい。その物質は、薬物化合物および内生的な化合物または分子を含み得る。典型的な吸収部位には、循環系への吸収が生ずる腸管上皮、および脳に血液を供給する毛管の壁にある高度に特殊化した内皮(中枢神経系(CNS)の組織中への吸収が生ずる、いわゆる血液脳関門)が含まれる。
【0029】
本明細書および特許請求の範囲で使用するとき、「傍細胞性浸透」なる語句は、細胞間経路を介する腸管にある上皮組織のような組織を通過する化合物、分子または他の物質の能力をいう。緊密接合は、浸透経路を介し上皮を通過する分子に対する効果的なバリアを供する、高度に特殊化したマルチタンパク質複合体である。当分野で行われている労力にもかかわらず、緊密接合の調節は十分に特性解析されていない。その為、本発明による緊密接合の、ある態様調節の特性解析は、長年、考えられており、当分野ではずっと追求されてきた。
【0030】
「親水性薬物」なる語句は、水に容易に溶解し、そのため、対象の細胞膜の脂質二重層の通過が困難となる薬物をいう。細胞間経路(すなわち、浸透経路)を介する上皮組織を通る化合物の通過もまた、緊密接合の存在により、厳密に制限される。
【0031】
本明細書および特許請求の範囲で使用するとき、「生体利用性(bioavailability)」なる語句は、本明細書で開示のような投与後、例えば、経口、頬、鼻、非経口、直腸または経皮の投与、結腸上皮との接触に適する型の投与、または例えば肺の肺胞上皮に接触させるための吸入(inhalation)または吸引(insufflation)(口または鼻の何れかを通して)に適する型の投与の後、対象の循環系または対象の組織中に吸収される治療剤または治療薬などの、全投与用量に対する薬剤の量をいう。
【0032】
本明細書および特許請求の範囲で使用するとき、「ホスホリパーゼCインヒビター」または「PLCインヒビター」なる語句は同義であり、以下に限らないが、現在同定されているPLC、PLC−β(ベータ)およびPLC−γ(ガンマ)のイソ型および以下で同定した現在知られていないPLCイソ型を含むPLC酵素の阻害において活性を有する任意の物質、分子または化合物をいう。作用の任意の特定理論により結合することは、出願人の意図するところではないが、PLCインヒビターがPLCの直接阻害によるかまたはシグナリング経路に結合するG−プロテインの破壊を介するようなPLCの間接阻害により作用し得ることを考えている。幾つかの典型的なPLCインヒビターを本明細書で開示する。
【0033】
長年にわたる特許法の慣例に従い、単数形の語句は、特許請求の範囲を含む本出願中で使用するとき、「1つまたはそれより多い」を意味する。
【0034】
B.一般的考察
上皮性および内皮性のシートは、バリアとして作用し、多細胞性の生物体または対象の明瞭な区切りを維持する。これは、上皮細胞間、または傍細胞経路を通して、多くの高分子およびより少ない程度で小分子の移動を制限する細胞間接合により行われる。上皮を通るイオン移動でさえ、少なくなり、その為、経上皮性電気抵抗(transepithelial electrical resistance)(TEER)が生ずる。ある区画から他の区画への巨大分子の傍細胞性漏出は、緊密接合の形成により妨げられる(Diamond, J., ”The Epithelial Junction: Bridge, Gate and Fence”, Physiologist 20: 10−18 (1977))。
【0035】
しかし、緊密接合のバリア機能は不活発である。例えば、多くの親水性の栄養分は傍細胞性経路を通して上皮を容易に通過する(Ballard, S. T., et al., Annu. Rev. Nutr. 15: 35−55 (1995))。その為、緊密接合は、力学型の傍細胞性浸透を調節するが、これは、上皮細胞は、緊密接合の機能を調節する能力を有することを示唆する。
【0036】
当該緊密接合は、膜貫通および細胞質性タンパク質の両方を含む複合構造体である(Denkar, B. M. and Nigam, S. K. (1998) Am. J. Physiol. 274: F1−F9; Fanning, A. S., et al., J. Soc. Nephrol. 10: 1337−1345 (1999))。これらのタンパク質の多く(例えば、オクルジン(occludin)、ZO−1、ZO−2およびZO−3)はリン酸化されるが、これは、これらタンパク質が種々のシグナルカスケードの終端であることを示唆する(Anderson, J. M. et al., J. Cell Biol. 106: 1141−1149 (1998); Sakakibara, A., et al., J. Cell. Biol. 137: 1393−1401 (1997))。多くのシグナル経路が傍細胞性浸透の調節に含まれている(例えば、チロシンキナーゼ、カルシウム、プロテインキナーゼC(PKC)(Anderson, J. M. and Van Italle, C. M., Am. J. Phys. 269: G467−G475 (1995); Collares−Buzato, C. B. et al., Eur. J. Cell Biol. 76: 85−92 (1998); Mullin, J. M., et al., Am. J. Physiol. 275: C544−C554(1998); Tai, Y. H., et al., J. Membr. Biol. 149: 71−79 (1996))。しかし、本発明が開示されるまで、当該調節と関連する分子機構は完全には解明されていなかった。
【0037】
分子は、図1に概略するように、主に三つの経路で腸管上皮を通って血液中へ通過する。第一に、分子は、細胞膜を通過する受動拡散により(経細胞経路);第二に、隣接細胞間の受動拡散(傍細胞経路)により;または、第三に担体仲介輸送(担体仲介経路)により、通過し得る。脂肪親和性分子は、経細胞経路を介する細胞膜を容易に通過する。一方、担体により認識されない親水性分子は、疎水性膜中に分配されず、その為、傍細胞経路を介し上皮バリアを浸透しなければならない。しかし、傍細胞経路を介する親水性分子の輸送は、緊密接合の存在により厳密に制限される。
【0038】
多くの有用な治療薬は親水性であり、その為、最も好ましい薬物送達経路である経口経路を介し確実に送達されない。例えば、親水性の、広範のスペクトルの抗生物質セフォキシチン(cefoxitin)は、あまり腸管浸透しない動物では5%未満の経口生体利用性であり、現在IV製剤として販売されているのみである。エナラプリラート(enalaprilat)、アンギオテンシン変換酵素インヒビターもまた、僅かに吸収される。この親水性薬物もまたIV製剤としてのみ市販されている。
【0039】
C.治療法
脊椎動物中の吸収部位での傍細胞性浸透を促進する方法を、本発明と関連して提供する。好ましい実施態様では、当該方法は、有効量のPLCインヒビターを、促進された傍細胞性浸透が望ましいときに対象に投与すること;および有効量のPLCインヒビターの投与を介する吸収部位での、対象における傍細胞性浸透を促進することを含む。
【0040】
より好ましい実施態様では、PLCインヒビターは、以下に制限されないが、アルキルホスホコリン、3−ニトロクマリン誘導体、およびN−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体からなる群から選択される。所望により、アルキルホスホコリンは更に10から20のメチレン基のアルキル鎖、すなわち、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20メチレン基のアルキル鎖を含み得る。当該吸収部位は、好ましくは腸管上皮を含む。他に、当該吸収部位は、血液脳関門を含み得る。
【0041】
対象における親水性薬物の吸収を促進する方法もまた開示する。好ましい実施態様では、当該方法は、有効量のPLCインヒビターを対象に、親水性薬物を当該対象に投与する前か当該投与と共に投与し、それにより促進された傍細胞性浸透が当該対象の吸収部位で生じること;および当該対象の吸収部位での親水性薬物の吸収を有効量のホスホリパーゼCインヒビターの投与を介し促進することを含む。
【0042】
より好ましい実施態様では、PLCインヒビターが、以下に制限されないが、アルキルホスホコリン、3−ニトロクマリン誘導体、およびN−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体からなる群から選択される。所望により、アルキルホスホコリンは更に10から20のメチレン基のアルキル鎖、すなわち、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20メチレン基のアルキル鎖を含み得る。当該吸収部位は、好ましくは腸管上皮を含む。他に、当該吸収部位は、血液脳関門を含み得る。
【0043】
本明細書で使用するとき、「有効」量または用量は、対象の母集団のうちの多数が有効であるかまたは有効範囲内にあり、そしてPLC活性を調節および/または対象での吸収が改善するのに十分であるものをいう。更に、本発明により、選択性および効力のあるPLCインヒビターである化合物を同定し、当該化合物は、傍細胞性浸透の調節に使用し得る最初の証明を提供した。その為、本発明により、当該化合物は、ミリモーラー濃度とは全く異なるインビボ濃度であるマイクロモーラー(μM)を供する用量で投与し得る。典型的なインビボ濃度は、1μM未満から約100μMまでの範囲であり得、以下に限らないが、2、4、5、10、25、50または75μMのような中間濃度(intermediate concentration)を含み得る。その為、非特異的活性および高ミリモーラー濃度に付随する望ましくない副作用、例えば細胞毒性が、本発明の方法および組成物で避けられる。
【0044】
その為、本発明の開示を見た後は、当業者ならば、特定の製剤および当該組成物を用いる投与方法、ならびに対象の伸長、体重、症状の重篤度、および処置すべき疾患の段階を考慮して、対象への有効用量を選択することができる。
【0045】
単位用量を、例えば、一日1から4回、投与し得る。好ましくは、有効量のPLCインヒビターを対象に、親水性薬物を当該対象に投与する前か当該投与と共に投与する。親水性薬物を当該対象に投与すると共にPLCインヒビターを投与する場合、PLCインヒビターおよび親水性薬物は単一製剤で対象に投与されることが好ましい。当該用量は、投与経路および化合物または化合物群を含む組成物の製剤による。更に、本発明の開示を見た後は、当業者ならば、用いる製剤の組合せ、対象の年齢および体重、および処置すべき病状の重篤度により、投与量の常套的調整または変更を行う必要があり得ることを理解するであろう。
【0046】
そのような調整または変更、ならびにその調節または変更を行う時点およびその仕方の評価は、医薬分野の当業者に既知である。評価のパラメーターおよび技術は、対象および疾患の重篤度により変わり得る。特に有用な評価技術には、以下に限らないが、本明細書で示した実施例中で開示したアッセイが含まれる。
【0047】
多くの実施態様における本発明で処置する対象は望ましくはヒトであるが、哺乳類(「対象」なる語句に含まれることを意図する)を含む本発明が全ての脊椎動物種に有効であることを本発明の原理が示していると理解される。本文中、哺乳類には、促進された傍細胞性浸透が望ましい任意の哺乳類種、特に酪農および家内飼育している哺乳類の種族を含むと理解される。
【0048】
本発明の方法は、温血性脊椎動物の処置に特に有用である。その為、本発明は、哺乳類および鳥類に好ましくは適する。
【0049】
より特に、予期されるのは、ヒトのような哺乳類、ならびに絶滅の危機に瀕した重要な哺乳類(シベリアンタイガーのような)、ヒトにとって商業的に重要な哺乳類(ヒトによる消費のため農場で飼育する動物)および/または社会的に重要な哺乳類(ペットとしてまたは動物園で飼われている動物)、例えば、ヒト以外の肉食動物(猫および犬のような)、ブタ(子ブタ、飼いブタおよび野生のイノシシ)、反芻動物(ウシ(cattle)、ウシ(oxen)、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソンおよびラクダのような)、およびウマ(例えば、競走馬)の処置である。また、予期されるのは、絶滅の危機に瀕した種類の鳥、動物園で飼われている種類の鳥(例えば、ダチョウ)、ならびに食用の鳥、およびより特に家畜の鳥、すなわち、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウなどのような飼鳥類(それらはまたヒトにとって商業的に重要性がある)の処置を含む、鳥類の処置である。その為、予期されるのは、以下に限らないが、飼育しているブタ(子ブタおよび飼いブタ)、反芻動物、ウマ、飼鳥類などを含む家畜の処置である。
【0050】
D.PLCインヒビター化合物
好ましいアルキルホスホコリンは、図2Aに示すような式2の化合物(式中、n=8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20)を含む。典型的なホスホコリン合成技術は、米国特許番号5,208,223および5,144,045に開示されている(それらの内容は全て引用により本明細書に加える)。
【0051】
ヘキサデシルホスホコリン(C16)は、細胞内および生化学アッセイにおけるPLCの阻害が見られた(Berkovic, D., et al., J. Exp. Ther. Onc. 1: 302−311 (1996); Pawelcyzk, T. and Lowenstein, J. M., Biochm. Pharm. 45: 493−497 (1999))。以下に限らないが、長いアルキル鎖および双性イオン性機能を含む構造的特徴を有するC16は、MDCK細胞単層を通過する傍細胞性浸透が強力に増加することが判明した。その為、C16の類似体を、10から20メチレン単位で鎖長が変わるように合成した(図2A、式1)。これらの類似体の効能を測定した。PLC阻害と傍細胞性浸透の変化との関係は、明らかに確証された。
【0052】
好ましい3−ニトロクマリンは、3−ニトロクマリンエステルおよびエーテルを含み、当該エステルまたはエーテル結合は、3−ニトロクマリン核の6つの位置である。典型的なエーテル類似体には、7−ヒドロキシ−ヘプタノキシ−3−ニトロクマリンおよび6−ヒドロキシヘキサオキシ−3−ニトロクマリンが含まれる。典型的なエステル誘導体には、ヘプタノイルおよびヘキサノイル3−ニトロクマリンが含まれる。他の典型的な3−ニトロクマリンを以下の表1に示しており、それには、3−ニトロクマリン自体、6−ヒドロキシ−3−ニトロクマリン、6−アセトキシ−3−ニトロクマリン、6−オクタノイル−3−ニトロクマリン、6−(10−ウンデセノイル)−3−ニトロクマリンおよび6−(8−ヒドロキシ−オクタノキシ)−3−ニトロクマリンが含まれている。誘導体は、以下に限らないが、Perrella et al., Journal of Medicinal Chemistry (1994) 37 (14): 2232−2237(引用により本明細書に加える)に開示のものを含む標準的合成アプローチを用い合成され得る。
表1−置換3−ニトロクマリン(式3)*
【化1】
*更に、3−シアノクマリン、3−ハロクマリン(3−F、3−Cl、3−I)、3−アセトキシクマリン、およびクマリン−3−スルホン酸の同一誘導体(表1で例示)もまた含まれている。その為、他の置換基、R4は、本発明により、上記式3の3の位置に提供され、すなわち、上記ニトロ基で置換される炭素原子である。その為、R4は、ニトロ基(−NO2)、シアノ基(−CN)、−F、−Clまたは−Iのようなハロゲン、アセトキシ基、すなわち、OCOCH3 −、またはスルホン酸基、すなわち、−SO3Hを含み得る。
【0053】
好ましくは、ステロイドのN−アルキルスクシンイミド誘導体は、図2Bに示すような式1の構造を含む。好ましくは、R1は1から10までのメチレン基の範囲のメチレン鎖、すなわち1、2、3、4、5、6、7、8、9または10メチレン基であり、R2は以下に限らないが、−OCH3、−OHおよびHを含む群から選択される。
【0054】
本発明により用い得る他のPLCインヒビター組成物には、1999年8月24日にMayhueらにより公開の米国特許番号5,942,246に開示のリポソーム組成物;1995年7月4日にSmithらにより公開の米国特許番号5,430,050に開示のヒスピドスペルミジン(hispidospermidin)組成物;および1996年12月3日にSaitoらにより公開の米国特許番号5,580,956に開示のPLC阻害ペプチドが含まれる(それらはそれぞれ引用により全て本明細書中に含める)。他の適当なホスホリパーゼインヒビターには、1996年5月21日にGibbsらにより公開の米国特許番号5,519,163に開示のアルファヒドロキシホスホネート化合物が含まれる。
【0055】
E.医薬製剤
本発明により、本明細書で「PLCインヒビター」としてまた称する、PLC生物学的活性を阻害する薬剤および物質を、医薬組成物としての投与に適用する。好ましい医薬組成物には、親水性薬物、有効量のPLCインヒビター、および医薬的許容される担体が含まれる。
【0056】
より好ましくは、PLCインヒビターは、以下に制限されないが、アルキルホスホコリン、3−ニトロクマリン、表1の脚注で示した他の3−置換クマリン、およびN−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体からなる群から選択される。所望により、アルキルホスホコリンは更に、10から20のメチレン基のアルキル鎖、すなわち、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20メチレン基のアルキル鎖を含む。
【0057】
組成物を必要とする対象への親水性薬物の経口生体利用性を促進する当該組成物を製造する方法をも提供する。好ましい実施態様では、当該方法は、親水性薬物を提供すること;有効量のPLCインヒビターを提供すること;ならびに親水性薬物および有効量のPLCインヒビターを医薬的許容される担体と混合し、それにより、親水性薬物の経口生体利用性を促進する組成物を製造することを含む。
【0058】
より好ましくは、PLCインヒビターは、以下に限定されないが、アルキルホスホコリン、3−ニトロクマリン、およびN−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体からなる群から選択される。また、より好ましくは、アルキルホスホコリンは更に、10から20のメチレン基のアルキル鎖、すなわち、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20メチレン基のアルキル鎖を含み、そしてN−アルキルスクシンイミドステロイドは、1から10のメチレン基のアルキル鎖、すなわち、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10メチレン基のアルキル鎖を含む。
【0059】
製剤および製造の技術は、当分野で一般的に述べられており、例えば、1994年7月5日にSeippらにより公開の米国特許番号5,326,902、1993年8月10日にMarnettらにより公開の米国特許番号5,234,933、および1993年12月23日にJohnsonらにより公開の国際特許番号93/25521参照(それらの文献は引用によりすべて本明細書に加える)。
【0060】
上記目的の為、同定物質は、通常、全身的にまたは部分的に、通常、経口または非経口的投与により投与され得る。投与すべき用量は、年齢、体重、症状、望ましい傍細胞性浸透促進効果、投与経路および処置期間などに基づき決定する。治療処置の分野の当業者ならば、有効治療のための適当な投与計画を決定するための適当な手法および技術を認識するだろう。更なる技術指示をもまた以下に示す実施例で提供する。種々の組成物および投与形式を提供し、それらは一般的に当分野に知られている。投与のための他の組成物は、1つまたはそれより多い作用物質を含む坐薬を含み、既知の方法で製造し得る。
【0061】
そのため、本発明による医薬組成物は、1つまたはそれより多い生理学的に許容される担体または賦形剤で製剤化され得る。そのため、本発明に使用の化合物は、経口、頬、鼻、非経口、直腸または経皮の投与、結腸上皮との接触に適する型の投与、または例えば肺の肺胞上皮に接触させるための吸入(inhalation)または吸引(insufflation)(口または鼻の何れかを通して)に適する型の投与用に製剤化され得る。投与はまた、任意の他の効果的な技術により行われ得る。
【0062】
経口投与の場合、医薬組成物は、結合剤(例えば、アルファ化メイズデンプン(pregelatinized maize starch)、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)、充填剤(例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム)、滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ)、崩壊剤(例えば、ポテトデンプンまたはグリコールデンプンナトリウム)または湿潤剤(例えば、ドデシル硫酸ナトリウム)のような医薬的に許容される賦形剤を用い通常の技術で製造した、例えば、錠剤またはカプセルの型となり得る。当該錠剤は、当分野に既知の方法により被覆され得る。
【0063】
経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の型となり得るか、それらは、使用前に水または他の適当なビヒクルにより構成する乾燥製品として提供され得る。その液体製剤は、懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用油)、乳化剤(例えば、レクチンまたはアカシア)、非水性ビヒクル(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別化植物油)、および保存剤(例えば、メチルまたはプロピル−p−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸)のような医薬的に許容される添加剤を用い通常の技術により製造され得る。当該製剤には、適当な緩衝塩、香料、着色剤および甘味料をも含み得る。経口投与用の製剤は適当に製剤化され、作用化合物の放出を調節し得る。頬投与(buccal administration)の場合、当該組成物は、通常の手法で製剤化された錠剤またはトローチ剤の型となり得る。
【0064】
本発明による投与方法には、例えば、ボラス注射または連続注入(continuous infusion)による、注射により非経口的に投与し得る。注射のための製剤化は、添加保存剤を伴うかまたは伴わない、アンプルまたは複数用量コンテナー(multi−dose container)などの単位用量型となり得る。注射剤は、特に血液脳関門を通る治療薬の中枢神経系への送達に使用することを意図される。
【0065】
当該方法に使用する組成物は、油性または水性ビヒクル中で懸濁液、溶液またはエマルジョンのような型となり得、懸濁剤、安定化剤および/または分配剤のような製剤化製剤を含み得る。他に、作用成分は、使用前に、適当なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水で構成される粉末型となり得る。当該化合物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような通常の坐薬ベースを含む、坐薬または持続性浣腸剤(retention enemas)のような直腸用組成物(rectal composition)中に製剤化され得る。前記製剤化に加えて、当該化合物はまた、移植または注射のための製剤として製剤化し得る。そのため、例えば、当該化合物は、適当な重合性もしくは疎水性の物質またはイオン交換樹脂で製剤化され得るか、例えば僅かに溶解する塩のような僅かに溶解する誘導体として製剤化され得る。
【0066】
実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含まれるものである。以下の実施例の特定の態様は、本発明の実施において十分に行われる本発明者により見られるかまたは予期される技術および手法に関し述べたものである。これらの実施例は、本発明者の標準的な研究での実施での使用を介し解説される。本発明の開示および当業者の一般的レベルの観点から、当業者ならば、以下の実施例は例示のみを目的としており、多くの変化、修飾および変更が本発明の要旨および本発明の範囲から出発することなく行い得ると評価するであろう。
【0067】
実施例のための物質および方法
試薬
MDCK上皮細胞系株IIは、Lineberger Comprehensive Cancer Center(Chapel Hill, Chapel Hill, North Carolinaに住所を有するUniversity of North Carolina)を介しAmerican Type Culture Collectionから得た。N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’−2−エタンスルホン酸(HEPES)は、Lineberger Comprehensive Cancer Center(Chapel Hillに住所を有するUNC)より得た。Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS)は、Mediatech of Hernford, Virginiaから得た。細胞培養試薬は、Grand Island, New YorkのGibco BRLから得た。TRANSWELL(商標)マルチウェルプレートおよびインサート(12ウェル/プレート、3μm孔および1.0cm2領域、ポリカーボネート)は、Costar of Cambridge, Massachusettsから得た。[14C]−マンニトールおよび[3H]−ミオ−イノシトールは、St. Louis, MissouriのAmerican Radiolabeled Chemicalsから得た。ドデシルホスホコリンは、Alabaster, AlabamaのAvanti Polar Lipidsから得た。AG1−X8ホルマートカラムは、Hercules, CaliforniaのBio−Rad Laboratoriesから得た。すべての他の化合物および試薬は、Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouriから得た。
【0068】
細胞培養
輸送研究の場合、輸送実験のモデルである、雄のコッカースパニエルの通常の近傍の上皮腎細胞から得られるMDCK細胞(Cho, M. J., et al. (1989) Pharm. Res. 6: 71−77)は、TRANSWELL(商標)マルチウェルプレートで増殖させた。それぞれのウェルに、200,000細胞をシードした。次いで、当該細胞を細胞培地(10%胎児ウシ血清(FBS)および1%NEAAを加えた1%抗生物質を有するMEM)中で増殖させ、37℃および5%CO2で維持した。コンフルエント細胞を4日間増殖させ、安定TEERの確立により証明されるように上皮細胞単層中に区別した。
【0069】
経上皮性電気抵抗(TEER)の測定
TEER(Ω・cm2のように表す)は、緊密接合の機能的完全性(functional integrity)の測定の役割をなす。TEERは、EVOM Epithelial Tissue Voltohmeter(World Precision Instruments, Sarasota, Florida)およびEndohm−12電極(World Precision Instruments, Sarasota, Florida)により測定される。MDCK細胞のTEER値は、150−250Ω・cm2の範囲で機能性単層(functional monolayer)を形成する。
【0070】
傍細胞性マーカーとしてのマンニトール
マンニトール、親水性化合物は、上皮膜を容易には通過できず、傍細胞性経路を介し上皮を横切らなければならない。そのため、上皮を通過するマンニトール流入は、傍細胞性経路の浸透性を反映したものである。マンニトールの検出は、[3H]または[14C]放射標識となる。
【0071】
TEER上のアルキルホスホコリンの効果の決定
実験は、化合物またはビヒクルを含む、10mM HEPES、pH7.4(輸送緩衝液)を加えたHBSS0.5mLを、TRANSWELL(商標)マルチウェルプレートの先端に加えることにより開始した。細胞単層は37℃でインキュベーション視、TEER値は、30分後測定した。それぞれの実験からのデータは、ビヒクルからの応答を正規化し、3回行った3実験の平均±SDとして示した。
【0072】
TEERにおけるアルキルホスホコリンの効果は、数種の濃度で評価し、未処理対照に関しTEER中で50%減少の要因となる濃度をEC50として定義した(Liu, D. Z., et al., (1999) J. Pharm. Sci. 88: 1161−1168; Liu, D. Z. et al. (1999) J. Pharm. Sci. 88: 1169−1174)。
【0073】
マンニトール輸送におけるアルキルホスホコリンの効果の測定
細胞単層の緊密接合の完全性は、実験前のTEER測定でモニターした。輸送実験は、先端培地を、化合物またはビヒクル、および[14C]−マンニトールを含む輸送緩衝液0.5mLと置換することにより開始した。[14C]−マンニトールの濃度は、25μM(55mCi/mmol)であった。輸送速度は、2回の30分間隔の間に基底部側(1.5mL)中に蓄積した[14C]−マンニトールの量を測定することによりモニターした。輸送された放射標識[14C]−マンニトールの量は、コネチカット州のメリデンにあるPackard Instrument Companyから購入したPackard Tri Carb 4000 Series spectrophotometerで液体シンチレーションカウンティングにより測定した。すべての輸送実験は、シンク条件下で行った(輸送実験は、[14C]−マンニトールの総量の10%未満が任意の所定時間、基底部側に存在した)。[14C]−マンニトールの輸送におけるアルキルホスホコリンの効果を、ビヒクル処理細胞中の[14C]−マンニトールの輸送に正規化し、3回行った3実験の平均±SDとして示した。EC10xは、ビヒクル処理した対照に関し、マンニトール流入で10倍の増加の要因となる化合物の濃度により決定した。
【0074】
細胞アッセイによる、PLC活性の測定
MDCK細胞中のPLCの活性の測定は、従前に開示された方法(Schachter, J. B., et al. (1997) Neuropharm. 36: 1181−1187)の適応により測定した。MDCK細胞を12ウェルプレート中に400,000細胞/ウェルでシードし、その後、4日間培養した。次いで、MDCK細胞単層を、24時間37℃で[3H]−ミオ−イノシトール(イノシトールフリー培地0.4ml中に1.6μCi/well)で標識した。アッセイは、化合物を伴うかまたは伴わない100mM LiClを含む250mM HEPES(pH7.3)100μlを細胞に直接加えることによりインキュベーターから取除いた標識細胞において開始した。その後、当該細胞は、30分間37℃でインキュベーションした。このインキュベーションの終了直後、ATP(最終濃度:100μM)またはEGF(20ng/ml)を加えた。
【0075】
次いで、細胞を37℃で15分間インキュベーションし、[3H]−イノシトールホスフェートを蓄積させた。インキュベーションは、培地を吸引し、10mM 煮沸EDTA(pH8.0)1mlを添加することにより、終了した。上清は、[3H]−イノシトールホスフェートのクロマトグラフィー単離用のAG1×8ホルマートカラムに適用した(Berridge, M. J., et al., (1983) Biochem. J. 212: 473−482)。[3H]−イノシトールホスフェートの量は、Packard Tri Carb 4000 Series spectrophotometerで液体シンチレーションカウンティングにより測定した。それぞれの実験からのデータは、100μM ATPまたは20ng/ml EGFで観察される応答を正規化し、3回行った3実験の平均±SDとして示した。IC50(PLC)は、ATP−またはEGF−刺激性の、[3H]−イノシトールホスフェートの蓄積で50%減少の要因となる化合物の濃度により測定した。
【0076】
アルキル鎖長の異なるアルキルホスホコリンの合成
アルキルホスホコリンは、アルコールを2−ブロモエチル−ジクロロホスフェートでリン酸化(Hirt, R., and Berchtold, R. (1958) Pharma. Acta. Helv. 33: 349−356)し、その後、臭素をトリメチルアミンで置換(Hanson, W. J., et al., (1982) Lipids 17: 453−459; Surles, J. R., et al. (1993) Lipids 28: 55−57)することにより合成した。
【0077】
データ分析
対となっていないデータのStudent t−テストを用い測定すると、未処理MDCK細胞単層と処理MDCK細胞単層の平均±SD間で有意な相違があった(p<0.05)。PLC活性と傍細胞性浸透との間の関係は、線形回帰分析により測定され、その相関は、ピアソン相関係数(Pearson correlation coefficient)で表す。
【0078】
実施例1
MDCK細胞を通過するTEERにおけるアルキルホスホコリンの効果
TEERにおけるアルキルホスホコリンの効果は、MDCK細胞単相の10分間および30分間の処理から評価した。10分後、アルキルホスホコリンシリーズの殆どの化合物(非毒性濃度)は、TEERを有意には減少しなかった(p>0.05)。30分後、すべてのアルキルホスホコリンが濃度依存の方法でTEERを減少した(図3−明らかなように、このシリーズのC12およびC16化合物のみを示す)。例えば、TEERにおける30μM C16の効果は、10分間遅延し、次いで、TEERは、2時間に渡り対照値の10%未満まで定速滴下する(図3挿入図)。アルキルホスホコリンでの長期処理による可能性ある非特異的効果を避けるため、傍細胞性浸透の有意な増加の要因となる最も短い処置時間(すなわち、30分間の処置)を更なる実験用に選択した。
【0079】
このシリーズのすべてのアルキルホスホコリンが、濃度依存の方法でTEERを減少し、それによって、最大濃度で、すべてのアルキルホスホコリンが、TEERを対照値の20%未満に減少した(図3)。TEERを50%(EC50)減少するアルキルホスホコリンの濃度に相当するアルキルホスホコリンの効力が顕著に変化した(表2)。興味あることに、有意なもの(p<0.05)を産するアルキル鎖中の僅かな変化により、これらの化合物のEC50は変化する。例えば、C16およびC12は、アルキル鎖で4メチレン単位が異なっているが、それぞれのEC50値は、おおよそ25倍異なっている。MDCK細胞を通過する傍細胞性浸透をアルキルホスホコリンが増加することを確認するため、マンニトール流入を増加するアルキルホスホコリンの能力を決定した。
【0080】
実施例2
MDCK細胞を通過するマンニトール流入におけるアルキルホスホコリンの効果
MDCK細胞単層を通過するマンニトール流入におけるアルキルホスホコリンの影響をまた、時間の関数としてモニターした。30分未満のこれらの化合物の処理は、MDCK細胞単層を通過するマンニトール流入を有意に(p<0.05)は増加しなかった。この結果は、TEERがMDCK細胞単層の通過を有意に(p<0.05)減少する前の、事前に決定した時間のアルキルホスホコリンによる処理(例えば、30分間の処理)の好ましいステップに相当する。そのため、マンニトール流入の測定は、30分間のアルキルホスホコリン処理後すぐに始め、60分間のアルキルホスホコリン処理前にすぐに停止した(すなわち、30〜60分間の間隔で広がる測定)。
【0081】
アルキルホスホコリンは、濃度依存の手法でマンニトール流入を増加した(図4、明らかにするため、この一連のC12およびC16化合物のみを示す)。マンニトール浸透におけるこれらの化合物の最大効果は、高濃度でアルキルホスホコリンが飽和応答(saturable response)を生じないため、得られない。そのため、傍細胞性浸透を増加するこれらの化合物の能力を、マンニトール流入を10倍(EC10x)増加する化合物の濃度により比較した(Liu, D. Z., et al. (1999) J. Pharm. Sci. 88: 1161−1168; Liu, D. Z., et al. (1999) J. Pharm. Sci. 88: 1168−1174)。
【0082】
対照値よりも10倍増加するマンニトール流入は、EDTAにより得られた最大マンニトール流入の50%に相当する(Liu, D. Z., et al. (1999) J. Pharm. Sci. 88: 1169−1174)。アルキルホスホコリンのEC10xを表2に要約する。これらの化合物のEC10xは、アルキルホスホコリンで達成されるEC10x値を有するウェルに相当する。
【0083】
実施例3
PLC活性を阻害するアルキルホスホコリンの能力を決定するため、イノシトールホスフェートのレベルにおいて、ATP−仲介増加を阻害するこれらの化合物の能力を決定した。しかし、基底からのカウントと、MDCK細胞単層からの[3H]−イノシトール−ホスフェートの、ATPで刺激されるレベルとの間の分離は、PLC活性を阻害するアルキルホスホコリンの能力の信頼ある測定に対して僅か(約1.5倍)である。この分離を増大させるため、P2Y2レセプターをコードしたプラスミドをトランスフェクトしたMDCK細胞を用いた。P2Y2レセプターはPLCを活性化させるG−タンパク質結合レセプターである(Pawelczyk, T., and Liowenstein, J.M. (1993) Biochem. Pharm. 45: 493−497)。基底からのカウントと、P2Y2レセプターを発現するMDCK細胞単層からの[3H]−イノシトール−ホスフェートの、ATPで刺激されるレベルとの間の分離は、おおよそ3倍増加し相違した(基底からのカウント、および[3H]−イノシトール−ホスフェートの、ATPで刺激されるレベルは、それぞれ200から400、および700から1200cpmの範囲である)。
【0084】
PLC阻害が、MDCK細胞中の傍細胞性浸透を増加するアルキルホスホコリンの能力と関連するかどうか決定するため、イノシトールホスフェート産物中のATP−刺激性増加を減少するアルキルホスホコリンの能力をも測定した(図5、明らかとするため、この一連のC12およびC6化合物のみを示す)。PLC活性を50%(IC50(PLC))阻害するアルキルホスホコリンの濃度に相当するアルキルホスホコリンの効力は、変化した(表2)。これらの化合物由来のPLC阻害の最大値(full extent)も変化した。例えば、C10(このシリーズの傍細胞性浸透のエンハンサーの効力は小さい)は、C10がイノシトールホスフェート産物中のATP−刺激性増加を50%減少させるため、表2に含まれていない。更に、C12による処置の最大値のPLC阻害は50%であった。この結果は、C10およびC12は、このシリーズで傍細胞性浸透のエンハンサーの効力が小さいため、驚くことではない。PLCを阻害する能力(すなわち、IC50(PLC))に相関する傍細胞性浸透(すなわち、EC10xおよびIC50)を増加するアルキルホスホコリンの能力をも決定した。一般的に、傍細胞性浸透のエンハンサーの効力の小さいアルキルホスホコリンは、PLCのインヒビターの効力も小さい(表2)。この観察は、EC10xおよびIC50(PLC)(図6A)と、EC50およびIC50(PLC)(図6B)間の有意な(p<0.001)陽性相関の決定により確認した。データポイントは、これらの相関の何れかからは顕著には変わらなかった(両相関でr>0.94)。そのため、これらの相関は、傍細胞性浸透を増加するアルキルホスホコリンの能力が、PLC活性を阻害するこれらの化合物の能力と関連することを示す。
【0085】
アルキルホスホコリンの効力が小さいため、傍細胞性促進の効力が小さいため、傍細胞性促進(すなわち、EC50およびEC10x)の効力とPLC阻害(すなわち、IC50(PLC))との間の分離はより大きくなった(表2)。例えば、C16のIC50(PLC)およびEC10x、アルキルホスホコリンシリーズの最も効力のあるエンハンサーは、僅かに異なるが、C12のIC50およびEC10x、アルキルホスホコリンシリーズの効力の小さいエンハンサーの1つは、顕著に異なる(表2)。この関係はまた、IC50(PLC)およびEC10xと、IC50(PLC)およびEC50との相関関係で説明され、この場合、これらの相関関係はlog−logスケールで直線となる。そのため、これらの相関関係は、傍細胞性浸透を増加する効力の小さいエンハンサーの能力は、PLCを阻害する当該エンハンサーの能力に殆ど依存せず、他の非特異的な効果(すなわち、細胞膜における細胞溶解効果および減少した細胞生存能力)により依存する。
【0086】
実施例4
MDCK細胞を通過する傍細胞性浸透における構造的に非関連PLCインヒビターの効果
増加した傍細胞性浸透が、PLC阻害の結果であるかどうか更に確証するため、傍細胞性浸透を増加する選択性PLCインヒビター(例えば、U−73,122および3−ニトロクマリン)(構造はそれぞれ図7Aおよび7B参照)の能力を決定した。傍細胞性浸透を増加するこれら選択性PLCインヒビターの能力は従前には示されていなかった。U−73,122および3−ニトロクマリンが、PLCを阻害しMDCK細胞単層の傍細胞性浸透を増加するアルキルホスホコリンの能力と有意に(p<0.05)相関するかどうかもまた決定した。
【0087】
傍細胞性浸透の増加がPLC阻害に依存することを確認するため、TEERを減少し、マンニトール流入を増加する選択性PLCインヒビター、U−73,122(Bleasdale, J. E., et al.,(1989) Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukot. Res. 19: 590−593)を決定した。U−73,122は、強力にTEERを減少し、MDCK細胞単層を通してマンニトール流入を増加する(図3、図4および表2)。一方、陰性対照化合物、U−73,122は、TEERまたはATP−刺激性PLC活性を増加しなかった(図7A)。これらの化合物間の活性の相違は、1つの二重結合により構造が異なることから、顕著である(図2B)。共同発明者の知る限りでは、U−73,122は、最も効力のある傍細胞性浸透のエンハンサーの1つである。更に、傍細胞性浸透を増加するPLC、3−ニトロクマリンの構造的に関連のない他のインヒビターの能力もまた、説明した。PLCの阻害(IC50(PLC)および傍細胞性浸透の促進(EC50およびEC10x)に関し、C16アルキルホスホコリンとおおよそ同程度の効力がある。この結果により、PLC阻害は、MDCK細胞中の傍細胞性浸透の増加と相関することが確認される。
【0088】
最終的に、傍細胞性浸透を増加し、PLCを阻害するU−73,122および3−ニトロクマリンの能力が、これらのパラメーターを変化するアルキルホスホコリンの能力と相関するかどうか、決定した。従前に、MDCK細胞中でPLC活性を50%阻害する(図5および表2)U−73,122の濃度が報告されている(Lockhart, L.K., and McNicol, A. J. (1999) Phrm. Exp. Ther. 289: 721−728)。U−73,122および3−ニトロクマリンのEC50およびEC10x、およびIC50(PLC)の値は、アルキルホスホコリンのこれらの値と有意に(p<0.05)相関した(図6Aおよび6B)。この証明により、傍細胞性浸透の調節におけるPLCの改善が確認された。
【表2】
【0089】
*結果は、3回の実験での3つの値での平均±SDを示している。
【0090】
実験例5
U73122およびHPCによる、PLCのイソ酵素ファミリー選択性阻害
U−73,122は、PLCイソ酵素ファミリー−βを選択的に阻害すると報告されている(Thompson et al. 1991)。本開示はまた、HPCがATP−刺激性PLC−β活性の強力なインヒビターであるという事実によりHPCはPLC−βのインヒビターであることを示す(図5)。そのため、本実施例では、PLC−βのHPCおよびU−73,122の選択性対PLC−γの他のPLCイソ酵素の選択性を決定した。しかし、ATP−刺激性PLC−β活性を阻害するU−73,122およびHPCは、EGF−刺激性PLC−γ活性に全く効果がなかった(図8)。従前に述べられているように、これらの化合物は、MDCK細胞単層を通過する緊密接合浸透の強力なエンハンサーである。そのため、PLC−βの阻害は、MDCK細胞単層を通過する緊密接合浸透の増加に関連する。
【0091】
実施例6
PLC−γのイソ酵素ファミリー選択性阻害は、緊密接合浸透の増加に関連する この実施例では、PLC−γ、3−ニトロクマリン(3−NC)の既知インヒビター(Perella et al., Journal of Medicinal Chemistry (1984) 37 (14): 2232−2237)は、MDCK細胞単層中のPLC−βに対し阻害活性のない、PLC−γの選択性インヒビターであることがわかった(図8)。緊密接合浸透を増加し、EGF−刺激性PLC−γ活性を阻害する(PLC−γの阻害を示唆する)この化合物はまた、緊密接合浸透と関連する。従前にはPLCを阻害するとは報告されていなかった3−NC、7−ヒドロキシ−3−ニトロクマリン(OH−3−NC)(図7B)の構造的に類似する類似体(Perrela et al., Journal of Medicinal Chemistry (1994) 37 (14): 2232−2237)は、500μM濃度であっても緊密接合浸透を増加せず(図7B)、これは、緊密接合浸透を増加する3−NCの能力がPLC−γによるものであることを示唆する。
【0092】
傍細胞性浸透の調節におけるPLC−依存経路の改善の証明が増しつつある。しかし、本発明の開示は、PLC阻害と傍細胞性浸透との間の直接の関連を最初に確立したことである。更に、傍細胞性浸透の最も強力なエンハンサーの1つ(すなわち、U−73,122)を同定した。そのため、本発明は、傍細胞性浸透を増大する試薬の能力よる機構の解明を提供し、緊密接合の調節の新規洞察を生ずる。
【0093】
参考文献
以下に列挙した参考文献および本明細書中で引用したすべての参考文献は、追加、解説、背景の提供、または本明細書で用いた方法、技術および/または組成物を教授する程度に引用により本明細書に含める。
【表3】
【表4】
【表5】
【0094】
米国特許番号5,942,246
米国特許番号5,430,050
米国特許番号5,580,956
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米国特許番号5,326,902
米国特許番号5,234,933
国際公開第93/25521
【0095】
本発明の種々の詳細が、本発明の範囲から出発することなく変化することが理解される。更に、前記記載は、特許請求の範囲により定義される本発明を解説のみを目的としており、本発明を制限する目的でない。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、腸管上皮を通過する輸送の概略図である。
【図2】図2は、アルキルホスホコリンの構造式、ならびに特定のPLCインヒビターU−73,122、1−[6−[[(17β)−3−メトキシエストラ−1,3,5(10)−トリエン−17−イル]アミノ]ヘキシル]−)1H−ピロール−2,5−ジオン、およびその不活性類似体、U−73,343、1−[6−[[(17β)−3−メトキシエストラ−1,3,5(10)−トリエン−17−イル]アミノ]ヘキシル]−)−2,5−ピロリジンジオンの構造式である。
【図3】図3は、MDCK細胞中でTEERにおけるアルキルホスホコリンおよびU−73,122の効果を示したグラフである。
【図4】図4は、MDCK細胞中のマンニトール流入におけるアルキルホスホコリンおよびU−73,122の効果を示すグラフである。
【図5】図5は、MDCK細胞中のATP−刺激性PLC活性におけるアルキルホスホコリンおよびU−73,122の効果を示すグラフである。
【図6】図6は、アルキルホスホコリン、3−NC、およびU−73,122のIC50(PLC)とEC10x値の間の相関(r=0.98、p<0.05)を示すグラフ、ならびにアルキルホスホコリン、3−NC、およびU−73,122のIC50(PLC)とEC10x値の間の相関(r=0.95、p<0.05)を示すグラフである。
【図7】図7は、構造式、およびTEER(白)およびATP−刺激性PLC活性(黒)におけるU−73,122およびU−73,343の効果を示す棒グラフ、ならびに構造式、およびTEER(白)およびEGF−刺激性PLC活性(黒)における3−ニトロクマリンおよび7−ヒドロキシ−ニトロクマリンの効果を示す棒グラフである。
【図8】図8は、PLC−β(黒)およびPLC−γ(白)の活性における3−NC、HPCまたはU−73,122の効果を示す棒グラフである。
Claims (27)
- 対象の吸収部位での傍細胞性浸透を促進する方法であって、
a)有効量のホスホリパーゼCインヒビターを、促進された傍細胞性浸透が望ましいときに対象に投与すること、
b)有効量のホスホリパーゼCインヒビターの投与を介する吸収部位での、対象における傍細胞性浸透を促進すること、
を含む当該方法。 - ホスホリパーゼCインヒビターが、アルキルホスホコリン、3−ニトロクマリンまたはその誘導体、3−シアノクマリンまたはその誘導体、3−ハロクマリンまたはその誘導体、3−アセトキシクマリンまたはその誘導体、クマリン−3−スルホン酸またはその誘導体、およびN−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体からなる群から選択される、請求項1の方法。
- アルキルホスホコリンが、更に、10から20のメチレン基のアルキル鎖を含む、請求項2の方法。
- 3−ハロクマリンが、3−フルオロクマリンまたはその誘導体、3−クロロクマリンまたはその誘導体、または3−ヨードクマリンまたはその誘導体である、請求項2の方法。
- N−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体が、1から10のメチレン基のアルキル鎖を含む、請求項2の方法。
- 吸収部位が腸管上皮を含む、請求項1の方法。
- 吸収部位が血液脳関門を含む、請求項1の方法。
- ホスホリパーゼCインヒビターが、経口、頬、直腸または経皮投与用に製剤化され、結腸上皮との接触に適する型、または吸入または吸引による投与に適する型である、請求項1の方法。
- 対象において親水性薬物の吸収を促進する方法であって、有効量のホスホリパーゼCインヒビターを対象に、親水性薬物を当該対象に投与する前か当該投与と共に投与し、それにより促進された傍細胞性浸透が当該対象の吸収部位で生じること、および当該対象の吸収部位での親水性薬物の吸収を有効量のホスホリパーゼCインヒビターの投与を介し促進すること、を含む当該方法。
- ホスホリパーゼCインヒビターが、アルキルホスホコリン、3−ニトロクマリンまたはその誘導体、3−シアノクマリンまたはその誘導体、3−ハロクマリンまたはその誘導体、3−アセトキシクマリンまたはその誘導体、クマリン−3−スルホン酸またはその誘導体、およびN−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体からなる群から選択される、請求項9の方法。
- アルキルホスホコリンが、更に、10から20のメチレン基のアルキル鎖を含む、請求項10の方法。
- 3−ハロクマリンが、3−フルオロクマリンまたはその誘導体、3−クロロクマリンまたはその誘導体、または3−ヨードクマリンまたはその誘導体である、請求項10の方法。
- N−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体が、1から10のメチレン基のアルキル鎖を含む、請求項10の方法。
- 吸収部位が腸管上皮を含む、請求項9の方法。
- 吸収部位が血液脳関門を含む、請求項9の方法。
- ホスホリパーゼCインヒビターが、経口、頬、鼻、直腸または経皮投与用に製剤化され、結腸上皮との接触に適する型、または吸入または吸引による投与に適する型である、請求項9の方法。
- a)親水性薬物、
b)ホスホリパーゼCを阻害する量のホスホリパーゼCインヒビター、および
c)医薬的許容される担体
を含む組成物。 - ホスホリパーゼCインヒビターが、アルキルホスホコリン、3−ニトロクマリンまたはその誘導体、3−シアノクマリンまたはその誘導体、3−ハロクマリンまたはその誘導体、3−アセトキシクマリンまたはその誘導体、クマリン−3−スルホン酸またはその誘導体、およびN−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体からなる群から選択される、請求項17の組成物。
- アルキルホスホコリンが、更に、10から20のメチレン基のアルキル鎖を含む、請求項18の組成物。
- 3−ハロクマリンが、3−フルオロクマリンまたはその誘導体、3−クロロクマリンまたはその誘導体、または3−ヨードクマリンまたはその誘導体である、請求項18の組成物。
- N−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体が、1から10のメチレン基のアルキル鎖を含む、請求項18の組成物。
- 親水性薬物を必要とする対象に対する当該親水性薬物の経口利用性を促進する組成物を製造する方法であって、
a)親水性薬物を提供すること、
b)ホスホリパーゼCインヒビターを提供すること、および
c)親水性薬物、およびホスホリパーゼCを阻害する量のホスホリパーゼCインヒビターを、医薬的許容される担体と混合し、それにより、親水性薬物の経口生体利用性を促進する組成物を製造すること、
を含む当該方法。 - ホスホリパーゼCインヒビターが、アルキルホスホコリン、3−ニトロクマリンまたはその誘導体、3−シアノクマリンまたはその誘導体、3−ハロクマリンまたはその誘導体、3−アセトキシクマリンまたはその誘導体、クマリン−3−スルホン酸またはその誘導体、およびN−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体からなる群から選択される、請求項22の方法。
- アルキルホスホコリンが、更に、10から20のメチレン基のアルキル鎖を含む、請求項23の方法。
- 3−ハロクマリンが、3−フルオロクマリンまたはその誘導体、3−クロロクマリンまたはその誘導体、または3−ヨードクマリンまたはその誘導体である、請求項23の方法。
- N−アルキルスクシンイミドステロイド誘導体が、1から10のメチレン基のアルキル鎖を含む、請求項23の方法。
- 当該組成物が、経口、頬、直腸または経皮投与用に製剤化され、結腸上皮との接触に適する型、または吸入または吸引による投与に適する型である、請求項22の方法。
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