JP2009545605A - フィトエストロゲン製剤およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
「エストロゲン受容体」は、本明細書で用いるように、イソ型及びその変異型を含むが、これらに限定されない、エストロゲンに結合する核受容体遺伝子ファミリーにおけるタンパク質を意味する。ヒトエストロゲン受容体は、アルファ及びベータイソ型(本明細書では「ERα」及び「ERβ」と呼ぶ)を含む。
1つ又は複数のフィトエストロゲンを含む組成物を本明細書で述べる。多くのフィトエストロゲンが分離され、同定され、すべてがエストロゲン受容体結合選択性を有するさらなる類似体が作製された。1つの実施形態において、ERβ結合選択性を有し、個別に投与するとき神経保護活性を示す2つ以上の植物由来エストロゲン様分子及び/又は構造類似体を含む組成物についてである。これらの組成物は、エストロゲン欠乏関連症状及び障害、特に年齢関連認知低下及びアルツハイマー病(「AD」)などの神経変性疾患を予防するのに有用である。
本明細書で述べる組成物は、ERβに対して結合優先性を示す1つ又は複数のフィトエストロゲン又は天然起源選択的エストロゲン受容体モジュレーター(SERM)を含む。PhytoSERMは、実施例1で述べるように同定することができる。適切なphytoSERMは、ゲニステイン、ダイゼイン、エコール、IBSO03569及びその組合せを含むが、これらに限定されない。ゲニステイン、ダイゼイン、エコール及びIBSO03569の構造を図1に示す。その他のものは、表1に示す。好ましい化合物は、血液脳関門を通過する。
化合物は単独の活性薬剤として投与することができるが、それらを本明細書に記載する1つ又は複数の他の化合物と組み合わせて、かつ/又はエストロゲン受容体媒介性障害の治療及び/又は予防に用いられる他の作用物質と組み合わせて用いることもできる。或いは、持続的な治療及び予防効果を得るために、化合物をこのような1つ又は複数の作用物質とともに逐次的に投与することができる。適切な作用物質は、他のSERM並びに伝統的エストロゲンアゴニスト及びアンタゴニストを含むが、これらに限定されない。
化合物は、経腸、経皮、経粘膜、鼻内又は非経口投与することができる。経口剤用賦形剤は、下で簡単に述べるように当業者に知られており、即時、持続、遅延又はパルス状放出を可能にするために用いることができる。化合物は、経皮パッチ、デポーを介して、ゲル剤、ローション剤、軟膏剤、リポソーム製剤、懸濁剤、泡剤、噴霧剤又は坐剤などの局所用担体を用いて膣又は直腸に、肺又は鼻腔経路により、口腔粘膜を介して頬又は舌下に投与することもできる。これらの製剤のすべてに対して適切な賦形剤が知られている。化合物は、生理食塩水、滅菌水若しくはリン酸緩衝生理食塩水、又はiv、im、皮下若しくはip注射用の適切な油に溶解又は懸濁することができる。
化合物は、経腸、非経口、肺、鼻、粘膜及び他の局所投与経路を含む様々な方法で投与することができる。例えば、投与の適切な方式としては、経口、皮下、経皮、経粘膜、イオン泳動、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻内、硬膜下、直腸、膣及び吸入が挙げられる。
キットは、投与する製剤を含むものを提供することができる。製剤は、1日1回又は1日複数回投与することができる。製剤は、経腸、非経口又は局所投与することができる。キットは、投与する活性物質(複数可)、賦形剤及び担体、並びに製剤の投与の指示書を一般的に含む。キットはまた、注射器などの製剤を投与するのに用いられる装置/用具を含み得る。
PhytoSERMの同定
ERβは、記憶機能及びニューロンの生存のエストロゲン誘発性増進に関連付けられた。ゲニステインと結合したヒトERβ LBDの最適化複合体構造に基づいて、植物ベースERβ選択的リガンドの存在を測定するために、天然起源化学データベースに対するコンピュータ援用の構造に基づく仮想スクリーニングを行った。データベーススクリーニングから得られた12の代表的ヒットを両ERに対するそれらの結合プロファイルについて評価したところ、そのうちの3つがERαに比べてERβに対する100倍以上の結合選択性を示した。
分子の同定
データベース中の化合物の同定
すべての計算作業は、IRIX6.5オペレーティングシステム(Silicon Graphic Inc.)を搭載したSGI Octaneワークステーションで実施した。最初に、ゲニステインと複合したヒトERβ LBDの3D結晶学的構造をProtein Data Bank(PDB ID:1QKM)からダウンロードした。複合体の構造をAccelrys分子モデリングソフトウエアパッケージInsightII 2000(Accelrys Inc.)により固定し、エネルギーを最小化した。約25000の植物ベースの天然分子又は誘導体を含む内部2D天然起源化学物質コレクションをAccelrysモデリングシフトウエアパッケージCatalyst9.8(Accelrys Inc.)を用いて3D多立体配座データベースに変換した。
データベーススクリーニングから得られた候補分子の結合親和力及び選択性は、精製バキュロウイルス発現ヒトERβ又はERα及び蛍光エストロゲンリガンドEL Red(PanVera Corp.)を用いて蛍光偏光競合結合検定により測定した。試験分子を検定緩衝液で2×濃度に連続希釈した(200μM〜200pM)。ERβ(30nM)又はERβ(60nM)とEL Red(2nM)のプレインキュベート済み2×複合体50μLを96ウエル非結合表面黒色マイクロプレート(Corning Life Sciences)の各ウエルに100μLの最終容積で加えた。ER及びEL Redを含む陰性対照(0%阻害に相当する)及び遊離EL Redのみを含む陽性対照(100%阻害に相当する)を含めた。室温で2時間のインキュベーションの後に、偏光値をTecan GENios Proリーダーを用いて535nm/590nm励起/放射で測定し、試験分子濃度の対数に対してプロットした。IC50値(ERからEL Redの半分を置換する試験分子の濃度)を非線型最小二乗分析を用いてプロットから決定した。
His475におけるND1と水素結合を形成することができる31種の分子を選択し、受容体とのファンデルワールス(VDW)定数(構造における環の数)及び静電相互作用(水素結合の数)に有利な化学的特徴に基づいて3つのカテゴリーに分類した。受容体との強いVDW相互作用を有するが、水素結合に寄与しない10分子をカテゴリーIVに分類した。これらの分子は、その構造における4つの環からなり、エストロゲン受容体に高い親和力で結合する内因性エストロゲンである17β−エストラジオールに認められるような受容体結合部位の中心との疎水性相互作用を促進する可能性があるそれらの構造に3又は4、5又は6員環を含む。
神経変性の予防のためのERβ選択的PhytoSERM併用の前臨床確認
神経変性及びアルツハイマー病(AD)の予防に関連するニューロン生存及び分子/機能マーカーに対する単独又は併用投与したときのERb選択的PhytoSERMの影響を検討した。
17β−エストラジオールをSteraloids(Newport、RI)から購入した。ゲニステイン、ダイゼイン及びエコールをIndofine Chemical(Hillsborough、NJ)から購入した。IBSO03569をInterBioScreen(Moscow、Russia)から購入した。これらの化合物の構造を図1に示す。
ERα結合検定
ERα受容体(約0.2mg/ml、Affinity Bioreagents)をpH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(「PBS」)で約2×103mg/mlに希釈した。次いで、50μlのEPα−PBS溶液をフラッシュプレート(flashplate)の各ウエルに加えた。プレートを密封し、暗所に4℃で16〜18時間保存した。使用直前に緩衝受容体溶液を除去し、プレートをウエル当たり200μlのPBSで3回洗浄した。受容体がウエル表面から脱出することを避けるために、洗浄は一般的に試薬のウエルへの緩やかな分注により行った。
ERβ受容体(約0.2mg/ml、Affinity Bioreagents)をpH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(「PBS」)で約2×103mg/mlに希釈した。次いで、50μlのERβ−PBS溶液をフラッシュプレート(flashplate)の各ウエルに加えた。プレートを密封し、暗所に4℃で16〜18時間保存した。使用直前に緩衝受容体溶液を除去し、プレートをウエル当たり200μlのPBSで3回洗浄した。受容体がウエル表面から脱出することを避けるために、洗浄は一般的に試薬のウエルへの緩やかな分注により行った。
トランスフェクトCHO細胞の構築
トランスフェクトCHO細胞は、American Type Culture Collection(「ATCC」、Rockville、Md.)から入手したCHO KI細胞から得た。トランスフェクト細胞を次の4つのプラスミドベクターを含むように修飾した。(1)ヒトエストロゲン受容体のDNAを含むpKCRE、(2)ネオマイシン耐性をもたらすタンパク質のDNAを含むpAG−60−neo、(3)ラットオキシトシンプロモーター及びホタルルシフェラーゼタンパク質のDNAを含むpRO−LUC及び(4)ハイグロマイシン耐性をもたらすタンパク質のDNAを含むpDR2。これらの遺伝学的に修飾されたCHO細胞を用いたすべての形質転換は、COGEM(Commissie Genetische Modificatie)のガイドラインに従ってrec−VMT包含のもとに実施する。スクリーニングは、エストラジオールの非存在下(発情原性)又はエストラジオールの存在下(非発情原性)で実施する。
ニューロン培養の調製
海馬ニューロンの初代培養を胎生18日目(E18d)ラット胎児から得た。簡単に述べると、ラット胎児の脳から切り離した後、海馬をハンクスの平衡塩類溶液(137mM NaCl、5.4mM KCl、0.4mM KH2PO4、0.34mM Na2HPO4.7H2O、10mMグルコース及び10mM HEPES)中0.02%トリプシンで37℃で5分間処理し、先端熱加工パスツールピペットに繰返し通して解離させた。形態分析のために2×104から4×104個の細胞を蓋付き35mmペトリ皿中のポリ−D−リシン(10μg/ml)被覆22mmカバーガラス上で平板培養し、生化学的分析のために1×105個/mlの細胞を96ウエル培養プレートのポリ−D−リシン被覆24ウエル上、又は3〜5×105個/mlの細胞を0.1%ポリエチレンイミン被覆60mmペトリ皿上で平板培養した。神経細胞は、最初の3日間は加湿10%CO2大気中で37℃でB27、5U/mlペニシリン、5μg/mlストレプトマイシン、0.5mMグルタミン及び25μMグルタミン酸塩を添加したフェノールレッド不含有Neurobasal培地(NBM、Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)中37℃で、その後はグルタミン酸塩を含まないNBM中で成長させた。血清不含有Neurobasal培地中で成長させた培養は、約99.5%のニューロンと0.5%のグリア細胞を生む。
グルタミン酸塩曝露
初代海馬ニューロンを化合物で48時間前処理した後、100mM NaCl、2.0mM KCl、2.5mM CaCl2、1.0mM MgSO4、1.0mM NaH2PO4、4.2mnM NaHCO3、10.0mMグルコース及び12.5mnM T−LEPESを含むHEPES緩衝液中で室温で5分間100μMグルタミン酸塩に曝露させた。グルタミン酸塩への曝露後直ちに、培養をHEPES緩衝液で1回洗浄し、試験化合物を含む新たなNeurobasal培地と交換した。培養を培養インキュベータに戻し、翌日に細胞生存能を測定する前に24時間インキュベートした。
CREBリン酸化
核溶解物を次のように調製した。簡単に説明すると、ポリ−D−リシン被覆培養皿上で成長させた海馬ニューロンを化合物で適切な期間処理し、冷PBSで1回洗浄し、1mlのPBS中にこすり落とした。次いで、細胞を5000rpmで5分間遠心分離し、ペレットを細胞質抽出緩衝液(10mM HEPES、1mM EDTA、60mM KCl、0.075%Igepal並びにプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル)に溶解し、200μlピペットチップに通して懸濁した。4℃で30〜45rpmでのインキュベーションの後、試料を5000rpmで5分間遠心分離して、上清中細胞質抽出物を得た。上清細胞質抽出物を除去し、核抽出緩衝液(20mM TrisHCl、1.5mM MgCl2、420mM NaCl、0.2mM EDTA、25%グリセロール、0.5%Igepal並びにプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル)をペレットに加えた後、5MNaClを加えて核膜を破壊した。4℃で30〜45rpmでのインキュベーションの後、試料を12000rpmで10分間遠心分離して、核抽出物を含む上清を得た。
PBS中0.005% SDS、0.1% Igepal、0.2mMオルトバナジン酸ナトリウム、0.2mMフッ化フェニルメチルスルホニル及びプロテアーゼ阻害剤混合物を含む氷冷溶解緩衝液中で細胞を4℃で45分間インキュベートすることにより溶解する前に、初代海馬ニューロンを化合物で48時間前処理した。細胞溶解物を10000rpmで4℃で10分間遠心分離し、上清中のタンパク質の濃度をBCA Protein Asaay(Pierce Biotechnology,Inc.、Rockford、IL)を用いて測定した。25μgの総タンパク質を試料緩衝液を含む15μlの2×SDSで希釈し、水で最終容積を30μlとした。95〜100℃の熱板上で5分間変性した後、1レーン当たり25μlの混合物を10% SDS−ポリアクリルアミドミニゲル上に載せた後、90Vで電気泳動した。次いで、タンパク質をゲルからポリジフッ化ビニリデン膜(Millipore Corp.、Bedford、MA)に電気転移した。非特異的結合部位を0.05% Tween(商標)−20を含むPBS(PBS−Tween(商標))中5%乾燥脱脂粉乳でブロックした。膜を、1%ウマ血清を含むPBS−Tween(商標)(Vector Laboratories,Inc.、Burlingame、CA)で1:250に希釈したBcl−2(Zymed Laboratories,Inc.、S.San Francisco、CA)に対する一次モノクローナル抗体とともに4℃で一夜インキュベートし、次いで、1%ウマ血清を含むPBS−Tween(商標)で1:5000に希釈した二次西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ウマ抗マウスIgG(Vector Laboratories,Inc.、Burlingame、CA)とともに室温で2時間インキュベートし、ペルオキシダーゼのTMB基質(Vector Laboratories,Inc.、Burlingame、CA)で膜を顕色化してBcl−2タンパク質を可視化した。β−アクチン(Santa Cruz Biotechnology,Inc.、Santa Cruz、CA)レベルを測定して等タンパク質ローディングを確認し、高範囲Precision Protein Standards(Bio−Rad Laboratories、Hercules、CA)を用いてタンパク質サイズを測定した。画像デジタル化ソフトウエアUn−Scan−Tt version5.1(Silk Scientific,Inc.、Orem、UT)を用いた光学密度分析により、バンドの相対強度を定量化した。
群間の統計的に有意な差は、一元配置分散分析(ANOVA)と続くNewman−Keuls事後解析により判定した。
発情原性、抗発情原性に関する未熟ラット子宮栄養バイオアッセイ
抗エストロゲン様活性は、1日当たり0.2μgの17−β−エストラジオール(「E2」)の投与に起因する子宮湿重量の増加を抑制する試験化合物の能力により測定した。E2対照群と比較して特定の投与群における子宮重量の統計的に有意な低下は、抗発情原性を示唆する。
試験したPhytoSERMを図1に示す。
図2にERβ及びERαに対する4つの既知ERリガンドの競合結合曲線を示す。結合曲線からこれらのリガンドについて決定されたIC50は、ラジオリガンドアッセイのような代替法を用いて以前に報告された値と一致しており、両ERへの小分子の結合プロファイルの測定におけるこの検定法の信頼性が実証された。
表3及び図3にLDH放出の測定による、初代海馬ニューロンにおける超生理学的グルタミン酸塩(100μM)誘発性神経毒性に対する4種のERβ選択的フィトエストロゲン様分子の用量依存的神経保護効果を示す。##P<0.01媒体単独処理培養との比較;*P<0.05及び**P<0.01グルタミン酸塩単独処理培養との比較。
ここで、Vtreatmentはフィトエストロゲン処理培養からの個々の値であり、Vglutamateはグルタミン酸塩単独処理培養からの平均値であり、Vcontrolは媒体処理対照培養からの平均値である。##P<0.01媒体単独処理培養との比較;*P<0.05及び**P<0.01グルタミン酸塩単独処理培養との比較。
これらの結果は、初代ニューロンにおける抗アポトーシスタンパク質Bcl−2及びBcl−xLの発現のウエスタン分析から得られた結果と類似している。図4A〜4Bに成体卵巣摘出ラットから得られたラット初代海馬ニューロン及び海馬組織におけるBcl−2及びBcl−XLの発現に対する影響を示す。7分裂にわたり成長させた初代海馬ニューロンを試験化合物(又は配合物)で48時間処理した後、ウエスタンブロット分析を行った。成体卵巣摘出ラットに1日1回、試験化合物(又は配合物)を計2回の皮下注射により投与した。2回目の注射の24時間後にラットを屠殺した。海馬組織をホモジナイズした後、ウエスタンブロット分析を行った。配合製剤は、(A)における等モル及び(B)における等重量のG:ゲニステイン;D:ダイゼイン;E:エコール;及びI:IBSO03569を含む個別のphytoSERMから構成されていた。
図5に初代海馬ニューロンにおける抗β−アミロイドタンパク質、インスリン分解酵素(「IDE」)の発現に対する併用投与したとき(4つのすべての分子について100nM)の4つのERβ選択的フィトエストロゲン様分子の影響を示す。**P<0.01媒体単独処理培養との比較。図5に初代ニューロンにおける抗β−アミロイド(抗−Aβ)タンパク質、インスリン分解酵素(IDE)の発現に対する、E2をともなうフィトエストロゲンのこれらの様々な併用影響を示す。データは、2つ、3つ又は4つのフィトエストロゲンからなる3種の併用のすべてがニューロンにおけるIDE発現を有意に増大させたことを示した。それらのうち、3つのフィトエストロゲンの併用は、最大のニューロン反応を誘発し、有効性はE2並びに2つのフィトエストロゲンの併用より大きかった。
図6に初代海馬ニューロンにおける棘マーカーであるスピノフィリンの発現に対する併用投与したとき(4つのすべての分子について100nM)の4つのERβ選択的フィトエストロゲン様分子の影響を示す。**P<0.01媒体単独処理培養との比較。ニューロン樹状突起棘の頭部に濃縮されているタンパク質であるスピノフィリンは、樹状突起の形態及びグルタミン酸作動性シナプス活性の調節に重要な役割を果たすことが示された。スピノフィリンのアップレギュレーションは、ニューロンシナプスの形成性のエストロゲン調節と相関付けられた。したがって、これらの結果は、これらのフィトエストロゲンの併用が神経栄養を促進させ、それにより、脳がシナプスにおいて活性な状態に留まることを持続させ、認知低下及び記憶喪失を予防するのに有効であることを示している。
図7A〜7Dにラット初代海馬ニューロンにおけるグルタミン酸塩(図7A)及びアミロイド1−42誘発性神経毒性に対する化合物の神経保護効果を示す。7分裂にわたり成長させた初代海馬ニューロンを試験化合物(又は配合物)で48時間前処理した後、100mMグルタミン酸塩に5分間曝露させた。カルセインAM染色によりニューロンの生存能を分析する前に、ニューロンをさらに24時間インキュベートした。試験化合物(又は配合物)で48時間前処理した後、ニューロンを3mM β−アミロイド1−42に2日間曝露させた。ニューロンの生存能は、培地中に放出されたLDH及び死細胞プロテアーゼ並びに完全な生存ニューロンにもっぱら入る生細胞プロテアーゼの活性の蛍光定量測定によって分析した。
ここで、Vtreatmentは試験化合物(又は配合物)処理培養からの個々の値であり、Vneurotoxinはグルタミン酸塩又はβ−アミロイド1−42単独処理培養からの平均値であり、Vcontrolは媒体処理対照培養からの平均値である。##P<0.01は媒体処理対照培養との比較;*P<0.05及び**P<0.01はグルタミン酸塩又はβ−アミロイド1−42単独処理培養との比較;δP<0.05はE2処理培養との比較;ζP<0.05はゲニステイン処理培養との比較;ΨP<0.05及びΨΨP<0.01は配合物(G+D)処理培養との比較;ΦP<0.05は配合物(G+D+E+I)処理培養との比較。配合製剤は、等モルの含めた個々のphytoSERMから構成されていた。G:ゲニステイン;D:ダイゼイン;E:エコール;I:IBSO03569。
図8A〜8Cに成体卵巣摘出ラットから得られた(A)ラット初代海馬ニューロン及び(B)海馬組織におけるインスリン分解酵素(IDE)/ネプリリシン(NEP)発現に対する影響を示す。(A)7DIVにわたり成長させた初代海馬ニューロンを試験化合物(又は配合物)で48時間処理した後、ウエスタンブロット分析を行った。(B)成体卵巣摘出ラットに1日1回、試験化合物(又は配合物)を計2回の皮下注射により投与した。2回目の注射の24時間後にラットを屠殺した。海馬組織をホモジナイズした後、ウエスタンブロット分析を行った。結果は、タンパク質発現の増加倍率として示し、対照のパーセント、n≧4として表す。*P<0.05及び**P<0.01は媒体処理対照培養又は動物との比較;δP<0.05及びδδP<0.01はE2処理培養との比較;ΨΨP<0.01は配合物(G+D)又はゲニステイン処理培養との比較;ΦP<0.05は配合物(G+D+E+I)処理培養との比較。配合製剤は、(A)における等モル及び(B)における等重量のG:ゲニステイン;D:ダイゼイン;E:エコール;及びI:IBSO03569を含む個別のphytoSERMから構成されていた。
図9A〜9Eに成体卵巣摘出ラットにおける前脳ミトコンドリアシトクロムcオキシダーゼ(COX)活性に対する影響を示す。ラットに1日1回、試験化合物(又は配合物)を計2回の皮下注射により投与した。2回目の注射の24時間後にラットを屠殺した。前脳ミトコンドリアを分離した後、免疫捕獲法を用いてCOX活性の分光光度測定を行った。550nmにおける比色吸光度を115分間にわたり5分ごとに記録した。COX活性は、還元シトクロムcの酸化の初期速度として示し、直線範囲内の2時点間(<20分)の初期勾配を計算して求めた。(上パネル)吸光度の経時変化;(下パネル)ミトコンドリアCOX活性の増加%、n≧4;*P<0.05及び**P<0.01は媒体投与対照動物との比較;ΨP<0.05はゲニステイン投与動物との比較。配合製剤は、E2:17b−エストラジオール;G:ゲニステイン;D:ダイゼイン;E:エコール;I:IBSO03569を含む等重量の個別のphytoSERMから構成されていた。
表4に成体卵巣摘出ラットにおける子宮重量に対する影響を示す。エストロゲン様刺激に対する子宮重量の変化を用いて、子宮組織に対する試験化合物のエストロゲン様特性を評価することができる。下で述べる1つの実施例において、エストロゲンの低い内因性レベルを有する未熟雌ラットに試験化合物を3日間毎日(皮下)投与した。化合物は、皮下注射用に適宜調合した。対照として、17β−エストラジオールのみを1つの投与群に投与した。媒体対照投与群も試験に含めた。最終投与の24時間後に、動物を剖検し、子宮を摘出し、傷を付け、ブロットし、重量を測定した。媒体対照群と比較したときの特定の投与群の子宮重量の統計的に有意な増加は、発情原性の証拠を示すものである。
in vitro及びin vivo分析により、選択した試験phytoSERMの併用は、神経毒で惹起したときのニューロンの生存を持続させ、ニューロン/脳における神経保護及びβ−アミロイドの代謝/クリアランスに重要な役割を果たすものとしてのタンパク質の発現を促進し、脳ミトコンドリアの機能を増大させることに関する有効性の有意な増大をもたらしたことが実証された。特に、ゲニステイン、ダイゼイン及びエコールの等重量での併用は、ニューロン/脳検定法において17b−エストラジオールと同等又はより大きい最大有効性をもたらした。これと対照的に、そのような併用は、17b−エストラジオールによって著しく増加した子宮重量に対して影響を示さなかった。
Claims (14)
- 血液脳関門を通過する、エストロゲン受容体βに選択的、優先的に結合する2つ以上の天然に存在する化合物を含む、神経障害又は老化の治療又は予防を必要とする個体への投与用の製剤。
- 2つ以上の天然に存在する化合物がゲニステイン、ダイゼイン、エコール、IBSO03569及びその組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の製剤。
- 1つ又は複数の賦形剤又は担体をさらに含む、請求項1に記載の製剤。
- 他の選択的エストロゲン受容体モジュレーター、エストロゲンアゴニスト、エストロゲンアンタゴニスト、抗腫瘍剤、アルキル化剤、抗生物質、ホルモン、抗代謝剤、抗骨粗鬆症薬、ビタミン、栄養補助食品、抗酸化剤及び補酵素からなる群から選択される1つ又は複数の追加の活性物質をさらに含む、請求項1に記載の製剤。
- 経腸、非経口又は局所投与用に調合されている、請求項1に記載の製剤。
- 有効な量の請求項1から5のいずれかに記載の製剤を患者に投与することを含む、エストロゲンの欠乏に関連する1つ又は複数の症状を軽減又は予防する方法。
- 患者が閉経後の女性である、請求項6に記載の方法。
- エストロゲン欠乏関連リスクが神経疾患又は障害である、請求項6に記載の方法。
- 前記神経疾患が神経変性疾患である、請求項8に記載の方法。
- 前記神経変性疾患が認知欠損又は記憶喪失である、請求項9に記載の方法。
- 前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項9に記載の方法。
- 有効な量の請求項1に記載の製剤を、それを必要とする患者に投与することを含む、ほてりをさらに治療又は予防するための、請求項6に記載の方法。
- 有効な量の請求項1に記載の製剤を、それを必要とする患者に投与することを含む、エストロゲン欠乏に関連する認知低下を治療又は予防するための、請求項6に記載の方法。
- 有効な量の請求項1に記載の製剤を、それを必要とする患者に投与することを含む、エストロゲン欠乏に関連する骨粗鬆症を治療又は予防するための、請求項6に記載の方法。
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