KR20220043857A - 3-페닐-2h-크로멘 유도체 및 이를 함유하는 알츠하이머의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 3-페닐-2H-크로멘 유도체 및 이를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 일 측면에서 제공하는 화합물, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 Aβ의 섬유화 및 올리고머화를 높은 활성으로 저해함에 따라 알츠하이머의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 3-페닐-2H-크로멘 유도체 및 이를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
퇴행성 신경 질환은 중추신경계와 말초신경계의 구조와 기능이 시간이 지남에 따라서 서서히 변하게 됨으로써 발생하게 되는 신경계 질환들을 통칭하며, 이 중 발병 빈도가 가장 높은 질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease)이다. 알츠하이머가 발생하는 정확한 원인은 아직 명확하게 밝혀지지 않았지만, 아밀로이드 플라크가 정상 알츠하이머 단백질을 변형시켜 플라크 덩어리를 형성해 고유한 기능을 잃어버리게 하는 것으로 추정된다. 조직병리학적으로는 뇌의 전반적인 위축, 뇌실의 확장, 신경섬유의 다발성 병변과 초로성 반점 등의 특징을 보인다.
알츠하이머에서 발생하는 몇 가지 주요 병리학적 증상 중에서, 아밀로이드 베타 (amyloid beta, Aβ)의 응집으로 인한 콜린성 신경세포의 세포독성은 알츠하이머의 주원인으로 알려져 있으며, Aβ의 침착/축적은 비가역적인 신경 퇴화의 원인이 된다. 따라서 Aβ생성 저해, Aβ로 인한 활성산소 발생 또는 염증 억제 또는 Aβ항체를 이용한 뇌내 Aβ제거 등 Aβ를 대상으로 하는 다양한 접근 전략의 알츠하이머 치료제가 개발되고 있다. 게다가, Aβ의 비정상적인 변화는 알츠하이머가 발병하기 약 10-20년 전에 발견될 수 있으며, 이는 알츠하이머의 조기 예방 가능성을 나타낸다. 지난 20년 동안, Aβ생산 및 응집을 억제하여 독성 Aβ수준을 낮추기 위하여 많은 방법이 시도되고 있다.
Aβ단량체는 알츠하이머 발병기 동안 올리고머화 및 섬유화 과정에 의하여 올리고머 및 섬유소로 비정상적으로 전환된다. 따라서, 이러한 과정을 이해하는 것은 알츠하이머 발병에 대한 약물의 발견에 중요하다. 예를 들어, Aβ올리고머에 의해 발생된 독성은 올리고머를 생성하는 단계인 핵 형성 현상을 억제하여 감소시킬 수 있지만, 신장 단계만을 억제하여 반대로 악화될 수도 있다. Aβ섬유소에 특이적으로 결합하는 티오플라빈 T를 사용한 분석은 Aβ섬유화에 대한 약물의 억제 효과를 빠르고 쉽게 조사할 수 있기 때문에, 약물 발견을 위한 도구로 사용되고 있다. 최근 개발된 멀티머 검출 시스템(Multimer Detection System;MDS)는 올리고머 형태의 단백질만을 검출할 수 있는 기술로, 인간의 혈액에서 Aβ올리고머화를 측정하여 알츠하이머를 진단하는 것으로 보고되어 있다. ThT 및 MDS 분석을 조합하여 약물에 의한 핵 형성 및 Aβ응집의 변화를 동시에 해석하는 전략은 알츠하이머 치료제를 체계적으로 발견할 수 있는 기회를 제공할 것이다.
한편, 알츠하이머의 발병과 질병의 경과에서 비정상적 단백질의 응집 이외에 신경염증반응 (neuroinflammation)이 또 다른 중요한 인자로 주목받기 시작했다. 중추신경계에 손상이 오게 되면 백혈구(leukocyte), 소신경교세포(microglia), 별아교세포(astrocyte)가 활성화되고 다양한 염증 관련 물질들이 분비되는데 이러한 일련의 종합적인 반응을 "신경염증반응"이라고 정의한다.
뇌신경의 급성 염증반응은 일반적으로 감염, 독성물질 등으로 인한 직,간접적 손상들로부터 뇌를 보호하는 기전이지만, 여러 요인들로 인해 염증 관련 신호들의 불균형이 생기면, 만성적인 염증반응으로 단계가 넘어가게 된다. 다시 말해서, 초기 급성 염증반응은 보호 작용을 하지만, 만성화될수록 신경세포에 부정적인 영향을 미치게 되는 것이다. 이러한 만성적 신경 염증 상태는 microglia 세포 등의 glia 세포를 활성화 시키고, 이들로부터 여러 가지 cytokine의 분비를 촉진하는데, 이러한 면역 반응들로 인해 신경 손상이 지속적으로 이루어지는 것이다. 따라서, 알츠하이머의 병태 생리에서 microglia, astrocyte 및 cytokine등의 염증 관련 인자들의 역할에 관한 연구 및 이를 기반으로 한 치료제 개발이 활발히 이루어지고 있다.
알츠하이머에 대한 실험을 통하여 신경학적 합병증을 포함한 여러 질환에 대하여 화학 물질이 사용되는 것으로 보고되어 있다. 이러한 화학 물질 중 이소플라본은 알츠하이머에서 신약 개발을 위한 후보 중 하나이다. 이소플라본은 식물계에 광범위하게 존재하는 디페놀 (Diphenol) 화합물로서 배당체 형태인 제니스틴 (genistin), 다이진 (daidzin), 글리시틴 (glycitin)과 비배당체인 제니스타인 (genistein), 다이드제인 (daidzein), 글리시테인 (glycitein) 등의 형태로 존재한다. 대두 단백질에서 발견되는 제니스타인(genistein) 및 유도체는 항혈관형성, 항암, 항염증, 항신경염증 및 신경 보호 효과를 나타낸다. 특히, 제니스타인은 쥐에서 Aβ침착, 과인산화 및 신경염증을 약화시켜서 신경 세포 변성에 대한 보호 효과를 발휘할 수 있다. 이와 유사하게, 다이드제인(daidzein) 이소플라본의 박테리아 대사 산물인 에쿠올(equol)이 항암, 항신경염증 및 신경보호효과를 나타내었다.
이에 본 발명자들은 이소플라본 유래 새로운 크로멘 유도체가 퇴행성 뇌질환에 효과가 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 퇴행성 뇌질환의 예방, 치료 또는 개선에 효과가 있는 이소플라본 유래 새로운 크로멘 유도체 화합물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 측면은 본 명세서에 기재된 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 측면은 상기 화합물, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 측면은 상기 화합물, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 측면은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제(medicament)를 제조하기 위한, 상기 화합물, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공한다.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 화합물, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 Aβ의 섬유화 및 올리고머화를 높은 활성으로 저해하고, 항산화 작용과 항염증 작용을 나타내어 신경세포를 보호할 뿐만 아니라, 인지기능을 개선함으로써, 퇴행성 뇌질환, 구체적으로 알츠하이머의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 약물에 따른 Aβ42의 섬유화 저해 효과를 측정한 그래프이다.
도 2는 MDS를 통하여 각 약물의 Aβ42의 올리고머화 저해 효과를 측정한 그래프이다.
도 3은 BV2 세포에서 약물의 세포독성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 LPS 처리된 BV2 세포에서 SPA1427을 처리한 경우, 세포독성 (위) 및 산화질소 생성 억제 (아래) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 C6 세포에서 약물의 세포독성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 N2a 세포에서 약물의 세포 독성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 SH-SY5Y 세포에서 약물의 세포 독성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 LPS 처리된 BV2 세포에서 약물의 산화질소 생성 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8b는 LPS 처리된 BV2 세포에서 약물의 세포독성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 LPS 처리된 primary microglia 세포에서 약물의 산화질소 생성 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9b는 LPS 처리된 primary microglia 세포에서 약물의 세포독성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10a는 LPS 처리된 BV2 세포에서 약물의 IL-6 발현 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10b는 LPS 처리된 BV2 세포에서 약물의 TNF-a 발현 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11a는 LPS 처리된 BV2 세포에서 약물의 COX-2 발현 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11b는 LPS 처리된 BV2 세포에서 약물의 iNOS 발현 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12a는 LPS 처리된 BV2 세포에서 약물의 JNK 인산화 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12b는 LPS 처리된 BV2 세포에서 약물의 p38 인산화 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 C6 세포에서 신경성장인자 분비량 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14a는 N2a 세포에서 neurite outgrowth 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14b는 N2a 세포에서 neurite outgrowth 결과를 나타내는 그림이다.
도 15는 primary microglia 세포에서 beta amyloid oligomer 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16은 LPS 처리된 HEK293 세포 및 치매유전자인 PSEN1 과발현된 HEK293 세포에서 세포독성을 확인한 그래프이다.
도 17는 HEK293 세포 및 치매유전자인 PSEN1 과발현된 HEK293 세포에 본 발명 화합물을 처리하였을 때 PSEN1 발현 저해를 나타내는 그래프이다.
도 18은 SPA1413의 농도에 따른 MGO-AGEs 파쇄 결과를 나타내는 그래프이다.
도 19는 본 발명 화합물을 처리한 경우, MGO-AGEs 파쇄 결과를 나타내는 그래프이다.
도 20 (a 내지 e)은 5xFAD 마우스에서 본 발명 화합물 투여 후, 사물인지 능력 및 공간기억에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 21 (a 및 b)은 5xFAD 마우스에서 본 발명 화합물 투여 후, 변경 행동 능력에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 22은 5xFAD 마우스에서 본 발명 화합물 투여 후, 회피 기억력 회복에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 23은 인지기능 개선 실험에 사용된 마우스의 염색된 조직들을 형광 현미경을 통해 관찰한 사진이다.
도 24 및 25는 인지기능 개선 실험에 사용된 마우스의 염색된 조직에서의 amyloid plaque의 수를 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 26은 마우스의 cortex 및 hippocampus에서 MHC II 양성반응을 나타내는 미세아교세포를 보여주는 그림이다.
도 27은 마우스의 cortex 및 hippocampus에서 MHC II 양성반응을 나타내는 미세아교세포 수를 나타낸 그래프이다.
도 28은 마우스의 cortex 및 hippocampus에서 Oligomeric Aβ proteins 발현 결과이다.
도 29는 마우스의 체중변화를 보여주는 그래프이다.
도 2는 MDS를 통하여 각 약물의 Aβ42의 올리고머화 저해 효과를 측정한 그래프이다.
도 3은 BV2 세포에서 약물의 세포독성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 LPS 처리된 BV2 세포에서 SPA1427을 처리한 경우, 세포독성 (위) 및 산화질소 생성 억제 (아래) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 C6 세포에서 약물의 세포독성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 N2a 세포에서 약물의 세포 독성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 SH-SY5Y 세포에서 약물의 세포 독성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 LPS 처리된 BV2 세포에서 약물의 산화질소 생성 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8b는 LPS 처리된 BV2 세포에서 약물의 세포독성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 LPS 처리된 primary microglia 세포에서 약물의 산화질소 생성 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9b는 LPS 처리된 primary microglia 세포에서 약물의 세포독성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10a는 LPS 처리된 BV2 세포에서 약물의 IL-6 발현 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10b는 LPS 처리된 BV2 세포에서 약물의 TNF-a 발현 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11a는 LPS 처리된 BV2 세포에서 약물의 COX-2 발현 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11b는 LPS 처리된 BV2 세포에서 약물의 iNOS 발현 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12a는 LPS 처리된 BV2 세포에서 약물의 JNK 인산화 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12b는 LPS 처리된 BV2 세포에서 약물의 p38 인산화 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 C6 세포에서 신경성장인자 분비량 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14a는 N2a 세포에서 neurite outgrowth 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14b는 N2a 세포에서 neurite outgrowth 결과를 나타내는 그림이다.
도 15는 primary microglia 세포에서 beta amyloid oligomer 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16은 LPS 처리된 HEK293 세포 및 치매유전자인 PSEN1 과발현된 HEK293 세포에서 세포독성을 확인한 그래프이다.
도 17는 HEK293 세포 및 치매유전자인 PSEN1 과발현된 HEK293 세포에 본 발명 화합물을 처리하였을 때 PSEN1 발현 저해를 나타내는 그래프이다.
도 18은 SPA1413의 농도에 따른 MGO-AGEs 파쇄 결과를 나타내는 그래프이다.
도 19는 본 발명 화합물을 처리한 경우, MGO-AGEs 파쇄 결과를 나타내는 그래프이다.
도 20 (a 내지 e)은 5xFAD 마우스에서 본 발명 화합물 투여 후, 사물인지 능력 및 공간기억에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 21 (a 및 b)은 5xFAD 마우스에서 본 발명 화합물 투여 후, 변경 행동 능력에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 22은 5xFAD 마우스에서 본 발명 화합물 투여 후, 회피 기억력 회복에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 23은 인지기능 개선 실험에 사용된 마우스의 염색된 조직들을 형광 현미경을 통해 관찰한 사진이다.
도 24 및 25는 인지기능 개선 실험에 사용된 마우스의 염색된 조직에서의 amyloid plaque의 수를 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 26은 마우스의 cortex 및 hippocampus에서 MHC II 양성반응을 나타내는 미세아교세포를 보여주는 그림이다.
도 27은 마우스의 cortex 및 hippocampus에서 MHC II 양성반응을 나타내는 미세아교세포 수를 나타낸 그래프이다.
도 28은 마우스의 cortex 및 hippocampus에서 Oligomeric Aβ proteins 발현 결과이다.
도 29는 마우스의 체중변화를 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 독립적으로 수소이거나,
C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬카보닐이다.
다른 일 측면에서,
R1 및 R2는 독립적으로 수소이거나,
C2-8의 직쇄 또는 분지쇄 알킬카보닐 일 수 있다.
다른 일 측면에서,
R1 및 R2는 독립적으로 수소이거나,
또 다른 측면에서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물일 수 있다.
(1) 3-(4-하이드록시페닐)-2H-크로멘-7-올(3-(4-hydroxyphenyl)-2H-chromen-7-ol);
(2) 4-(7-(부티릴옥시)-2H-크로멘-3-일)페닐 부티레이트(4-(7-(butyryloxy)-2H-chromen-3-yl)phenyl butyrate);
(3) 4-(7-((2-프로필펜타노일)옥시)-2H-크로멘-3-일)페닐 2-프로필펜타노에이트(4-(7-((2-ethylpentanoyl)oxy)-2H-chromen-3-yl)phenyl 2-ethylpentanoate).
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류, 트리플루오로아세트산, 아세테이트, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜서 제조할 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 광학 이성질체, 수화물 등을 모두 포함한다.
용어 "수화물(hydrate)"은 비공유적 분자간력(non-covalent intermolecμLar force)에 의해 결합된 화학양론적(stoichiometric) 또는 비화학양론적(non-stoichiometric) 량의 물을 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 수화물은 비공유적 분자간 힘으로 결합되는 화학양론적 또는 비화학양론적 양의 물을 포함할 수 있다. 상기 수화물은 1당량 이상, 바람직하게는, 1당량 내지 5당량의 물을 함유할 수 있다. 이러한 수화물은 물 또는 물을 함유하는 용매로부터 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 결정화시켜 제조될 수 있다.
용어 "용매화물(solvate)"은 비공유적 분자간력에 의해 결합된 화학양론적 또는 비화학양론적 양의 용매를 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 그에 관한 바람직한 용매들로는 휘발성, 비독성, 및/또는 인간에게 투여되기에 적합한 용매들이 있다.
용어 "이성질체(isomer)"는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 구조적 또는 입체적으로 다른 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 이러한 이성질체에는 호변이성질체(tautomer) 등의 구조 이성질체와, 비대칭 탄소 중심을 가지는 R 또는 S 이성체, 기하이성질체(트랜스, 시스) 등의 입체 이성질체, 광학 이성질체(enantiomer)가 모두 포함된다. 이들 모든 이성질체 및 그것의 혼합물들 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 제조방법을 청구한다.
<제조예>
Reaction conditions: (a) i) (4-hydroxyphenyl) acetic acid, BF3·Et2O, 120 ℃, 10 min; ii) DMF, 50 ℃, 10 min; iii) MeSO2Cl, 80 ℃; (b) BnBr, K2CO3, DMF, 40 ℃, 2 h; (c) NaBH4, THF, EtOH, rt, 4 h; (d) 20% Pd(OH)2, Ammonium formate, EtOH, THF, H2O, 100 ℃, 35 min; (e) 20% HCl-EtOH, EtOH, rt, 45 min; (f) butyryl chloride or 2-propylpentanoyl chloride, pyridine, DCM, rt, 4 h.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 퇴행성 뇌질환은, 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머(Alzheimer's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 알코올성 뇌신경질환, 척수손상(spinal cord injury) 및 알코올성 치매 및 베르니케-코르사코프 증후군(Wernicke-Korsakoff's syndrome)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명 화합물은 Aβ42의 섬유화 및 올리고머화를 억제하는데, Aβ로 인한 활성산소 발생 또는 염증 억제 또는 Aβ항체를 이용한 뇌내 Aβ제거를 통하여 비가역적인 신경 퇴화를 억제하여, 알츠하이머를 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
Aβ는 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein; APP)이 β 및 γ-secretases에 의해 분해되어 생성된다. 이러한 Aβ의 비정상적 축적은 AD와 관련된 신경세포 퇴화의 원인으로 여겨진다. Aβ단량체는 알츠하이머 발병기 동안 올리고머화 및 섬유화 과정에 의하여 올리고머 및 섬유소로 비정상적으로 전환된다. Aβ에 의한 독성기작은 Aβ 섬유화와 깊이 연관되어 있는데, 이 섬유화 과정에서 다양한 상태의 응집체, 예를 들어 용해성 올리고머(soluble oligomers), 원섬유체(protofibril) 및 아밀로이드 섬유체(amyloid fibril)를 형성한다.
한편, 알츠하이머의 발병과 질병의 경과에서 비정상적 단백질의 응집 이외에 신경염증반응 (neuroinflammation) 역시 다른 하나의 중요한 인자이다. 중추신경계에 손상이 오게 되면 백혈구(leukocyte), 소신경교세포(microglia), 별아교세포(astrocyte)가 활성화되고 다양한 염증 관련 물질들이 분비되는데, 염증반응의 증가는 신경세포의 손상 뿐 아니라 베타아밀로이드의 축적을 증가시켜 알츠하이머의 원인이 될 수 있다고 알려져 있다.
신경성장인자 (nerve growth factor)는 특정 뉴런의 성장과 분화, 생존 및 기능 유지에 중요한 단백질이며, 신경세포의 기능을 촉진하는 역할을 하여 부족할 경우 세포가 사멸하게 된다. 알츠하이머가 진행되는 과정에서 신경성장인자 시스템에 변화가 발생하고, 이러한 변화는 이차적으로 콜린성 뉴런의 기능을 저하시키고, 뇌 신경세포의 가소성을 감소시키며, 아밀로이드 단백 침착, 타우 단백의 과인산화와 같은 알츠하이머의 진행을 촉진시켜 결과적으로 신경퇴행성 신호가 우세해지면서 알츠하이머가 발생하고 인지 기능이 저하된다.
PSEN1(Presenilin-1)은 가족성 알츠하이머병과 관련된 유전자이다. 이 유전자의 일부 돌연변이는 독성이 더 강한 Aβ 단편의 생성을 초래할 수 있다. PSEN1에 의해 암호화된 단백질은 γ-secretase의 활성 부분이며 이 단백질 복합체는 Notch 수용체의 절단에 관여한다. 또한, PSEN1은 해마 척추 신경염(hippocampal vertebral neuritis)에서 시냅스전달물질의 방출에 관여한다. 또한, PSEN1의 돌연변이는 알츠하이머 병과 관련이 있으며 일부는 전두측두엽치매, ALS 등과 같은 다른 신경 질환과도 밀접한 관련이 있다.
최종당산화물 (Advanced glycoxidation End-products)은 단백질의 당화작용으로 만들어지는 물질로, 굽거나 튀기는 음식에서 생기며, 채내에서 단백질과 당이 결합되어 생성되기도 하는 물질이다. 당산화물은 분해되지 않는 노폐물로 세포독성을 띄는 활성산소를 만들어내면 당뇨, 암, 동맥경화, 고혈압, 고지혈증의 원인이 되기도 하는데, 이 물질이 뇌신경을 손상시키는 경우 알츠하이머를 유발한다고 알려져 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 화합물 SPA1413, SPA1426 및 SPA1427가 Aβ42의 섬유화 저해 (도 1) 및 Aβ42의 올리고머화 저해 (도 2) 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
쥐 유래 미세아교세포 (BV2 세포) 및 신경세포 (N2a 세포), 래트 유래 신경아교세포 (C6 세포), 사람 유래 신경세포 (N2a 세포)에 본 발명 화합물 SPA1413, SPA1426 및 SPA1427을 처리할 경우, 세포독성이 없는 것을 확인하였고, BV2 세포에서 LPS 처리에 의하여 과생산되는 산화질소가 본 발명 화합물 처리에 의하여 감소되는 것을 확인하였다 (도 3 내지 9).
또한, BV2 세포에서 LPS 처리에 의하여 과발현하는 염증 인자 (IL-6, TNF-a, COX-2, iNOS, JNK 및 p38)가 본 발명 화합물 처리에 의하여 감소되는 것을 확인하였고 (도 10 내지 12), C6 세포에서 본 발명 화합물 처리에 의하여 신경성장인자 분비량이 증가하고 (도 13), N2a 세포에서 neurite outgrowth 가 증가함을 확인하였다 (도14). 본 발명자들은 primary microglia 세포에서 Aβ1-40를 처리에 의하여 감소한 세포 생존률이 본 발명 화합물 처리에 의하여 증가함을 확인하였다 (도 15).
아울러, 구체적인 실시예에서, PSEN1이 과발현된 HEK293 세포에 본 발명 화합물을 처리하였을 때 PSEN1 의 발현이 저해되는 것을 확인하였고 (도 16 및 17), 본 발명 화합물의 최종당산화물 파쇄능을 확인하였다 (도 18 및 19).
또한, 치매 동물 모델을 이용하여, 본 발명의 화합물을 투여하는 경우 동물의 체중에는 변화가 없지만 (도 29), 본발명 화합물의 사물인지 능력, 공간 기억능력, 변경 행동 능력, 회기 기억력 회복 효과를 확인하였고 (도 20 내지 22), 본 발명 화합물을 투여한 마우스의 염색된 조직에서 amyloid plaque의 수가 감소하고 (도23 내지 25), MHC II 양성반응을 나타내는 미세아교세포가 감소하였으며 (도 26 내지 27), Oligomeric Aβ proteins의 발현이 감소하였음을 확인함으로써 (도 28), 본 발명의 화합물이 알츠하이머의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로써 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등 이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유한다.
본 발명의 다른 일 측면은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 화합물을 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머 병의 치료방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 또 다른 일 측면은 알츠하이머 병의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 상기 화합물을 제공한다. 나아가, 본 발명의 다른 일 측면은 알츠하이머 병의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제(medicament)를 제조하기 위한, 상기 화합물의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예, 실험예를 통해 상세히 설명한다.
단, 후술하는 실시예, 실험예는 본 발명을 일 측면에서 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> 7-Hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)chromen-4-one의 제조
Resorcinol(2.0 g, 18.16 mmol)과 4-Hydroxyphenylacetic acid(2.8 g, 18.16 mmol)를 two-neck round-bottom flask에 넣고 질소가스로 치환 후 120℃에서 Boron trifluoro etherate (5.2 mL)을 10분 동안 천천히 적가 및 교반 한다. 실온으로 낮춘 후 생성된 하얀색 고체를 DMF(24 mL)에 완전히 녹인 후 50℃에서 10분 동안 교반하였다. 온도를 80℃로 올린 후 methane sulfonyl chloride(13.7 g, 119.88 mmol)를 넣어 30분 동안 반응시킨 후 TLC로 확인하여 0℃에서 물을 적하여 반응을 종결한다. Ethyl acetate로 추출한 후 얻어진 유기층을 NaHCO3, 물과 포화식염수로 세척하고 MgSO4로 건조, 여과하여 감압 농축한다. 얻어진 고체를 chloroform, 물 및 소량 MeOH로 세척하여 아이보리색 고체로 화합물 1 (1.9 g, 7.56 mmol, 41.6%)을 얻었다.
R f = 0.28 (n-hexane/EtOAc = 1:1); 1H NMR (400MHz, DMSO) δ10.75 (OH, s), 9.55 (OH, s), 8.29 (1H, s), 7.96 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.38 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.93 (1H, dd, J = 8.8, 2.0 Hz), 6.85~6.79 (3H, m); 13C NMR (100MHz, DMSO) δ184.2, 172.1, 166.9, 166.7, 162.3, 139.6, 136.8, 132.9, 132.0, 124.6, 124.4, 114.1, 111.6.
<제조예 2> 7-Benzyloxy-3-(4-benzyloxyphenyl)chromen-4-one의 제조
상기 화합물 1(540.8 mg, 2.11 mmol)을 dimethylformamide(2 mL)에 녹인 후, K2CO3(961.8 mg, 6.38 mmol)을 첨가한 후 30분간 교반하였다. Benzyl bromide(1.1 g, 6.38 mmol)을 첨가한 후 40℃에서 2시간 반응시켰다. TLC로 반응을 확인하고 물로 반응종료 후 ethyl acetate로 추출하여 얻어진 유기층을 물과 포화식염수로 세척하고 MgSO4로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 column chromatography로 정제하여 하얀색 고체로 화합물 2 (743.2 mg, 1.70 mmol, 79%)을 얻었다.
R f = 0.27 (n-hexane/EtOAc = 4:1); 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ8.22(1H,d, J = 9.2 Hz), 7.91 (1H, s), 7.50~7.33 (10H, m), 7.07~7.03 (3H, m), 6.93 (1H, s), 5.18 (2H, s), 5.11 (2H, s); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ162.9, 152.1, 135.7, 130.1, 128.8, 128.6, 128.4, 127.9, 127.5, 127.4, 115.0, 114.9, 105.0, 101.3, 70.5, 70.1
<제조예 3> 7-Benzyloxy-3-(4-benzyloxyphenyl)chroman-4-ol의 제조
상기 화합물 2(743.2 mg, 1.70 mmol)을 THF-EtOH(10:1 v/v, 22 mL)에 완전히 녹인 후 NaBH4(302.6mg, 8.21mmol)를 첨가하여 실온에서 24시간 동안 반응을 진행하였다. TLC로 확인한 후 물로 반응을 종료한 후 ethyl acetate로 추출하여 얻어진 유기층을 물과 포화 식염수로 세척하고 MgSO4로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 column chromatography로 정제하여 하얀색 고체로 화합물 3(410 mg, 1.44 mmol, 48%)을 얻었다.
R f = 0.30 (chloroform/n-hexane/ethyl acetate = 20:5:1); 1HNMR (400MHz, CDCl3) δ7.30 (5H, m), 7.21 (3H, d, J = 8.8 Hz), 7.12 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.82 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.51 (1H, dd, J = 8.4, 2.4 Hz), 4.57 (1H, d, J = 4.8 Hz), 4.58 (2H, s), 4.49 (1H, dd, J = 11.2, 3.2 Hz), 4.34 (1H, dd, J = 11.2, 4.8 Hz), 3.78 (3H, s), 3.76 (3H, s), 3.34 (1H, m); 13CNMR (100MHz, CDCl3) δ160.8, 154.1, 152.9, 143.3, 139.2, 124.5, 121.1, 120.0, 109.4, 102.8, 101.1, 100.7, 95.3, 70.6, 71.0, 39.3.
<제조예 4> 3-(4-Hydroxyphenyl)chroman-4,7-diol의 합성
상기 화합물 3(100 mg, 0.21 mmol)을 EtOH-THF(2:1 v/v, 15 mL)을 녹인 후 20% Pd(OH)2(100 mg, 100 wt%)를 첨가하고 120℃로 가열 및 교반한다. 온도를 실온으로 식힌 후, 1M ammonium formate(248.9 mg, 3.9 mmol) 용액을 적가하고 120℃로 가열하여 1시간 동안 반응을 진행하였다. TLC로 반응을 확인하고 반응액을 celite pad를 통하여 여과하고 methanol로 씻어준 뒤 감압 농축한 후 column chromatography로 정제하여 하얀색 고체로 화합물 4(30.7 mg, 0.09mmol, 45%,)을 얻었다.
R f = 0.18 (n-hexane/ethyl acetate =1/1); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ7.18 (1H,d,J = 8.4 Hz), 7.03 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.71 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.38 (1H; dd; J = 8.4, 2.4 Hz), 6.25 (1H, d, 2.4 Hz), 4.74 (1H, d, J = 2.4 Hz), 4.24 (1H, dd, J = 11.6, 3.2 Hz), 4.14 (1H; dd; J = 10.0, 8,8 Hz), 3.01~2.96 (1H, m); 13C NMR (100MHz, CD3OD) δ159.1, 157.4, 156.8, 131.9, 130.9, 130.1, 117.9, 116.3, 109.6, 103.3, 69.9, 69.3, 47.7.
<실시예 1> 3-(4-Hydroxyphenyl)-2H-chromen-7-ol(SPA1413)의 합성
상기 화합물 4(50 mg, 0.19 mmol)을 EtOH(2 mL)에 녹인 후 20% HCl-EtOH (0.2 mL)을 첨가 후 45분 동안 교반하였다. TLC로 확인하고 물로 반응을 종료한 후 ethyl acetate로 추출하여 얻어진 유기층을 물과 포화 식염수로 세척하고 MgSO4로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 column chromatography로 정제하여 적갈색 고체로 화합물 5(23 mg, 0.09 mmol, 49%)를 얻었다.
R f = 0.24 (n-hexane/EtOAc = 2:1); 1H NMR (400MHz, CD3OD) δ 7.29 (2H, d, J = 6.8 Hz), 6.89 (1H, d, J = 6.4 Hz), 6.78 (2H, d, J = 6.8 Hz), 6.67 (1H, s), 6.34 (1H; dd, J = 6.4, 1.6 Hz), 6.26 (1H, d, J = 1.6 Hz), 5.02 (2H, S); 13C NMR(100MHz, CD3OD)δ159.3, 158.3, 155.7, 129.8, 129.4, 128.6, 126.8, 118.5, 116.9, 116.5, 105.6, 103.5, 68.1.
<실시예 2> 4-(7-(butyryloxy)-2H-chromen-3-yl)phenyl butyrate(SPA1426)의 합성
상기 화합물 5(200 mg, 0.83 mmol)를 무수 dichloromethane(DCM, 5 ml)에 녹인 후 butyryl chloride(0.5 ml, 4.8 mmol)와 pyridine(0.5 ml, 6 mmol)을 첨가 후 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 확인하고 반응 종료 후 용매를 감압농축하여 제거하였다. 얻어진 잔사를 ethyl acetate에 용해하고 유기층을 물로 세척, NaSO4로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 column chromatography로 정제하여 화합물 6(160 mg, 0.42 mmol, Yield = 50%)을 얻었다.
R f = 0.50 (n-hexane/ethyl acetate = 90:10); 1H NMR (400MHz, CH3OD) δ7.44(2H, d, J= 8.0 Hz), 7.02-7.05 (3H, m), 6.81 (s, 1H), 6.54 (1H, d, J= 8.0 Hz), 6.47 (s, 1H), 5.06 (s, 2H), 2.43-2.49(m, 4H), 1.63-1.69(m, 8H), 0.95 (6H, t, J= 8.0Hz)
<실시예 3> 4-(7-((2-ethylpentanoyl)oxy)-2H-chromen-3-yl)phenyl 2-ethylpentanoate(SPA1427)의 합성
상기 화합물 5(200 mg, 0.83 mmol)를 무수 dichloromethane(DCM, 5 ml)에 녹인 후 2-propylpentanoyl chloride(0.5 ml, 3 millimole)와 pyridine(0.5 ml, 6 mmol)을 첨가 후 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 확인하고 반응 종료 후 용매를 감압농축하여 제거하였다. 얻어진 잔사를 ethyl acetate에 용해하고 유기층을 물로 세척, NaSO4로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 column chromatography로 정제하여 화합물 7(150 mg, 0.3 mmol, Yield = 36%)을 얻었다.
R f = 0.80 (n-hexane/ethyl acetate = 95:5); 1H NMR (400MHz, CH3OD) δ 7.56 (2H, d, J= 8.0 Hz), 7.10-7.17 (3H, m), 6.93 (s, 1H), 6.62 (1H, d, J= 8.0 Hz ), 6.54 (s, 1H), 5.18 (s, 2H), 2.61-2.69 (m, 2H), 1.61-1.78 (m, 8H), 1.49-1.56 (m, 8H), 1.01 (12H, t, J= 8.0Hz)
<실험예 1> Aβ42 올리고머화 및 섬유화에 대한 약물의 억제 효과 평가
<1-1> 싸이오플라빈 T(Thioflovin T;ThT) 분석
ThT 분석을 이용하여 Aβ42의 섬유화에 약물이 저해 효과를 일으키는지 확인하였다. 동결 건조된 AggreSure Aβ42(# AS-72216, AnaSpec)를 차가운 Tris 완충 식염수(TBS; pH 7.2)에 용해시켜 160 μg/mL의 Aβ42용액을 제조하였다. 이를 1.5 mL 튜브에 분주하고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. ThT(# T3516, Sigma-Aldrich) 및 약물 후보를 TBS에 용해시켜 최종 농도를 500 μM으로 만들었다. 희석된 응집체를 386 well black plate(Nunc # 242764)에 첨가하고, ThT 및 약물 후보 물질과 혼합하여 37℃에서 180분 동안 배양하였다. 형광 신호는 매 5분 간격으로 plate reader(Victor3, PerkinElmer)로 측정하였다.
도 1을 통해서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 화합물(SPA1413, SPA1426, SPA1427)이 음성 대조군(Aβ42의 희석 완충액만을 첨가한 경우) 및 이소플라본 유도체 화합물인 Daidzien이나 Equol에 비하여 Aβ42 섬유화를 저해시키는 효과를 보였다.
<1-2> MDS 분석
ThT 실험 결과를 바탕으로 선별된 약물로 멀티머 검출시스템(Multimer detiction system; MDS) 분석을 사용하여 Aβ42의 올리고머화 억제 효과를 평가하였다. 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 처리된 Aβ42(# A-1163-1, rPeptide)를 1% NH4OH(# 221228, Sigma-Aldrich)에 용해시켜 즉시 500 μL의 인산완충생리식염수에 희석하고(PBS; pH 7.5), 1.5 mL 튜브에 분주하여 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. Aβ42및 화합물을 PBS와 혼합하여 최종 농도를 각각 200 μg/mL 및 100 μM으로 만들고 실온에서 배양하였다. Aβ42의 응집은 -80℃에서 유지함으로써 종료되었다.
각각의 약물과 Aβ42와의 반응 후에, 시간별로 올리고머 형태의 Aβ42를 측정하여 올리고머 저해 효과를 측정하였다. 그 결과, 도 2를 통해서 확인되듯이, 본 발명의 화합물(SPA1413, SPA1426, SPA1427)이 음성 대조군(Aβ42의 희석 완충액만을 첨가한 경우) 및 이소플라본 유도체 화합물인 Daidzien이나 Equol에 비하여 Aβ42 올리고머화를 저해시키는 효과를 보였다.
<실험예 2> 세포 독성 평가 연구
<2-1> 마우스 유래 미세아교세포에서의 세포독성 평가
한국 세포주 은행에서 분양받은 마우스 유래 미세아교세포 (BV2 cell)를 10% FBS 및 1% 항생제가 첨가된 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Media) 배지에서 배양하고, 96-웰 플레이트에 4×105cell/well로 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 그 후, daidzein, o-desmethylangolensin (O-DMA), S-equal, SPA1413 및 SPA1426을 다양한 농도 (0.5, 1 및 5 μM)로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후, 0.5 mg/ml 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 용액을 1시간 처리하고, 환원된 포르마잔 (formazan)을 150 μl의 디메틸설폭사이드 (DMSO)에 녹여 570 nm 파장에서 미세분광광도계(microspectrophotometer)로 세포 생존율 (cell viability)을 측정하였다. 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군 (Control)의 세포 생존율을 100%로 하여, 각 시료들을 처리한 경우의 세포 생존율을 평가하여 그 결과를 도 3 및 도4 (위)에 나타내었다.
도 3 및 4 (위)로부터 알 수 있는 바와 같이, 각 시료들은 다양한 농도로 처리한 결과 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
<2-2> 렛 유래 신경아교세포에서의 세포독성 평가
한국 세포주 은행에서 분양받은 렛 유래 신경아교세포 (C6 cell)를 10% FBS 및 1% 항생제가 첨가된 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Media) 배지에서 배양하고, 96-웰 플레이트에 4×105cell/well로 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 그 후, daidzein, o-desmethylangolensin, S-equal, SPA1413 및 SPA1426을 다양한 농도 (1 및 5 μM)로 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
도 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 각 시료들은 다양한 농도로 처리한 결과 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
<2-3> 마우스 유래 신경세포에서의 세포독성 평가
한국 세포주 은행에서 분양받은 마우스 유래 신경세포 (N2a cell)를 10% FBS 및 1% 항생제가 첨가된 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Media) 배지에서 배양하고, 96-웰 플레이트에 2×105cell/well로 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 그 후, daidzein, o-desmethylangolensin, S-equal, SPA1413 및 SPA1426을 다양한 농도 (1 및 5 μM)로 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
도 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, 각 시료들은 다양한 농도로 처리한 결과 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
<2-4> 사람 유래 신경세포에서의 세포독성 평가
한국 세포주 은행에서 분양받은 사람 유래 신경세포 (N2a cell)를 10% FBS 및 1% 항생제가 첨가된 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Media) 배지에서 배양하고, 96-웰 플레이트에 2×105cell/well로 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 그 후, daidzein, o-desmethylangolensin, S-equal, SPA1413 및 SPA1426을 다양한 농도 (1 및 5 μM)로 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
도 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 각 시료들은 다양한 농도로 처리한 결과 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
상기 결과는 화합물의 세포 독성이 없고 세포 보호효과가 있음을 의미한다.
<실험예 3> 뇌 세포주를 이용한 항신경염증 연구
<3-1> Nitric Oxide 생성량 평가
BV2 세포는 4 x 105 cell/well로 96-웰 플레이트에 분주하고, 1태령 ICR 마우스의 뇌에서 분리한 primary microglia 세포는 4 x 105 cell/well로 24-웰 플레이트에 분주하였다.
24시간 동안 안정화시킨 후, daidzein, o-desmethylangolensin, S-equal, SPA1413 및 SPA1426을 다양한 농도 (1 및 5 μM)로 처리하고 30분 뒤에 LPS (100 ng/ml)로 처리하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 배지를 모아 Griess reagent 용액 (1% sulfanilamide and 0.1% N-1-naphthyl ethylenediamine dihydrochloride in 5% phosphoric acid)을 사용하여 NO 생성량을 평가하였다. 구체적으로, 총 50 μL의 supernatant를 새로운 96 well plate로 이동시키고, 동일 부피의 Griess reagent 용액과 혼합하여, 570 nm에서 OD를 측정하였다. 또한, 세포생존률은 실험예 2와 동일한 방법으로 진행하여 계산하였다.
도 4 (아래) 및 도 8a 및 9a 로부터 알 수 있는 바와 같이, LPS로 처리시 NO 생성량이 증가하였으며, SPA 1413, SPA 1426 및 SPA 1427을 처리한 군에서는 농도의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
특히, IC50 값을 확인 시에 SPA 1413 및 SPA 1426 처리한 군에서 유의적으로 LPS 처리한 군보다 유의적으로 낮은 값을 나타내었다 (표 1).
| Compounds | IC50 (μM) | |
| 1 | Daidzein | 86.48 |
| 2 | O-DMA | 34.66 |
| 3 | S-equol | 11.70 |
| 4 | SPA1413 | 5.20 *** |
| 5 | SPA1426 | 3.67 *** |
| PC | L-NMMA (10 μM) | 15.12 |
또한, 도 8b 및 9 b에서 확인되는 바와 같이, 세포생존율이 SPA 1413 및 SPA 1426 처리한 군에서 LPS 처리군에 비하여 증대되는 것을 확인하였다.
<3-2> IL-6 및 TNF-a 생성량 평가
BV2 세포를 4 x 105 cell/well로 96-웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 그 후, daidzein, o-desmethylangolensin, S-equal, SPA1413 및 SPA1426을 5 μM로 처리하고 30분 뒤에 LPS (100 ng/ml)로 처리하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 배지를 모아 효소면역측정법인 Competitive Enzyme-Linked Immuno Assay (ELISA) kit (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 통해 BV2 배양 상층액에서 생성된 IL-6 및 TNF-a 분비량을 정량하였다 LPS를 처리한군의 IL-6 및 TNF-a 분비량을 100%로 하여, 각 시료들을 처리한 경우의 IL-6 및 TNF-a 분비량을 평가하여 그 결과를 도 10 a, b에 나타내었다.
도 10a, b로부터 알 수 있는 바와 같이, LPS로 처리시 IL-6 및 TNF-6 생성량이 증가하였으며, SPA 1413 및 SPA 1426 처리한 군에서는 유의적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
<3-3> COX-2 및 iNOS 단백질 발현 억제 효과 확인
BV2 세포를 1 x 106 cell/well로 60 mm dish에 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 그 후, S-equal, SPA1413 및 SPA1426을 5 μM로 처리하고 30분 뒤에 LPS (100 ng/ml)로 처리하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 완전히 가득찬 세포를 PBS로 세척 하고, lysis buffer (PRO-PREP™ Protein Extraction Solution, Intron Biotechnology, Seongnam, Korea)를 사용하여 용해시켰다. 그 후, bovine serum albumin (BSA)를 표준으로 하여, Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Califonia, USA)로 상기 용해물 상측액의 단백질 함량을 측정하여 각 시료의 총 단백질 함량을 조정하였다. 그 후 전기영동을 위해, 10-12% SDS-PAGE 겔에 상기 시료들을 각각 30 μg의 단백질량이 되도록 로딩하고, PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 5% 탈지유로 블록킹한 후, COX-2 또는 iNOS (Cell Signaling Technologies, Massachusetts, USA)에 대한 항체를 각각 이용하여 ChmiDoc XRS+ imaging system (Bio-Rad, CA, USA)으로 검출하였다.
도11a, b로부터 알 수 있는 바와 같이, LPS로 처리시 COX-2와 iNOS 단백질 발현양이 대조군에 비해 유의적으로 증가되는 것을 확인하였다. 반면, SPA 1413 및 SPA 1426 처리한 군에서는 LPS 처리군에 비해 유의적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
<3-4> MAPKs (JNK 및 P38) 단백질 발현 억제 효과 확인
BV2 세포를 1 x 106 cell/well로 60 mm dish에 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 그 후, S-equal, SPA1413 및 SPA1426을 5 μM로 처리하고 30분 뒤에 LPS (100 ng/ml)로 처리하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 완전히 가득찬 세포를 PBS로 세척 하고, lysis buffer (PRO-PREP™ Protein Extraction Solution, Intron Biotechnology, Seongnam, Korea)를 사용하여 용해시켰다. 그 후, bovine serum albumin (BSA)를 표준으로 하여, Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Califonia, USA)로 상기 용해물 상측액의 단백질 함량을 측정하여 각 시료의 총 단백질 함량을 조정하였다. 그 후 전기영동을 위해, 10-12% SDS-PAGE 겔에 상기 시료들을 각각 30 μg의 단백질량이 되도록 로딩하고, PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 5% 탈지유로 블록킹한 후, JNK 또는 p38 (Cell Signaling Technologies, Massachusetts, USA)에 대한 항체를 각각 이용하여 ChmiDoc XRS+ imaging system (Bio-Rad, CA, USA)으로 검출하였다.
도12a, b로부터 알 수 있는 바와 같이, LPS로 처리시 JNK와 P38 단백질 발현양이 대조군에 비해 유의적으로 증가되는 것을 확인하였다. 반면, SPA 1413 및 SPA 1426 처리한 군에서는 LPS 처리군에 비해 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과는 SPA1413, SPA1426, SPA1427이 신경염증 유발인자 저해 효과가 있음을 의미하며, 이는 본 발명 화합물이 신경염증을 유발하는 염증인자의 생성을 저해함으로써, 신경세포를 보호하는 효과가 있음을 의미한다.
<실험예 4> 신경보호효과 연구
<4-1> 렛 유래 신경아교세포에서의 nerve growth factor (NGF) 분비량 평가
C6 cell를 96-웰 플레이트에 4×105cell/well로 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 그 후, daidzein, o-desmethylangolensin, S-equal, SPA1413 및 SPA1426을 5 μM로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 배지를 모아 효소면역측정법인 Competitive Enzyme-Linked Immuno Assay (ELISA) kit (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 통해 C6 배양 상층액에서 생성된 NGF 분비량을 정량하였다 정상군의 NGF 분비량을 100%로 하여, 각 시료들을 처리한 경우의 NGF 분비량을 도 13에 나타내었다.
도13으로부터 알 수 있는 바와 같이, SPA 1413 및 SPA 1426 처리한 군에서는 정산군에 비하여 유의적으로 NGF함량이 증대되는 것을 확인할 수 있었다.
<4-2> N2a 세포에서의 neurite outgrowth 평가
N2a 세포를 1 x 104cell/well로 24 well plate에 분주하고, daidzein, o-desmethylangolensin, S-equal, SPA1413 및 SPA1426을 5 μM로 처리한후, 실시간세포관찰기인 InCucyte를 통하여 neurite outgrowth 유무를 평가하였다. 각 세포들은 2시간 마다 사진으로 측정되었으며, Incucyte software를 통하여 neurite 수를 측정하여 계산하였다.
도 14a, b에 나타낸 바와 같이, daiazein, SPA1413 및 SPA1426에서 유의적으로 neurite outgrowth가 증가되는 것을 확인하였다. 특히, 형태학적으로도 대조군에 비하여 SPA1413 및 SPA1426 처리군의 neurite outgrowth가 증가됨을 확인할 수 있었다.
<4-3> Primary microglia 세포주에서의 beta amyloid oligomer 억제능 확인
1태령 ICR 마우스의 뇌에서 분리한 primary microglia 세포를 2 x 105 cell/well로 96-웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 그 후, daidzein, S-equal, SPA1413 및 SPA1426을 5 μM로 처리하고 1 시간 뒤에 beta amyloid oligomer (Aβ1-40, 10 μM)로 처리하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 세포생존률은 실험예2 동일한 방법으로 진행하였다.
도 15에 나타낸 바와 같이, Aβ1-40를 처리한 군에서는 대조군에 비하여 감소하였다. 특히, SPA1413을 처리한 군에서는 유의적으로 세포생존률을 증대시키는 것으로 확인되었다.
상기 결과는 본 발명의 화합물이 신경성장인자 분비를 증가시키고, 축삭의 형성을 촉진하며, 아밀로이드베타에 의한 세포 사멸을 저해함으로써, 신경세포를 보호하는 효과가 있음을 의미한다.
<실험예 5> 치매 유전자 (PSEN1) 발현 저해 효과 실험
<5-1> 세포독성연구(MTT assay)
HEK293 세포와 치매유전자인 PSEN1 과발현 HEK293 세포를 96 well plate에 2×105 cells/well의 농도가 되도록 DMEM 배양액에 분주하여 overnight 동안 안정화 시킨 후, 시료(SPA1413)를 농도별(1, 5, 10μM)로 처리한 후 24시간 동안 반응시켰다. 배양액을 제거한 후, 0.5 mg/ml MTT solution을 100 μl씩 각 well에 넣고 최소 1시간 37℃incubator에서 배양한 후 MTT를 제거하고 DMSO를 200 μl씩 분주하여 well에 생성된 formazin을 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여, 세포 독성 여부를 확인하였다.
도 16으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 SPA1413 처리군에서의 세포 생존율은 정상 대조군(Control)과 동일하거나 거의 유사하였음이 확인되었다. 특히, HEK 293 세포주에서 PSEN1 유전자의 과발현 시킨 세포주에서 정상 세포주에 비하여 증가하는 것을 확인할 수 있는데, 이는 본 발명 화합물이 신경세포에 대해서 독성이 없을 뿐만 아니라, 치매 유전자가 과발현된 세포에 대해서 세포 보호 효과가 있음을 의미한다.
<5-2> 치매 유전자 저해 확인 실험
HEK293 세포와 PSEN1 과발현 HEK293 세포를 6 well plate에 1×106 cells/well의 농도가 되도록 DMEM 배양액에 분주하여 overnight 동안 안정화 시킨 후, 시료를 처리하지 않거나 시료(SPA1413)를 농도별(0.1, 1μM)로 처리한 후, 24시간 동안 반응시킨 후, TRIzol 시약을 통해 세포로부터 RNA를 추출하였다. 역전사를 제조사의 사양에 따라 GoScript™역전사 시스템으로 수행하였고, 표준 프로토콜에 따라 표준 SYBR 그린 PCR 키트 및 Roche Light®Instrument를 통해 20 μl의 부피로 qRT-PCR 반응을 수행하였다. 상대 유전자 발현 수준은 2-ΔΔCt 방법으로 계산하였다.
도 17로부터 PSEN1 유전자 과발현 시킨 세포주에서 SPA1413 를 처리하는 경우, 증가된 PSEN1 유전자의 발현을 저해하는 것을 알 수 있으며, 이는 본 발명 화합물이 퇴행성 뇌질환, 특히 알츠하이머에 있어서 유용한 치료제가 될 수 있음을 의미한다.
<실험예 6> 메틸글리옥살(Methylglyoxal, MGO) 유도 최종당화산물(Advanced Glycation End products. AGEs) 파쇄 효능연구
메틸글리옥살(MGO)을 BSA(bovine serum albumin) 및 아지드화 나트륨 (sodium azide)과 혼합한 후 7일 동안 37 ℃에 보관하여 최종당화산물(AGEs)을 제조하였다. 메틸글리옥살(MGO)로부터 유도된 최종당화산물을 MGO-AGEs로 지칭한다. MGO-AGEs 1 mg/ml 농도의 최종당화산물에 SPA1413 화합물을 농도별(0.1, 0.2, 0.4 mM)로 24시간 동안 처리하였다. 양성대조군으로는 최종당화산물(AGEs) 억제제로 알려진 아미노구아니딘(aminoguandine, AG)을 사용하였다. TNBSA(2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산), 4% 소듐바이카보네이트(sodium bicarbonate) 시약을 넣어 반응시킨 후, 10% 소듐 도데실 설페이트(sodium dedecyl sulfate) 및 1N 염산 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이 후, microplate reader기를 이용하여 최종당화산물 (AGEs) 분해물인 유리 아민의 양을 335 nm에서 측정하여 최종당화산물(AGEs) 파쇄 효능을 평가하였다.
도 18을 통해서, 본 발명의 SPA1413를 처리한 군은 음성 대조군(MGO-AGEs)과 비교하여 유리 아민의 양을 증가시킴으로써 최종당화산물을 파쇄하는 효능을 가지고 있음을 알 수 있다.
또한, 도 19에서 보면, SPA1413, SPA1426 및 SPA1427 각각을 처리한 결과, SPA1413과 비교하여 SPA1426 및 SPA1427의 경우 유리 아민의 양을 증가시킴으로써 보다 우수한 최종당화산물 파쇄 효능을 나타냈다.
<실험예 7> 인지기능 평가 실험
<7-1> 실험 동물 준비
알츠하이머가 유발되는 5X-FAD 형질전환 마우스(transgenic mouse)를 이용하여 실험을 진행하였다. 5X FAD 마우스는 인간의 APP(695)를 과발현하는 돌연변이에서 Swedish(K670N, M671N), Florida(I716V), London(V717I) 및 Presenilin 1(M146L) 모두가 변이된 알츠하이머 동물 모델이다.
5xFAD 마우스는 Jacson Lab으로부터 구입 후, 공급처에서 제공된 정보를 바탕으로 C57B16/SJL F1 암컷과의 교미를 통해 동종 번식을 하였다. 제조타이핑(genotyping)을 통해, 정상군(WT)과 유전자변형군(5xFAD)으로 나누었고, 4.5개월 령의 5xFAD 마우스(Tg)와 연령대비 대조군(WT)을 포함하여 그룹당 7~9마리 그룹으로 나뉘었다. WT 또는 Tg 그룹에, 경구로 vehicle 또는 SPA1413 10mg/kg 농도로 1개월간 매일 1회 투여하였다. SPA1413이 알츠하이머에 대한 치료 효과가 있는지 여부를 테스트하기 위해 5개 그룹(WT-vehicle; WT-SPA1413 5xFAD- vehicle; 5xFAD-SPA1413; 5xFAD-donepezil)의 마우스의 인지 능력을 평가하였다.
<7-2> 사물인지 시험(Novel object recognition test)
Novel object Recognition test는 Ethovision XT 9 system을 이용하여 동물이 새로운 물체에 대해 관심이 있는지를 측정하였다. 불투명한 박스에 동물이 사육되는 환경과 유사한 환경을 만들어 준 후, 동물을 박스에 1일간 적응을 시켜주었다. 실험동물이 새롭게 인지할 수 있는 물체를 넣어준 후, 이에 대해 얼마나 관심을 가지는지에 대해 물체 근처에 머문 시간, 빈도 등을 측정하였다. 약물에 대한 효과로 새로운 물체에 대한 인지 능력에 대한 차이를 보이는지 확인하였다.
그 결과 도 20 (a 내지 e)을 통해 알 수 있듯이, SPA1413를 투여한 5xFAD 마우스(5xFAD-SPA1413)는 5xFAD-saline 그룹에 비해 object recognition test 결과와 Memory index 결과에서 유의적인 차이를 나타내었고, total distance와 velocity에서는 그룹 간 큰 차이가 없었다. 이러한 결과는 5xFAD 마우스에서 SPA1413 약물 투여에 의해 인지 능력과 공간 관련 기억력이 증가되었음을 보여준다.
<7-3> Y자 미로시험(Y-maze test)
Y자 미로시험을 이용하여 기억 손상을 평가하였다. Y자 미로시험은 Y 모양의 arm을 수조 안에 설치하였다. 동물에게 que가 보이도록 가지 모양 끝에 설치하고, Ethovision XT 9 system을 통해 동물의 움직임을 8분 동안 관찰하였다. 각 arm에 임의의 번호를 정한 후 동물이 들어가는 번호를 기록하였다. 동물은 갔었던 길을 기억하고, 새로운 길로 가려는 행동을 통하여 기억력을 살펴보았다.
그 결과 도 21 (a 및 b)을 통해 알 수 있듯이, SPA1413를 투여한 5xFAD 마우스(5xFAD-SPA1413)는 5xFAD-saline 그룹에 비해 변경 행동(spontaneous alteration) 결과에서 유의적인 차이를 나타내었고, total arm entries에서는 그룹 간 큰 차이가 없었다. 이러한 결과는 5xFAD 마우스에서 SPA1413 약물 투여에 의해 변경 행동 능력 즉, 공간 기억력이 증가되었음을 보여준다.
<7-4> 수동회피실험(Passive avoidance test)
수동회피실험(Passive avoidance test): 수동회피실험을 이용하여 기억 손상을 평가하였다. 수동회피실험은 실험쥐에게 외부에서 오는 불쾌한 자극(electric shock)을 학습시켜 해당 자극에 대한 기억력을 평가하기 위해 수동회피실험을 진행하였다. Training 단계로, 어두운 환경을 좋아하는 쥐의 습성을 이용해 실험쥐가 Gemini에 입장하면 20초안에 어두운 방으로 이동하도록 학습시켰다(다음날 어두운 방에서 불쾌한 자극을 학습시키기 위함). 쥐에게 어두운 방에서는 불쾌한 자극이 주어진다는 것을 학습시킨 뒤, 해당 내용에 대한 기억력을 Step-through latency로 측정하여 평가하였다.
도 22 에서 보면, WT-saline 그룹을 기준으로 다른 그룹과 비교하였을 때, 5xFAD-vehicle 그룹의 step-through latency는 확연히 감소된 것을 확인할 수 있었다. 5xFAD mouse에 SPA1413를 투약한 그룹에서는 step-through latency가 상당히 많이 회복된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, SPA1413 투약이 알츠하이머 동물 모델에서 학습과 기억능력 향상에 도움을 준다는 것을 의미한다.
<7-5> 면역조직화학검사
동물행동실험 진행 후 실험동물들의 뇌 조직을 회수해 절편화 작업을 거쳐 6E10 항체를 이용하여 면역염색화학법을 위해 Thioflavin S를 염색하였다.
면역조직화학염색은 조직 내에 있는 특정 단백질을 염색하여 확인하는 기법이다. 행동실험에 사용한 동물들의 뇌 조직을 회수하여 한 hemisphere를 고정하고 얼려서 절편화 작업을 진행하였다. 각 slice는 22 μm로 제작하였다. 절편화된 뇌 조직을 6E10 항체와 Thioflavin S로 염색하고 slide glass에 Vectashiled를 활용해 mounting 하였다. 염색된 조직들은 형광 현미경을 통해 확인하였으며, 그 이미지는 도 23에 제시되어 있다.
제시된 6E10항체와 Thioflavin S로 염색한 이미지를 분석해서 정량화한 결과를 도 24 및 25에 제시한다. 각 group에서 실험동물 5 마리를 선정하여 분석하였다. 관찰결과, WT-saline 그룹 동물들의 cortex 및 hippocampus에서는 amyloid plaque을 찾아볼 수 없었다. 이러한 결과는, 동물실험에 사용된 해당 동물이 조직학적으로 wild type에 해당한다는 것을 보여준다. 5xFAD-vehicle, 5xFAD-SPA1413 그룹 동물들의 cortex 및 hippocampus에서 모두 amyloid plaque이 관찰되었다. 이러한 결과는, 동물실험에 사용된 해당 동물이 조직학적으로 Tg mouse에 해당한다는 것을 보여준다. 그러나, 5xFAD mouse에 SPA1413을 투약한 그룹에서는 amyloid plaque이 유의적으로 감소한 것으로 확인되었다. 10mg/kg 농도의 SPA1413 투약이 cortex와 hippocampus에서 amyloid plaque을 감소시키는 영향을 줄 수 있음을 보여준다.
WT-saline 그룹 동물들의 cortex 및 hippocampus에서는 MHC II 양성반응을 나타내는 활성화된 미세아교세포를 찾아볼 수 없었고, 5xFAD-vehicle, 5xFAD-SPA1413 그룹 동물들의 cortex 및 hippocampus에서 모두 MHC II 양성반응을 나타내는 활성화된 미세아교세포가 관찰되었다. 이러한 결과는, 동물실험에 사용된 Tg mouse에서 신경면역반응이 증가되어 있음을 보여준다. 그러나, 5xFAD mouse에 SPA1413을 투약한 그룹에서는 MHC II 양성반응을 나타내는 활성화된 미세아교세포의 수가 유의적으로 감소되어 있는 것으로 확인되었다. 10mg/kg 농도의 SPA1413 투약이 cortex와 hippocampus에서 신경면역반응을 현저히 감소시키는 영향을 줄 수 있음을 보여준다 (도 26 및 27).
<7-6> 웨스턴블롯
동물행동실험 진행 후 실험동물들의 뇌 조직을 회수해 한 쪽 뇌반구에서cortex와 hippocampus 영역의 뇌조직을 분리하여 동결시켜 보관한 후, 시험일에 녹인 후, lysis 용매를 처리하여 단백질을 분리하고 정량한 후, 동일한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 분자량에 따라 분리 및 항 oligomeric Aβ 항체를 처리하여 특정 단백질을 확인하였다.
5xFAD-vehicle, 5xFAD-SPA1413 그룹 동물들의 cortex 및 hippocampus에서 Oligomeric Aβ proteins (60-70 kDa) 를 western blot 분석으로 확인한 이미지는 도 28 에 제시되었고, Band의 intensity를 image j 프로그램으로 분석하여 정량화한 결과, 5xFAD mouse에서 10mg/kg 농도의 SPA1413 투약이 cortex와 hippocampus에서 Oligomeric Aβ proteins 양을 현저히 감소시키는 영향을 줄 수 있음을 보여준다.
이상의 결과는 본 발명 화합물이 신경세포를 보호하고, 아밀로이드 단백질의 응집을 억제함으로써 알츠하이머를 예방, 개선 또는 치료할 수 있으며, 알츠하이머 환자에서의 인지기능을 개선할 수 있는 가능성이 있음을 보여주고 있다.
<7-7> 체중 변화 확인
실험기간 동안 각 그룹별 마우스의 체중 변화를 모니터링하였고, 그룹간 유의적인 차이가 없음을 확인하였다 (도 29).
Claims (13)
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 독립적으로 수소이거나,
C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬카보닐이다.
- 제1항에 있어서,
R1 및 R2는 독립적으로 수소이거나,
C2-8의 직쇄 또는 분지쇄 알킬카보닐인 것을 특징으로 하는,
약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
R1 및 R2는 독립적으로 수소이거나,
, 또는
인 것을 특징으로 하는,
약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은,
하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물:
(1) 3-(4-하이드록시페닐)-2H-크로멘-7-올(3-(4-hydroxyphenyl)-2H-chromen-7-ol);
(2) 4-(7-(부티릴옥시)-2H-크로멘-3-일)페닐 부티레이트(4-(7-(butyryloxy)-2H-chromen-3-yl)phenyl butyrate);
(3) 4-(7-((2-프로필펜타노일)옥시)-2H-크로멘-3-일)페닐 2-프로필펜타노에이트(4-(7-((2-ethylpentanoyl)oxy)-2H-chromen-3-yl)phenyl 2-ethylpentanoate).
- 제1항에 있어서,
상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 화합물은 뇌세포에서의 Aβ42의 섬유화 또는 올리고머화를 저해하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 화합물은 신경세포를 보호하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 화합물은 최종당화산물을 파쇄하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 화합물은 PSEN1 유전자의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 화합물은 인지기능을 개선하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 화합물은 염증 인자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제 11항에 있어서,
상기 염증 인자는 산화질소 (nitric oxide), IL-6, TNF-a, COX-2, iNOS 및 MAPK 로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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