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Gebiet der
Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft einen Multianalyten-Immunoassay beispielsweise
unter Verwendung eines Biochips oder Mikrochips mit einem Array
von Analyten-spezifischen
Liganden darauf.
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Hintergrund
der Erfindung
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Biochips/Mikrochips
sind für
das Messen großer
Arrays von entweder Immunoassays oder Nukleotid-Hybridisierungsassays
beschrieben worden. Die industriell hergestellten Arrays sind gewöhnlich mit
zahlreichen einzelnen Reaktionsstellen aufgebaut, die in räumlich unterschiedlichen
Bereichen auf einem festen Träger
angeordnet sind. Die Arrays können
hohe Dichten der gleichen oder verschiedener Moleküle umfassen, die
auf der festen Trägeroberfläche immobilisiert
sind.
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Wann
immer eine Multianalyten-Kombination zu testen ist, ist es erforderlich,
die Menge jedes Analyten, der in einer unbekannten Probe vorliegt,
korrekt zu quantifizieren. Deshalb muss eine optimale Standardkurve
für jeden
Analyten erzeugt werden, der in der Multianalyten-Kombination repräsentiert
ist. Diese Standardkurve muss einen dynamischen Bereich abdecken,
der für
die Messung des speziellen Analyten, den sie repräsentiert,
geeignet ist und für
die Art von Patientenprobe, die zu messen ist, geeignet ist. Dieser
dynamische Bereich ist ein Maß der
Empfindlichkeit des Assays für
den gemessenen Analyten.
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Es
entstehen Schwierigkeiten bei dem Bereich von Konzentrationen, der
für jeden
Analyten nachgewiesen werden muss. Da der erforderlich zu messende
Konzentrationsbereich für
jeden Analyten in der Kombination sehr unterschiedlich sein kann,
kann eine Optimierung jeder Standardkurve Empfindlichkeitsprobleme bereiten.
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Diese
Vielfalt von dynamischen Bereichen, die von den Standardkurven der
Multianalyten-Kombination umfasst werden müssen, kann zu praktischen Problemen
bei der Herstellung eines Multi-Konjugats führen, das zu jedem Biochip
gegeben werden muss. Dieses Multi-Konjugat ist das Reagens, durch
welches ein nachweisbarer Marker, der für jeden einzelnen Immunoassay
geeignet ist, zu dem Biochip gegeben wird. Durch diesen nachweisbaren
Marker wird jeder Immunoassay sichtbar gemacht und anschließend auf
dem Biochip quantifiziert.
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Beispielsweise
ist es erforderlich, die Form der Standardkurve für einen
Array von Liganden, die Drogen in einem Biochip-Format binden, zu
steuern. Die derzeitigen Durchmusterungsrichtlinien decken einen großen Konzentrationsbereich
ab; zum Beispiel liegt der Ausschlussgrenzwertbereich zwischen 0,5
ng/ml bei LSD bis zu 2000 ng/ml bei Opiaten.
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Dies
zu erzielen ist im Hinblick darauf, dass die fraglichen Moleküle bezüglich ihres
Molekulargewichts und ihrer Immunogenität im Großen und Ganzen ziemlich ähnlich sind,
eine ziemliche Herausforderung. Deshalb haben alle Antikörper gegen
diese Moleküle
ziemlich ähnliche
Eigenschaften mit Bezug auf die erzielbaren Nachweisgrenzen. Bei
derzeitigen Testverfahren hat jede Droge ihren eigenen spezifischen
Test. Dies ermöglicht
dem Testhersteller, jeden einzelnen Test so zu modifizieren, dass
die Durchmusterungsrichtlinie für diesen
speziellen Arzneistofftest am besten untergebracht wird. Jedoch
werden in einem Multianalyten-Format die Bedingungen auf den vollständigen Bereich
von Assays angewandt, die auf dem Biochip vorliegen. Deshalb sind
die verfügbaren
Wahlmöglichkeiten
zur Unterbringung eines breiten Bereichs von Ausschlussgrenzwerten
beschränkt.
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Die
US-A-4 722 889 und US-A-5 026 653 offenbaren das Testen eines Analyten
in einer Probe durch Umsetzung mit einem markierten Antikörper mit
Spezifität
für den
Analyten. Zusätzlich
kann ein monoklonaler Abfänger-Antikörper mit
niedriger Spezifität
für den
Analyten, aber hoher Spezifität
für Analoga
verwendet werden, welche als Interferenten wirken.
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Die
US 5 026 653 ,
US 4 595 661 , WO 98-26644,
EP 0 572 845 und
EP 0 617 285 offenbaren
Immunoassays für
Analyten, bei denen die Proben mit einem für den Analyten spezifischen
Liganden und zusätzlich mit
einem Abfänger-Antikörper, der
den Analyten bindet, in Kontakt gebracht werden.
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Die
WO-A-98/26644 offenbart einen Assay für einen Analyten, zum Beispiel
eine Droge, in einer Probe unter Verwendung eines "Nachweis-Antikörpers", der mit Analyt
reagiert. Eine zweite Reaktion verwendet einen "neutralisierenden Antikörper" (welcher der gleiche
wie der Nachweis-Antikörper
sein kann), der Analyten bindet und dadurch verhindert, dass er
eine positive Reaktion in einem Assay ergibt, der mit einem Nachweis-Antikörper durchgeführt wird:
So enthalten Proben, die eine positive Reaktion mit dem Nachweis-Antikörper, aber
eine verringerte Reaktion in der zweiten Reaktion ergeben, den wahren
Analyten; Proben, die ähnliche
positive Reaktionen bei beiden ergeben, enthalten einen Interferenten.
Ein Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es die Notwendigkeit vermeidet,
die genaue Natur des Interferenten zu kennen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass die Optimierung
des dynamischen Bereichs schwierig sein kann, wenn man in Betracht
zieht, dass jeder Analyt bei Konzentrationen, die oft sehr verschieden
von den anderen in der Kombination sind, nachgewiesen werden muss
und dass jedes Konjugat in dem Multikonjugat-Reagens mit einer Konzentration/Verdünnung repräsentiert
sein muss, welche für
den speziellen Analyten, den es erkennt, geeignet ist. Es wurde
nun erkannt, dass die Analyten innerhalb der Kombination in einem
Biochip eventuell bei sehr verschiedenen Konzentrationen bezüglich einander
nachgewiesen werden müssen.
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Speziell
betrifft die Erfindung die Änderung
der Empfindlichkeit einer Standardkurve, von der gefunden wird,
dass sie für
einen Analyten/Bereich von Analyten, der in der betreffenden Multianalyten-Kombination
gefunden wird, in einem Bereich zu empfindlich und in einem anderen
Bereich nicht genügend
empfindlich ist. Sie beinhaltet die Zugabe einer gewissen Menge
eines Abfänger-Antikörpers oder
anderen Abfängermaterials zu
dem Assaysystem, zum Beispiel zu dem Assaypuffer. Dieses Abfängermaterial
kann das gleiche sein oder auch nicht wie jenes, das auf der Biochip-Oberfläche zum
Einfangen des Analyten immobilisiert ist. Der Zweck des Abfängermaterials
ist es, etwas des Analyten in der Probe (Standard oder Patientenprobe)
spezifisch abzufangen/gefangen zu nehmen und deshalb dessen verfügbare messbare
Konzentration zu verringern. Dies wiederum hat die Auswirkung, dass
die Empfindlichkeit eines sehr empfindlichen Teils einer Standardkurve verringert
und die Empfindlichkeit eines anderen Bereichs der Kurve verbessert
wird.
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Beschreibung
der Erfindung
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Ein
Biochip zur Verwendung in der Erfindung kann durch bekannte Verfahren
hergestellt werden. Siehe zum Beispiel die GB-A-2324866.
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Ein
derartiger Biochip präsentiert
einen Array von Liganden, zum Beispiel Antikörpern. Es können mehrere verschiedene Liganden
mit einer Spezifität
für verschiedene
Analyten vorliegen. Der neue Assay kann verwendet werden, um einen
oder mehrere derartige Analyten zu testen und kann die Verwendung
eines oder mehrerer Antikörper
beinhalten. Andere Abfängermaterialien,
die verwendet werden können,
werden dem Fachmann leicht ersichtlich und schließen Aptamere
ein. Das Abfängermaterial
wird typisch in dem Assaypuffer eingeschlossen, der ansonsten gewöhnlich herkömmliche
Komponenten, wie Lösungsmittel
usw., enthält.
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Die
Empfindlichkeit einer Standardkurve ist eine Funktion von B/Bo,
worin B bzw. Bo die Lichteinheitswerte für gebundene Spezies und null
Standard darstellen. In jedem Fall, in dem ein quantitativer Assay
erforderlich ist, kann eine Standardkurve konstruiert werden. Alternativ
ist zum Beispiel bei Drogen-Assays ein ja/nein-Assay zufriedenstellend;
für diesen
Zweck eine Kalibrierung bei der 100%-Grenze geeignet ist.
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Für den Zweck
der Erläuterung
wird die Erfindung mit Bezug auf eine Drogen-Multianalyten-Kombination und unter
Verwendung eines Antikörpers
als Abfänger
erörtert.
Eine typische derartige Kombination umfasst kompetitive Immunoassays
für die
folgenden Drogen: Amphetamin, Methamphetamin, THC, Benzodiazepin,
Opiate, Barbiturate, Benzoylecgonin, Methadon, PCP und LSD.
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Für die Drogen-Standardkurve
(0%–300%)
enthält
der 100%-Standard die Ausschlussgrenzwertkonzentration jeder dieser
Drogen, d.h. die Konzentration, unterhalb welcher die Probe als
negativ bezüglich
der Droge erklärt
wird und oberhalb welcher die Probe als positiv bezüglich der
Droge erklärt
wird. Es ist der große Bereich
von Ausschlussgrenzwertkonzentrationen, wie nachstehend aufgeführt, der
Probleme beim Erhalt geeigneter Standardkurven aus der Zugabe eines
Multikonjugats für
alle Analyten bereitet.
| Droge | Ausschlussgrenzwert |
| Amphetamin | 1000
ng/ml |
| Methamphetamin | 1000
ng/ml |
| THC | 50
ng/ml |
| Benzodiazepin | 200
ng/ml |
| Opiate | 2000
ng/ml oder 300 ng/ml |
| Barbiturate | 200
ng/ml |
| Benzoylecgonin | 300
ng/ml |
| Methadon | 300
ng/ml |
| PCP | 25
ng/ml |
| LSD | 0,5
ng/ml |
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Bei
der Bestimmung der zu verwendenden Menge an Abfänger-Antikörper muss im Allgemeinen ein Kompromiss
zwischen der Erhöhung
des Wertes zwischen dem 0%- und 25%-Standard und zwischen einer Nicht-Verringerung
des Abfalls zwischen 75%–100%–125% gemacht
werden. Mit anderen Worten, obwohl es das Ziel ist, die Kurve zwischen
0% und 25% weniger empfindlich zu machen, darf sie zwischen 75%
und 125%, wo die Ausschlussgrenzwert-Entscheidungen für jede Droge
getroffen werden, nicht weniger empfindlich werden. Es ist deshalb
wichtig, die Empfindlichkeit um den Ausschlussgrenzwertbereich zu
maximieren, so dass genaue Bestimmungen der Positivität oder Negativität einer
Probe vorgenommen werden können.
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Der
Ausschlussgrenzwertbereich jedes speziellen Analyten ist bekannt
oder kann durch den Fachmann leicht ermittelt werden. Eine derartige
Person kann auch leicht ermitteln, wie die Empfindlichkeit der Kurve
um diesen Punkt herum maximiert werden kann.
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Unter
Verwendung von PCP, BZG und Amphetamin wurden Experimente durchgeführt, um
den Grad der erzielten Änderung
am Ausschlussgrenzwertbereich von Standardkurven durch die Zugabe
verschiedener Mengen des geeigneten Abfänger-Antikörpers zu demonstrieren. Spezieller
demonstrieren die folgenden Daten für PCP, BZG und Amphetamin,
dass ohne die Zugabe von Abfänger-Antikörpern die
Standardkurve im Ausschlussgrenzwertbereich nicht empfindlich genug
ist (in jedem Fall war sie zwischen 0% und 25% zu empfindlich).
Für die
Zwecke dieser Erfindung und für
diese Analyten sind die Kurven zwischen 0% und 25% zu empfindlich
und über
diesen Punkt hinaus nicht empfindlich genug.
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Die
Ergebnisse bei PCP sind wie folgt:
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Die
Zugabe von 1–2
mg/l PCP-Antikörper
verbessert die Empfindlichkeit der Kurve um den Ausschlussgrenzwertbereich
von 75–125%
herum beträchtlich.
Dies wird klar durch den prozentualen Inhibierungsabfall von 11,45%
(B/Bo 31,79 bei 75% auf 20,34 bei 125%) ohne zugesetzten Antikörper auf
46,22% (B/Bo 95,72 bei 75% bis 49,50 bei 125%) mit der Zugabe von
2 mg/l PCP-Antikörper
demonstriert.
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Die
Ergebnisse für
BZG sind wie folgt:
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Eine
beträchtliche
Menge an BZG-Antikörper
muss zugesetzt werden, um die Empfindlichkeit dieser Standardkurve
signifikant zu ändern.
Zwischen 50 und 80 mg/l müssen
zugesetzt werden, um die Empfindlichkeit des Ausschlussgrenzwertbereichs
zu verbessern. Ohne zugesetzten Antikörper beträgt der prozentuale Inhibierungsabfall
4,99% (B/Bo 14,46 bei 75% bis 9,47 bei 125%) und dies verbessert
sich mit der Zugabe von 80 mg/l BZG-Antikörper auf 17,51% (B/Bo 47,89
bei 75% bis 30,38 bei 125%).
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Die
Ergebnisse für
Amphetamin sind wie folgt:
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1,25
mg/l Amphetamin-Antikörper
war die optimale Zugabe, um die Empfindlichkeit des Ausschlussgrenzwertbereichs
der Standardkurve zu verbessern. Konzentrationen über 1,25
mg/l verbesserten das Ergebnis nicht weiter. Ohne zugesetzten Antikörper beträgt der prozentuale
Inhibierungsabfall 2,12% (B/Bo 5,61% bei 75% bis 3,49% bei 125%)
und dies verbessert sich mit der Zugabe von 1,25 mg/l Amphetamin-Antikörper auf
26,92% (B/Bo 67,83% bei 75% bis 40,91% bei 125%).
