DE60122350T2 - Benzoesaüre derivate und deren verwendung - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung bezieht sich auf biologisch aktive Benzoesäurederivate und deren Verwendung in der Behandlung und Profilaxe von Erkrankungen. Im Besonderen bezieht sich die Erfindung auf eine Verbindungsklasse, welche die Stabilität von mRNA, welche eine oder mehrere Instabilitätssequenzen enthalten, beeinflusst.
  • Verschiedene Benzoesäuren haben therapeutische Aktivität manifestiert, zum Beispiel in Japan, Koki 61-22046, 61-22047 und 61-76440. Es wurde gezeigt, dass Benzoesäuren, repräsentiert durch die folgende generelle Formel:
    Figure 00010001
    wobei R'1, R'2, R'3, R'4 und R'5 entweder identisch oder verschieden sind und jeder Rest entweder ein Wasserstoff oder ein mittleres oder niederiges Alkyl repräsentiert, mit der Bedingung, dass nicht alle gleichzeitig ein Wasserstoff sein können, und wobei zwei benachbarte Substiutenten zu einem Cylcoalkylring mit 5 bis 6 Kohlenstoffatomen kombiniert werden können, R'6 repräsentiert Hydroxyl, nideriges Alkyloxy oder niedriges Alkylamino der Formel NR'7R'8, worin R'7 und R'8 jeweilen für ein Wasserstoff oder ein niederiges Alkyl steht und X eine Gruppe der folgenden Formeln repräsentiert:
    Figure 00010002
    fähig sind in malignen Zellen, speziell in Leukämie Zellen, eine Differenzierung gegen morphologisch und funktionell maturierte Zellen, weiche sich nicht weiter vermehren können, zu induzieren. Sie sind somit pharmakologisch wertvoll in der Behandlung von bösartigem Zellwachstum oder Immunkrankheiten wie Krebs, Rheumatismus or Psoriasis. Verwandte Verbindungen werden auch in Kokai 62-215581 (Japan) gezeigt.
  • Die Literatur zeigt auch Aktivität und Aktivitätsmessungen dieser Verbindungen bei der Differenzierung von humanen akut promyelocytischen Leukämie Zellen (HL-60).
  • U.S. Patent No. Re.36,477 beschreibt ebenfalls solche Benzoesäurederivate, welche in der Lage sind, neoplastiche Zellen, speziell Leukämische Zellen, zur Differenzierung zu induzieren oder als therapeutische Verbindungen für Psoriasis, Immunologische Erkrankungen wie auch Enzündungen wirksam sind.
  • U.S. Patent No. 5,849,796 zeigt ortho-substituierte Benzosäurederivate, welche antiarrhytmische Eigenschaften aufweisen und als Inhibitoren des zellulären Na+/H+ Austauschers wirken. Zusätzlich wurde gezeigt, dass diese Verbindungen sich auch als Edukte in der Synthese von Arzneimitteln, besonders von Inhibitoren des zellulären Na+/H+ Austauschers, eignen.
  • Diese Hintergrundinformation dient dem Zweck der Offenlegung von Tatsachen, von welchen die Bewerber glauben, dass sie für die in dieser Patentanmeldung gemachten Erfindungen von Bedeutung seien. Es wird dabei in keiner Weise impliziert oder dargelegt, dass es sich dabei um Priorität zu der in dieser Bewerbung gemachten Erfindung handelt. Zitierte Publikationen in dieser Beschreibung sind hiermit in ihrer Ganzheit in diese Bewerbung eingefügt.
  • Zweck der vorliegenden Erfindung ist die Präsentierung von Benzoesäurederivaten und deren Anwendungen.
  • Im Zusammenhang mit einem Aspekt dieser Erfindung steht eine Verbindung mit der Strukturformel (I):
    Figure 00020001
    oder Stereoisomere davon, oder pharmazeutisch verträgliche Salze oder Hydrate davon oder physiologisch verträgliche und hydrolysierbare Ester davon, worin:
    R1 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht;
    R2 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht;
    R3 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht;
    R4 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht;
    R5 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4) Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; Y für O or-NR'steht, worin R' für H or (C1-C4)-Alkyl steht;
    n für 0–8 steht;
    R6 für einen 5 bis 8 gliederigen Lacton- or Lactamring steht;
    R7 für H, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, Phenyl oder (C1-C4)-Alkyl-COO- steht, worin der Lactam- oder Lactonring optional eine oder mehrere C=C-Doppelbindung(en) umfasst und der Lactam- oder Lactonring optional mit einer oder mehreren (C1-C4)-Alkyl- oder (C2-C4)-Alkenylgruppe(n) substituiert ist:
    unter der Voraussetzung, dass wenn R1=R2=R3=R4=R5=R7=N darstellt, und Y für O steht, und n für 0 steht, R6 dann anders als:
    Figure 00030001
    ist.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind nützlich für die Behandlund oder Profilaxe von Krankheiten welche mit exzessiver Zytokinfreisetzung, speziel IL-1β Freizetzung, assoziert sind, wie z.B. Rheumatische Arthritis, Osteoarthritis, Septischer Schock, Psoriasis, Artherosklerose, Darmentzündungen wie Morbus Crohn und Asthma. Die Aufzeichnungen von EP 0606044 A zeigen Lactone für die Behandlung von Krankheiten welche mit rezessiver Zytokinfreisetzung assoziiert sind. Sie werden hiermit durch Referenzierung in diese Bewerbung eingefügt.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt ebenfalls Verbindungen welche von Nutzen sind in der Herstellung von Medikamenten zur Behandlung eines Karzinoms und/oder einer malignen Erkrankung.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER GRAPHIKEN
  • 1 zeigt den prozentualen Verlust an lebendigen Krebszellen nach der Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen eines Benzoessäurederivates im Vergleich mit unbehandelten Kontrollzellen.
  • 2 beschreibt das relative Wachstum von Krebszellen nach der Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen eines Benzoesäurederivates im Vergleich mit unbehandelten Kontrollzellen.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Ausdrücke und Abkürzungen welche in den folgenden Beispielen verwendet werden haben, wenn nicht anders erwähnt, ihre normale Bedeutung. Zum Beispiel: "°C" bezieht sich auf Grad Celsius; "N" bezieht sich auf Normal or Normalität; "mmol" beschreibt Millimol or Millimols; "g" weist auf Gramm oder Gramme hin; "ml" heisst Milliliter; "M" beschreibt molar or Molariät; "p-" weist auf para hin, "MS" bezieht sich auf Massenspektrometrie; "IR" weisst auf Infrarotspektrometrie hin und "NMR" bezieht sich auf magnetische Kernresonanzspektroskopie.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt eine Verbindung der Formel (I):
    Figure 00040001
    oder Stereoisomere davon, oder pharmazeutisch verträgliche Salze oder Hydrate davon oder physiologisch verträgliche und hydrolysierbare Ester davon, worin:
    R1 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht;
    R2 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht;
    R3 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht;
    R4 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht;
    R5 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; Y für O or-NR'steht, worin R' für H or (C1-C4)-Alkyl steht; n für 0–8 steht;
    R6 für einen 5 bis 8 gliederigen Lacton- or Lactamring steht;
    R7 is H, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, Phenyl oder (C1-C4)-Alkyl-COO- steht,
    worin der Lactam- oder Lactonring optional eine oder mehrere C=C-Doppelbindungen enthält und der Lactam- oder Lactonring optional mit einer oder mehreren (C1-C4)-Alkyloder (C2-C4)-Alkenylgruppen substituiert ist. Halogen oder Halo in diesem Zusammenhang ist entweder F, Cl, Br oder I sofern nicht anders erwähnt, bevorzugt wird Cl.
  • In einer Anwendung der vorliegenden Erfindung liegt eien Verbindung der Formel (I) in freier Form oder in Form eines physiologisch hydrolysierbaren und verträglichen Esters vor, wobei
    • R1
    = H, OH, MeCOO- oder Methoxy darstellt;
    R2
    = H darstellt;
    R3
    = H, OH, MeCOO- oder Methoxy darstellt;
    R4
    = H, Methoxy oder Halogen darstellt;
    R5
    = H, OH, Methoxy oder (C1-C4) alkyl darstellt;
    Y
    für O steht;
    R6
    die Teilstruktur
    Figure 00050001

    darstellt worin m für 0–4 steht;
    R7
    = H, Methyl, Isopropy darstellt.
  • In einer anderen Anwendung der vorliegenden Erfindung liegt eine Verbindung der Formel (I) in freier Form oder in Form eines physiologisch hydrolysierbaren und verträglichen Esters vor, wobei
    R1 für H, -OH, MeO- or MeCOO- steht;
    R2 für H steht;
    R3 für H, -OH, MeO- or MeCOO- steht;
    R4 für H or Halogen steht;
    R5 für -OH, MeO-, MeCOO- oder Methyl steht.
  • In einer anderen Anwendung der vorliegenden Erfindung liegt eine Verbindung der Formel (I) in freier Form oder in Form eines physiologisch hydrolysierbaren und verträglichen Esters vor, wobei:
    R1 für H or MeO, R3 für H, -OH or MeO; R4 für H und R5 für Methoxy oder Methyl steht.
  • Die vorliegenden Erfindung beinhaltet z.B. folgende Verbindungen, ist aber nicht limitiert auf diese Beispiele:
    Figure 00060001
  • Eine weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung beinhaltet folgende Verbindungen, ist aber nicht limitert auf diese Beispiele.
  • Figure 00060002
  • Wie oben erwähnt schliesst die Erfindung pharmazeutisch verträgliche Salze von Verbindungen der Formel (I) mit ein. Eine Verbindung dieser Erfindung kann eine genügend saure oder genügend basische oder beide funktionelle Gruppen enthalten, so dass eine Reaktion mit einer entsprechenden Anzahl organischer oder anorganischer Basen, oder organischer oder anorganischer Säuren pharmazeutisch verträgliche Salze ergibt.
  • Diese Erfindung schliesst ebenfalls pharmazeutisch verträgliche Lösungen von Verbindungen der Formel (I) ein. Viele der Verbindungen der Formel (I) können in Verbindung mit Lösungsmitteln wie Wasser, Methanol, Aethanol und Acetonitril zu pharmazeutisch verträglichen Solvaten führen wie z.B. die entsprechenden Hydrate, Methanloate, Aethanolate und Acetonitrilate.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können asymmetrische (chirale) Zentren aufweisen. Als Konsequenz aus diesen chiralen Zentren, können die Verbindungen als Racemate, Mischungen von Enantiomeren und als individuelle Enantiomere sowie als Diastereomere und Mischungen von Diastereomeren vorliegen.
  • Die Erfindung beinhaltet somit alle individuellen Isomeren (welche durch sterospezifische Synthese oder durch Auftrennung einer synthetischen Mischung mit konventionellen Methoden hergestellt werden) und Kombinationen davon.
  • Die Präfixe "R" and "S" werden im vorliegenden Dokument analog der üblichen Gebrauchsweise in der Organischen Chemie angewandt, um die absolute Konfiguration eines chiralen Zentrums zu beschreiben, basierend auf dem Cahn-Ingold-Prelog System.
  • Der stereochemische Descriptor R (rectus) bezieht sich auf diejenige Konfiguration eines chiralen Zentrums, wenn von der der Gruppe mit der niederigsten Prorität gegenüberliegenden Seite beobachtet, die Abhängigkeit der Gruppen von der höchsten Priorität zu der zweitniederigsten Priorität dem Uhrzeigersinn folgt.
  • Der stereochemische Descriptor S (sinister) bezieht sich auf diejenige Konfiguration eines chiralen Zentrum, wenn von der der Gruppe mit der niederigsten Priorität gegenüberliegenden Seite beobachtet, die Abhängigkeit der Gruppen von der höchsten Priorität zu der zweitniederigsten Priorität dem Gegenuhrzeigersinn folgt.
  • Die Priorität der Gruppen wird gemäss den Regeln bestimmt, welche in Cahn et al., Angew. Chem., 78, 41347, 1966, und Prelog, V. and Heimchen, G.; Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 21, 567–583, 1982) beschrieben werden.
  • Zusätzlich zum R,S-System, welches gebraucht wird um die absolute Konfigration eines chiralen Zentrums zu beschreiben, wird auch das ältere D,L-System in diesem Dokument verwendet um relative Konfigurationen, speziell bei Aminosäuren und Aminosäurederivaten, zu beschreiben.
  • Bei diesem System wird eine Fischerprojekton der Verbindung so orientiert, dass das Kohlenstoffatom 1 der Hauptkette zuoberst liegt. Das Präfix D wird gebraucht um die relative Konfiguration der Verbindung zu beschreiben in welcher die funktionelle (bestimmende) Gruppe auf der rechten Seite des chiralen Zentrums liegt und L bei Isomeren in welchen diese Gruppe auf der linken Seite des chiralen Zentrums steht.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können (C=C)-Doppelbindungen enthalten, und können somit cis/trans Isomere bilden. Die vorliegende Erfindung sieht beides, Mischungen der Isomeren, wie auch individuelle, isolierte/gereinigte Isomere vor.
  • Die Benzoesäurederivate dieser Erfindung, welche -OH Substituenten aufweisen können auch als pharmazeutisch verträgliche, metabolisch labile Esterderivate vorliegen und sind als solche in diese Erfindung miteinbezogen. Pharmazeutisch verträgliche Ester sind vorzugsweise "prodrug"-Esterderivate, und als solche umwandelbar zum freien Derivat durch Solvolyse oder unter physiologischen Bedingungen. Bevorzugte pharmazeutisch verträgliche "prodrug"-Ester sind solche ausgehend von Carbonsäuren, Carbonsäuremonoestern oder Carbaminsäuren.
  • Synthese von Verbindungen der Formel (I)
  • Gemäss einem anderen Aspekt, beinhaltet die vorliegende Erfindung einen Prozess zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch verträglichen, metabolisch labilen Esters oder Amids davon, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, nämlich:
    • a) die Reaktion einer Verbindung der Formel (II):
      Figure 00080001
      worin R1 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R2 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht R3 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht R4 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht und X für Halogen steht; mit einer Verbindung der Formel (III):
      Figure 00090001
      worin: n' für 1–9 steht; und m für 0–4 steht;
    Verbindung (III) enthält optional eine oder mehrere (C=C)-Doppelbindungen enthält und mit einer oder mehreren (C1-C4)-Alkyl or (C2-C4)-Alkenylgruppen substituiert ist; in Anwesenheit oder Abwesenheit einer Base und einem passenden Lösungsmittel. Beispiele solcher Lösungsmittel sind Dichlormethan und Chloroform.
  • Verbindungen der Formel (II) können durch eine Reaktion einer Verbindung der Formel (IV):
    Figure 00090002
    worin: R1-R5 wie oben erwähnt definiert sind;
    mit einem Säurehalogenid einer organischen oder anorganischen Säure in Anwesenheit eines passenden Lösungsmittels, welches einer entsprechend geschulten Person bekannt ist, synthetisiert werden. Beispiele solcher Säurehalogenide sind Thionlylchlorid, Phosphortrichlorid, Phosphortribromid, Phosphorpentachlorid und Oxalylchlorid. Beispiele solcher Lösungsmittel sind DMF und THF.
    oder
    • b) die Reaktion einer Verbindung der Formel (IV) mit einer Verbindung der Formel (III) in Anwesenheit einer Säure wie z.B. Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder einer Arylsulfonsäure. Diese Reaktion kann unter azeotropen Destillationsbedingungen mit Benzol als Lösungsmittel durchgeführt werden.
    • c) die Reaktion eines Alkali- oder Erdalkalimetallsalzes einer Verbindung der Formel (IV):
      Figure 00100001
      worin: R1-R5 wie oben erwähnt definiert sind; mit einer Verbindung der Formel (V):
      Figure 00100002
      worin: X fü F, Cl, Br or I steht; n' für 1–9 steht; und m für 0–4 steht; und Verbindungen der Formel (V) optional mit einer oder mehreren Doppelbindungen substituiert sind und optional mit einer oder mehreren (C1-C4)-Alkyl or (C2-C4)-Alkenylgruppen substituiert sind, in Anwesenheit eines polaren aprotischen Lösungsmittel oder eines Kronenäther-Katalysators. Beispiele solcher polaren aprotischen Lösungsmittel sind Aceton, DMF und DMSO.
  • Verbindungen der Formel (IV) sind entweder kommerziell erhältlich oder können durch einfache Syntheseschritte, welche einer entsprechend geschulten Person bekannt sind, hergestellt werden. Zum Beispiel durch Hydrolyse einer Verbindung der Formel (VI):
    Figure 00100003
    worin:
    R1-R5 wie oben erwähnt definiert sind
    R8 für (C1-C4)-Alkyl, Aryl or Arylaklyl steht.
  • Verbindungen der Formel (VI) können in Anwesenheit von Säuren wie Salzsäure, Schwefeläure oder Basen wie einem Alkalimetallhydroxid wie z.B. Natriumhydroxid hydrolysiert werden. Die Hydrolyse kann in einem wässerigen Lösungsmittel bei einer Temparatur zwischen 50 und 200°C durchgeführt werden. Verbindungen der Formel (VI) sind entweder kommerziell erhältlich oder können durch einfache Syntheseschritte, welche einer entsprechend geschulten Person bekannt sind, hergestellt werden.
  • Verbindungen der Formeln (III) oder (V) sind entweder kommerziell erhältlich oder können durch einfache Syntheseschritte, welche einer entsprechend geschulten Person bekannt sind, hergestellt werden.
  • Wirkungen der Benzoesäurederivate
  • Die Benzoezäurederivate der vorliegenden Erfindung haben verschiedene biochemische Wirkungen inklusive eine oder mehrere der folgenden: Wachstumshemmung von Krebszellen; Wiederherstellung oder Erhöhung der Sensitivität von Krebszellen gegenüber einem oder mehreren anti-neoplastischen/zytotoxischen Medikament; Induzierung von mRNA-Abbau. Die Wirkungsstärke von Verbindungen der vorliegenden Erfindung kann durch standardisierte Methoden, welche einer entsprechend geschulten Person bekannt sind, gezeigt werden. Beispiele solcher Testmethoden, welche hier aufgeführt werden, sollen in keiner Weise dahingehend interpretiert werden, dass sie die Breite der vorliegenden Erfindung einschränken.
  • Krebshemmende Aktivitäten
  • Wie entenstehend gezeigt wird können gewisse Benzoesäurederivate gemäss der vorliegenden Erfindung das Wachstum von Krebzellen unterbinden. Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auf ihre krebshemmende Aktivität hin in Zell- oder in vivo-Modellen wie entenstehend beschrieben oder in Variationen davon, welche einer entsprechend geschulten Person bekannt sind, getested werden.
  • Verbindungen dieser Erfindung können durch Standardmethoden, inklusive der nachfolgend beschrieben Beispiele, auf krebshemmende Wirkung getested werden.
  • 1. In Vitro Methodologie
  • Zelltoxizität kann durch die standardisierte Methode für adhärente Zellen wie dem microculture tetrazolium assay (MTT-Test) gemessen werden. Details dieser Methode sind in Alley, M C et al, Cancer Research 48:589–601, 1988 beschrieben. Es werden exponential wachsende Zellkulturen von Tumorzellen wie z.B. die Darmkarzinomzellen HT-29 oder die Lungenkrebszelline LX-1 gebraucht um Miktrotiterplattenkulturen herzustellen. Es werden 3000 Zellen pro Loch in 96-Lochplatten (in 150 μl oder Media) ausgesät und über Nacht bei 37°C inkubiert. Testverbindungen werden in 10-facher Verdünnung von 10–4M bis 10–10M dazugegeben und für 72 Stunden weiter inkubiert. Um die Anzahl lebender Zellen zu ermitteln wird in jedes Loch der MTT Farbstoff (50 μl or 3 mg/ml Lösung von 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide in saline) dazugegeben und für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Danach werden 50 μl 25% SDS, pH2 zu jedem Loch zugegeben und nach einer Inkubation über Nacht wird die Absorbtion bei 550 nm in einem ELISA reader gemessen. Die Durchschnittswerte und Standardabweichungen werden mit der Formel % T/C (% viable cells treated/control). 1 OD of treated cells OD of control cells × 100 + % T/C berechnet. Die Konzentration einer Testverbindung welche ein T/C von 50% Wachstumsreduktion ergibt wird als IC50 Wert bezeichnet.
  • Eine Alternative um Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf krebshemmende Wirkung hin zu untersuchen ist, die Lebensfähigkeit von Zellen zu eruieren. Exponenziell wachsende Krebszellen werden mit verschiedenen Konzentrationen einer Testverbindung behandelt. Zelllinien, welche sich für diese Experimente eignen und ohne weiteres von ATCC, Bethesda, MD, U.S.A. bezogen werden können sind z.B. MCF-7, MDA-MB-231, HCT116, KB 31, HCT-15, und DU 145. Die Zellen werden dann weiter für 24 h, 48h und 96 h inkubiert und mit einem Farbstoff gefärbt, welcher zwischen lebensfähigen und nicht-lebensfähigen Zellen unterscheiden kann, wie z.B. YOPRO-1 wie in T. Idziorek et al., J Immunol Meth 185, 249 (1995) beschrieben. Der prozentuale Anteil der Lebensfähigkeit wird dann mit Kontrollzellen verglichen. Eine verminderte Lebensfähigkeit (gezeigt als Zunahme des protenzualen Verlusts an Lebensfähigkeit in 1) in den behandelten Zellen im Vergleich mit Kontrollzellen ist ein Hinweis auf eine krebshemmende Aktivität.
  • Eine weitere Methode um eine krebshemmende Wirkung von Verbindungen dieser Erfindung zu eruieren, beinhaltet die Messung der Wirkung von Verbindungen auf die Zellzyklusprogression. Exponenziell wachsende Krebszellen werden mit verschiedenen Konzentrationen einer Testverbindung behandelt. Die Zellen werden dann weiter für 24 h, 48h und 96 h inkubiert. Die Zellen werden dann lysiert und die doppelsträngige DNA wird mit dem YOPRO-1 Farbstoff gefärbt wie in T. Idziorek et al., J Immunol Meth 185, 249 (1995) beschrieben. Fluoreszenzmessungen werden anschliessend wie in V.L. Singer et al., Anal Biochem 249, 228 (1997) beschrieben durchgeführt und die Werte mit Kontrollzellen verglichen. Eine Verminderung der relativen Wachstumsrate in behandelten gegenüber unbehandelten Zellen weist auf eine krebshemmende Aktivität hin. (vrgl. 2).
  • In einem typischen Beispiel zur Eruierung der Hemmwirkung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf das Krebszellwachstum werden Zellen mit Testverbindungen behandelt und die Genexpression wird mit unbehandelten Zellen verglichen. Zum Beispiel werden die humanen MCF-7 Brustkrebszellen bei 5% CO2 and 37°C in MEM mit 0.1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin and 10% FBS kultiviert. Totale RNA von ca. 50% konfluenten Zellen wird dann mit dem Qiagen RNeasy MidiTM kit gemäss den Vorschriften des Herstellers isoliert. Totale RNA wird zu verschiedenen Zeiten der Behandlung mit oder ohne des zu testenden Benzoesäurederivates isoliert. RNA wird sodann mit der RNase protection Methode "RiboQuantTM Multi-Probe Ribonuclease Protection Assay System" von Pharmingen analysiert, welche hAPO-2c and kundenspezifische humane (bclx L/S, p53, GADD45, c-fos, bax, bcl-2, c-myc, L32 und GAPDH) Template, T7 RNA polymerase und [α-32P]UTP (gemäss den Vorschriften des Herstellers) verwendet. Quantifizierung des Expressionsgrades wird mittels eines Storm 860TM Molecular Dynamics Phosphoimager mith ImageQuantTM Software durchgeführt. Verminderte Expression eines Proto-onkogens wie z. B. bcl-2 in behandelten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen weist auf krebshemmende Aktivität hin.
  • 2. In Vivo Methodology
  • Verbindungen der vorliegenden Erfindung können weiter in präklinischen in vivo Versuchen, welche auf eine klinische Relevanz hindeuten, untersucht werden. Solche, in diesem Forschungsgebiet bestens bekannte Versuche beinhalten die Einpflanzung von vorzugsweise humanem Tumorgewebe in Nacktmäuse (xenografts). Testverbindungen werden nach der Applikation an diesen Xenograftmäusen auf ihre Anti-tumoraktivität hin untersucht.
  • Zum Beispiel können humane Brusttumore (MX-1) welche in athymischen Nacktmäusen kultiviert werden in Fragmenten von ca. 50 mg Grösse in neue Rezeptormäuse eingepflanzt werden. Der Transplantationstag wird als Tag 0 bezeichnet. Sechs bis zehn Tage später werden den Mäusen, in Gruppen von 5 bis 10 Mäusen pro Dosis, die Testverbindungen entweder durch intravenöse Injektion oder oral verabreicht. Die Verbindugen werden an jedem zweiten Tag über drei Wochen hin verabreicht.
  • Die Tumordurchmesser und das Körpergewicht werden zweimal wöchentlich gemessen. Die Tumorvolumen werden mit Hilfe der mit Vernier caliper gemessenen Durchmesser mittels der folgenden Formel eruiert (Länge × Breite2) = 2 = Tumorvolumen in mm3
  • Durchschnittliche Tumorvolumen werden für jede behandelte Gruppe von Tieren berechnet und daraus T/C Werte für jede Gruppe relativ zu unbehandelten Kontrollgruppen bestimmt.
  • Erhöhung oder Widerherstellung der Drogensensitivität
  • Gewisse Benzoesäurederivate dieser Erfindung können die Sensitivität von Krebszellen gegenüber einer oder mehreren anti-neoplastischen oder zelltoxischen Verbindungen erhöhen oder wiederherstellen. Fogender auf Krebszellen basierender in vitro Test eignet sich zur Bestimmung der Wiederherstellung der Sensitivität von Krebszellen gegenüber anti-neoplastischen oder zelltoxischen Verbindungen. Krebszelllinen z.B. vom humanem Kleinzellkarzinom der Lunge, welche gegenüber einer oder mehreren krebsbehandelten Verbindung wie Daunorubicin (DR); Vincristine (VC); Adriamycin (AM); Etoposide (ET); Tenoposide (TE); Colchicine (CC); und Taxol resistent geworden sind, werden gemäss Twentyman et al., Br. J. Cancer, 54, 253 (1986) gezüchtet.
  • Die Sensitivität von resistenten Sub-zellinien wird dann jeweilen mit parentalen sensitiven Zellinien durch die Messung der Wachstumshemmung, in der Anwesenhiet ab initio von krebsbehandelnden Verbindungen wie z. B. DR im Wachstumsmedium, verglichen. Zu diesem Zweck wird die Wachstumsrate mittels einem elektronischen Zellzähler nahe dem Ende der exponentiellen Wachstumsphase ermittelt. Resistente Sub-zellinien werden gewählt bei welchen eine IC80 (Konzentration, z.B. von DR welche erfordelidch ist um die Zellzahl auf 20% der unbehandelten Kontrolle zu reduzieren) > 80 ×, vorzugsweise > 100 ×, grösser ist als die der parentalen sensitiven Zelline.
  • Die Sensitivität der gewählten resistenten Zellinien z.B. gegenüber DR in Anwesenheit oder Abweesenheit von Benzosäurederivaten wird sodann mittels der oben erwähnten Zellzählmethode als Mass der Zellproliferation ermittelt. Zu diesem Zweck werden die Zellen ab initio in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von Krebsmittelns sowie Benzoesäurederivaten kutiviert. Zum Screening der Letzteren werden Konzentrationen, welche allein keine signifikante Reduktion der Wachstumsrate bewirken, verwendet. Diese werden durch Inkubation von resistenten und nicht-resistenen Zellinen mit verschiedenen Konzentrationen von Benzoesäurederivaten in Abwesenheit von anderen Krebsmitteln ermittelt. Benzoesäurederivate werden routinemässig bei Konzentrationen von 0.01 bis 50 μg/ml, speziell 0.1 bis 10.0 μg/ml, z.B. mit Konzentrationen von 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0 und 50 μg/ml getestet. Das Verhältnis der Konzentration eines Krebsmittels, welche benötigt wird um das Zellwachstum um 50% in Abwesenheit von Benzoesäurederivaten zu reduzieren verglichen mit der Konzentration in Anwesenheit von Benzoezäurenderivaten wird als Mass einer durch Benzoesäurederivaten induzierten erhöhten Sensitivität einer resistenten Zelline für ein Krebsmittel genommen.
  • Die Stabilität einer resistenten Zelllinie wird gebraucht um Vergleiche mit der zum Vornherein etablierten Sensitivität gegenüber Krebsmitteln anstellen zu können.
  • Weitere Verfahren zur Ermittlung der Wiederherstellung der Sensitivität von Krebszellen gegenüber anti-neoplastischen oder zelltoxischen Verbindungen, inklusive in vivo Methoden, werden in EP 0296122B beschrieben, welche hiermit unter Hinweis auf diese Referenz in diese Anmeldung einbezogen werden.
  • Induzierung von mRNA Abbau
  • In letzter Zeit wurde mehr und mehr realisiert, dass die Regulierung der RNA Halbwertszeit eine kritische Rolle in der Kontrolle der Genexpression spielt, und dass die Regulation des RNA-Abbaus ein höchst kontrollierter Prozess ist. Die RNA-Instabilität erlaubt einen raschen Auf- oder Abbau von RNA Transkriptmengen aufgrund von Änderungen in der Transkriptionsrate. Mehrere kritische Zellfaktoren wie z.B. Transkriptionsfaktoren wie c-myc oder Genprodukte welche kritisch für die Immunabwehr sind wie Zytokine werden in der Regel nur vorübergehend nötig um ihre Funktion wahrnehmen zu können. Eine transiente Stabilisierung der mRNA welche für dies Faktoren kodieren erlaubt eine rasche Akkumulierung und Translation dieser mRNA um wenn nötig eine gewünschte Reaktion zu erzielen, wobei unter normalen nicht stabilisierten Bedingungen die rapide Abbaurate dieser mRNA die Expression dieser Zellfaktoren effizient limitiert und praktisch abschaltet. Abnormale Regulierung der mRNA Stabilisierung hingegen, kann eine ungewollte Akkumulierung von Zellfaktoren bewirken und zu ungewünschten Zelltransformationen wie z.B. Tumonnrachstum oder zu ungewollten und gewebeschädigenden Enzündungsreaktonen führen.
  • Trotz der relativen Unbekanntheit der Mechanismen, welche die mRNA Stabilität kontrollieren, hat man Sequenzregionen in einer Anzahl von mRNA identifiziert welche diesen mRNAs Instabilität verleihen. Diese Sequezregionen werden fortan als mRNA Instabilitätssequenzen bezeichnet. Typische mRNA Instabilitätssequenzen sind die AREs (AU rich elements), welche in den 3'UTR (untranslated region) von gewissen Genen wie "immediate early" Gene and Genes welche für Inflammatorische Zytokine wie IL-1β and TNFα kodieren.
  • mRNA Instabilitätssequenzen wurden in den UTRs speziell in den 3' UTRs, einer grossen Anzal von transient expressierten Genen wie Gene für Zytokine, Chemokine, nukleäre Transkriptionsfaktoren, Proto-onkogenen, Immediate Early Genen, Gene welche den Zellzyklus kontrolieren, Oxigenasen, und Gene welche eie Rolle in der Apoptose spielen gefunden.
  • Natürlich auftretende RNA Sequenzen welche mRNA Instabilitätssequenzen definieren werden auch als Adenylateluridylate (AU)-reiche Elemente, oder AREs bezeichnet. Transient exprimierte Gene welche mRNA Instabilitätssequenzen beinhalten sind z.B. Gene welche für GM-CSF, c-fos, c-myc, c-jun, krox-20, nur-77, zif268, IFN-β, uPA, IL-1, IL-3, TNF-α, MCP1, syn1, β2-AR, E-selectin, VCAM-1, ICAM-1, P-glycoproteins (MDR), MRPs, Pγh1 (pf mdr), COX II, metalloproteinases (MMPs), bcl-2 und MIP-2α kodieren.
  • Die folgenden Publikationen beinhalten extensive Diskussionen über mRNA Instabilitätssequenzen und AREs, den Sequenzregionen welche diese enthalten und (minimale) Sequenzregionen welche zur mRNA Destabilisierung nötig sind, sowie eine Anzahl mRNA Instabilitätssequenzen und Gene welche diese enthalten:
    • Shaw & Kamen, Cell, Vol. 46, 659–667, Aug. 29 1986 (GM-CSF);
    • Shyu et al., Genes & Development, 5:221–231 (1991) (c-fos);
    • Sachs, Cell, Vol. 74, 413–421, Aug. 13 1993 (Review. "Messenger RNA Degradation in Eukaryotes");
    • Chen et al., Mol. Cell. Biol., Jan 1994, p 416–426 (c-fos);
    • Akashi et al., Blood, Vol. 83, No. 11, (June 1), 1994: pp 3182–3187 (GM-CSF etc.);
    • Nanbu et al., Mol. Cell. Biol., July 1994, p. 4920–4920 (Upa);
    • Stoecklin et al., J. Biol. Chem., Vol. 269, No. 46, Nov. 18 1994, pp 28591–28597 (IL-3);
    • Lagnado et al., Mol. Cell. Biol., Dec. 1994, p. 7984–7995 (general);
    • Zhang et al., Mol. Cell. Biol., Apr. 1995, p. 2231–2244 (yeast);
    • Zubiaga et al., Mol. Cell. Biol., Apr. 1995, p. 2219–2230 (general);
    • Winstall et al., Mol. Cell. Biol., July 1995, p. 3796–3804 (c-fos, GM-CSF);
    • Chen et al., Mol. Cell. Biol., Oct. 1995, p. 5777–5788 (c-fos, GM-CSF);
    • Chen et al., TIBS 20 Nov. 1995, 465–470 (review);
    • Levy et al., J. Biol. Chem., Vol. 271, No., Feb. 2 1996, pp. 2746–2753 (VEGF);
    • Kastelic et al., Cytokine, Vol. 8, No. 10 (Oct.), 1996: pp751–761;
    • Crawford et al., J. Biol. Chem., Vol. 272, No. 34, Aug. 1997, pp. 21120–21127 (TNF-α);
    • Xu et al., Mol. Cell. Biol., Aug. 1997, Vol. 18, No. 8, p. 4611–4621 (general);
    • Danner et al., J. Biol. Chem., Vo1.273, No. 6, Feb. 6 1998, pp. 3223–3229 (human β2- adrenergic receptor);
    • Lewis et al., J. Biol. Chem., Vol. 273, No. 22, May 29 1998, pp. 13781–13786 (TNF-α).
  • Wie in den obenstehenden Publikationen beschrieben wird, enthalten mRNA Instabilitätssequenzen oft eine oder mehrere Kopien eines Sequenzmotivs aus der Reihe von: AUUUA, UAUUUAU, UUAUUUA(U/A)(U/A), and AUUUAUUUA.
  • Solche Sequenzmotive sind typischerweise in Genen zwischen dem Stopkodon und dem PolyA Signal angeordnet und können mit entsprechend flankierenden Sequenzen assoziiert sein welche z.B in der 5'UTR oder in der kodierenden Region der mRNA auftreten können, interagieren.
  • Wie hierin gezeigt können gewisse Benzoesäurederivate der vorliegenden Erfindung als Induzierer einer mRNA degradation welche solche mRNA Inatabilitätssequenzen aufweisen, agieren. Die Aktivität der Verbindungen in dieser Erfindung als mRNA Degradationsinduzierer kann mit Tests weche einer entsprechend geschulten Person bekannt sind eruiert werden. Ein solcher Test ist z.B. ein reporter gene assay wie unten beschrieben wird oder in mehr Details in der internationalen Patentanmeldung PCT/CA99/01235 gezeigt wird.
  • Eine Methode zur Identifizierung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung weche fähig ist mRNA Degradation zu induzieren beinhaltet:
    • i) Kontaktierung der Verbindung mit einem DNA-Expressionssystem welches in der Abwesenheit der Verbindung in der Lage ist ein Protein zu exprimieren welches eine messbares Signal vermittelt, worin die mRNA welche für dieses Protein kodiert mindestens eine Kopie einer mRNA Instabilitätssequenz enthält
    • ii) Messung des Signals in Anwesenheit der Testverbindung und Vergleich des Testresultates mit einer Kontrolle.
  • Eine verwandte Methode um Verbindungen zu vergleichen welche mRNA Degradation induzieren, kann verwendet werden. Dabei handelt es sich um separate Kontaktierung der einzelnen Verbindungen mit einem DNA-Expressionssystem welches in der Abwesenheit der Verbindung in der Lage ist ein Protein zu exprimieren welches ein messbares Signal vermittelt, worin die mRNA welche für dieses Protein kodiert mindestens eine Kopie einer mRNA Instabilitätssequenz enthält und nachträglicher Vergleich der Testresultate.
  • Das DNA-Expressionssystem welches in der oben erwähnten Methode beschrieben wurde, enthält typischerweise ein Gen welches für ein Protein kodiert welches ein messbares Signal erzeugt wobei das Gen DNA enthält welche für die Aminosäuresequenz des Proteins kodiert zusammen mit 5' and 3'UTR Sequenzen welche entsprechende Expressionskontrollelemente, inklusive promoter and/or enhancer Regionen enthalten, und charakteristischerweise DNA welche mindestens eine Kopie einer mRNA Instabilitätssequenz aufweisen. Beispiel eines solchen DNA-Expressionssystems welches in den oben erwähnten Methoden gebraucht werden kann ist ein auf Zellen basierendes System, Einfacherweise in der Form einer entsprechend transformierten Zellline, optional eine stabile transformierte Zellline. Die Wirtszelle ist vorzugsweise eine eukariotische Wirtszelle, im speziellen eine tierische Wirtszelle wie eine Säugerwirtszelle.
  • Die Wirtszelle kann dem gleichen generellen Zelltyp entsprechen welcher das Protein exprimiert welches durch die mRNA kodiert wird welche man zu destabilisieren versucht. So wird z. B. die Methode gebraucht um Verbindungen der vorliengenden Erfindung zu charakterisieren welche die Fähigkeit haben mRNA welche für ein Zytokin kodiert, so ist die Wirtszelle vorzugsweise des selben oder ähnlichen Typs welche normaleweise das in Frage stehenden Zytokins exprimiert. Zum Beispiel Monozyten oder Monozytenähnliche Zelllinien können als Wirtszellen benutzt werden um Verbindungen welche Zytokine wie z.B. IL-1 ss, mRNA degradieren. Bevorzugte Zelllinien für Onkogene und andere mit Krebs in Verbindung stehende Gen mRNA-Instabilitätsversuche sind z.B. Colon 205, KB 31, KB 8511, DU145, HCT116, MCF7, MCF7/ADR, MDA-MB-231, MDA-MB-435-und MDA-MB-435/TO.
  • Die Gene welche für das Protein kodieren welches ein messbares Signal aussendet können selber ein Protein kodieren welches ein messbares Signal hat. Zum Beispiel kann es ein fluoreszierndes Protein sein wie z.B. green fluorescent protein.
  • Als Alternative dazu kann auch ein Protein verwendet werden welches in der Lage ist zusammen mit einem entsprechende Substrat ein messbares Signal zu erzeugen. Vorzugsweise ist das Protein welches durch die mRNA kodiert wird ein Enzym oder enzymatisch actives Fragment eines Enzymes. Beispiele solcher möglichen Enzyme beinhalten horseradish peroxidase (HRP), Chloramphenicol-acetyltransferase (CAT), Alkalische-phosphatase (AP), ausgeschiedne Alkalische-phosphatase (SEAP), β-galactosidase, oder Luciferase. Methoden zur Messung und Quantifizierung solcher Enzyme mit entsprechenden Substraten und Messmethoden sind bestens bekannt. Es ist aber abzusehen, dass geeignete detektierbare Proteine und Messmethoden welche hierin beschraben werden, verwendet werden.
  • Alternative Methoden zur Bestimmung der Fähigkeit von Testmolekülen welche eine mRNA Degradierung induzieren können sind einer entsprechend geschulter Person bekannt und können zur Messung der Aktivität von Benzoesäurederivaten der vorliegenden Erfindung benutzt werden.
  • Entzündungshemmende Aktivität
  • Wie hierin demonstriert wird, weisen gewisse Benzoesäurederivate der vorliegenden Erfindung entzündungshemmende Aktivität auf, welche z.B. auf ihrer Fähigkeit die Zytokinausschüttung zu hemmen oder als Zytokinantagonisten zu wirken, beruhen.
  • 1. In Vitro Methodologie
  • Ein Beispiel einer Methode zur Messung der Fähigkeit eines Benzoesäurederivates der vorliegenden Erfindung, die Zytokinfreisetzung zu inhibieren, ist die Zytokinfreisetzung von Zellen welche dazu stimuliert wurden, entweder in der Präsenz oder Abwesenheit einer Testverbindung zu eruieren. Lipopolysaccharid (LPS) ist ein Typ eines Stimulanses, welches dazu benutzt werden kann, eine Zytokinefreisetzung zu induzieren, hingegen kennt eine entsprechend geschulte Person auch andere Stimulantien welche in diesem Test benutzt werden können. Nach der Behandlung von Zellen in Kultur mit einem Stimulans in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung werden die Zellen für eine gewisse Zeit inkubiert und anschliessend wird das Kulturmedium und das Zelllysat gesammelt. Die Menge von Zytokinen wie z.B. IL-1β (Medium und Lysat), IL-6 (Medium), TNF-α (Medium) und PGE2 (Medium and Lysat) wird sodann bestimmt. Um sicherzustellen, dass die Testverbindung nicht zelltoxisch ist, wird auch die Lactate dehydrogenase (LDH) Activität (Medium and Lysate) und DNA (Lysate) analysiert. IL-1β, IL-6 und TNF-α Mengen können durch kommerziell erhältliche ELISA kits (Cistron) bestimmt werden, PGE2 kann mit einem Standard RIA and DNA fluorimetrisch mit DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole·2HCl) gemessen werden. Es wird darauf hingewiesen, dass dieser Test nicht limitiert ist durch die hier beschriebenen Methoden zur Quantifizierung von Zytokinen, LDH Sekretion oder DNA Mengen, da mehrere Testmethoden einer entsprechend geschulten Person bekannt sind und die Methoden welche hier beschrieben sind in keiner Weise die Breite der vorliegenden Erfindung beeinschränken sollen. Eine Reduzierung der Menge an Zytokinen im Medium der behandelten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen weist auf die Fähigkeit einer Testverbindung, die Zytokinefreisetzung zu hemmen, hin. Zusätzlich werden die Verbindungen als nicht zytotoxisch betrachtet wenn die LDH-Sekretion in behandelten verglichen mit unbehandelten Zellen unverändert bleibt.
  • Ein weiteres Beispiel einer Methode zur Messung der Fähigkeit eines Benzoesäurederivates der vorliegenden Erfindung, die Zytokinfreiseztung zu hemmen ist der Vergleich der Zytokinfreisetzung von stimulierten Zellen in Kultur in der Gegenwart und Abwesenheit von Testverbindung. In einem solchen Beispiel werden mononukleare Zellen in Kulturschalen gezüchtet in der Gegenwart verschiedener Konzentrationen einer Testverbindung, [Schnyder et al., Agents & Actions, 30, 350–362 (1990)]. Die nicht-adherenten Lymphozyten werden nach 4 Stunden entfernt und mehrmals gewaschen. Frisches Medium, Testverbindung und ein Stimulans, z.B. Lipopolysaccharide (LPS), werden hinzugefügt und die Monozyten werden einen weiteren Tag inkubiert.
  • Gereinigtes IL-1, rekombinantes humanes IL-1-β (rhlL-1) oder konditioniertes Medium welches von stimulierten humanen Monozyten stammt, Mausmacrophagen oder die Mauszellinie P388D1, bewirken charakteristische Veränderungen im Sekretionsmuster von Chondrozyten. Speziell bewirken die oben genannten Faktoren eine Induzierung einer latenten Metalloproteinase währendem die Sekretion von Plasminogenaktivator reduziert ist. Die Eigenschaften von Metalloproteinasen oder Stromelysin wurde im Detail in Chin et al., J. Biol. Chem. 260, 12367–12376 (1985) beschrieben, sowie dieselben von Plasminogen Aktivatoren in Schnyder et al., Anal. Biochem. 200, 156–162 (1992). Der Test wird dadurch durchgeführt indem man gesammeltes Kulturmedium 1:10 verdünnt und wie frisches Medium zu konfluenten Hasenchondrozytes gibt. Metalloproteinase Aktiviät im Chondrocytenkulturmedium wird nach weiteren 2 Tagen mit Standardmethoden, welche einer entsprechend geschulten Person bekannt sind, gemessen. Ein Beispiel einer solchen Methode is in Beispiel 6 der vorliegenden Anmeldung erwähnt. Verbindungen welche die Fähigkeit haben eine Zytokinfreisetzung zu hemmen bewirken eine Reduktion der Induzierung von Metalloproteaseaktivität in Chondrozyten in Medium von behandelten Zellen im Vergleich zu Medium von unbehadelten Zellen.
  • Um einen antagonistischen Effekt eines Benzoesäurederivates der vorliegenden Erfindung zu bestimmen wird ein Zytokin, von dem man weiss, dass es eine Wirkung auf kultivierte Zellen hat, zu diesen gegeben, und die Wirkung wird in der Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung gemessen. Beispiel 7 der vorliegenden Anmeldung demonstriert einen solchen Test, in dem Chondrozyten verwendet werden. Wie beschrieben reagieren Chondrozyten auf IL-1 mit einer erhöhten Metalloproteinaseaktivität. Eine Testverbindung hat dann eine antagonistische Wirkung, wenn die Metalloproteinaesaktivität in der Gegenwart einer Testverbindung reduziert ist im Vergleich zu der Aktivität in deren Abwesenheit.
  • 2. In Vivo Methodologie
  • Ein bekanntes Tiermodell, um Entzündungsreaktionen zu messen, ist das LPS induzierte Fiebermodell in Ratten. Es wird dabei eine LPS-Suspension in Ratten injiziert.
  • Nach bestimmten Zeitintervallen nach der Injektion wird die Körpertemperatur der Ratten gemessen und anschliessend an das folgende Zeitintervall wird eine Testverbindung verabreicht. Am Ende des dritten Zeitintrevalls wird erneut die Körpertemperatur gemessen. Die Temperaturerhöhung der unbehandelten Kontrolle kann als 100% angenommen werden und diejenige der behandelten Gruppe wird als Prozentsatz dieses Wertes ausgedrückt. Als ED50 wird die Dosis welche eine 50 %ige Hemmung der Temperaturerhöhung im Vergleich zu Kontrolltieren bewirkt, bezeichnet. Verbindungen der vorliegenden Erfindung weisen typischerweise ED50 Werte zwischen 0.1 und ca. 1 mg/kg auf.
  • Ein weiteres bekanntes Entzündungstiermodell ist das Canageenan-induzierte Pfotenödem in der Rattet. Testverbindungen werden eine Stunde vor der Carragenaninjektion verabreicht. Carrageenan wird durch eine subplantare Injektion in die Hinterpfote verabreicht. Die Anschwellung der Pfote wird gemessen. Eine Kontrollmessung wird unmittelbar nach der Injektion durchgeführt und die Schwellung wird nach 3 und 5 Stunden gemessen. Der Durchschnittswert der 3 und 5 Stundenmessung wird bestimmt nach Subtraktion des Kontrollwertes und der erhaltene Wert wird als Prozentsatz des Wertes, welcher von unbehandelten Kontrolltieren bestimmt wurde, ausgedrückt. Die EDV ist diejenige Dosis, welche eine 50 % Hemmung der canagenaninduzierten Schwellung nach 3 Stunden bewirkt. Verbindungen dieser Erfindung wiesen typischerweise ED50 Werte von 0.5 bis 1 mg/kg auf.
  • Es ist offensichtlich für eine entsprechend geschulte Person, dass es sich bei den erwähnten Beispielen um Standardtests handelt, um die Aktivität von Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu messen. Eine Vielzahl von Tests, welche die krebshemmende oder anti-neoplastische Aktivität, die Fähigkeit die Sensitivität gegenüber Krebsmitteln wiederherzustellen oder zu erhöhen, die Fähigkeit mRNA-Abbau zu induzieren und die entzündungshemmende Wirkung ermitteln können, sind bekannt und können dazu verwendet warden, um die Benzoesäurederivate der vorliegenden Erfindung zu charakterisieren.
  • Verwendung der Benzoesäurederivate
  • In einer Darstellung der vorliegenden Erfindung werden die Benzoesäurederivate in der Behandlung von Patienten benutzt, welche pathologische Zustände aufweisen, welche mit abnormaler Zellproliferation verbunden sind. Diese pathologischen Zustände beinhalten die abnormale Zellproliferation von malignen Zellen von verschiedenen Geweben und/oder Organen ohne Ausschliessung anderer, z.B. aus Muskeln, Knochen oder Bindegewebe, Haut, Hirn, Lunge, Sexorganen, des Lymphsystems, Nierensystem, Brust oder Blutzellen, Leber, Verdauungstrakt, Pankreas und Schilddrüse oder Nebenniere. Diese pathologischen Zustände beinhalten auch solide Tumore, Eierstockkrebs, Brustkrebs, Hirnkrebs, Prostakrebs, Darmkrebs, Bauch-, Nieren- oder Hodenkrebs, Kaposi's sarcoma, Cholangioma, Neuroblastoma, Wilms' Tumor, Hodgkin's Syndrom, Melanom, Multiples Myeloma, Lymphatische Leukämie und akute oder chronische Granulozytenlymphoma.
  • In einer alternativen Darstellung der vorliegenden Erfindung werden die Benzoesäurederivate dazu benutzt, die Zytokinfreisetzung zu hemmen oder als funktionaler Zytokinantagonist zu wirken. In einer spezifischen Darstellung werden die Benzoesäurederivate benutzt um die Freisetzung von IL-1, IL-6 und/oder TNF-α zu hemmen und/oder als funktionelle Antagonisten von IL-1 zu wirken.
  • Eine verwandte Anwendung der vorliegenden Erfindung beinhaltet den Gebrauch der Benzoesäurederivate in der Behandlung von Störungen, welche eine Ätiologie aufweisen die mit übermässiger Zytokinfreisetzung, vor allem IL-1β-Freisetzung z.B. in einer Vielzahl von Enzündungen und Enzündungskrankheiten wie Rheumatische Arthritis, Osteoarthritis, Sepsis, Septischer Schock, Psoriasis, Artenosklerose, Chronisch entzündliche Darmerkrankung, Morbus Crohn und Asthma assoziiert ist.
  • In einer anderen Anwendung können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in der Prophylaxe oder Behandlugn von Krankheiten und generellen medizinischen Befunden, die eine Ätiologie aufweisen, welche mit einer erhöhten oder verlängerten mRNA Stabilität von mRNA welche eine oder mehrere mRNA Instabilitätssequenzen aufweisen und welche bei verlängerter oder unerwünschter Expression typischerweise zu unerwünschten Effekten wie z.B. Krebszellenwachstum oder ungewollten Enzündungsreaktionen führt, assoziert sind.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindungen können im Zusammenhang mit Krankheiten und medizinischen Befunden, welche mit einem der oben oder in den aufgelisteten Publikationen erwähnten Genen, welche mRNA Instabilitätssequenzen enthalten, assoziert sind, verwendet warden.
  • Beispiele von Krankheiten und medizinischen Befunden welche mittels vorliegender Erfindung verhindert oder behandelt werden können, beinhalten Karzinome wie Darm, Brust, Lunge etc., akute und chronische Enzündungen, Autoimmunerkrankungen, Atemwegskrankheiten, Infektionen und Transplantatabstossungen sowie neuronale Enzündungen, Alzheimer's Erkrankung und Kardiovaskuläre Krankheiten.
  • Eine verwandte Anwendung der vorliegenden Erfindung beinhaltet, Verbindungen welche mRNA Abbau von mRNA mit einer oder mehreren mRNA-Instabilitätssequenzen enthalten induzieren, zum Gebrauch als Pharmazeutikas zur Prophylaxe oder Behandlung von Krankheiten und medizinischen Befunden, welche im Allgemeinen eine Ätiologie aufweisen welche in Zusammenhang mit erhöhter oder verlängerter mRNA Stabilität steht und welche bei verlängerter oder unerwünschter Expression typischerweise zu unerwünschten Effekten wie Krebszellwachstum oder ungewollten Enzündungsreaktionen führen.
  • Im Zusammenhang mit ihrer Aktiviät als Induzierer des Abbaus von mRNA welche mRNA-Instabilitätssequenzen enthalten, sind diese Verbindungen von Nutzen in der Prophylaxe und Behandlung von malignen Erkrankungen welche eine ungewollte Akkumulierung und Erhöung der mRNA Expression von mRNA welche mRNA Instabilitätssequenzen aufweisen, beinhalten, und welche für Proteine kodieren die in der Auslösung, Progression und Aufrechterhaltung von Karzinomen, malignen Erkrankungen eine Rolle spielen. Beispiele solcher krebsrelevanter mRNA welche mRNA-Instabilitätssequenzen enthalten sind verschiedene Onkogene, Transkriptionsfaktoren, z.B. c-myc, c-fos, Spl, bcl-2 und ähnliche Gene. Die unerwünschte oder verlängerte Expression solcher Onkogene spielt eine Rolle in gewissen Formen von Karzinomen wie Darmkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, etc. Weitere Beispiele von mit Krebs im Zusammenhang stehenden Genen, deren mRNAs Instabilitätssequenzen aufweisen, sind die Metalloproteinasen wie z.B. MMP-1, MMP-2, Collagenasen etc., die in der Gewebsneubildung welche für das Tumorwachsugm und die Metastasenbildung erforderlich ist eine Rolle spielen; Zellzyklusverwandte Gene wie p45/SKIP2 etc. und die Multiarzneimittelresistenzgene zB. mdr-1, MRPs, etc. die in der intrinsischen oder erworbenenen Multiarzneimittelresistenz gewisser Krebszellen involviert sind.
  • Vorteilhaft an den vorliegenden Verbindungen ist, dass eine Behandlung mit ihnen zu einem Abbau der mRNA solcher Gene führt was in einer Verminderung oder Abschaltung der Genexpression resultiert. So können zum Beispiel diese Verbindungen gebraucht werden zur Behandlung und der Profilaxe von, durch Onkogene vermittelten, Karzinomen und malignen Krankheiten, zur Behandlung oder Vorbeugung von Tumorwachstum und Metastasenbildung im Allgemeinen und zur Vorbeugung oder Rückgängigmachung der Multiarzneimittelresistenz im Speziellen, was zur Erleichterung der Krebs- und Tumorbehandlung durch konventionelle zytotoxische Krebsmittel führt.
  • Wenn die Benzoesäurederivate benutzt warden, um eine Multiarzneimittelresistenz von Karzinomen oder malignen Zellen umzukehren oder ihrer vorzubeugen, werden sie kennzeichnenderweise in Kombination mit zytostatischen oder zytotoxischen Verbindungen angewandt.
  • Die Benzoesäurederivate der vorliegenden Erfindung können entweder allein oder in Kombination mit anderen pharmakologisch aktiven Verbindungen, wie z.B. Polyaminsyntheseenzyminhibitoren, Proteinkinase C-inhibitoren, oder anderer Tyrosinkinaseinhibitoren, negativen Wachstumsregulatoren, z.B. TGF-β or IFN-β; Aromataseinhibitoren, Antiöstrogenen und/oder zytostatischen Verbindugnen, angewendet warden.
  • Zusammensetzungen, die Benzoesäurederivate enthalten
  • Eine Anwendung der vorliegenden Erfindung zeigt Zusammensetzungen, welche ein oder mehrere Benzoesäurederivate der Formel I und einen oder mehrere nicht-toxische pharmazeutisch aktzeptable Träger und/oder Verdünner und/oder Hilfsstoffe und, falls wünschenswert, andere aktive Inhaltsstoffe aufweisen. Wie oben erwähnt werden solche Zusammensetzungen zur Behandlung von verschiedenen Befunden in Säugern, inklusive Menschen, gebraucht.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung werden duch konventionelle Methoden verabreicht, speziell entweder nasal, enteral, vorzugsweise oral, z.B. in der Form von Tabletten oder Kapseln, oder parenteral z. B in der Form von Injektionslösungen oder Supensionen oder in Zäpfchenform. Dosiseinheiten enthalten zum Beispiel von ca. 2 mg bis 1 g der Verbindung dieser Erfindung. Die Erfidung beinhaltet auch die pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine effiziente Menge der Verbindung zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnern oder Trägern enthält.. Solche Zusammensetzungen können mit konventionellen Herstellungsmethoden fabriziert werden. [0078] Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen welche die Verbindungen der vorliegenden Erfindung als aktiven Inhaltsstoff enthalten, und welche speziell für die Behandlung der oben erwähnten Krankheiten gebraucht werden können, sind Zusammensetzungen zur enteralen, wie nasalen, buccalen, rektalen oder speziell oralen Verabreichung, und parenteralen wie intravenösen, intramuskulären oder subkutanen Behandlung von warmblütitigen Tieren, im speziellen Menschen. Die Zusammensetzungen enthalten den aktiven Inhaltsstoff allein oder vorzugsweise zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Die Dosis des aktiven Inhaltsstoffes hängt von der zu behandelten Krankheit, der Spezies, Alter, Gewicht, und dem individuellen Zustand, den individuellen pharmakokinetischen Gegebenheiten und der Verabreichungsmethode ab.
  • Die Dosis kann durch eine entsprechend geschulte Person ohne weiters mit Standardmethoden unter Abwägung der oben erwähnten Gegebenheiten ermittelt werden.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann von ca. 1 % bis ca. 95% der aktiven Verbindung enthalten. Für eine Einzeldosisverabreichung enhält die Zusammenstzung vorzusweise ca. 20% bis ca. 90% aktive Verbindung, für Verabreichung in Mehrfachdosierung vorzugsweise ca 5% bis 20% aktiver Vebindung. Dosiseinheiten sind zum Beispiel Dragees, Tabletten, Ampullen, Zäpfchen oder Kapseln. Ander Verabreichungsformen sind zum Beispiel, Salben, Cremen, Pasten, Schaum, Tinkturen, Lippenstift, Tropfen, Sprays, Dispersionen etc. Beispiele sind Kapseln welche zwischen ungefähr 0.05 g bis ungefähr 1.0 g der aktiven Verbindung enthalten.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden auf per se bekannte Art zum Beispiel duch mischen, granulieren, konfektionieren, lösen oder lyophilisieren, hergestellt.
  • Lösungen des aktiven Inhaltsstoffes und auch Suspensionen oder Dispersionen, speziell isotonische wässrige Lösungen, Dispersionen oder Suspensionen werden vorzugsweise benutzt damit z.B. im Falle einer lyophylisierten Zusammensetzung, welch die active Verbindung enthält, entweder allein oder zusammen mit einem Träger, z.B. Mannitol, es möglich ist die Suspension oder Dispersion unmittelbar vor Gebrauch herzustellen. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann sterilisiert sein und/oder enthält Arzneistoffträger z. B. Präservierungsstoffe, Stabilisatoren, netzende Mittel und/oder Emulgatoren, Lösungsmittel, Saltze zur Reglierung des osmotischen Druckes und/oder Puffer, und werden durch per se bekannte Weisen zum Beispiel durch konventionales lösen oder gefriertrocknen, hergestellt. Die Lösungen oder Suspensionen können Viskositätserhöhende Substanzen wie Natriumcarboxymethylzellulose, Dextran, Polyvinylpyrrolidone or Gelatine enthalten.
  • Suspensionen in Oel enhalten als Öle Pflanzenöl, synthetisches oder halbsynthetisches Öl welche normalerweise für Injektonen gebraucht werden. Erwähnt werden als solche können speziell flüssige Fettsäureester welche als Säurekomponente langkettige Fettsäuren welche von 8 bis 22, im Speziellen 12 bis 22 Kohlenstoffatome enthalten, z.B. Laurylsäure, Tridecylsäure, Myristylsäure, Pentadecylsäure. Palmitinsäure, Margarinsäure, Stearinsäure, Arachidonsäure, Beheninsäure oder die entsprechenden ungesättigten Säuren zum Beispiel Oleinsäure, Elaidinsäure, Erucidinsäure, Brassidinsäure oder Linoleinsäure, falls wünschenswert mit der Zugabe von Antioxidantien z. B. Vitamin E, (i-Carotin or 3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxitoluol. Die Alkoholkomponente dieser Fettsäureester hat im Maximum 6 Kohlenstoffatome und ist mono- oder polyhydroxylisch, z.B. mono-, di- oder trihydroxilischer Alkohol, wie Methanol, Aethanol, Propanol, Butanol oder Pentanol oder die Isomeren davon, im Speziellen aber Glycol und Glycerin. Die folgenden Beispiele von Fettsäureestern werden deshalb erwähnt: Aethyloleat, Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, "Labrafil M 2375" (Polyoxyäthylenglycerin-trioleat, Gattefossé, Paris), "Labrafil M 1944 CS" (ungesättigtes polyglykolisiertes Glycerid hergestellt durch Alkoholyse von Aprikosensteinöl und Glyceride und Polyäthylenglykolester enthaltend; Gattefossé, France), "Labrasol" (gesättigte polyglykolisierte Glyceride hergestellt durch Alkoholyse von TCM und Glyceride und Polyäthylenglykolester enthaltend; Gattefossé, France) und/oder "Miglyol 812" (Triglycerid von gesättigten Fettsäuren mit einer Kettenlänge von C8 bis C12, Hüls AG, Germany), aber speziell Pflanzenöle wie Leinsamenöl, Mandelöl, Olivenöl, Rizinusöl, Sesamöl, Soyabohnenöl und speziell Erdnussöl
  • Die Injektionszusammensetzungen werden in üblich er Weise unter sterilen Bedingungen hergestellt. Das Gleiche gilt auch für den Einschluss der Zusammensetzungen in z.B. Ampullen oder Fläschchen und für die Versiegelung der Behälter.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können zum Beispiel duch eine Kombination der aktiven Substanz mit einem oder mehreren soliden Trägern, wenn gewünscht durch Granulieren der resultierenden Mischung und Verarbeitung der Mischung oder des Granulates und wenn nötig, durch Zugabe zusätzlicher Hilfsstoffe zu Tabletten oder Dragéekerne verarbeitet werden.
  • Geeignete Träger sind speziell Füllstoffe wie Zucker, z.B. Laktose, Saccharose, Mannitol oder Sorbitol, Zellulosepräparate und/oder Kalziumphosphat, z.B. Trikalziumphosphat or Kalziumhydrogenphosphat, und auch Bindemittel wie Stärke, z.B. Mais-, Weizen-, Reis-, oder Kartoffelstärke, Methylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon, und/oder, falls gewünscht Desintegrierer wie die oben erwähnten Stärken, auch Karboxymethylstärke, kreuzvernetzte Polyvinylpyrrolidone oder Alginsäure, oder Salze davon wie Natriumalginat. Zusätzliche Hilfsstoffe sind spezielle Flusskonditionierer und Schmiermittel, zum Beispiel Kieselsäure, Stearinsäure, Talk oder Salze davon wie Magnesium oder Kalziumstearat und/oder Polyäthyleneglykol, oder Derivate davon.
  • Dragéekerne können mit geeigneten enterischen Überzügen geliefert werden, wobei inter alia konzentrierte Zuckerlösungen, welche Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Polyäthyleneglykol und/oder Titandioxid, oder Beschichtungslösungen in geeigneten organischen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelmischungen oder zur Produktion enterischer Beschichtungen, Lösungen von geigneten Zellulosepräparaten wie Acetylzellulosephthalat oder Hydroxypropylmethylzellulosephthalat, enthalten, gebraucht werden.
  • Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten oder Dragees gegeben werden zu, zum Beispiel, Identifikationszwecken oder um auf unterschiedliche Dosierung des aktiven Inhaltstoffes hinzuweisen.
  • Oral verabreichbare pharmazeutische Zusammensetzungen beinhalten auch trocken gefüllte Kapseln aus Gelatine, oder auch weiche, versiegelte Kapseln aus Gelatine mit einem Weichmacher wie Glyzerin oder Sorbitol. Die trocken gefüllten Kapseln können den aktiven Inhaltsstoff in Form eines Granulats, z.B. in Mischung mit Füllstoffen wie Maisstärke, Bindemittel und/oder Gleitmittel wie Talk oder Magnesiumstearat und wahlweise Stabilisatoren, enthalten. In weichen Kapseln ist der aktive Inhaltsstoff vorzugsweise gelöst oder suspendiert in einem geeigneten flüssigen Hilfsstoff wie Ölen, Paraffinöl, oder flüssigen Polyäthylenglykolen, oder Fettsäureestern von Aethylen- oder Propylenglykol zu welchen Stabilisatoren oder Detergentien z.B. des Polyoxyäthylensorbitolfettsäureestertyps gegeben werden können.
  • Andere orale Verabreichungsformen, zum Beispiel Sirupe, hergestellt in einer üblichen Weise welche die aktive Verbindung in z.B. suspendierter From und in einer Konzentration zwische ca. 5 % bis 20 %, vorzugsweise ca. 10% oder in ähnlichen Konzentrationen welche eine geeignete Einzeldosis, zu Beispiel wenn in Mengen von 5 oder 10 ml verabreicht werden, ergeben. Auch geeignet zur Verpackung in Einzeldosen sind z.B. Pulfer oder flüssige Konzentrate zur Herstellung von "Shakes" z. B in Milch.
  • Für die rektale Verabreichung z. B. durch ein Zäpfchen, eignen sich pharmazeutische Zusammensetzungen welche aus einer Kombination der aktiven Verbindung und einer Zäpfchenbasis bestehen. Geeignete Zäpfchenbasen sind z. B. natürliche oder synthetische Triglyceride, Paraffinkohlenwasserstoffe, Polyäthylenglykole oder höhere Alkanole.
  • Zur parenteralen Verabreichung sind speziell wässrige Lösungen einer aktiven Verbindung, z.B in Form eines wasserlöslichen Salzes oder wässriger Injektionssuspension welche viskositätserhöhende Substanzen, z.B. Natriumkarboxymethylzellulose, Sorbitol und/oder Dextran und wenn wünschenswert Stabilisatroren, enthält, geeignet. Die aktive Verbindung kann nach Wunsch zusammen mit Hilfstoffen auch in lyophilisierter Form dargeboten werden, welche kurz vor der parenteralen Verabreichung durch Zugabe geeigneter Lösungsmittel in eine Lösung umgewandelt werden kann.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung können prophylaktisch oder therapeutisch in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, vorzugsweise in einer wirksamen Dosis gegen eine gegebene Krankheit, einem warmblütigen Tier, zum Beispiel einem Menschen, welche eine solche Behandlung durch diese Verbindungen speziell in in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung erfordert, verabreicht werden. Zu einer solchen Behandlung eines Individiums von ca. 70 kg Körpergewicht wird eine tägliche Dosis einer Verbindung von ca. 0.1g bis ca. 5g, vorzugsweise von 0.5 g bis ca. 2 g verabreicht
  • Die Erfindung liefert auch eine pharmazeutische Verpackung oder Kit welche ein oder mehrere Behälter gefüllt mit einem oder mehreren Inhaltsstoffen der pharmzeutischen Zusammensetzug dieser Erfindung beinhaltet. Zu einem solchen Behälter gehört eine durch eine Behörde vorgeschriebene Notiz welche Herstellung, Gebrauch und Verkauf von Pharmazeutika oder biologischen Produkten reguliert und welche die Bewilligung der Behörde zur Herstellung, Gebrauch oder Verkauf zur menschlichen Verabreichung beinhaltet.
  • Zusatzlich können die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch in Verbindung mit anderen therapeutischen Mitteln gebraucht werden.
  • Um ein besseres Verständniss der hier beschriebenen Erfindung zu vermitteln werden die folgenden Beispiele angefügt. Es ist aber selbstverständlich, dass es sich dabei nur um Illustrationsbeispiele handelt welche deshalb in keiner Weise die Breite dieser Erfindung limitieren sollen. BEISPIELE BEISPIEL 1: Herstellung der Verbindung D und von Derivaten
    Figure 00260001
  • Verbindung B
  • Zu einer Lösung von 46.7 g Verbindung A (welche synthetisiert wurde gemäss der in Synthesis 1980, 814 beschriebenen Prozedur) in 800 ml Methanol wurden 400 ml 2N NaOH zugegeben. Diese Mischung wurde unter Rückfluss während 24 Stunden gerührt. Methanol wurde abgedampft und die verbliebene wässrige Flüssigkeit wurde mit Diäthyläther extrahiert. Die Wasserphase wurde unter Kühlung mit konzentrierter Salzsäure angesäuert. Der Niederschlag wurde abfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und bei 80°C unter Vacuum getrocknet. Die Ausbeute war 31.8 g einer beigen soliden Substanz mit Smp. 138–140°C.
  • Verbindung D
  • Zu einer Lösung von 1.55 g Verbindung B (wie oben hergestellt) in 42 ml THF wurde bei 20°C tropfenweise 4.1 ml Oxalylchlorid zugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt und das Lösungsmittel mit dem Rotavap verdampft. Der Rückstand wurde in 40 ml Methylenchlorid und 0.8 ml Pyridin gelöst. Eine Lösung von 1g der Verbindung C (hergestellt nach der Methode beschrieben in J. Chem. Research (3) 1987, 369) in 10 ml Methylenchlorid wurde tropfenweise dazugegeben. Diese Mischung wurde unter Argon bei Raumtemperatur wärend 17 Stunden gerührt und mit gesättigter wässriger NaHCO3-Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft zu einem braunen Öl (1.97 g), welches an einer Silicagelsäule mit Hexan Aethylacetat = 2 : 1 als Fliessmittel gereinigt wurde, und eine Ausbeute von 0.9 g Verbindung D, als farblose Kristalle, ergab. Smp. 74–78°C.
    D: NMR (in CDCl3): 2.28 ppm (s, 3H); 3.8 ppm (s, 3H); 4.59 ppm (d, 2H);
    5.32 ppm (m, 1H); 6.21 ppm (dd, 1H); 6.7–6.85 ppm (m, 2H);
    7.23 ppm (t, 1H); 7.51 ppm (dd, 1H). BEISPIEL 2: Herstellung der Verbindung der Formel F und Derivaten
    Figure 00270001
  • Verbindung E
  • Zu einer Lösung von 3.6 g 2-Methoxy-benzoesäure wurden bei 20°C, tropfenwieise 10.1 ml Oxalylchlorid plus ein Tropfen DMF zugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur wärend 3 Stunden gerührt. Die blassgelbe Lösung wurde eingedampft und wieder in 100 ml Dichloromethan gelöst. Zu dieser Lösung wurden 2.5 g Verbindung C (hergestellt wie oben beschrieben) in 25 ml Dichloromethan hinzugegeben. Dies Mischung wurde bei Raumtemperatur wärend 24 Stunden gerührt und dann mit Wasser gewaschen, mit Na2SO4 getrocknet und zu einem dunkelgelben Öl eingedampft. Dieses wurde an Silikagel mit Toluol : Aethylacetat = 4:1 as Eluent flash-chromatographiert und ergab 3.6 g E als farblose Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 53–58°C.
    E: NMR (in CDCl3):
    3.9 ppm (s, 3H); 4.6 ppm (dq, 2H); 5.35 ppm (m, 1H);
    6.21 ppm (dd, 1H); 6.9–7.05 ppm (m, 2H); 7.4–7.6 ppm (m, 2H);
    7.78 ppm (dd, 1H).
  • Verbindung F
  • Zu einer Lösung von 3.1 g E (hergestellt wie oben) in 100 ml Dichlormethan wurden bei 0°C 17.8 ml einer 2.1 molaren Lösung BCl3 in Aethylenchlorid zugegeben. Diese Mischung wurde bei 0°C wärend 30 Minuten gerührt und dann auf Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde 2x mit Wasser und 1x mit sat. NaCl Lösung gewaschen und mit Na2SO4 getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde an Silikagel mit Toluol: Aethylacetat = 4:1 als Eluent, chromatographiert, was 2.1 g F als farbloses Öl ergab.
    F: NMR (in CDCl3): 4.62 ppm (dq, 2H); 5.38 ppm (m, 1H); 6.27 ppm (dd, 1H);
    6.8–7.0 ppm (m, 2H); 7.4–7.6 ppm (m, 2H); 7.76 ppm (dd, 1H);
    10.42 ppm (s, 1H). BEISPIEL 3: Herstllung von Verbindungen der Formel H und Derivaten
    Figure 00280001
  • Verbindungen G und H wurden mit den oben beschriebenen Methoden hergestellt.
    G: NMR (in CDCl3): 3.85 ppm (s, 3H); 3.88 ppm (s, 3H); 4.57 ppm (dq, 2H);
    5.32 ppm (m, 1H); 6.19 ppm (dd, 1H); 6.4–6.55 ppm (m, 2H);
    7.5 ppm (dd, 1H); 7.8 ppm (d, 1H).
    H: NMR (in CDCl3): 3.82 ppm (s, 3H); 4.39 ppm (m, 2H); 5.35 ppm (m, 1H);
    6.23 ppm (dd, 1H); 6.35–6.5 ppm (m, 2H); 7.5 ppm (dd, 1H);
    7.67 ppm (d, 1H); 10.6 ppm (s, 1H).
  • BEISPIEL 4: Herstllung von Verbindungen der Formel I und Derivaten
    Figure 00290001
  • Verbinung I wurde mit den oben beschriebenen Methoden hergestellt.
    I: NMR (in CDCl3): 2.5 ppm (s, 3H); 4.5–4.8 ppm (m, 2H); 5.38 ppm (m, 1H);
    6.27 ppm (dd, 1H); 6.7 ppm (d, 1 H); 6.83 ppm (d, 1H);
    7.29 ppm (t, 1H); 7.5 ppm (dd, 1H); 11.0 ppm (s, 1H).
  • Die Verbindungen der Erfindung haben pharmakologische Eigenschaften. Im speziellen zeigen sie hemmende Effekte auf Zytokine, nicht nur durch Hemmung der Freisetzung von IL-1, IL-6 und TNF-α, sondern auch als funktionelle Antagonisten von IL-1 wie in den folgenden in vitro und in vivo Testmethoden beschrieben wird.
  • BEISPIEL 5: Zytokinfreisetzung von THP-1 Zellen
  • Die THP-1 Zelllinie ist allgemein erhältlich und ist durch Tsuchiya et al. [Int. J. Cancer 26 171–176 (1980)] beschrieben. 900 μl THP-1 Zellen (0.5 × 106 Zellen) zusammen mit 100 U γ-interferon/0.9 ml RPMI 1640 Medium (enthaltend 2 mM L-Glutamin and 5% hitreinaktiviertes fötales Kalbsserum) werden in 24-Lochplatten gegeben. 100 μl der zu testenden Verbindung wird dann hinzugefügt. Nach 3 Stunden bei 37°C in 5 % CO2/95 Luft wird 10 μl Lipopolysaccharid (LPS) 500 μg/ml hinzugegeben und die Inkubation für weitere 40 Stunden fortgeführt. Geeignete Kontrollen (mit und ohen Stimulus oder Lösungmittel) werden auch miteinbezogen. Das Medium wird entnommen und durch Zentrifugation bei 1000 g for 10 min geklärt. 1.0 ml Digitonin 0.01 % wird hinzugefügt und die Zellen werden lysiert und von der Platte durch abschaben mit einem "rubber policeman" entfernt und bei 4°C für 10 min stehen gelassen. Lactatdehydrogenase Messungen werden sofort durchgeführt und die Proben bei –20°C aufbewart bis andere Messungen gemacht werden können. Diese beinhalten IL-1β (Medium und Lysat), IL-6 (Medium), TNF-α (Medium), PGE2 (Medium und Lysat), Lactatdehydrogenase (LDH) (Medium und Lysat) und DNA (Lysate). IL-1β, IL-6 und TNF-α werden mit Hilfe komerziell erhältlichen ELISA kits (Cistron), PGE2 mittels Standard-RIA and DNA fluorimetrisch mit DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole·2HCl) gemessen. In diesen Tests hemmen die Verbindungen dieser Erfindung IL-1β, IL-6, TNF-α und PGE2 Freisetzung bei Konzentrationen von ca. 0.1 bis 10 μM. Im Gegensatz dazu bleiben die DNA Werte praktisch unangetastet und da die LDH Werte unverändert bleiben sind die Verbindungen nicht toxisch.
  • BEISPIEL 6: Zytokinfreisetzung von humanen Monozyten
  • Humane Monozyten
  • Mononucleäre Zellen werden vom Blut gesunder Freiwilligen mittels Zentrifugation gewonnen und durch Kultivierung in Petrischalen in Anwesenheit der Testverbindung in verschiedenen Konzentrationen, gezüchtet, [Schnyder et al., Agents & Actions, 30, 350–362 (1990)]. Die nicht-adherenten Lymphozyten werden nach 4 Stunden durch mehrfaches Waschen entfernt. Frisches Medium, Testverbindungen und LPS (10 μg/ml) als Stimulans werden zu den Monozyten hinzugegeben und für einen zusätzlichen Tag weiter inkubiert. Die zusammengefassten Kulturmedien werden 1:10 mit frischem Medium verdünnt und konfluenten Kaninchenmonozyten verabreicht. Die Aktivität von Metalloproteinasen im Chondrozytenkulturmedium wird nach weiteren 2 Tagen wie unten beschrieben, gemessen. Die Verbindungen der Erfindung sind aktiv in der Hemmung der Monokinfreisetzung in dieser Testmethode bei Konzentrationen von 0.1 bis 10 μM.
  • Bestimmung von IL-1 durch den Chondrozytentestät
  • IL-1, rekombinantes humanes IL-1-β (rhlL-1) oder konditioniertes Medium welches von stimulierten humanen Monozyten, Mäusemakrophagen oder der Mauszelllinie P388D, stammt, bewirken charakteristische Veränderungen im Sekretionsmuster von Chondrozyten. Im Speziellen wird eine latente Metalloproteinase induziert währendem die Sekretion von Plasminogenaktivator reduziert wird. Die Eigenschaften von Metalloproteinase oder Stromelysin wurde im Detail in Chin et al., J. Biol. Chem. 260, 12367–12376 (1985) beschrieben wie auch diejenige des Plasminogenaktivators durch Schnyder et al., Anal. Biochem. 200, 156–162, (1992). Unter Verwendung von gereinigtem oder rekombinantem IL-1 und Neutralisation mit einem humanen Antikörper gegen humanes Monozyten IL-1 wurde mit Hilfe von Dosis-Wirkungskurven gezeigt, dass dieses System als ein spezifischer und sensitiver Bioassay für IL-1 verwendet werden kann. Die Stimulierung der Sekretion der latenten Metalloproteinase durch Kaninchengelenkchondrozyten ist relativ IL-1 spezifisch. IL-2, TNF-α, rekombinantes humanes Interferon-α, und -γ, Phorbolmyristatacetate, Concanavalin A, Prostaglandin E und Indomethacin haben keinen Einfluss [Schnyder and Payne, Brit. J. Rheumatol. 24 (suppl. 1), 128–132 (1985); Schnyder et al., J. Immunol. 138, 496–503 (1987)].
  • Chondrozyten werden wie in Evequoz et al., Biochem. J. 219, 667–677 (1984) beschrieben, geerntet und gezüchtet. In Kürze, Chondrozyten werden von Scheiben des distalen Knorpels vom Femur eines ca. 1.2 kg schweren weiblichen New Zealand White Hasen durch Proteinasebehandlung gewonnen. Die gewaschenen Zellen werden in 48-Loch Platten in DMEM, angereichert mit 1% Antibiotika, 2 mM Glutamin und 10 % hitze-inaktiviertem fötalem Kalbsserum kultiviert. Nach Erreichen der Konfluenz werden die Zellen mit 20 u Proben des Testkulturmediums des IL-1 Bioassays inkubiert und mit Iscove's modifiziertem Dulbecco's Medium auf ein Volumen von 300 μl gebracht. Die Medien im Überstand werden nach 48 Stunden gesammelt, zentrifugiert und biochemisch analysiert.
  • Biochemische Assays
  • Metalloproteinasen werden kinetisch in 96-Loch Platten mit einem Twinreader (Flow Laboratories AG), gesteuret durch einen Komputer, gemessen.
  • Ac-Pro-Leu-Gly-S-Leu-Leu-Gly-OC2H5, ein synthetisches Substrat für Wirbeltierkollagenasen wird zur Bestimmung von Metalloproteinasen verwendet [Weingarten and Feder, Anal. Biochem. 147, 437 (1985)].
  • 50 μl der latenten Metalloproteinase wird durch 50 μl Tripsin (120 μg/ml in 50 mM PIPES pH 6.8, 20 mM CaCl2) während 30 min bei 37°C aktiviert, wonach die Aktivitäten aller Serinproteinasen durch Zugabe von Soyabohnentrypsininhibitor (SBTI; 166 μ/ml in dem oben erwähnten Puffer), gestoppt wird. Ein 50 μl Aliquot der aktivierten Metalloproteinase wird dann mit 100 μl Reaktionslösung (2.5 mM 5, 5'-dithio-bis-2-nitrobenzoesäure, 100 μg/ml SBTI, 20 mM CaCl2 in oben erwähntem Puffer) gemischt und für 10 min. bei Raumtemperatur stehen gelassen damit alle SH-Gruppen reagieren können. Die Reaktion wird dann durch Zugabe von 100 μl Substratlösung (1.25 mM in Puffer mit 100 μg/ml SBTI) gestartet und die Veränderungen der Absorption bei 414 nm wird 11 mal in 1 Minutenintervallen gemessen.
  • BEISPIEL 7: Funktionale IL-1 Antagonisteneftekte
  • Die Testmethode in Beispiel 6 wird wiederholt aber anstelle von humanen Monozyten wird IL-1 selber (recombinant human IL-1, Sandoz) in Konzentrationen von 1 ng/ml zugegeben. Metalloproteinaseaktivität in dem Chondrozytenkulturmedium wird nach 2 Tagen gemessen Verbindungen der Erfindung sind aktive funktionelle Antagonisten bei Konzentrationen von 1–10 μM.
  • BEISPIEL 8: LPS-Fieber
  • Eine LPS-Suspension (Sigma, No. L-5886; 100 μg/5 ml Glukoselösung/kg s.c.) wird männlichen Tuttlingen SD Ratten (150–160 g) gespritzt. Nach 2 Stunden wird die Körpertemperatur mit einem rektalen thermistor ELLAB Telethermometer gemessen. Nach 4 Stunden wird die Testsubstanz verabreicht. 2 Stunden später (6 Stunden nach der LPS Verabreichung) wird die Temperatur erneut gemessen. Die Temperaturerhöhung der unbehandelten Kontrolle kann als 100% angenommen werden und diejenige der behandelten Gruppe wird als Prozentsatz dieses Wertes ausgedrückt. Als ED50 wird die Dosis welche eine 50 %ige Hemmung der Temperaturerhöhung im Vergleich zu Kontrolltieren bewirkt, bezeichnet. Verbindungen der vorliegenden Verbindung weisen typischerweise ED50 Werte zwischen 0.1 bis etwa 1 mg/kg auf.
  • BEISPIEL 9: Carrageenin-Induziertes Pfotenödem
  • Fünf männliche OFA Ratten mit einem Körpergewicht von 150–170 g werden pro Gruppe verwendet. Die Testverbindung wird oral in einer Suspension von physiologischem Kochsalz/0.5 tragacanth eine Stunde vor der Canageenininjektion verabreicht. Canageenin (0.1 ml einer 1 % Suspension in physiologischer Kochsalzlösung) wird durch Subplantarinjekton in die Hinterpfote verabreicht. Die Schwellung der Pfote wird durch ein Antophlogometer nach Kemper & Amelm gemessen. Eine Kontrollmessung wird unmittelbar nach der Injektion gemacht und die Schwellung wird nach 3 und 5 Stunden gemessen. Der Durchschnittswert der Werte der 3 und 5 Stundenmessung wird bestimmt nach Subtraktion des Kontrollwertes und der erhaltene Wert wird als Prozentsatz des Wertes welcher von unbehandelten Kontrolltieren bestimmt wurde, ausgedrückt. Die ED50 ist diejenige Dosis welche eine 50 % Hemmung der Canageni-ninduzierten Schwellung nach 3 Stunden bewirkt. Verbindungen dieser Erfindung wiesen typischerweise ED50 Werte von 0.5 bis 1 mg/kg auf.
  • BEISPIEL 10: Reporter Gene Assay für Verbindungen welche mRNA destabilisieren
  • Die THP-1 Zelllinienklone 63 (mit PGL2_Neo30) und 53 (mit pGL2-Control) werden kultiviert, differenziert und stimuliert mit IFN-γ und LPS in gleicher Weise wie normale THP-1 Zellen (für Details siehe WO 00/39314). Testverbindungen werden 16 Stunden nch LPS Zugabe hinzugefügt und Zellextrakte werden nach weiteren 8 Stunden oder wie speziell erwähnt entnommen. Die Luziferaseaktivität wurde durch 1 μM Benzoesäurederivate im Schnitt um 40 %, gehemmt wo hingegen bis zu 5 μM der Benzoesäurederivate keinen Effekt auf den Kontrollklon 53 hatten.
  • Tablle 1
    Figure 00320001
  • Die Verbindungen der Erfindung sind deshalb angezeigt für die Behandlung von Störungen, welche mit einer exzessiven Zytokinfreisetzungsätiologie verbunden sind, speziell mit IL-1-Freisetzung z. B. in verschiedensten Enzündungszuständen und Krankheiten wie Rheumatische Arthritis, Osteoarthritis, Septischer Schock, Psoriasis, Atherosklerose, Chronisch entzündliche Darmenterkrankung, Morbus Crohn and Asthma.
  • Für die oben erwähnten Anwendungen variiert die benötigte Dosis natürlich und ist von der Verabreichungsmethode, den besonderen Befunden, welche behandelt werden und den gewünschten Wirkungen abhängig. Im allgemeinen werden jedoch befriedigende Resultate mit Dosen von 0.1 bis 20 mg/kg Tierkörpergewicht vorzugsweise 0.5 bis 5 mg/kg, erreicht.
  • BEISPIEL 11: Herstellung einer Pharmazeutischen Zusammensetzung
  • Tabletten, welche jede z.B. 50 mg einer Verbindung oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon enthalten, werden folgendermassen dargestellt: Zusammensetzung (10000 Tabletten)
    Aktiver Inhaltsstoff 500.0 g
    Lactose 500.0 g
    Kartoffelstärke 352.0 g
    Gelatine 8.0 g
    Talk 60.0 g
    Magnesiumstearat 10.0 g
    Siliziumdioxide (hochgradig dispergiert 20.0 g
    Aethanol q.s.
  • Die aktive Verbindung wird mit Laktose und 292 g Kartoffelstärke gemischt und mit einer Aethanollösung von Gelatine benetzt und durch ein Sieb granuliert. Nach Trocknung wird der Rest der Kartoffelstärke, Magnesiumstearat, Talk und Siliziumdioxide dazugemischt und die Mischung wird zu Tabletten gepresst von welchen jede 145.0 mg wiegt und 50.0 mg der aktiven Verbindung enthält. Die Tabletten können, falls gewünscht, mit einer Brechrille versehen werden um eine feinere Dosierung zu erlauben.
  • BEISPIEL 12: Herstellung einer Pharmazeutischen Zusammensetzung
  • Filmüberzogene Tabletten mit je 100 mg eines Benzoesäurenderivates oder pharmazeutisch verträglichen Salzes davon werden folgendermassen hergestellt: Zusammensetzung (10000 filmbeschichtete Tabletten)
    Aktiver Inhaltsstoff 100.0 g
    Lactose 100.0 g
    Maisstärke 70.0 g
    Talk 60.0 g
    Kalziumstearat 1.5 g
    Hydroxypropylmethylzellulose 2.36 g
    Schelllack 0.64 g
    Wasser q.s.
    Methylenchlorid q.s.
  • Die aktive Verbindung, die Laktose und 40 g der Maisstärke werde gemischt und mit einer Paste, hergestellt aus 15 g Maisstärke und Wasser (durch Erwärmen), benetzt und granuliert. Das Granulat wird getrocknet und die übrige Maisstärke, der Talk, und das Kalziumstearat dem Granulat zugemischt. Die Mischung wird zu Tabletten gepresst welche je 280 mg wiegen welche dann mit einem Film einer Hydroxypropylmethylzelluloselösung und Schelllack in Methylenchlorid überzogen. Das Endgewicht der filmbeschichteten Tablette ist 283 mg.
  • BEISPIEL 13: Herstellung einer Pharmazeutischen Zusammensetzung
  • Harte Gelatinekapseln mit 100 mg der aktiven Verbindung z.B. eines Benzoesäurederivates oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon werden folgendermassen hergestellt: Zusammensetzung (für 1000 Kapseln)
    Aktiver Inhaltsstoff 100.0 g
    Laktose 250.0 g
    Mikrokristalline Zellulose 30.0 g
    Natriumlaurylsulfat 2.0 g
    Magnesiumstearat 8.0 g
  • Natriumlaurylsulfat wird zum lyophilisierten aktiven Inhaltsstoff durch ein Sieb mit 0.2 mm Maschengrösse zugefügt. Die beiden Komponenten werde gut durchmischt. Danach wird zuerst die Laktose durch ein Sieb mit 0.6 mm Maschengrösse zugegeben und anschliessend die mikrokristalline Zellulose durch ein Sieb mit Maschengrösse von 0.9 mm. Diese Mischung wird erneut kräftig gemischt. Schliesslich wird das Magnesiumstearat durch ein Sieb mit 0.8 mm Maschengrösse zugefügt. Nach weiteren 3 Minuten Mischen werden Gelatinekapseln der Grösse 0 mit 390 mg der resultierten Formulierung gefüllt. Weiche Gelatinekapseln können mit ähnlichen Zutaten und Prozeduren hergestellt werden.
  • BEISPIEL 14: Effekte auf die Lebensfähigkeit von Krebszellen
  • Die Zelllinien welche in diesem Experiment verwendet werden (MCF-7, MDA-MB-231, HCT116, KB 31, HCT-15, and DU 145 stammen von ATCC, Bethesda, MD, U.S.A.
  • Exponentiell wachsende Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen der Testverbindung behandelt. Die Zellen wurden dann während 24 Stunden, 48 Stunden und 96 Stunden weiterinkubiert. Die Zellen wurden dann mit YOPRO-1, wie in T. Idziorek et al., J Immunol Meth 185, 249 (1995) beschrieben, gefärbt und der Prozentsatz der sterbenden Zellen ermittelt.
  • BEISPIEL 15: Effekt auf die Zellryklusprogression von Krebszellen
  • Die Zelllinien welche in diesem Experiment verwendet werden (MCF-7, MDA-MB-231, HCT116, KB 31, HCT-15, and DU 145 stammen von ATCC, Bethesda, MD, U.S.A Exponentiell wachsende Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen der Testverbindung behandelt.. Die Zellen wurden dann während 24 Stunden, 48 Stunden und 96 Stunden weiterinkubiert. Die Zellen wurden lysiert und dsDNA wurde mit YOPRO-1, wie in T. Idziorek et al., J Immunol Meth 185, 249 (1995) beschrieben, angefärbt. Fluoreszenzmessungen wurden sodann durchgführt wie in V.L. Singer et al., Anal Biochem 249, 228 (1997) beschrieben und die Messwerte mit Werten von Kontrollzellen verglichen.
  • BEISPIEL 16: Effekt auf mRNA Werte von Interleukin-1β
  • Totale zelluläre mRNA wurde von THP-1 Zellen zu verschiedenen Zeiten nach der Induzierung der Differenzierung mit der Guanidinisothiocyanatmethode von Chirgwin et al. Biochemistry 18, 5294 (1979) isoliert. 20 μg jeder mRNA Probe wurde denaturiert und auf einem 1 % agarose gel mit 2.2 M Formaldehyd analysiert. Das Gel wurde auf eine Hybond-N (Amersham) Membran transferiert und mit einem Stratagene Stratalinker (1600 μJoules × 100) UV-vernetzt. Einheitliche Beladung des Gels wurde mit einer Methylenblaufärbung überprüft. Die Membran wurde zu einer digoxigenin (DIG)-vernetzten DNA Probe hybridisiert. Markierung und Detektion wurde mit einem DIG kit(Boehringer Mannheim) gemäss den Vorschriften des Herstellers durchgeführt. DNA Proben wurden mittels Subklonierung von durch RT-PCR enhaltenen Fragmenten der Gene von Interesse in den pGemT-vector (Promega) hergestellt. Zur RT-PCR Analyse wurde 1 μg der totalen RNA AMV Reverstranscriptase rücktranskribiert und anschliessend mit der PCR Methode amplifiziert. Jede PCR Reaktion enhielt auch ein paar μ-Aktiv primers als interne Kontrolle. Die Werte der erwarteten PCR Produkte wurde mit den konstanten Werten von β-Aktiv verglichen. Die Grösse der PCR Produkte wurden durch Vergleich mit Mspl verdauten pBR322 Standards (New England Biolabs) bestimmt. PCR Produkte wurden auf einem 4% agarose gel analysiert. Nucleotidsequenzes für die Oligonucleotide 5' and 3' primers waren:
    Figure 00350001
  • Verbindungen der Erfindung reduzieren mRNA Werte von Interleukin-1β bis zu 70% bei Konzentrationen von 10 μM.

Claims (34)

  1. Verbindungen mit der Strukturformel (I): Im Zusammenhang mit einem Aspekt dieser Erfindung steht eine Verbindung mit der Strukturformel (I):
    Figure 00360001
    oder Stereoisomere davon, oder pharmazeutisch verträgliche Salze oder Hydrate davon oder physiologisch verträgliche und hydrolysierbare Ester davon, worin: R1 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R2 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R3 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R4 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R5 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; Y für O or-NR'steht, worin R' für H or (C1-C4)-Alkyl steht; n für 0–8 steht; R6 für einen 5- bis 8-gliederigen Lacton- or Lactamring steht; R7 für H, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, Phenyl oder (C1-C4)-Alkyl-COO- steht, worin der Lactam- oder Lactonring optional eine oder mehrere C=C-Doppelbindung(en) umfasst und der Lactam- oder Lactonring optional mit einer oder mehreren (C1-C4)-Alkyl- oder (C2-C4)-Alkenylgruppe(n) substituiert ist: falls R1=R2=R3=R4=R5=R7=N darstellt, und Y für O steht, und n für 0 steht, dann muss R6 anders als:
    Figure 00360002
    sein.
  2. Verbindungen nach Anspruch 1, worin: R1 = H, OH, MeCOO- oder Methoxy darstellt; R2 = H darstellt; R3 = H, OH, MeCOO- oder Methoxy darstellt; R4 = H, Methoxy oder Halogen darstellt; R5 = H, OH, Methoxy oder (C1-C4) Alkyl darstellt; Y für O steht; R6
    Figure 00370001
    darstellt worin m für 0–4 steht ; R7 = H, Methyl, Isopropy darstellt.
  3. Verbindungen nach Anspruch 1, worin: R1 für H, -OH, MeO- oder McCOO- steht; R2 für H; R4 is H oder Halogen steht; R3 für H, -OH, MeO- oder MeCOO- steht; R4 für H oder Halogen steht; R5 für -OH, MeO-, MeCOO- oder Methyl steht.
  4. Verbindungen nach Anspruch 2, worin: R1 für H or MeO, R3 für H, -OH or MeO- steht; R4 für H und R5 für Methoxy oder Methyl steht.
  5. Verbindungen nach Anspruch 1, worin die genannte Verbindung aus der folgenden Gruppe von Verbindungen ausgewählt ist:
    Figure 00370002
    Figure 00380001
  6. Verbindungen nach Anspruch 1, worin die genannte Verbindung aus der folgenden Gruppe von Verbindungen ausgewählt ist:
    Figure 00380002
  7. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, eines pharmazeutisch verträglichen, metabolisch labilen Esters oder eines Amids davon, oder eines pharmazeutisch veträglichen Salzes davon, das Folgendes umfasst: a) Reaktion einer Verbindung der Formel (II):
    Figure 00380003
    worin R1 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, oder (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R2 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht R3 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C1-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht R4 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht und X für Halogen steht; mit einer Verbindung der Formel (III):
    Figure 00390001
    worin: n' für 1–9 steht; und m für 0–4 steht; Verbindung (III) optional eine oder mehr C=C Doppelbindunge(en) enthält und mit einer oder mehr (C1-C4)-Alkyl or (C1-C4)-Alkenylgruppe(n) substituiert ist; oder
  8. Reaktion einer Verbindung der Formel(IV):
    Figure 00390002
    worin: R1-R5 wie oben erwähnt definiert sind; mit einer Vedrbindung der Fromel (II) in Anwesenheit einer Säure unter azeotropen Destillationsbedingungen; oder d) zur Reaktion bringen eiens Alkali-oder Erdalkalimetalsalzes der Verbindung der Formel (IV):
    Figure 00400001
    mit einer Verbindung der Formel (V):
    Figure 00400002
    worin: X fü F, Cl, Br or I steht; n' für 1–9 steht; und m für 0–4 steht; und Verbindungen der Formel (V) optional eine oder mehrere Doppelbindung(en) enthalten kann und optional mit einer oder mehreren (C1-C4)-Alkyl or (C2-C4)-Alkenylgruppe(n) substituirt ist
  9. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine Verbindung mit der Strukturformel (I):.
    Figure 00400003
    oder Stereoisomere davon, oder pharmazeutisch verträgliche Salze oder Hydrate davon oder physiologisch verträgliche und hydrolysierbare Ester davon, worin: R1 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- stehet; R2 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R3 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R4 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R5 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; Y für O or -NR'steht, worin R' für H or (C1-C4)-Alkyl steht; n für 0–8 steht; R6 für einen 5 bis 8 gliederigen Lacton- or Lactamring steht; R7 ist H, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, Phenyl oder (C1-C4)-Alkyl-COO- steht, worin der Lactam- oder Lactonring optional eine oder mehrere C=C-Doppelbindung(en) umfasst und der Lactam- oder Lactonring optional mit einer oder mehreren (C1-C4)-Alkyl- oder (C2-C4)-Alkenylgruppe(n) substituiert ist; für die Prophylaxe oder Behandlung eines Karzinoms und/oder einer malignen Erkrankung, oder medizinischen Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe umfassend: eine akute und/oder chronische Entzündung, Autoimmunkrankheiten, Atemwegserkrankungen, Infektionserkrankungen; oder für die Prophylaxe oder Behandlung von Onkogen-vermittelten Karzinomen oder malignen Erkrankungen; oder für die Prophylaxe oder Behandlung von Tumorwachstum und/oder einer Metastaseninvasion im Allgemeinen; oder für die Prävention oder Umkehr ener Multiarzneimittelresistenz.
  10. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine oder mehrere Verbindung(en) nach einem der Ansprüche 1–6 und ein(en) pharmazeutisch verträglichen/s Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel.
  11. Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, die zusätzlich ein zytostatisches oder zytotoxisches Mittel umfasst.
  12. Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, die zusätzlich ein Chemotherapeutikum umfasst.
  13. Verwendung einer Verbindung mit der Strukturformel (I):
    Figure 00420001
    oder Stereoisomere davon, oder pharmazeutisch verträgliche Salze oder Hydrate davon oder physiologisch verträgliche und hydrolysierbare Ester davon, bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines Säugers, worin: R1 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- stehet; R2 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R3 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R4 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R5 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; Y für O or-NR'steht, worin R' für H or (C1-C4)-Alkyl steht; n für 0–8 steht; R6 für einen 5 bis 8 gliederigen Lacton- or Lactamring steht; R7 ist H, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, Phenyl oder (C1-C4)-Alkyl-COO- steht, worin der Lactam- oder Lactonring optional eine oder merhn C=C-Doppelbindung(en) umfasst und der Lactam- oder Lactonring optional mit einer oder mehreren (C1-C4)-Alkyl- oder (C2-C4)-Alkenylgruppe(n) substituiert ist.
  14. Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1–6 bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines Säugers.
  15. Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, worin das genannte Arzneimittel in der Behandlung eines Karzinoms und/oder einer malignen Erkrankung verwendet wird.
  16. Verwendung nach Anspruch 14, worin das genannte Karzinom und/oder die maligne Erkrankung eine abnorme Zellproliferation von malignen Zellen aus verschiedenen Geweben und/oder Organen umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, umfassend: Muskel-, Knochen und Bindegewebe, die Haut, das Hirn, die Lungen, die Geschlechtsorgane, das Lymph- und Nierensystem, Mamma- oder Blutzellen, die Leber, den Verdauungstrakt, den Pankreas und die Schilddrüse und die Nebennieren.
  17. Verwendung nach Anspruch 14, worin das genannte Karzinom und/oder die maligne Erkrankung aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend: solide Tumoren, Ovarial-, Mamma-, Hirn-, Prostata-, Kolon- Magen-, Nieren- oder Hodenkarzinome, Kaposi-Sarkome, Cholangiome, Choriome, Neuroblastorne, Wilms-Tumoren, Hodgkin-Lymphome, Melanome, multiple Myelome, lymphatische Leukämien und akute und/oder chronische granulozytäre Lymphome.
  18. Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, worin das genannte Arzneimittel in der Behandlung einer Entzüngungserkrankung oder medizinischen Erkrankung verwendet wird.
  19. Verwendung nach Anspruch 17, worin die genannte Erkrankung oder medizinische Erkrankung aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend: rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, septischer Schock, Psoriasis, Atherosklerose, entzündliche Darmerkrankung, Morbus Crohn und Asthma.
  20. Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, worin das Arzneimittel in der Behandlung einer Erkrankung oder medizinischen Erkrankung verwendet wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend: eine akute und/oder chronische Entzündung, Autoimmunerkrankungen, Atemwegserkrankungen, Infektionskrankheiten, Transplantatabstoßung, neuronale Enzündung, Alzheimersche Krankheit und kardiovaskuläre Erkrankungen.
  21. Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, worin das Arzneimittel in der Behandlung und Prävention von Onkogen-vermittelten Karzinomen und malignen Erkrankungen, für die Behandlung oder Prävention von Tumorwachstum und/oder Metastaseninvasion im Allgemeinen oder für die Prävention oder Umkehr einer Multiarzneimittelresistenz verwendet wird.
  22. Verwendung nach einem der Ansprüche 12–20, worin der genannte Säuger ein Mensch ist.
  23. Verbindung mit der Strukturformel (I):
    Figure 00440001
    oder Stereoisomere davon, oder pharmazeutisch verträgliche Salze oder Hydrate davon oder physiologisch verträgliche und hydrolysierbare Ester davon, bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines Säugers, worin: R1 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R2 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R3 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R4 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R5 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; Y für O or-NR'steht, worin R' für H or (C1-C4)-Alkyl steht; n für 0–8 steht; R6 für einen 5 bis 8 gliederigen Lacton- or Lactamring steht; R7 ist H, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, Phenyl oder (C1-C4)-Alkyl-COO- steht, worin der Lactam- oder Lactonring optional eine oder mehrere C=C-Doppelbindung(en) umfasst und der Lactam- oder Lactonring optional mit einer oder mehreren (C1-C4)-Alkyl- oder (C2-C4)-Alkenylgruppe(n) substituiert ist; für die Prophylaxe oder Behandlung eines Karzinoms und/oder einer malignen Erkrankung.
  24. Verbindung nach einem der Ansprüche 1–6 für die Prophylaxe oder Behandlung eines Karzinoms und/oder einer malignen Erkrankung.
  25. Verbindung nach Anspruch 22 oder 23, worin das genannte Karzinom und/oder die maligne Erkrankung eine abnorme Zellproliferation von malignen Zellen aus verschiedenen Geweben und/oder Organen umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, umfassend: Muskel-, Knochen- oder Bindegewebe, die Haut, das Hirn, die Lungen, die Geschlechtsorgane, das Lymph- oder Nierensystem, Mamma- oder Blutzellen, die Leber, den Verdauungstrakt, den Pankreas und die Schilddrüse oder die Nebennieren.
  26. Verbindung nach Anspruch 22 oder 23, worin das genannte Karzinom und/oder die maligne Erkrankung aus der Gruppe ausgewählt sind, umfassend: solide Tumoren, Ovarial-, Mamma-, Hirn-, Prostata-, Kolon-, Magen-, Nieren- oder Hodenkarzinome, Kaposi-Sarkome, Cholangiome, Choriome, Neuroblastorne, Wilms-Tumoren, Hodgkin-Lymphome, Melanome, multiple Myelome, lymphatische Leukämien und akute und/oder chronische granuloztäre Lymphome.
  27. Verbindung mit der Strukturformel (I):
    Figure 00450001
    oder Stereoisomere davon, oder pharmazeutisch verträgliche Salze oder Hydrate davon oder physiologisch verträgliche und hydrolysierbare Ester davon, bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines Säugers, worin: R1 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- stehet; R2 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R3 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R4 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R5 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; Y für O or-NR'steht, worin R' für H or (C1-C4)-Alkyl steht; n für 0–8 steht; R6 für einen 5 bis 8 gliederigen Lacton- or Lactamring steht; R7 ist H, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, Phenyl oder (C1-C4)-Alkyl-COO- steht, worin der Lactam- oder Lactonring optional eine oder mehrere C=C-Doppelbindung(en) umfasst und der Lactam- oder Lactonring optional mit einer oder mehreren (C1-C4)-Alkyl- oder (C2-C4)-Alkenylgruppe(n) substituiert ist; für die Prophylaxe oder Behandlung einer Entzündungserkrankung oder medizinischer Erkrankung.
  28. Verbindung nach einem der Ansprüche 1–6 für die Prophylaxe oder Behandlung einer Entzündungserkrankung oder medizinische Erkrankung.
  29. Verbindungen nach Anspruch 26 oder 27, worin die genannte Erkrankung oder medizinische Erkrankung aus der Guppe asgewählt ist , umfassend: rheumatoide Arthiris, Osteorarthritis, septische Schock, Psoriasis, Atherosklerose, entzündliche Darmerkankung, Morbus Crohn und Asthma.
  30. Verbindung mit der Strukturformel (I):
    Figure 00460001
    oder Stereoisomere davon, oder pharmazeutisch verträgliche Salze oder Hydrate davon oder physiologisch verträgliche und hydrolysierbare Ester davon, bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines Säugers, worin: R1 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- stehet; R2 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R3 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R4 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R5 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; Y für O or-NR'steht, worin R' für H or (C1-C4)-Alkyl steht; n für 0–8 steht; R6 für einen 5 bis 8 gliederigen Lacton- or Lactamring steht; R7 ist H, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, Phenyl oder (C1-C4)-Alkyl-COO- steht, worin der Lactam- oder Lactonring optional eine oder mehrere C=C-Doppelbindung(en) umfasst und der Lactam- oder Lactonring optional mit einer oder mehr (C1-C4)-Alkyl- oder (C2-C4)-Alkenylgruppe(n) substituiert ist; für die Behandlung und Prävention von Onkogenvermittelten Karzinomen und malignen Erkrankungen, für die Behandlung und Prävention von Tumorwachstum und/oder Metastaseninvasion im Allgemeinen oder für die Prävention oder Umkehr einer Multiarzneimittelresistenz.
  31. Verbindung nach einem der Ansprüche 1–6 für die Behandlung und Prävention von Onkogen-vermittelten Karzinomen und malignen Erkrankungen, für die Behandlung oder Prävention von Tumorwachstum und/oder Metastaseninvasion im Allgemeinen oder für die Prävention oder Umkehr einer Multiarzneimittelresistenz.
  32. Verbindung mit der Strukturformel (I):
    Figure 00470001
    oder Stereoisomere davon, oder pharmazeutisch verträgliche Salze oder Hydrate davon oder physiologisch verträgliche und hydrolysierbare Ester davon, bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines Säugers, worin: R1 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- stehet; R2 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R3 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R4 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; R5 für H, OH, Halogen, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)- Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, or (C1-C4)-Alkyl-COO- steht; Y für O or-NR'steht, worin R' für H or (C1-C4)-Alkyl steht; n für 0–8 steht; R6 für einen 5 bis 8 gliederigen Lacton- or Lactamring steht; R7 ist H, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkoxy, Phenyl oder (C1-C4)-Alkyl-COO- steht, worin der Lactam- oder Lactonring optional eine oder merhn C=C-Doppelbindung(en) umfasst und der Lactam- oder Lactonring optional mit einer oder mehr (C1-C4)-Alkyl- oder (C1-C4)-Alkenylgruppe(n) substituiert ist; für die Behandlung oder Prävention einer Erkrankung oder medizinischen Erkrankung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend; eine akute und/oder chronische Entzündung, Autoimmunerkrankungen, Atemwegserkrankungen, Infektionskrankheiten, Transplantatabstossung, neuronale Entzündung, Alzheimersche Krankheit, und kardiovaskuläre Erkrankungen. von Onkogen-vermittelten Karzinomen und malignen Erkrankungen, für die Behandlung und Prävention von Tumorwachstum und/oder Metastaseninvason im Allgemeinen oder für die Prävention oder Umkehr einer Multiarzneimittelresistenz.
  33. Verbindung nach einem der Ansprüche 1–6 für die Behandlung oder Prävention einer Erkrankung oder einer medizinischen Erkrankung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend: eine akute und/oder chronische Entzündung, Autoimmunerkrankungen, Atemwegserkrankungen, Infektionskrankheiten, Transplantatabstoßung, neuronale Entzündung, Alzheimersche Krankheit und kardiovaskuläre Erkrankungen.
  34. Verbindung nach einem der Ansprüche 22–32 zur Behandlung eines Menschen.
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