DE60121225T2

DE60121225T2 - Tetrapeptidische tryptase substrate und ihre verwendung zur tryptase aktivitätsbestimmung

Info

Publication number: DE60121225T2
Application number: DE60121225T
Authority: DE
Inventors: L. Andrew Madison NILES; Mary Newark HAAK-FRENDSCHO; L. Jennifer San Diego HARRIS; S. Charles San Francisco CRAIK
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 2000-10-27
Filing date: 2001-10-03
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2021-10-04
Also published as: WO2002034765A9; US6797461B2; DE60121225D1; EP1358205A2; EP1358205B1; AU2002216613A1; WO2002034765A2; US20020197661A1; WO2002034765A3; ATE331729T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Assays zur Feststellung von Tryptaseaktivität und Polypeptidsubstrate für Tryptase, die in diesem Assay eingesetzt werden.
Bibliographie
Eine vollständige Bibliographie der Literaturzitate, die hier angeführt werden, sind in dem Bibliographieteil enthalten, der den Ansprüchen unmittelbar vorangeht.
Beschreibung des Standes der Technik
Mastzellen liegen auf allen epithelialen und mucosalen Oberflächen des Körpers vor. Zudem werden sie in den Schleimhäuten des Atmungssystems sowie des Magendarmtrakts gefunden. Mastzellen befinden sich auch in der Nähe von Blutgefäßen im Bindegewebe. Mastzellen spielen eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunreaktion durch die Freisetzung von dichten Bläschen nach Aktivierung. Die Hauptkomponente der sekretorischen Bläschen der Mastzellen sind Serinproteasen (Schwarz, L., et al.).
Menschliche β-Tryptase ist das am weitesten verbreitete und ein einzigartiges Mitglied der Serinproteasefamilie. Obwohl β-Tryptase unbestimmte physiologische Funktionen hat, ist sie als ein Effektor in eine Unzahl von menschlichen allergenen und pathophysiologischen Zuständen verwickelt, einschließlich Asthma, Arteriosklerose, Krebs, Mittelohrentzündung, Arthritis, interstitielle Zystitis, Nasenschleimhautentzündung, Dermatitis und andere Krankheiten tiefer Organe. Ihre herausragende Rolle bei der Gewebeumgestaltung und Angiogenese deuten auf potentiell heilsame physiologische Prozesse hin. Es gibt wenigstens drei proteolytisch aktive Isoformen der Tryptase in Mastzellen, βI-Tryptase, βII-Tryptase und βIII-Tryptase. Diese Tryptaseisoformen werden als katalytisch aktive Tetramere (~135 kD) sekretiert, die gegen die Inaktivierung durch Plasmainhibitoren resistent sind.
Das β-Tryptase-Enzym wurde kürzlich kristallisiert und die Struktur deutet darauf hin, dass die Assoziierung der Tryptaseuntereinheiten zu dem nativen Tetramer einen stereospezifischen Zugang für potentielle Substrate zu dem aktiven Zentrum jeder Untereinheit ergibt. Obwohl in verschiedenen In vitro Studien zahlreiche Substrate für Tryptase einschließlich Neuropeptiden, Fibrinogen, Stromelysin, Pro-Urokinase, Prothrombin und Protease aktivierter Rezeptor-2 identifiziert wurden, konnte das physiologisch relevante In vivo Target der Serinproteaseaktivität von β-Tryptase nicht entdeckt werden.
Das menschliche Chromosom 16 kodiert wenigstens vier homologe, dennoch verschiedene Tryptasegene, die als α-, βI-, βII- und βIII-Tryptase bezeichnet werden (Pallaoro, M., et al.). Im vorliegenden Text wird der unmodifizierte Ausdruck „Tryptase" zur Bezeichnung von allen Tryptaseisoformen verwendet. Zwei Isoformen von β-Tryptase zeigen eine Sequenzidentität von mehr als 99%, βI- und βII-Tryptase unterscheiden sich nur durch eine einzige N-Glycosylierungsstelle. Es ist nicht klar, warum so viele sehr ähnliche Tryptasen durch Mastzellen exprimiert werden. Eine Möglichkeit ist, dass jede unterschiedliche proteolytische Funktionen ausübt, die sich in der Präferenz der Substratspezifität widerspiegeln. In der Tat wurde vor kurzem gezeigt, dass die Substitution einer einzigen Aminosäure in Tryptase α und Tryptase βII zu einem Unterschied der Substratpräferenz der beiden Enzyme führt (Huang, C., et al.).
Es ist schwierig, β-Tryptase und deren physiologische Rolle zu untersuchen, da es keine geeigneten Tiermodelle für menschliche Allergien gibt. Weiter weisen die menschlichen β-Tryptasen nur eine geringe oder keine Homologie mit den Tryptasen auf, die in anderen Tieren als Primaten gefunden werden. Zudem ist die Isolierung natürlicher β-Tryptase aus menschlichen Leichen ein mühsames und biologisch riskantes Unterfangen. Erst kürzlich konnte rekombinante enzymatisch aktive Tryptase durch die Arbeit der Anmelder der vorliegenden Anmeldung, Promega Corporation of Madison, Wisconsin, USA bereit gestellt werden (siehe US-Patent 6,274,366).
Während der letzten Dekade haben Kliniker den Wert der Messung von freigesetzter Tryptase für atopische Diagnosen sowie zur Beobachtung des Verlaufs von Mastzellen-vermittelten Krankheiten schätzen gelernt und darüber berichtet („Atopisch" ist ein allgemeiner Begriff zur Bezeichnung von krankhaften Zuständen, die durch Symptome gekennzeichnet sind, die durch den Einfluss von erregenden Antigenen hervorgerufen werden, oder durch Zustände wie Asthma oder andere allergische Reaktionen). β-Tryptase kann im Serum von nicht-atopischen „normalen" Individuen nachgewiesen werden, wobei der allgemeine Serumgehalt üblicherweise weniger als 1000 Picogramm β-Tryptase pro Milliliter Serum beträgt.
Im Gegensatz dazu sind die Tryptasegehalte im Serum von atopischen Personen beträchtlich erhöht. Zu häufig jedoch zeigen immunologische Nachweisverfahren (das heißt, ELISA, RIA, PCFIA, und ähnliche Nachweise auf Tryptase) eine nur geringe Empfindlichkeit oder Verfügbarkeit auf (zum Beispiel die ELISA-Methode nach Schwartz) und erfordern teuere zusätzliche Nachweisausstattung. Außer bei erhöhten Mastzellengehalt oder Degranulation wie sie während der Mastozytose oder Anaphylaxie auftreten, ist die Aufstellung nichtatopischer Basislinien oder Basislinien bei Remission schwierig.
Herkömmliche Verfahren zum Nachweis der proteolytischen Aktivität von Tryptase werden durch die geringe Spezifität beeinträchtigt. Für diese Verfahren werden Substrate eingesetzt, die lediglich für die Messung von „Trypsin ähnlicher" Aktivität gedacht sind, insbesondere in gereinigten Tryptasepräparationen. Beispielsweise werden Benzoyl-Arg-Paranitroanilin (Trypsin), Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa (Thrombin), Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNa (Plasmin) und Tosysl-Arg-Methyl-Ester bei Kontakt mit Tryptase gespalten, jedoch werden sie ebenfalls durch andere Serinproteasen gespalten. Da Tryptase und verwandte, aus dem Blut stammende Serinproteasen diese Substrate spalten können, sind sie von geringem Wert für die Bestimmung des Aktivitätsgrads von Tryptase in komplexen biologischen Proben.
US 4,390,528 beschreibt ein Polypeptid mit der Sequenz T-K-P-R-T-K-P-R. Diese Verbindung, deren pharmakologisch akzeptablen Salze und Derivate und einige ihrer optischen Isomere sind für die Stimulierung oder Inhibierung der Phagozytose oder Pinozytose bei Säugetieren nützlich.
Barbier et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110, 6880–2 beschreiben ein Polypeptid (R-T-K-P) und befassen sich mit der Beschleunigung der Hydrolyse von RNA durch basische Polypeptide.
In US 4,409,141 wird ein Peptid beschrieben, das die Sequenz P-R-K-K enthält, wobei das Peptid für den Nachweis von humanen Parathyroidhormon geeignet ist.
In DE 2945239 wird das Peptid PKPR beschrieben. Das Peptid ist als Inhibitor der T-Zellproliferation geeignet.
In WO 9411014 wird das Peptid PRGK beschrieben. Das Peptid ist als entzündungshemmendes Mittel geeignet.
Briggs, S. et al. (1991) Immunology, 73, 505–507 beschreiben Tetrapeptide mit der allgemeinen Formel PXTR, wobei X K oder R sein kann, das heißt die Peptide haben die Sequenz PKTR und PRTR. Diese Peptide sind als Epitope für menschliches Epithelmuzin geeignet.
Eine erste Ausführungsform der Erfindung betrifft ein isoliertes Polypeptid mit der Sequenz, gesehen vom aminoterminalen Ende zum carboxyterminalen Ende, P4-P3-P2-P1, wobei P4 Prolin („P"), P3 Arginin („R") oder Lysin („K") ist, P2 eine beliebige Aminosäure und P1 K oder R (SEQ. ID. NO: 1) ist oder wobei P4-P3-P2-P1 P-A-N-K ist, mit der Maßgabe, dass das Tetrapeptid nicht P-K-P-R, P-R- G-K, P-K-T-R oder P-R-T-R ist. Für die Abkürzungen der Aminosäuren wird auf die nachstehend angeführte Tabelle 1 verwiesen. Diese isolierten Polypeptide wirken als sehr spezifische Substrate, die mittels Tryptasen gespalten werden können.
Eine zweite Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Aktivität einer enzymatisch aktiven β-Tryptase in einer Probe. Das Verfahren umfasst als erstes das in Kontaktbringen der Probe mit einem isolierten Polypeptid mit der Sequenz, gesehen vom aminoterminalen Ende zum carboxyterminalen Ende, P4-P3-P2-P1, wobei P4 P, P3 R oder K, P2 eine beliebige Aminosäure und P1 K oder R (SEQ. ID. NO: 1) ist.
Das isolierte Peptid umfasst auch eine nachweisbare Abgangsgruppe, die an P4-P3-P2-P1 gebunden ist und aminoterminal geschützt ist. Die Probe wird mit dem isolierten Polypeptid unter Bedingungen in Kontakt gebracht, bei denen ein Teil der nachweisbaren Abgangsgruppe aufgrund der Einwirkung von β-Tryptase, die in der Probe vorliegt, abgespalten wird. Die Menge an nachweisbarer Abgangsgruppe, die von dem Polypeptid abgespalten worden ist, wird dann quantifiziert, um einen Indikator für das Ausmaß der Tryptaseaktivität in der Probe zu erhalten.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die Probe mit einem isolierten Polypeptid in Kontakt gebracht, das vom aminoterminalen Ende zum carboxyterminalen Ende gesehen P4-P3-P2-P1 enthält, wobei P4 acetyliert ist, und wobei P4-P3-P2-P1 ausgewählt ist unter einer Gruppe bestehend aus P-R-N-K (SEQ. ID. NO: 2), P-K-N-K (SEQ. ID. NO: 3), P-R-N-R (SEQ. ID. NO: 4), P-K-N-R (SEQ. ID. NO: 5), P-A-N-K (SEQ. ID. NO: 6) und P-R-T-K (SEQ. ID. NO: 7) (wobei Asparagin „N" und Threonin „T" ist), und wobei zudem eine fluorogene Abgangsgruppe, die 7-Amino-4-carbamoylmethylcumarin enthält, über eine Amidbindung an das carboxyterminale Ende von P4-P3-P2-P1 gebunden ist. In diesem Fall wird, falls die Probe Tryptaseaktivität aufweist, aufgrund der Aktivität ein nachweisbarer fluoreszierender Teil erhalten. Die Fluoreszenz der Probe wird dann gemessen, um festzustellen, ob eine nachweisbare Änderung der Fluoreszenz eintritt, wobei die nachweisbare Änderung ein Indikator für die Aktivität der enzymatisch aktiven β-Tryptase in der Probe ist. Die Probe kann eine beliebige Probe sein, von der angenommen wird, dass sie Tryptaseaktivität aufweist, einschließlich Vollblut, Serum, Plasma, Urin, Tränenflüssigkeit, Lavage, Gewebeextrakt, ein konditioniertes Medium, etc.
Eine dritte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Kit für die Analyse von Proben auf β-Tryptaseaktivität. Das Kit enthält ein isoliertes Polypeptid mit der Sequenz, von dem aminoterminalen Ende zu dem carboxyterminalen Ende gesehen, P4-P3-P2-P1, wobei P4 P, P3 R oder K, P2 eine beliebige Aminosäure und P1 K oder R (SEQ. ID. NO: 1) ist, und wobei eine nachweisbare Abgangsgruppe kovalent an P4-P3-P2-P1 gebunden ist, wobei das isolierte Polypeptid in einem geeigneten Behälter enthalten ist. Das Kit kann auch P4-P3-P2-P1 enthalten, das einen auf Serinprotease reaktiven Teil hat.
Das Kit kann gegebenenfalls einen Vorrat an rekombinanter Tryptase enthalten, der zur Erzeugung einer Standardkurve verwendet werden kann, sowie einen Vorrat an Aprotinin oder einem funktionalen Äquivalent davon. Es ist insbesondere bevorzugt, dass jedes Kit Anweisungen für den Gebrauch des Kits enthält.
Wie vorstehend angegeben, exprimieren Mastzellen wenigstens 4 verschiedene Tryptasegene: α, βI, βII und βIII. Zurzeit ist nicht bekannt, ob diese Proteasen die gleiche oder verschiedene Funktionen ausüben. Nach den hier aufgeführten Daten haben βI- und βII-Tryptasen sehr ähnliche P4 bis P1 Substratpräferenzen. Diese gemeinsame Präferenz für Peptidsubstrate erstreckt sich wahrscheinlich auf eine gemeinsame Präferenz für physiologische Substrate. Tatsächlich findet sich die optimale Sequenz für β-Tryptase P4 = P, P3 = R oder K, P2 = beliebige Aminosäure und P1 = K oder R in vielen der makromolekularen Substrate, für die wenigstens in vitro gezeigt wurde, dass sie durch Tryptase gespalten werden, die vorzugsweise nach R oder K spaltet.
Beispielsweise kann die Aktivierung der Plasminogenkaskade, die die Zerstörung der extrazellulären Matrix bei zellulärer Extravasation und Migration bewirkt, eine Wirkung der Tryptaseaktivierung des Pro-Urokinase Plasminogenaktivators an der P4-P1-Sequenz von Pro-Arg-Phe-Lys (SEQ. ID. NO: 8) (Stack, M., und Johnson, D.) sein. Vasoaktives intestinales Peptid, ein Neuropeptid, das an der Regulierung der vaskulären Permeabilität beteiligt ist, wird durch Tryptase hauptsächlich nach den Argininen in der Sequenz Thr-Arg-Leu-Arg (SEQ. ID. NO: 9) (Stack, M. und Johnson, D.) gespalten. Der G-Protein gekoppelte Rezeptor, PAR-2, kann durch Tryptase an Ser-Lys-Gly-Arg (SEQ. ID. NO: 10) gespalten und aktiviert werden, wohingegen der Thrombin aktivierte Rezeptor, PAR-1, durch Tryptase nach der Stelle Pro-Asn-Asp-Lys (SEQ. ID. NO: 11) (Jameson, G., et al.) inaktiviert wird.
Im Rahmen der Arbeit, die zu dieser Erfindung führte, wurde enzymatisch aktive βI und β-II-Tryptase heterolog in Hefe exprimiert und gereinigt, um die Substratspezifität von jedem Enzym zu bestimmen. Verschiedene positional scanning kombinatorische Tetrapeptidsubstratbibliotheken wurden eingesetzt, um die primäre und erweiterte Substratspezifität zu analysieren. Beide Enzyme haben eine strikte primäre Präferenz für die Spaltung nach den basischen Aminosäuren Lysin und Arginin mit einer nur geringfügig höheren Bevorzugung von Lysin gegenüber Arginin. βI- und βII-Tryptasen zeigen ähnliche erweiterte Substratspezifitäten mit einer Bevorzugung der Spaltung nach P4-Prolin, P3-Arginin oder Lysin, wobei P2 eine gewisse Asparagin- und Threonin-Selektivität aufweist (N-Präferenz, 3A).
Es wird hier gezeigt, dass βI- und βII-Tryptasen eine definierte primäre Substratspezifität (das heißt der Rest an der P1-Position) und eine definierte erweiterte Substratspezifität (das heißt die Reste an den P4-P2-Positionen) aufweisen.
Die Biblioteksprofile, die im Zuge der Entwicklung der Erfindung erzeugt worden sind, und die hier beschrieben und beansprucht werden, weisen darauf hin, dass die Substratspezifität der zwei Enzyme ähnlich ist. Weiter wurden einzelne Substrate entwickelt und untersucht, um die Voraussetzungen der erweiterten Substratspezifität zu untersuchen, wobei empfindliche und selektive Substrate für β-Tryptasen erhalten wurden. Strukturelle Determinanten der Spezifität wurden untersucht, indem in das aktive Zentrum der Tryptasestruktur ein optimiertes Substrat modeliert wurde. Schließlich korelliert die Spezifität, die in dieser Studie festgestellt wurde, mit den Schnittstellen, die in vielen der charakterisierten physiologischen Substrate gefunden wurden, und kann zur Identifzierung von weiteren Substraten sowohl für die Immunität und Pathologie von βI- und βII-Tryptasen führen.
Die hier beschriebene Erfindung unterstreicht den Nutzen des Einsatzes von generalisierten positional scanning kombinatorischen Peptidbibliotheken zur Charakterisierung von funktionalen Ähnlichkeiten und Unterschieden zwischen den homologen Enzymen, zur Erzeugung von empfindlichen und selektiven Tryptase-Substraten und Inhibitoren und zur Bestimmung eines Subsets von potentiellen physiologischen Tryptasesubstraten.
Die Zielsetzungen und Vorteile der Erfindung werden anhand der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zusammen mit den Figuren vollständig ersichtlich.
Beschreibung der Figuren
1 ist eine Darstellung der Standardnomenklatur für Substrataminosäurepräferenzen in Bezug auf die zu spaltende Bindung der Schnittstelle nach Schechter, I. und Berger, A. (1967) „On the size of the active site in proteases." Biochem. Biophys. Res. Com. 27, 157–162.
2 zeigt ein Aktivitätsprofil von Tryptase für eine ACC-P1-diverse-Bibliothek. Für das P1-Profil wurden rekombinante menschliche β-I Tryptasen verwendet und es zeigt eine starke Präferenz für P1 = R oder K.
3A und 3B zeigen Aktivitätsprofile von rekombinanter menschlicher β-I Tryptase („Hauttryptase") für eine Arg- oder Lys-fixierte P1 ACC-PS-SCL. Mit diesen beiden Diagrammsets wird die Fähigkeit von Tryptase, ein synthetisches Tetramer zu spalten, wobei der P1-Rest entweder Lysin (3A) oder Arginin (3B) ist, verglichen
4A und 4B zeigen Aktivitätsprofile von rekombinanter menschlicher β-II Tryptase („Lungentryptase") für eine Arginin- oder Lysin-fixierte P1 ACC-PS-SCL. Mit diesen beiden Diagrammsets wird die Fähigkeit von Tryptase zur Spaltung eines synthetischen Tetramers, wobei der P1-Rest entweder Lysin (4A) oder Arginin (4B) ist, verglichen.
5 ist ein Diagramm, das zeigt, dass Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) ein spezifisches Substrat für Tryptase in Vergleich zu anderen, aus dem Blut stammenden Serinproteasen ist.
6 und 7 sind Diagramme von typischen Aktivitätsbasierten Standardkurven, die unter Verwendung von Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. Nr: 12) in Pufferlösungen, die rekombinante Tryptase enthalten, erhalten wurden. Die Kurven wurden über 2 Logarithmus Tryptaseproteinkonzentrationsbereich erzeugt.
8 ist ein Diagramm, das zeigt, dass lineare Tryptasestandardkurven für mit Tryptase geimpftes menschliches Serum mit Ac-PRNK-ACC erhalten werden können. Die intrinsische Fluoreszenz ist über die Standardkurve konsistent.
9 ist ein Diagramm, das zeigt, dass die intrinsische Fluoreszenz aufgrund der nicht durch Tryptase bewirkten Proteolyse signifikant und spezifisch im Serum mit dem Serinproteaseinhibitor Aprotinin unterdrückt werden kann.
10 ist ein Diagramm, das zeigt, dass lineare Tryptasestandardkurven in Serum und Puffer in Gegenwart von exogen zugesetzten Aprotinin erhalten werden könne.
11 ist ein Diagramm, das zeigt, dass lineare Tryptasestandardkurven in Urin ohne signifikante nicht durch Tryptase vermittelte Proteolyse erhalten werden können. Die praktische Nachweisgrenze liegt annähernd bei 300 pg/ml an aktiver Tryptase.
12 und 13 sind Diagramme, die veranschaulichen, dass durch Ersatz des fluorophoren 7-Amino-4-Carbamoylmethylcumarin (ACC) in Ac-PRNK (SEQ. ID. NO: 13) durch Chlormethylketon (CMK) ein Inhibitor sowohl für rekombinante menschliche Haut-(βI) Tryptase (12) als auch für rekombinante menschliche Lungen-(βII) Tryptase (13) erhalten wird.
14 ist ein Diagramm, das zeigt, dass der Inhibitor Ac-PRNK-CMK (SEQ. ID. NO: 14) weitestgehend unwirksam für Faktor Xa ist, eine von Tryptase verschiedene, aus dem Blut stammende Protease, deren Spezifität für eine bestimmte Peptidsequenz PRNK (SEQ. ID. NO: 2) nicht erfüllt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Abkürzungen und Definitionen:
Für ein klares und einheitliches Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche werden hier die folgenden Definitionen verwendet. Ausdrücke, die nicht ausdrücklich beschrieben werden, haben ihre Standardbedeutung wie sie Fachleute verstehen.
ACC – bedeutet 7-Amino-4-carbamoylmethylcumarin.
Amiono-Säuren-Abkürzungen für die Aminosäuren sind in Tabelle 1 gezeigt:
Tabelle 1
Enzymatisch aktive Tryptase – bezogen auf die Expression von heterologen Proteinen in einer gentechnisch veränderten Wirtszelle ist ein Protein enzymatisch aktiv, wenn im Anschluss an die Expression oder im Anschluss an die Isolierung keine chemische Behandlung wie künstliche Abspaltung eines Signalpeptids für die Sekretion oder künstliche Glykosylierung erforderlich ist, damit das exprimierte/isolierte Protein die gewünschte Aktivität aufweist. Proteolytische Tryptase muss korrekt in der tetrameren Form ausgebildet sein, damit sie enzymatisch aktiv ist.
Fmoc – bezieht sich auf 9-Fluorenylmethoxycarbonyl.
Gentechnik – Viele der Schritte, die nachstehend für die Manipulierung von DNA beschrieben sind, einschließlich Verdauung mit Restriktionsendonukleasen, Amplifizierung mittels PCR, Hybridisierung, Verknüpfung, Auftrennung und Isolierung mittels Gelelektrophorese, Transformierung von Zellen mit heterologer DNA, Auswahl erfolgreicher Transformanten und so weiter sind allgemein bekannt und werden in weitem Umfang von Fachleuten eingesetzt und werden hier nicht im Einzelnen dargelegt. Sofern nicht anders angegeben, werden hier die von Sambrook, Fritsch und Manjatis (1989) beschrieben DNA Protokolle verwendet.
Tryptase-Substrate
Anhand multipler positional scanning synthetischer kombinatorischer Tetrapeptidbibliotheken (PS-SCL positional scanning synthetic combinatorial tetrapeptide libraries) wird die Substratspezifität von heterolog exprimierten menschlichen βI- und βII-Tryptasen bestimmt. In 1 ist die Standardnomenklatur für Substrataminosäurepräferenzen in Bezug auf die Schnittstelle mit zu spaltender Bindung gezeigt. Die Aminosäuren am Aminoende des Substrats, werden Pn, Pn – 1, ... P2, P1 bezeichnet. Die Aminosäuren am Carboxylende des Substrats werden P1', P2', ..., Pm – 1' bezeichnet. Folglich sind Substrate, die in einem P4-P3-P2-P1-Format geschrieben sind, vom Aminoende zum Carboxylende dargestellt. Die Hydrolyse der Amidbindung erfolgt zwischen P1 und P1'. Die entsprechenden Enzymbindungsstellen werden Sn, Sn – 1, ..., S2, S1, S1', S2', ..., Sm – 1', Sm' bezeichnet.
Eine positional scanning synthetische kombinatorische Substratbibliothek (PS-SCL) wurde zur Identifizierung der erweiterten Substratspezifität von menschlichen rekombinanten βI- und βII-Tryptasen an den P1-P4-Positionen relativ zur Schnittstelle mit zu spaltender Bindung verwendet. Die Informationen aus diesen Bibliotheken wurden dann benutzt, um bevorzugte optimierte fluorogene Substrate herzustellen, wobei Acetyl-Prolyl-Arginyl-Asparaginyl-Lysyl-Aminoacetamidcumarin (Ac-PRNK-AAC) (SEQ. ID. NO: 12) am meisten bevorzugt wurde. Wie hier beschrieben, kann dieses optimierte Substrat dazu verwendet werden, auch noch kleinste Konzentrationen an aktiver Tryptase in komplexen biologischen Fluiden nachzuweisen. Dieses Substrat kann auch als Aktivitätsreporter in Screening-Anwendungen mit hohem Durchsatz eingesetzt werden. Die aus den PS-SCL erhaltenen Informationen wurden auch zur Herstellung eines bevorzugten, für das aktive Zentrum spezifischen Inhibitors, Acetyl-Prolyl-Arginyl-Asparaginyl-Lysyl-Chlormethylketon (AC-PRNK-CMK) (SEQ. ID. NO: 14) verwendet.
Materialien:
DNA modifizierende Enzyme wurden von Promega Corporation (Madison, Wisconsin) bezogen. Heparin und andere Biochemikalien wurden von Sigma (St. Louis, Missouri) bezogen.
positional scanning synthetische kombinatorische Bibliotheken:
ACC-Harz-Synthese:
7-Fmoc-Aminocumarin-4-essigsäure wurde durch Behandlung von 7-Aminocumarin-4-Essigsäure (Kanaoka, Y., et al., Besson, T., et al.) mit Fmoc-Cl hergestellt. 7-Aminocumarin-4-essigsäure (10,0 g, 45,6 mmol) und H₂O (228 ml) wurden vermischt. NaHCO₃ (3,92 g, 45,6 mmol) wurde in kleinen Portionen zugegeben und anschließend wurde Aceton (228 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt und Fmoc-Cl (10,7 g, 41,5 mmol) wurde unter Rühren im Verlauf einer Stunde zugegeben. Das Eisbad wurde entfernt und die Lösung über Nacht gerührt.
Aceton wurde mit dem Rotationsverdampfer entfernt und der erhaltene gummiartige Feststoff durch Filtrieren gesammelt und mit mehreren Portionen Hexan gewaschen. Das Material wurde über P₂O₅ getrocknet, wobei 14,6 g (80%) cremfarbiger Feststoff erhalten wurde. ¹H NMR (400 MHz): 3,86 (s, 2), 4,33 (t, I, J = 6,2), 4,55 (d, 2, J = 6,2), 6,34 (s, 1), 7,33–7,44 (m, 5), 7,56 (s, 1), 7,61 (d, 1, J = 8,6), 7,76 (d, 2, J = 7,3), 7,91 (d, 2, J = 7,4), 10,23 (s, 1), 12,84 (s, 1). ¹³C NMR (101 MHz): 37,9, 47,4, 66,8, 67,2, 105,5, 114,6, 115,3, 121,1, 125,9, 126,9, 128,0, 128,6, 141,6, 143,6, 144,5, 150,7, 154,1, 154,8, 160,8, 171,4.
ACC-Harz wurde durch Kondensation von Rink Amid-AM-Harz mit 7-Fmoc-aminocumarin-4-essigsäure erhalten. Rink Amid-AM-Harz (21 g, 17 mmol) wurde in DMF (200 ml) solvatisiert. Die Mischung wurde 30 min gerührt und mit einer Filterkanüle filtriert, worauf 20% Piperidin in DMF (200 ml) zugesetzt wurden. Nach 25 min Rühren wurde das Harz filtriert und mit DMF (3 mal, jeweils 200 ml) gewaschen. 7-Fmoc-aminocumarin-4-essigsäure (15 g, 34 mmol), HOBt (4,6 g, 34 mmol) und DMF (150 ml) wurden zugesetzt und anschließend DICI (5,3 ml, 34 mmol). Die Mischung wurde über Nacht gerührt, filtriert, gewaschen (DMF, 3 mal mit 200 ml; Tetrahydrofuran, 3 mal mit 200 ml; MeOH, 3 mal mit 200 ml), und über P₂O₅ getrocknet. Der Substitutionsgrad des Harzes war 0,58 mmol/g (> 95%) bestimmt mittels Fmoc-Analyse (Harris et al., (2000)).
Synthese von P1-substituiertem ACC-Harz:
Fmoc-ACC-Harz (100 mg, 0,058 mmol) wurde 20 Reaktionsgefäßen eines Argonaut Quest 210 Organic Synthesizers zugesetzt und in DMF (2 ml) solvatisiert. Das Harz wurde filtriert und 20% Piperidin in DMF (2 ml) wurde jedem Gefäß zugesetzt. Nach 25 minütigem Rühren wurde das Harz filtriert und mit DMF gewaschen (3 mal mit 2 ml). Fmoc-Aminosäure (0,29 mmol), DMF (0,7 ml), Collidin (76 μl, 0,58 mmol) und HATU (110 mg, 0,29 mmol) wurden dem vorgesehenen Reaktionsgefäß zugesetzt und anschließend 20 Stunden gerührt. Die Harze wurden dann filtriert, mit DMF gewaschen (3 mal mit 2 ml) und ein zweites Mal den Kopplungsbedingungen ausgesetzt. Eine Lösung aus AcOH (40 μl, 0,70 mmol), DICI (110 μl, 0,70 mmol) und Nitrotriazol (80 mg, 0,70 mmol) in DMF (0,7 ml) wurden jedem Reaktionsgefäß zugesetzt und anschließend 24 Stunden gerührt. Die Harze wurden filtriert, gewaschen (DMF, 3 mal mit 2 ml; Tetrahydrofuran, 3 mal mit 2 ml; MeOH, 3 mal mit 2 ml) und über P₂O₅ getrocknet. Der Substitutionsgrad von jedem Harz wurde mittels Fmoc-Analyse bestimmt (Bunin (1998)).
Synthese einer P1-Diverse-Bibliothek:
Einzelne P1-substituierte Fmoc-Aminosäure-ACC-Harze (25 mg, 0,013 mmol) wurden den Mulden einer MultiChem 96-Well Reaktionsvorrichtung zugesetzt. Den Harz enthaltenden Mulden wurden DMF zugesetzt (0,5 ml). Nach Filtrierung wurde eine 20% Piperidin-Lösung in DMF (0,5 ml) zugesetzt und anschließend 30 Minuten gerührt. Die Mulden des Reaktionsblocks wurden filtriert und mit DMF gewaschen (3 mal mit 0,5 ml). Zur Einführung der randomisierten P2-Position wurde eine isokinetische Mischung (Ostresh et al.) von Fmoc-Aminosäuren (4,8 mmol, 10 Äquivalente pro Mulde; Fmoc-Aminosäure, mol%: Fmoc-Ala-OH, 3,4; Fmoc-Arg(Pbf)-OH, 6,5; Fmoc-Asn(Trt)-OH, 5,3; Fmoc-Asp(O-t-Bu)-OH, 3,5; Fmoc-Glu(O-t-Bu)-OH, 3,6; Fmoc-Gln(Trt)-OH, 5,3; Fmoc-Gly-OH, 2,9; Fmoc-His(Trt)-OH; 3,5; Fmoc-Ile-OH, 17,4; Fmoc-Leu-OH, 4,9; Fmoc-Lys(Boc)-OH, 6,2; Fmoc-Nle-Oh, 3,8; Fmoc-Phe-OH, 2,5; Fmoc-Pro-OH, 4,3; Fmoc-Ser(O-t-Bu)-OH, 2,8; Fmoc-Thr(O-t-Bu)-OH, 4,8; Fmoc-Trp(Boc)-OH, 3,8; Fmoc-Tyr(O-t-Bu)-OH, 4,1; Fmoc-Val-OH, 11,3) mit DICI (390 μl, 2,5 mmol) und HOBt (340 mg, 2,5 mmol) in DMF (10 ml) voraktiviert. Die Lösung (0,5 ml) wurde jeder Mulde zugesetzt. Der Reaktionsblock wurde 3 Stunden gerührt, filtriert und mit DMF gewaschen (3 mal mit 0,5 ml). Die randomisierten P3- und P4-Positionen wurden auf die selbe Weise eingeführt. Fmoc der P4 Aminosäure wurde entfernt und das Harz mit DMT (3 mal mit 05, ml) gewaschen und mit 0,5 ml Capping-Lösung aus AcOH (150 μl, 2,5 mmol), HOBt (340 mg, 2,5 mmol) und DICI (390 μl, 2,5 mmol) in DMF (10 ml) behandelt.
Nach 4 Stunden Rühren wurde das Harz mit DMF (3 mal mit 0,5 ml) und CH₂Cl₂ (3 mal mit 0,5 ml) gewaschen und mit einer Lösung aus 95:2,5:2,5 TFA/TIS/H₂O behandelt. Nach einer Inkubation von einer Stunde wurde der Reaktionsblock geöffnet und auf eine 96-deep well Titerplatte gegeben und die Mulden wurden mit zusätzlicher Spaltungslösung (2 mal mit 0,5 ml) gewaschen. Die Kollektionsplatte wurde konzentriert und das Material in den Substrat enthaltenden Mulden mit Ethanol (0,5 ml) verdünnt und zweifach konzentriert. Der Inhalt der einzelnen Mulden wurde aus CH₃CN/H₂O-Mischungen lyophilisiert. Die Gesamtmenge an Substrat in jeder Mulde wurde auf Basis einzelner Substratergebnisse konservativ auf 0,0063 mmol (50%) geschätzt.
Synthese von P1-fixierten Bibliotheken:
Multigrammmengen an P1-substituiertem ACC-Harz können nach den beschriebenen Verfahren synthetisiert werden. Es wurden 3 Bibliotheken hergestellt, bei denen die P1-Position definiert Lys, Arg, oder Leu war. Fmoc-Aminosäure substituiertes ACC-Harz (25 mg, 0,013 mmol Lys, Arg oder Leu) wurde in 57 Mulden eines 96-Mulden-Reaktionsblocks gegeben: 3 Subbibliotheken gekennzeichnet durch die zweite definierte Position (P4, P3, P2) von 19 Aminosäuren (ohne Cystein und Ersatz von Methionin durch Norleucin).
Synthese, Capping und Spaltung der Substrate waren identisch zu dem vorstehend beschriebenen Abschnitt mit der Ausnahme, dass für die P2, P3 und P4-Subbibliotheken einzelne Aminosäuren (5 Äquivalente an Fmoc-Aminosäuremonomer, 5 Äquivalente DICI und 5 Äquivalente HOBt in DMF) anstelle der isokinetischen Mischungen in die räumlich adressierten P2-, P3- oder P4-Positionen inkorporiert wurden.
Synthese einzelner Substrate:
Substrate in den positional scanning synthetischen kombinatorischen Bibliotheken, Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12), Ac-PANK-ACC (SEQ. ID. NO: 15), Ac-PRTK-ACC (SEQ. ID. NO: 16) und Ac-PRNR-ACC (SEQ. ID. NO: 17) wurden wie kürzlich beschrieben hergestellt. Siehe hierzu Harris, J. et al. (2000). Die Einzelheiten der Synthese folgen im Anschluss.
Einzelne Substrate für die kinetische Analyse wurden nach den vorstehend beschriebenen Methoden hergestellt. Die ungereinigten Produkte wurde einer präparatorischen Reversphasen-HPLC und anschließend einer Lyophilisierung unterzogen.
Fluoreszenzeigenschaften von ACC:
Die Fluoreszenz von freien ACC und Peptidyl-derivatisierten ACC wurde mit einem Spex Fluorimeter bestimmt, das auf 25°C thermostatisiert war. Es wurden Anregungswellenlängen von 300 bis 410 nm, 5-nm Intervalle, mit Emissionswellenlängen von 410 bis 500 nm, 5-nm Intervalle, verwendet, um die optimalen Anregungs- und Emissionsparameter zu bestimmen.
Enzymatischer Assay der Bibliothek:
Der enzymatische Assay der Bibliothek wurde wie bei Harris et al. (2000) beschrieben, durchgeführt. Die Konzentration der proteolytischen Enzyme wurde durch Messung der Absorbtion bei 280 nm bestimmt (Gill, S C. & von Hippel, P. H.). Die Anteile an katalytisch aktiven Thrombin, Plasmin, Trypsin, uPA, tPA und Chymotrypsin wurden durch Titration des aktiven Zentrums mit 4- Methylumbelliferyl-p-guanidinbenzoat (MUGB) oder Methylumbelliferyl-p-trimethylammoniocinnamatchlorid (MUTMAC) (Jameson, G. W. et al.) quantifiziert.
Die Substrate aus den positional scanning synthetischen kombinatorischen Bibliotheken (PS-SCLs) wurden in DMSO gelöst. Annähernd jeweils 1,0 × 10^–9 mol einer P1-Lys, P1-Arg, oder P1-Leu-Subbibliothek (361 Verbindungen) wurden 57 Mulden einer 96 well Mikrofluorplatte (Dynex Technologies, Chantilly, Virginia) mit einer Endkonzentration von 0,1 μm zugesetzt. Annähernd jeweils 1,0 × 10^–10 mol einer P1-diverse-Subbibliothek (6.859 Verbindungen) wurden 20 Mulden einer 96 well Platte mit einer Endkonzentration von 0,01 μM für jede Verbindung zugesetzt.
Die Hydrolysereaktionen wurden durch Zugabe von Enzym (0,02–100 nM) gestartet und fluorometrisch mit einem Lumineszenzspektrometer LS50B von Perkin-Elmer mit Anregung bei 380 nm und Emission bei 450 nm oder 460 nm beobachtet. Bestimmungen der Serinproteasen wurden bei 25°C in einem Puffer durchgeführt, der 50 mM Tris mit pH 8,0, 100 mM NaCl, 0–5 mM CaCl₂, 0,01% Tween-20 und 1% DMSO (aus den Substraten) enthielt. Die Bestimmung der Cysteinproteasen, Papain und Cruzain, wurden bei 25°C in einem Puffer durchgeführt, der 100 mM Natriumacetat mit pH 5,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 0,01% Brij-35 und 1% DMSO (aus den Substraten) enthielt.
Kinetische Assays der einzelnen Substrate:
βI- und βII-Tryptasekonzentrationen lagen in einem Bereich von 5 nM bis 15 nM. Die Endkonzentration an Substrat lag in einem Bereich von 5 μM bis 200 μM; die Konzentration an DMSO in dem Assay war weniger als 5%. Die Hydrolyse der ACC-Substrate wurde fluorometrisch mit einer Anregungswellenlänge von 380 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm mit einem Fluoromax-2-Spektrofluorimeter beobachtet.
Konstruktion des βII-Tryptasegens:
pPIC9-Hu Try (menschliches βI-Tryptaseplasmid) wurde wie bei Niles et al., Biotechnology and Applied Biochemistry, 28(Pt. 2) 125–31 (1998) erzeugt.
Expression und Reinigung:
Rekombinante menschliche βI- und βII-Tryptasen wurden exprimiert und gereinigt wie kürzlich beschrieben (Niles, A. et al., US. Pat. Anmeldung S. N. 09/598,982, eingereicht am 21. Juni 2000 und U.S. Pat. Anmeldung S. N. 09/079,970, eingereicht am 15. April 1998). Kurz gesagt wurde pPIC9-Hu Try/N113K mittels Sac-I-Verdauung linearisiert und in den GS115 Stamm von Pichia pastoris (Pichia pastoris Expressionssystem, Invitrogen, San Diego, Californien) transformiert. Ein Tryptase exprimierender Klon wurde isoliert und für die Expression im großen Umfang durch Fermentation in gepufferten Minimal Methanol Komplexmedien mit 0,5 mg/ml Heparin eingesetzt. Sekretierte reife βI- und βII-Tryptasen wurden bis zur Homogenität gereinigt, wobei ein bekanntes 2-Säulen-Affinitätschromatographieverfahren eingesetzt wurde. Die Enzyme wurde in einem Puffer zur Endlagerung suspendiert, der 2 M NaCl und 10 mM MES enthielt, pH 6,1.
Die Anteile an katalytisch aktiven βI- und βII-Tryptasen wurde durch Titration des aktiven Zentrums mit 4-Methylumbelliferyl-p-guanidinbenzoat (MUGB) (Jameson, G., et al.) quantifiziert. Kurz gesagt, wurde die Fluoreszenz mit Anregung bei 360 nm und Emission bei 450 nm nach Zusatz von Enzym zu MUGB beobachtet. Die Konzentration an Enzym wurde anhand der Zunahme der Fluoreszenz im Vergleich zu einer Standardkonzentrationskurve bestimmt.
Screening der positional scanning synthetischen kombinatorischen Bibliothek:
Herstellung und Screening der positional scanning synthetischen kombinatorischen Bibliothek (PS-SCL) wurde wie vorstehend beschrieben, durchgeführt (Harris, J., et al. (2000), Backes, B. J., et al.). Die Konzentration von jedem der 361 Substrate pro Mulde der P1-Lysin- und P1-Arginin- Bibliotheken war 0,25 μM, die Konzentration der 6859 Verbindungen pro Mulde der P1-diverse-Bibliothek war 0,013 μM. Die Enzymaktivität der PS-SCL wurde in 100 mM Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES) pH 7,5, 10% Glycerin und 0 oder 0,1 mg/ml Heparin bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 380 nm beziehungsweise 450 nm bestimmt.
Kinetische Analyse des einzelnen Substrats:
Tryptaseaktivität wurde bei 30°C in einem Assaypuffer mit 100 mM HEPES, pH 7,5, 10% w/v Glyzerin und 0,1 mg/ml Heparin beobachtet.
Die Substratstocklösungen wurden in DMSO hergestellt. Die Endkonzentration an Substrat lag in einem Bereich von 5 μM bis 2000 μM, die Konzentration an DMSO in dem Assay betrug weniger als 5%. Die Tryptasekonzentration war 5 nM.
Fluorogene Verbindungen:
Fluorogene Verbindungen werden als Sonden für eine Reihe von Anwendungen eingesetzt, einschließlich der strukturellen Aufklärung von Materialien, der Substratspezifität von Enzymen, der Hybridisierung von Nukleinsäuren, der Substrattransformation, Verdauung oder Abbau von Biomolekülen wie Peptiden, Nukleinsäuren, Sacchariden und so weiter.
Die vorliegende Erfindung stellt einen festen Träger zur Verfügung, der die Konjugation eines fluorogenen Teils mit Verbindungen unterschiedlicher Art erlaubt, die an dem erfindungsgemäßen festen Träger synthetisiert worden sind.
Ein bevorzugter fester Träger ist ein Harz, obwohl jeder beliebige andere feste Träger, zum Beispiel eine Platte, gleichfalls eingesetzt werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein fluorogenes Peptid mit einer fluorogenen Abgangsgruppe, die kovalent an eine Peptidsequenz P4-P3-P2-P1 an ein carboxyterminales Ende von P4-P3-P2-P1 gebunden ist. Vorzugsweise ist die Bindung eine Amidbindung. Beispielhaft für eine erfindungsgemäße Abgangsgruppe ist 7-Amino-4-carbamoylmethylcumarin (ACC).
Gemäß einer illustrativen Ausführungsform, wobei Fmoc Syntheseprotokolle verwendet werden, können alle 20 proteinogenen Aminosäuren direkt an die Träger gebundene ACC-Abgangsgruppe gekoppelt sein, so dass allgemeine Sets an Substraten erhalten werden für die Analyse der Substratspezifität der Proteasen. Die Vielseitigkeit der Festphasensynthesestrategie ermöglicht die schnelle Herstellung von Substratarrays (Lee, D. et al. (1999)) und positional scanning Bibliotheken (Rano, T. A. et al. (1997)) mit beliebiger Konfiguration. Die Profile der Substratspezifität von zahlreichen repräsentativen Serin- und Cystein-Proteasen belegen den Nutzen und die Allgemeingültigkeit von Bibliotheken, die mit der ACC-Methode erzeugt werden.
Die erfindungsgemäßen fluorogenen Polypeptide haben vorzugsweise eine Peptidsequenz, die mindestens eine Peptidbindung beinhaltet, die durch Tryptase gespalten wird. Durch Spaltung der Peptidbindung wird vorzugsweise die fluorogene Abgangsgruppe aus dem Peptid freigesetzt.
Die Hydrolyse der ACC-Substrate wurde fluorometrisch mit einer Anregungswellenlänge von 380 nm und eine Emissionswellenlänge von 450 nm mit einem Fluoromax-2 Spektrofluorometer beobachtet. Das aminoterminale Ende von jedem Polypeptid war acetyliert.
Verbindungsbibliotheken:
Es wurde eine Bibliothek von fluorogenen Peptiden geschaffen. Die Bibliothek wird verwendet, um die Substratspezifität von Tryptase zu bestimmen. Bibliotheken mit positional array oder geordneten array sind bevorzugt. Diese Bibliotheken erlauben die Identifizierung von Peptiden oder anderen Verbindungen, die mit Aktivitätsbereichen verbunden sind, die beim screening der Bibliothek lokalisiert werden. Genauer gesagt, kann die Bibliothek geordnet sein, so dass die Position des Peptids auf dem array der Identität des Peptids entspricht. Das heißt, sobald eine Bestimmung durchgeführt worden ist, und die Position auf dem array für ein aktives Peptid bestimmt worden ist, kann die Identität des Peptids ohne Weiteres festgesetzt werden.
Fluorogenes Polypeptid:
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein isoliertes Polypeptid, das vom aminoterminalen zum carboxyterminalen Ende gesehen P4-P3-P2-P1 aufweist, wobei P4 P, P3 R oder K, P2 eine beliebige Aminosäure und P1 K oder R ist (SEQ. ID. NO: 1). Das Polypeptid ist vorzugsweise acetyliert und enthält eine fluorogene Abgangsgruppe, die kovalent an P4-P3-P2-P1 an einem carboxyterminalen Ende von P4-P3-P2-P1 gebunden ist. Vorzugsweise ist die fluorogene Abgangsgruppe über eine Amidbindung gebunden. Eine bevorzugte fluorogene Abgangsgruppe ist 7-Amino-4-carbamoylmethylcumarin. Das heißt, ein bevorzugtes Polypeptid ist Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12).
Bestimmung der Tryptaseaktivität:
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität einer enzymatisch aktiven β-Tryptase in einer Probe. Proben, die für die Bestimmung eingesetzt werden können, umfassen ohne jedoch darauf beschränkt zu sein Plasma, Urin, Tränenflüssigkeit, Lavage, Serum oder andere klinische Proben von Körperflüssigkeiten. Das Verfahren umfasst die Schritte des Inkontaktbringens der Probe mit einem isolierten Polypeptid enthaltend P4-P3-P2-P1, gesehen vom aminoterminalen zum carboxyterminalen Ende. In dieser bevorzugten Ausführungsform ist P4 P, P3 R oder K, P2 eine beliebige Aminosäure und P1 K oder R (SEQ. ID. NO: 1). P4 ist vorzugsweise acetyliert und eine fluorogene Abgangsgruppe ist über eine Amidbindung an P4-P3-P2-P1 an ein carboxyterminales Ende von P4-P3-P2-P1 gebunden. Wird die Probe mit dem isolierten Polypeptid in Kontakt gebracht, wird die fluorogene Abgangsgruppe durch die β-Tryptase von P4-P3-P2-P1 abgespalten. Die Probe kann dann untersucht werden, um zu bestimmen, ob eine nachweisbare Änderung der Fluoreszenz eingetreten ist, wobei die nachweisbare Änderung ein Indikator für die Aktivität der enzymatisch aktiven β-Tryptase in der Probe ist.
Aprotininbestimmung:
Aprotinin inhibiert von β-Tryptase verschiedene Proteasen. Daher kann es Proben zugesetzt werden, um die unspezifische Abspaltung der fluorogenen Abgangsgruppe aus P4-P3-P2-P1 durch andere Proteasen als β-Tryptase zu verringern. Entsprechend betrifft die Erfindung auch ein Nachweissverfahren, das als zusätzlichen Schritt den Zusatz von Aprotinin zu der Probe enthält, um von β-Tryptase verschiedene Proteasen zu inhibieren.
Tryptase-Polypeptidinhibitor:
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypeptid, das Tryptase inhibiert. Das isolierte Polypeptid umfasst, vom aminotermialen zum carboxyterminalen Ende gesehen, P4-P3-P2-P1, wobei P4 P, P3 R oder K, P2 eine beliebige Aminosäure und P1 K oder R ist. (SEQ. ID. NO: 1). Das Polypeptid enthält einen reaktiven Inhibitorteil für Serinprotease, wie zum Beispiel Chlormethylketon, der mit P1 verknüpft ist, und wobei P4 acetyliert ist.
Tryptaseinhibierung:
Das mit Chlormethylketon modifizierte Polypeptid, das vorstehend beschrieben worden ist, kann zur Inhibierung von β-Tryptase eingesetzt werden. Damit wird ein Verfahren zur Inhibierung einer enzymatisch aktiven β-Tryptase in einer Probe bereitgestellt, das das in Kontaktbringen der Probe mit einem isolierten Polypeptid umfasst, das, vom aminoterminalen zum carboxyterminalen Ende gesehen, P4-P3-P2-P1 aufweist, wobei P4 acetyliert ist, und wobei P1 mit einem Chlormethylketon verknüpft ist. Vorzugsweise ist P4 P, P3 R oder K, P2 eine beliebige Aminosäure und P1 K oder R (SEQ. ID. NO: 1). Das in Kontaktbringen erfolgt derart, dass das isolierte Peptid mit der β-Tryptase wechselwirkt und dadurch die β-Tryptase inhibiert. Auf Wunsch kann der Grad der Inhibierung der β-Tryptase verfolgt werden.
Kits:
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Kits zur Bestimmung der Aktivität von β-Tryptase in Proben. Die Kits beinhalten einen oder mehrere Behälter, die ein oder mehrere erfindungsgemäße fluorogene Polypeptide enthalten. Die fluorogenen Polypeptide können in Lösung, lyophilisiert oder an einen festen Träger gebunden vorliegen. Die Kits können Indikatorlösungen oder Indikator-„Messstäbe", Plättchen, Kulturmedien und so weiter enthalten. Die Kits können auch Indikatorkassetten (wobei das fluorogene Polypeptid an einen festen Träger gebunden ist) für die automatisierte Bestimmung der Tryptaseaktivität enthalten.
Die Kits können zudem Gebrauchseinweisungen enthalten, die das erfindungsgemäße Verfahren und den Einsatz der Polypeptide des Kits beschreiben. Zusätzlich können die Kits weitere Reagenzien, Puffer, verschiedene Konzentrationen an Enzyminhibitoren, Stockenzyme (zur Erzeugung von Standardkurven etc.), Kulturmedien, Einwegküvetten usw. enthalten, die für die Bestimmung der Tryptaseaktivität unter Verwendung der erfindungsgemäßen fluorogenen Peptide nützlich sind.
Es ist anzumerken, dass die Kits zusätzlich oder alternativ beliebige andere Indikatoren enthalten können, wie zum Beispiel Indikatoren auf Basis von Nukleinsäuren, Oligosaccharidindikatoren, Lipidindikatoren.
Ebenso ist ein weiteres Kit umfasst, das ein isoliertes Polypeptid enthält, das β-Tryptase inhibiert.
Strukturmodellierung eines optimierten Substrats in das aktive Zentren von Tryptase:
Die Tryptasestruktur (PDB-Code 1aO1) wurde für die Modellierung vorbereitet, indem Inhibitor- und Wassermoleküle entfernt wurden, Wasserstoffe mit Sybyl6.5 eingeführt und atomzentrierte Punktladungen (partial atomic charge) mit AMBER zugeordnet wurden. Alle 4 Untereinheiten des Tetramers wurden beibehalten. Da die Struktur einen kovalenten Inhibitor enthält, erfolgte eine Modellierung von katalytischen Ser-195 in eine Geometrie, die mit einem nichtkovalenten Inhibitor konsistent ist, indem die Wasserstoffbindung mit His-57 wiederhergestellt wurde. Hierfür wurde eine Torsionsminimierung mit Sybyl6.5 in zwei Schritten durchgeführt (Tripos Kraftfeld, eps = lr). Im ersten Schritt wurde die Position des Hydroxylwasserstoffs von Ser-195 mittels Torsion um die CCOH-Bindung minimiert und im zweiten Schritt wurden sowohl Sauerstoff als auch Wasserstoff mittels Torsion um die CCOH- und CCCO (chi I)-Bindungen minimiert. Die Koordinaten von allen Atomen des Enzyms wurden für die übrige Modellierung festgehalten.
Das Peptidrückgrat von Ac-PRNK-Nme (SEQ. ID. NO: 18) (das heißt das Peptid war N-methyliert) wurde in das aktive Zentrum der Tryptasestruktur wie folgt modelliert. Als Templat für die Rückgratkonfiguraton wurde die Struktur des P1-P3-Teils von Ovomucoid (komplexiert mit Chymotrypsin, PDB-Code I cho) benutzt. Dieser Teil des Inhibitors wurde in das aktive Zentrum der Tryptase mit least squares superposition der Reste 57, 102, 195 und 214 bis 216 des aktiven Zentrums der Protease mit den entsprechenden Resten des Tryptase-„A"-Protomer übertragen. Die Peptidseitenketten wurden dann an C-β trunkiert, Wasserstoffe und AMBER-Ladungen wurden (wie vorstehend) eingefügt und die Konfiguration des resultierenden (Ac-AAA-Nme)-Peptids wurde mit sukzessiven Minimierungen für das aktive Zentrum der Tryptase optimiert. Mit DOCK4.0 wurden zunächst die Atome der zu spaltenden Amidbindung minimiert. Dann wurden sukzessive die starren Segmente des Peptids (wobei die Torsionswinkel des Ovomucoidinhibitors benutzt wurden) im Wechsel mit Minimierung zugefügt. Die Minimierungen umfassten starre und flexible Freiheitsgrade und wurden mit dem Simplexalgorithmus durchgeführt, wobei die Größe der Anfangsschritte kleiner als der Fehlerwert war (zum Beispiel betrug die maximale Anfangstranslation 0,02 Angst.) und mit bis zu 500 Wiederholungen für jede Minimierung.
Der Scoring-Term, der sowohl für intermolekulekulare als auch für intramolekulare Atompaare benutzt wurde, enthielt die Coulomb- und van der Waals-Terme aus AMBER mit einem interatomaren Cutoff von 25 Angst. und eps. = 4r. Die Peptidseitenketten (PRNK) (SEQ. ID. NO: 2) wurden dann eingeführt und die Konformation der P1 bis P3-Seitenketten und von P4 Prolin wurden mit DOCK 4.0 gemäß Lamb, M. et al., „Design, Docking, and Evaluation of Multiple Libraries Against Multiple Targets," Proteins (in Druck) modelliert. Zum Schluss wurden 10 unabhängige Minimierungen durchgeführt und die Konfiguration mit der niedrigsten Energie ausgewählt.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung. Es ist selbstverständlich, dass die folgenden Beispiele die Erfindung in keiner Weise einschränken.
Beispiel 1: Substratspezifität von βI- und βII-Tryptasen:
Rekombinante βI- und βII-Tryptasen wurden erzeugt und in Pichia pastoris als reife Enzyme sekretiert. Die Fähigkeit das aktive reife Enzym anstelle des inaktiven Vorläufers Zymogen zu erzeugen, ist wichtig für die Untersuchung der Substratspezifität, da dadurch vermieden wird, dass das Propeptid durch Zusatz einer aktivierenden Protease entfernt werden muss, deren Aktivität die anschließende Untersuchung der Spezifität komplizieren könnte. Es besteht ein Unterschied in einer einzigen Aminosäure zwischen βI- und βII-Tryptasen mit Asparagin beziehungsweise Lysin an Position 113. Durch Ersatz von Asparagin durch Lysin wird eine N-verknüpfte Glykosylierungsstelle in Tryptase βII entfernt, so dass sie eine einzige Glykosylierungsstelle enthält. Die Reduzierung der Anzahl an Glykosylierungsstellen kann bei der rekombinanten Expression der beiden Enzyme beobachtet werden, wobei βI-Tryptase in mehrfach glykosylierten Banden und βII-Tryptase in glykosylierten und nichtglykosylierten Banden wandert. Der einzige Unterschied bei der Expression und Reinigung der zwei Enzyme liegt in der Endausbeute des aktiven Enzyms, wobei βI-Tryptase 10 mal mehr exprimiert als βII-Tryptase. Das Phänomen der verringerten Expression aufgrund der Entfernung der Glykosylierungsstelle wurde auch bei anderen Proteasen beobachtet und es wird angenommen, dass damit eine verringerte Stabilität oder Löslichkeit des Enzyms ohne post-translatorische Glykosylierung einhergeht (Harris, J. L. et al. (1998)).
Beispiel 2: Substratspezifitäten von βI- und βII-Tryptase:
Zur Bestimmung ob dieser einzige Unterschied in der Glykosylierung die Substratspezifität von βI- und βII-Tryptasen beeinflusst, wurden mehrere kombinatorische Peptidbibliotheken mit fluorogenen Abgangsgruppen eingesetzt. Zunächst wurde die P1-Position mit einer Bibliothek bestimmt, bei der jede P1-Aminosäure in einem Tetrapeptid konstant gehalten wurde, und die anderen 3 Positionen eine äquimolare Mischung aus 19 Aminosäuren (ohne Cystein und Ersatz von Metheonin durch Norleuzin) aufwiesen. Beide βI- und βII-Tryptasen bevorzugen die Spaltung nach Lysin gegenüber der nach Arginin, wobei keine andere Aminosäure an dieser Position akzeptiert wurde (2).
Beispiel 3: Erweiterte Substratspezifität von βI- und βII-Tryptasen:
Zur Feststellung der erweiterten Substratspezifitäten der β-Tryptasen als auch zur Bestimmung, ob die erweiterte Spezifität von dem Kontext der P1-Aminosäure abhängig ist, wurden βI- und βII-Tryptasen mit zwei Bibliotheken untersucht, die sich lediglich in der konstanten P1-Aminosäure, Lysin beziehungsweise Arginin, unterschieden. Die erweiterten P4 bis P2-Substratspezifitäten von beiden β-Tryptasen ergaben, dass die Enzyme eine ähnliche Substratpräferenz aufweisen, die unabhängig davon ist, ob die P1-Aminosäure Lysin oder Arginin ist (3A und 3B). Obwohl aus dem Spezifitätsnachweis ersichtlich ist, dass beide Enzyme an jeder Position Selektivität aufweisen, können viele weniger optimale Aminosäuren ebenso in das Substrat eingebaut werden, was darauf hinweist, dass zusätzliche Mechanismen der Substratdiskriminierung vorliegen können. Beide Tryptasen zeigen eine ungewöhnliche Präferenz für Prolin in der P4-Position. Keine andere Serinprotease, die bis heute untersucht worden ist, zeigt diese Präferenz. Für die P3-Position ergibt sich eine Präferenz für positiv geladene Aminosäuren, nämlich Lysin und Arginin. Schließlich ergibt sich für die P2-Position eine Präferenz für Asparagin (3A und 3B).
Beispiel 4: Kinetische Charakterisierung der Leitsubstrate:
Zur Quantifizierung der Abhängigkeit von Tryptase βI und βII von der erweiterten Substratspezifität wurden verschiedene Peptidsubstrate synthetisiert und die kinetischen Konstanten für jedes Enzym bestimmt. Die geringfügige Bevorzugung von Lysin gegenüber Arginin wie sie in der P1-diverse Peptid-Bibliothek festgestellt worden ist, wurde mit den Substraten Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) und Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 17) bestätigt. Das Substrat Ac-PRNR-ACC (SEQ. ID. NO: 17) zeigt etwa 70–90% der Aktivität von Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) mit k_cat/K_m (1,12 ± 0,14) × 10⁶ M^–1s^1– beziehungsweise (1,23 ± 0,15) × 10⁶ M^–1s^1– für Tryptase βI und (1,31 ± 0,19) × 10⁶ M^–1s¹ beziehungsweise (1,89 ± 0,17) × 10⁶ M^–1s¹ für Tryptase βII (Tabelle II). Für beide Enzyme konnte eine geringfügige Präferenz, ungefähr das zweifache, für P2-Asparagin gegenüber P2-Threonin bei Vergleich von Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) und Ac-PRTK-ACC (SEQ. ID. NO: 16) beobachtet werden mit k_cat/K_m (0,78 ± 0,07) × 10⁶ M^–1s¹ beziehungsweise (1,23 ± 0,15) × 10⁶ M^–1s¹ für Tryptase βI und (1,27 ± 0,12) × 10⁶ M^–1s¹ beziehungsweise (1,89 ± 0,17) × 10⁶ M^–1s¹ für Tryptase βII. Der größte Unterschied findet sich in der P3-Position mit einer annähernd 10 mal höheren Präferenz für Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) gegenüber Ac-PANK-ACC (SEQ. ID. NO: 15), mit k_cat/K_m (1,23 ± 0,15) 10⁶ M^–1s¹ beziehungsweise (0,14 ± 0,01) × 10⁶ M^–1s¹ für Tryptase βI und (1,89 ± 0,17) × 10⁶ M^–1s¹ beziehungsweise (0,18 ± 0,01) × 10⁶ M^–1s¹ für Tryptase βII. All diese Effekte zeigen sich in dem K_m-Wert, nicht in dem k_cat-Wert. Dies weist darauf hin, dass die Bindung im Grundzustand und Erkennung wichtige Faktoren der Tryptasekatalyse sind.
Beispiel 5: Kinetische Vergleiche:
Tabelle 2 zeigt einen kinetischen Vergleich von fluorometrischen Tryptasesubstratkandidaten, wie sie mit PS-SCL vorherbestimmt wurden. Kinetische Parameter wurden unabhängig für beide rekombinante βI und βII- Tryptasen für rationale Substitutionen in den Substraten an den P2-P4-Positionen erhalten.
Beispiel 6: Ac-PRNK-ACC zeigt Spezifität gegenüber andere Proteine:
Menschliche rekombinante βI-Tryptase (Promega) wurde 2-fach seriell dreimal in einer Mikrotiterplatte von 10.000 auf 156 pg/ml verdünnt, wobei ein „Assaypuffer" verwendet wurde, der 100 mM HEPES, 10% v/v Glycerin und 0,1 mg/ml Heparin, pH 7,5, enthielt. Menschliches α-Thrombin (Haematologic Technologies, Inc.) und bovine factor Xa-Protease (Promega) wurden gleichermaßen von 200.000 auf 190 pg/ml verdünnt. Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) wurden zu 100 μM zugesetzt und die Platte bei Raumtemperatur eine Minute inkubiert vor Auslesen bei einer Anregungswellenlänge von 355 nm und Emissionswellenlänge von 460 nm. 5 zeigt, dass Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) ein spezifisches Substrat für Tryptase im Vergleich zu anderen, aus dem Blut stammenden Serinproteasen ist.
Beispiel 7: Tryptaseaktivität über einen weiten Proteinbereich
Menschliche rekombinante β-I Tryptase (Promega) wurde zweifach seriell dreimal in einer Mikrotiterplatte von 125 auf 7,8 ng/ml und 125.000 auf 195 pg/ml verdünnt, wobei ein „Assaypuffer" eingesetzt wurde, der 100 mM HEPES, 10% v/v Glycerin und 0,1 mg/ml Heparin, pH 7,5, enthielt. Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) wurde zu 100 μM zugegeben und die Platte bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubiert bevor sie bei einer Anregungswellenlänge von 355 nm und Emissionswellenlänge von 460 nm ausgelesen wurde.
6 und 7 zeigen typische Standardkurven der Aktivität, die mit Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) in Pufferlösungen mit rekombinanter Tryptase erhalten wurden. Die Kurven wurden über 2 Logarithmus Tryptaseproteinkonzentrationsbereich erzeugt.
Beispiel 8: Aktivität von menschlicher β-Tryptase in Serum:
Menschliche rekombinante βI-Tryptase (Promega) wurde zweifach seriell dreimal in einer Mikrotiterplatte von 31,25 ng auf 0,488 ng/ml entweder in menschlichen Serum (Sigma) oder einem Puffer verdünnt, der 100 mM HEPES, 10% v/v Glyzerin und 0,1 mg/l Heparin, pH 7,5, enhielt. Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) wurde zu 100 μM zugegeben und die Platte bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubiert, bevor bei einer Anregungswellenlänge von 355 nm und Emissionswellenlänge von 460 nm ausgelesen wurde.
8 zeigt, dass lineare Tryptase-Standardkurven mit geimpften menschlichem Serum mit Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) möglich sind. Die intrinsische Fluoreszenz ist über die Standardkurve konsistent.
Beispiel 9: Nicht-Tryptase proteolytische Aktivitäten im Serum:
Menschliche rekombinante βI-Tryptase (Promega) wurde zweifach seriell in menschlichem Serum von 10.000 pg auf 190 pg/ml verdünnt.
Aprotinin, Soyabohnentrypsininhibitor (SBTI) oder Antitrypsin wurden jeder Verdünnung mit 25 μg/ml zugesetzt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Gleichermaßen wurde eine Serumstandardkurve ohne Inhibierung erzeugt. Von jeder der behandelten und unbehandelten Serumverdünnungen wurden 100 μl 3-fach auf eine Mikrotiterplatte pipettiert. Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) wurde auf 100 μM zugegeben und die Platte bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubiert, bevor bei einer Anregungswellenlänge von 355 nm und Emissionswellenlänge von 460 nm ausgelesen wurde.
9 zeigt, dass die intrinsische Fluoreszenz aufgrund Nicht-Tryptaseproteolyse beträchtlich und spezifisch im Serum mit dem Serinproteaseinhibitor Aprotenin unterdrückt werden kann.
Beispiel 10: Aprotinin unterdrückt Nicht-Tryptase-Aktivität:
10 zeigt, dass lineare Tryptasestandardkurven in Serum und Puffer in Gegenwart von exogen zugesetztem Aprotinin möglich sind.
Der Nachweis wurde im Wesentlichen wie in 9 durchgeführt mit der Ausnahme, dass Aprotinin für eine menschliche rekombinante βI-Tryptase Pufferstandardkurve von 15.600 bis 237 pg/ml zugesetzt wurde.
Beispiel 11: Tryptaseaktivität in Urin:
Menschliche rekombinante βI-Tryptase (Promega) wurde zweifach seriell in unfiltrierten, first-void, normalen menschlichen Urin von 10.000 pg auf 190 pg/ml verdünnt. Aprotinin wurde mit einer Endkonzentration von 25 μg/ml einem Set der Standardkonzentrationen zugesetzt und die Lösung bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert, bevor Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) zugegeben wurde. Die Platte wurde dann bei Raumtemperatur inkubiert und nach 15 und 30 Minuten gelesen. „Normal" bedeutet, dass keine Krankheitsgeschichte auf allergene Empfindlichkeiten oder Symptome vorliegt.
11 zeigt, dass lineare Tryptasestandardkurven für Urin ohne beträchtliche Nicht-Tryptaseproteolyse möglich sind. Praktische Nachweisgrenzen treten bei Annäherung an 300 pg/ml aktiver Tryptase auf.
Beispiel 12: Peptidkandidat gekoppelt mit CMK:
Ac-PRNK-CMK (SEQ. ID. NO: 14) wurde zweifach seriell von 1000 auf 3,9 μM in einem „Assaypuffer" verdünnt, der aus 100 mM HEPES, 10% v/v Glyzerin und 0,1 mg/ml Heparin, pH 7,5, bestand. Menschliche rekombinante βI-Tryptase (Promega) wurde jedem Röhrchen in einer Menge von 1 μg zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die kinetische Geschwindigkeit wurde dann durch Zusatz von CBZ-Lys-Thiobenzylestersubstrat und DNTB mit Endkonzentrationen von 400 μM beziehungsweise 1 mM bestimmt und bei 450 nm analysiert.
12 und 13 zeigen, dass die Substitution von 7-Amino-4-Carbamoylmethylcumarin (ACC) durch Chlormethylketon (CMK) in Ac-PRNK einen Inhibitor für Tryptase Isoformen ergibt.
Beispiel 13: Bestimmung der Spezifität des Inhibitorkandidaten:
Ac-PRNK-CMK (SEQ. ID. NO: 14) wurde zweifach seriell von 16130 auf 31 μM und von 1000 auf 31 μM für Faktor Xa beziehungsweise Thrombin in „Assaypuffer" verdünnt, bestehend aus 100 mM HEPES, 10% v/v Glyzerin und 0,1 mg/ml Heparin mit pH 7,5. Es wurden pro Verdünnung 6,6 μg Thrombin und pro Verdünnung 5 μg Faktor Xa zugegeben. Jede Reihe der Inhibierungsverdünnungen wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert. Die kinetische Geschwindigkeit wurde dann durch Zusatz von CBZ-Lys-Thiobenzylestersubstrat und DNTB mit einer Endkonzentration von 400 mM beziehungsweise 1 mM bestimmt und bei 450 nm analysiert.
14 zeigt, dass der Ac-PRNK-CMK (SEQ. ID. NO: 14) Inhibitor weitestgehend gegenüber aus dem Blut stammenden Serinproteasen mit einer von Tryptase abweichenden proteolytischen Spezifität, zum Beispiel Faktor Xa und Thrombin, unwirksam ist.
Potentielle/zwingende physiologische Substrate, die durch PS-SCL identifiziert worden sind.
Weitere nützliche Substrate, die gefunden worden sind, umfassen die folgenden.
PRTK (SEQ. ID. NO: 7) latentes TGF-b Bindungsprotein, Integrin E, Methioninaminopeptidase
PRFK (SEQ. ID. NO: 19) für aktives Zentrum von Pro-Urokinase
IRSK (SEQ. ID. NO: 20) Granzym-K-Vorläufer
SKGR (SEQ. ID. NO: 21) PAR-2
FRTK (SEQ. ID. NO: 22) PAR-2
IKTK (SEQ. ID. NO: 23) Hepatozyt-Wachstumsfaktor
Auf die selbe Weise wie vorstehend für Tryptase beschrieben, können diese Substrate für die Bestimmung der Aktivität der angeführten Enzyme eingesetzt werden. Andere Enzyme und mögliche korrespondierende synthetische Substrate können über Datenbanksuche mit Software wie BLAST identifiziert werden. Beispielsweise kann eine geeignete BLAST-Suche mit Hilfe folgender Parameter durchgeführt werden: Software: NCBI BlastP 2.0.10; Datenbank: nicht-redundante Genbank CDS; Translations, PDB, SwissProt, Spupdate, PIR; fortgeschrittene Suche: -e 10.000, -w2.
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SEQUENCE LISTING

Claims

Isoliertes Tetrapeptid mit der Sequenz, gesehen vom aminoterminalen Ende zum carboxyterminalen Ende, P4-P3-P2-P1, wobei P4 P, P3 R oder K, P2 eine beliebige Aminosäure und P1 K oder R (SEQ. ID. Nr: 1) ist oder wobei P4-P3-P2-P1 P-A-N-K (SEQ. ID. Nr: 6) ist, mit der Maßgabe, dass das Tetrapeptid nicht P-K-P-R, P-R-G-K, P-K-T-R oder P-R-T-R ist.
Isoliertes Tetrapeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Tetrapeptid eine nachweisbare Abgangsgruppe umfasst, die kovalent an P4-P3-P2-P1 gebunden ist, oder einen reaktiven Serinprotease Inhibitorteil umfasst, der mit P1 verknüpft ist.
Isoliertes Tetrapeptid mit der Sequenz, gesehen vom aminoterminalen Ende zum carboxyterminalen Ende, P4-P3-P2-P1, wobei P4 P, P3 R oder K, P2 eine beliebige Aminosäure und P1 K oder R (SEQ. ID. Nr: 1) ist, oder wobei P4-P3-P2-P1 P-A-N-K (SEQ. ID. Nr: 6) ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Tetrapeptid eine nachweisbare Abgangsgruppe umfasst, die kovalent an P4-P3-P2-P1 gebunden ist, oder einen reaktiven Serinprotease Inhibitorteil umfasst, der mit P1 verknüpft ist.
Isoliertes Tetrapeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass P4 am aminoterminalen Ende geschützt ist.
Isoliertes Tetrapeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass P4 acetyliert ist.
Isoliertes Tetrapeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass P2 N ist.
Isoliertes Tetrapeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass P4-P3-P2-P1 P-R-N-K (SEQ. ID. Nr: 2), P-K-N-K (SEQ. ID. Nr: 3) P-R-N-R (SEQ. ID. Nr: 4), P-K-N-R (SEQ. ID. Nr: 5), P-A-N-K (SEQ. ID. Nr: 6) oder P-R-T-K (SEQ. ID. Nr: 7) ist.
Isoliertes Tetrapeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die nachweisbare Abgangsgruppe eine fluorogene Abgangsgruppe ist, die kovalent an P4-P3-P2-P1 am carboxyterminalen Ende von P4-P3-P2-P1 gebunden ist.
Isoliertes Tetrapeptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die fluorogene Abgangsgruppe über eine Amidbindung angebunden ist.
Isoliertes Tetrapeptid nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die fluorogene Abgangsgruppe 7-Amino-4-carbamoylmethylcumarin umfasst.
Isoliertes Tetrapeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass P1 mit einem reaktiven Serinprotease Inhibitorteil verknüpft ist.
Isoliertes Tetrapeptid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der reaktive Serinprotease Inhibitorteil Chlormethylketon ist.
Verfahren zur Bestimmung der Aktivität einer enzymatisch aktiven β-Tryptase in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst: (a) In Kontakt bringen der Probe mit einem isolierten Tetrapeptid nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die Modifikation eine fluorogene Abgangsgruppe enthält, unter Bedingungen, bei denen die fluorogene Abgangsgruppe unter Einfluss der β-Tryptase von P4-P3-P2-P1 abgespalten wird, sodass ein fluoreszierender Teil erhalten wird; und dann (b) Quantitative Bestimmung der Menge an nachweisbarer Abgangsgruppe, die von dem Tetrapeptid abgespalten worden ist, wobei die Menge ein Hinweis auf die Aktivität der enzymatisch aktiven β-Tryptase in der Probe ist.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (b) die Menge an nachweisbarer Abgangsgruppe, die von dem Tetrapeptid abgespalten worden ist, dadurch bestimmt wird, indem beobachtet wird, ob in der Probe eine nachweisbare Änderung der Fluoreszenz eintritt.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine klinische Probe einer Körperflüssigkeit ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe Vollblut, Serum, Plasma, Urin, Tränenflüssigkeit, Lavage, Gewebeextrakt oder ein konditioniertes Medium ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, zusätzlich umfassend den Zusatz von Aprotinin zu der Probe, um von β-Tryptase verschiedene Proteasen zu inhibieren, um so die nichtspezifische Abspaltung der fluorogenen Abgangsgruppe von P4-P3-P2-P1 durch andere Proteasen als β-Tryptase zu reduzieren.
Verfahren zur Inhibierung einer enzymatisch aktiven β-Tryptase in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst: in Kontakt bringen der Probe mit einem isolierten Tetrapeptid, das vom aminoterminalen Ende zum carboxyterminalen Ende gesehen P4-P3-P2-P1 umfasst, wobei P4 P, P3 R oder K, P2 eine beliebige Aminosäure und P1 K oder R (SEQ. ID. Nr: 1) ist, oder wobei P4-P3-P2-P1 P-A-N-K (SEQ. ID. Nr: 6) ist, wobei P4 acetyliert ist, und wobei P1 mit Chlormethylketon verknüpft ist, unter Bedingungen, bei denen das isolierte Tetrapeptid mit der enzymatischen β-Tryptase in der Probe wechselwirkt und diese inhibiert.
Verfahren nach Anspruch 18, zudem umfassend die quantitative Bestimmung der Inhibierung der Aktivität der β-Tryptase in der Probe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass P4-P3-P2-P1 P-R-N-K (SEQ. ID. Nr: 2), P-K-N-K (SEQ. ID. Nr: 3), P-R-N-R (SEQ. ID. Nr: 4), P-K-N-R (SEQ. ID. Nr: 5), P-A-N-K (SEQ. ID. Nr: 6) oder P-R-T-K (SEQ. ID. Nr: 7) ist.
Kit zur Analyse von Proben auf β-Tryptase Aktivität enthaltend: ein isoliertes Tetrapeptid mit der Sequenz, gesehen vom aminoterminalen Ende zum carboxyterminalen Ende, P4-P3-P2-P1, wobei P4 P, P3 R oder K, P2 eine beliebige Aminosäure und P1 K oder R (SEQ. ID. Nr: 1) ist, oder wobei P4-P3-P2-P1 P-A-N-K (SEQ. ID. Nr: 6) ist, und wobei eine nachweisbare Abgangsgruppe kovalent an P4-P3-P2-P1 gebunden ist, und einen geeigneten Behälter, in dem das isolierte Tetrapeptid enthalten ist.
Kit nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die nachweise Abgangsgruppe eine fluorogene Abgangsgruppe ist, die kovalent an das carboxyterminale Ende von P4-P3-P2-P1 über eine Amidbindung gebunden ist
Kit nach Anspruch 21 oder 22 zusätzlich enthaltend ein zweites isoliertes Tetrapeptid mit der Sequenz, gesehen vom aminoterminalen Ende zum carboxyterminalen Ende, P4-P3-P2-P1, wobei P4 P, P3 R oder K, P2 eine beliebige Aminosäure und P1 K oder R (SEQ. ID. Nr: 1) ist, oder wobei P4-P3-P2-P1 P-A-N-K (SEQ. ID. Nr: 6) ist, wobei das zweite P4-P3-P2-P1 einen auf Serinprotease reaktiven Teil enthält.
Kit nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass der auf Serinprotease aktive Teil Chlormethylketon ist.
Kit nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das isolierte Tetrapeptid in Lösung, lyophilisiert oder an einen festen Träger gebunden vorliegt.
Kit nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass P4 des isolierten Tetrapeptids acetyliert ist.
Kit nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass P4-P3-P2-P1 P-R-N-K (SEQ. ID. Nr: 2), P-K-N-K (SEQ. ID. Nr: 3), P-R-N-R (SEQ. ID. Nr: 4), P-K-N-R (SEQ. ID. Nr: 5), P-A-N-K (SEQ. ID. Nr: 6) oder P-R-T-K (SEQ. ID. Nr: 7) ist.
Kit nach einem der Ansprüche 21 bis 27 zudem enthaltend einen Vorrat an Aprotinin in einem zweiten Behälter.