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Die
vorliegende Erfindung betrifft Assays zur Feststellung von Tryptaseaktivität und Polypeptidsubstrate
für Tryptase,
die in diesem Assay eingesetzt werden.
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Bibliographie
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Eine
vollständige
Bibliographie der Literaturzitate, die hier angeführt werden,
sind in dem Bibliographieteil enthalten, der den Ansprüchen unmittelbar
vorangeht.
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Beschreibung
des Standes der Technik
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Mastzellen
liegen auf allen epithelialen und mucosalen Oberflächen des
Körpers
vor. Zudem werden sie in den Schleimhäuten des Atmungssystems sowie
des Magendarmtrakts gefunden. Mastzellen befinden sich auch in der
Nähe von
Blutgefäßen im Bindegewebe.
Mastzellen spielen eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen
Immunreaktion durch die Freisetzung von dichten Bläschen nach
Aktivierung. Die Hauptkomponente der sekretorischen Bläschen der
Mastzellen sind Serinproteasen (Schwarz, L., et al.).
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Menschliche β-Tryptase
ist das am weitesten verbreitete und ein einzigartiges Mitglied
der Serinproteasefamilie. Obwohl β-Tryptase
unbestimmte physiologische Funktionen hat, ist sie als ein Effektor
in eine Unzahl von menschlichen allergenen und pathophysiologischen
Zuständen
verwickelt, einschließlich
Asthma, Arteriosklerose, Krebs, Mittelohrentzündung, Arthritis, interstitielle
Zystitis, Nasenschleimhautentzündung,
Dermatitis und andere Krankheiten tiefer Organe. Ihre herausragende
Rolle bei der Gewebeumgestaltung und Angiogenese deuten auf potentiell
heilsame physiologische Prozesse hin. Es gibt wenigstens drei proteolytisch aktive
Isoformen der Tryptase in Mastzellen, βI-Tryptase, βII-Tryptase und βIII-Tryptase. Diese Tryptaseisoformen
werden als katalytisch aktive Tetramere (~135 kD) sekretiert, die
gegen die Inaktivierung durch Plasmainhibitoren resistent sind.
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Das β-Tryptase-Enzym
wurde kürzlich
kristallisiert und die Struktur deutet darauf hin, dass die Assoziierung
der Tryptaseuntereinheiten zu dem nativen Tetramer einen stereospezifischen
Zugang für
potentielle Substrate zu dem aktiven Zentrum jeder Untereinheit
ergibt. Obwohl in verschiedenen In vitro Studien zahlreiche Substrate
für Tryptase
einschließlich
Neuropeptiden, Fibrinogen, Stromelysin, Pro-Urokinase, Prothrombin
und Protease aktivierter Rezeptor-2 identifiziert wurden, konnte
das physiologisch relevante In vivo Target der Serinproteaseaktivität von β-Tryptase
nicht entdeckt werden.
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Das
menschliche Chromosom 16 kodiert wenigstens vier homologe, dennoch
verschiedene Tryptasegene, die als α-, βI-, βII- und βIII-Tryptase bezeichnet werden
(Pallaoro, M., et al.). Im vorliegenden Text wird der unmodifizierte
Ausdruck „Tryptase" zur Bezeichnung
von allen Tryptaseisoformen verwendet. Zwei Isoformen von β-Tryptase
zeigen eine Sequenzidentität
von mehr als 99%, βI-
und βII-Tryptase
unterscheiden sich nur durch eine einzige N-Glycosylierungsstelle. Es ist nicht
klar, warum so viele sehr ähnliche
Tryptasen durch Mastzellen exprimiert werden. Eine Möglichkeit
ist, dass jede unterschiedliche proteolytische Funktionen ausübt, die
sich in der Präferenz
der Substratspezifität
widerspiegeln. In der Tat wurde vor kurzem gezeigt, dass die Substitution
einer einzigen Aminosäure
in Tryptase α und
Tryptase βII
zu einem Unterschied der Substratpräferenz der beiden Enzyme führt (Huang,
C., et al.).
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Es
ist schwierig, β-Tryptase
und deren physiologische Rolle zu untersuchen, da es keine geeigneten Tiermodelle
für menschliche
Allergien gibt. Weiter weisen die menschlichen β-Tryptasen nur eine geringe
oder keine Homologie mit den Tryptasen auf, die in anderen Tieren
als Primaten gefunden werden. Zudem ist die Isolierung natürlicher β-Tryptase
aus menschlichen Leichen ein mühsames
und biologisch riskantes Unterfangen. Erst kürzlich konnte rekombinante
enzymatisch aktive Tryptase durch die Arbeit der Anmelder der vorliegenden Anmeldung,
Promega Corporation of Madison, Wisconsin, USA bereit gestellt werden
(siehe US-Patent 6,274,366).
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Während der
letzten Dekade haben Kliniker den Wert der Messung von freigesetzter
Tryptase für
atopische Diagnosen sowie zur Beobachtung des Verlaufs von Mastzellen-vermittelten
Krankheiten schätzen
gelernt und darüber
berichtet („Atopisch" ist ein allgemeiner
Begriff zur Bezeichnung von krankhaften Zuständen, die durch Symptome gekennzeichnet
sind, die durch den Einfluss von erregenden Antigenen hervorgerufen werden,
oder durch Zustände
wie Asthma oder andere allergische Reaktionen). β-Tryptase kann im Serum von nicht-atopischen „normalen" Individuen nachgewiesen
werden, wobei der allgemeine Serumgehalt üblicherweise weniger als 1000
Picogramm β-Tryptase
pro Milliliter Serum beträgt.
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Im
Gegensatz dazu sind die Tryptasegehalte im Serum von atopischen
Personen beträchtlich
erhöht. Zu
häufig
jedoch zeigen immunologische Nachweisverfahren (das heißt, ELISA,
RIA, PCFIA, und ähnliche Nachweise
auf Tryptase) eine nur geringe Empfindlichkeit oder Verfügbarkeit
auf (zum Beispiel die ELISA-Methode nach Schwartz) und erfordern
teuere zusätzliche
Nachweisausstattung. Außer
bei erhöhten
Mastzellengehalt oder Degranulation wie sie während der Mastozytose oder
Anaphylaxie auftreten, ist die Aufstellung nichtatopischer Basislinien
oder Basislinien bei Remission schwierig.
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Herkömmliche
Verfahren zum Nachweis der proteolytischen Aktivität von Tryptase
werden durch die geringe Spezifität beeinträchtigt. Für diese Verfahren werden Substrate
eingesetzt, die lediglich für
die Messung von „Trypsin ähnlicher" Aktivität gedacht
sind, insbesondere in gereinigten Tryptasepräparationen. Beispielsweise
werden Benzoyl-Arg-Paranitroanilin (Trypsin), Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa
(Thrombin), Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNa (Plasmin) und Tosysl-Arg-Methyl-Ester
bei Kontakt mit Tryptase gespalten, jedoch werden sie ebenfalls
durch andere Serinproteasen gespalten. Da Tryptase und verwandte,
aus dem Blut stammende Serinproteasen diese Substrate spalten können, sind
sie von geringem Wert für
die Bestimmung des Aktivitätsgrads
von Tryptase in komplexen biologischen Proben.
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US 4,390,528 beschreibt
ein Polypeptid mit der Sequenz T-K-P-R-T-K-P-R. Diese Verbindung,
deren pharmakologisch akzeptablen Salze und Derivate und einige
ihrer optischen Isomere sind für
die Stimulierung oder Inhibierung der Phagozytose oder Pinozytose
bei Säugetieren
nützlich.
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Barbier
et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110, 6880–2 beschreiben ein Polypeptid
(R-T-K-P) und befassen sich mit der Beschleunigung der Hydrolyse
von RNA durch basische Polypeptide.
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In
US 4,409,141 wird ein Peptid
beschrieben, das die Sequenz P-R-K-K enthält, wobei das Peptid für den Nachweis
von humanen Parathyroidhormon geeignet ist.
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In
DE 2945239 wird das Peptid
PKPR beschrieben. Das Peptid ist als Inhibitor der T-Zellproliferation geeignet.
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In
WO 9411014 wird das Peptid PRGK beschrieben. Das Peptid ist als
entzündungshemmendes
Mittel geeignet.
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Briggs,
S. et al. (1991) Immunology, 73, 505–507 beschreiben Tetrapeptide
mit der allgemeinen Formel PXTR, wobei X K oder R sein kann, das
heißt
die Peptide haben die Sequenz PKTR und PRTR. Diese Peptide sind
als Epitope für
menschliches Epithelmuzin geeignet.
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Eine
erste Ausführungsform
der Erfindung betrifft ein isoliertes Polypeptid mit der Sequenz,
gesehen vom aminoterminalen Ende zum carboxyterminalen Ende, P4-P3-P2-P1,
wobei P4 Prolin („P"), P3 Arginin („R") oder Lysin („K") ist, P2 eine beliebige
Aminosäure
und P1 K oder R (SEQ. ID. NO: 1) ist oder wobei P4-P3-P2-P1 P-A-N-K ist,
mit der Maßgabe,
dass das Tetrapeptid nicht P-K-P-R, P-R- G-K, P-K-T-R oder P-R-T-R ist. Für die Abkürzungen
der Aminosäuren
wird auf die nachstehend angeführte
Tabelle 1 verwiesen. Diese isolierten Polypeptide wirken als sehr
spezifische Substrate, die mittels Tryptasen gespalten werden können.
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Eine
zweite Ausführungsform
der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Aktivität einer
enzymatisch aktiven β-Tryptase
in einer Probe. Das Verfahren umfasst als erstes das in Kontaktbringen
der Probe mit einem isolierten Polypeptid mit der Sequenz, gesehen
vom aminoterminalen Ende zum carboxyterminalen Ende, P4-P3-P2-P1,
wobei P4 P, P3 R oder K, P2 eine beliebige Aminosäure und
P1 K oder R (SEQ. ID. NO: 1) ist.
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Das
isolierte Peptid umfasst auch eine nachweisbare Abgangsgruppe, die
an P4-P3-P2-P1 gebunden ist
und aminoterminal geschützt
ist. Die Probe wird mit dem isolierten Polypeptid unter Bedingungen
in Kontakt gebracht, bei denen ein Teil der nachweisbaren Abgangsgruppe
aufgrund der Einwirkung von β-Tryptase,
die in der Probe vorliegt, abgespalten wird. Die Menge an nachweisbarer
Abgangsgruppe, die von dem Polypeptid abgespalten worden ist, wird
dann quantifiziert, um einen Indikator für das Ausmaß der Tryptaseaktivität in der Probe
zu erhalten.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens wird die Probe mit einem isolierten Polypeptid in
Kontakt gebracht, das vom aminoterminalen Ende zum carboxyterminalen
Ende gesehen P4-P3-P2-P1 enthält,
wobei P4 acetyliert ist, und wobei P4-P3-P2-P1 ausgewählt ist
unter einer Gruppe bestehend aus P-R-N-K (SEQ. ID. NO: 2), P-K-N-K (SEQ.
ID. NO: 3), P-R-N-R (SEQ. ID. NO: 4), P-K-N-R (SEQ. ID. NO: 5),
P-A-N-K (SEQ. ID. NO: 6) und P-R-T-K (SEQ. ID. NO: 7) (wobei Asparagin „N" und Threonin „T" ist), und wobei
zudem eine fluorogene Abgangsgruppe, die 7-Amino-4-carbamoylmethylcumarin
enthält, über eine
Amidbindung an das carboxyterminale Ende von P4-P3-P2-P1 gebunden
ist. In diesem Fall wird, falls die Probe Tryptaseaktivität aufweist,
aufgrund der Aktivität
ein nachweisbarer fluoreszierender Teil erhalten. Die Fluoreszenz
der Probe wird dann gemessen, um festzustellen, ob eine nachweisbare Änderung
der Fluoreszenz eintritt, wobei die nachweisbare Änderung
ein Indikator für
die Aktivität
der enzymatisch aktiven β-Tryptase
in der Probe ist. Die Probe kann eine beliebige Probe sein, von
der angenommen wird, dass sie Tryptaseaktivität aufweist, einschließlich Vollblut,
Serum, Plasma, Urin, Tränenflüssigkeit,
Lavage, Gewebeextrakt, ein konditioniertes Medium, etc.
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Eine
dritte Ausführungsform
der Erfindung betrifft ein Kit für
die Analyse von Proben auf β-Tryptaseaktivität. Das Kit
enthält
ein isoliertes Polypeptid mit der Sequenz, von dem aminoterminalen
Ende zu dem carboxyterminalen Ende gesehen, P4-P3-P2-P1, wobei P4
P, P3 R oder K, P2 eine beliebige Aminosäure und P1 K oder R (SEQ. ID.
NO: 1) ist, und wobei eine nachweisbare Abgangsgruppe kovalent an
P4-P3-P2-P1 gebunden ist, wobei das isolierte Polypeptid in einem
geeigneten Behälter
enthalten ist. Das Kit kann auch P4-P3-P2-P1 enthalten, das einen auf Serinprotease
reaktiven Teil hat.
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Das
Kit kann gegebenenfalls einen Vorrat an rekombinanter Tryptase enthalten,
der zur Erzeugung einer Standardkurve verwendet werden kann, sowie
einen Vorrat an Aprotinin oder einem funktionalen Äquivalent
davon. Es ist insbesondere bevorzugt, dass jedes Kit Anweisungen
für den
Gebrauch des Kits enthält.
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Wie
vorstehend angegeben, exprimieren Mastzellen wenigstens 4 verschiedene
Tryptasegene: α, βI, βII und βIII. Zurzeit
ist nicht bekannt, ob diese Proteasen die gleiche oder verschiedene
Funktionen ausüben. Nach
den hier aufgeführten
Daten haben βI-
und βII-Tryptasen
sehr ähnliche
P4 bis P1 Substratpräferenzen. Diese
gemeinsame Präferenz
für Peptidsubstrate
erstreckt sich wahrscheinlich auf eine gemeinsame Präferenz für physiologische
Substrate. Tatsächlich
findet sich die optimale Sequenz für β-Tryptase P4 = P, P3 = R oder
K, P2 = beliebige Aminosäure
und P1 = K oder R in vielen der makromolekularen Substrate, für die wenigstens
in vitro gezeigt wurde, dass sie durch Tryptase gespalten werden,
die vorzugsweise nach R oder K spaltet.
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Beispielsweise
kann die Aktivierung der Plasminogenkaskade, die die Zerstörung der
extrazellulären Matrix
bei zellulärer
Extravasation und Migration bewirkt, eine Wirkung der Tryptaseaktivierung
des Pro-Urokinase Plasminogenaktivators an der P4-P1-Sequenz von
Pro-Arg-Phe-Lys (SEQ. ID. NO: 8) (Stack, M., und Johnson, D.) sein.
Vasoaktives intestinales Peptid, ein Neuropeptid, das an der Regulierung
der vaskulären Permeabilität beteiligt
ist, wird durch Tryptase hauptsächlich
nach den Argininen in der Sequenz Thr-Arg-Leu-Arg (SEQ. ID. NO:
9) (Stack, M. und Johnson, D.) gespalten. Der G-Protein gekoppelte
Rezeptor, PAR-2, kann durch Tryptase an Ser-Lys-Gly-Arg (SEQ. ID.
NO: 10) gespalten und aktiviert werden, wohingegen der Thrombin
aktivierte Rezeptor, PAR-1, durch Tryptase nach der Stelle Pro-Asn-Asp-Lys
(SEQ. ID. NO: 11) (Jameson, G., et al.) inaktiviert wird.
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Im
Rahmen der Arbeit, die zu dieser Erfindung führte, wurde enzymatisch aktive βI und β-II-Tryptase heterolog
in Hefe exprimiert und gereinigt, um die Substratspezifität von jedem
Enzym zu bestimmen. Verschiedene positional scanning kombinatorische
Tetrapeptidsubstratbibliotheken wurden eingesetzt, um die primäre und erweiterte
Substratspezifität
zu analysieren. Beide Enzyme haben eine strikte primäre Präferenz für die Spaltung
nach den basischen Aminosäuren
Lysin und Arginin mit einer nur geringfügig höheren Bevorzugung von Lysin
gegenüber
Arginin. βI-
und βII-Tryptasen
zeigen ähnliche
erweiterte Substratspezifitäten
mit einer Bevorzugung der Spaltung nach P4-Prolin, P3-Arginin oder Lysin,
wobei P2 eine gewisse Asparagin- und Threonin-Selektivität aufweist
(N-Präferenz, 3A).
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Es
wird hier gezeigt, dass βI-
und βII-Tryptasen
eine definierte primäre
Substratspezifität
(das heißt der
Rest an der P1-Position) und eine definierte erweiterte Substratspezifität (das heißt die Reste
an den P4-P2-Positionen) aufweisen.
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Die
Biblioteksprofile, die im Zuge der Entwicklung der Erfindung erzeugt
worden sind, und die hier beschrieben und beansprucht werden, weisen
darauf hin, dass die Substratspezifität der zwei Enzyme ähnlich ist.
Weiter wurden einzelne Substrate entwickelt und untersucht, um die
Voraussetzungen der erweiterten Substratspezifität zu untersuchen, wobei empfindliche
und selektive Substrate für β-Tryptasen
erhalten wurden. Strukturelle Determinanten der Spezifität wurden
untersucht, indem in das aktive Zentrum der Tryptasestruktur ein
optimiertes Substrat modeliert wurde. Schließlich korelliert die Spezifität, die in
dieser Studie festgestellt wurde, mit den Schnittstellen, die in
vielen der charakterisierten physiologischen Substrate gefunden
wurden, und kann zur Identifzierung von weiteren Substraten sowohl
für die
Immunität
und Pathologie von βI-
und βII-Tryptasen
führen.
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Die
hier beschriebene Erfindung unterstreicht den Nutzen des Einsatzes
von generalisierten positional scanning kombinatorischen Peptidbibliotheken
zur Charakterisierung von funktionalen Ähnlichkeiten und Unterschieden
zwischen den homologen Enzymen, zur Erzeugung von empfindlichen
und selektiven Tryptase-Substraten und Inhibitoren und zur Bestimmung
eines Subsets von potentiellen physiologischen Tryptasesubstraten.
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Die
Zielsetzungen und Vorteile der Erfindung werden anhand der nachfolgenden
ausführlichen
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zusammen
mit den Figuren vollständig
ersichtlich.
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Beschreibung
der Figuren
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1 ist
eine Darstellung der Standardnomenklatur für Substrataminosäurepräferenzen
in Bezug auf die zu spaltende Bindung der Schnittstelle nach Schechter,
I. und Berger, A. (1967) „On
the size of the active site in proteases." Biochem. Biophys. Res. Com. 27, 157–162.
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2 zeigt
ein Aktivitätsprofil
von Tryptase für
eine ACC-P1-diverse-Bibliothek. Für das P1-Profil wurden rekombinante
menschliche β-I
Tryptasen verwendet und es zeigt eine starke Präferenz für P1 = R oder K.
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3A und 3B zeigen
Aktivitätsprofile
von rekombinanter menschlicher β-I
Tryptase („Hauttryptase") für eine Arg-
oder Lys-fixierte P1 ACC-PS-SCL. Mit diesen beiden Diagrammsets
wird die Fähigkeit
von Tryptase, ein synthetisches Tetramer zu spalten, wobei der P1-Rest
entweder Lysin (3A) oder Arginin (3B)
ist, verglichen
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4A und 4B zeigen
Aktivitätsprofile
von rekombinanter menschlicher β-II
Tryptase („Lungentryptase") für eine Arginin-
oder Lysin-fixierte P1 ACC-PS-SCL.
Mit diesen beiden Diagrammsets wird die Fähigkeit von Tryptase zur Spaltung
eines synthetischen Tetramers, wobei der P1-Rest entweder Lysin
(4A) oder Arginin (4B) ist,
verglichen.
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5 ist
ein Diagramm, das zeigt, dass Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) ein
spezifisches Substrat für
Tryptase in Vergleich zu anderen, aus dem Blut stammenden Serinproteasen
ist.
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6 und 7 sind
Diagramme von typischen Aktivitätsbasierten
Standardkurven, die unter Verwendung von Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. Nr:
12) in Pufferlösungen,
die rekombinante Tryptase enthalten, erhalten wurden. Die Kurven
wurden über
2 Logarithmus Tryptaseproteinkonzentrationsbereich erzeugt.
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8 ist
ein Diagramm, das zeigt, dass lineare Tryptasestandardkurven für mit Tryptase
geimpftes menschliches Serum mit Ac-PRNK-ACC erhalten werden können. Die
intrinsische Fluoreszenz ist über
die Standardkurve konsistent.
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9 ist
ein Diagramm, das zeigt, dass die intrinsische Fluoreszenz aufgrund
der nicht durch Tryptase bewirkten Proteolyse signifikant und spezifisch
im Serum mit dem Serinproteaseinhibitor Aprotinin unterdrückt werden
kann.
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10 ist
ein Diagramm, das zeigt, dass lineare Tryptasestandardkurven in
Serum und Puffer in Gegenwart von exogen zugesetzten Aprotinin erhalten
werden könne.
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11 ist
ein Diagramm, das zeigt, dass lineare Tryptasestandardkurven in
Urin ohne signifikante nicht durch Tryptase vermittelte Proteolyse
erhalten werden können.
Die praktische Nachweisgrenze liegt annähernd bei 300 pg/ml an aktiver
Tryptase.
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12 und 13 sind
Diagramme, die veranschaulichen, dass durch Ersatz des fluorophoren 7-Amino-4-Carbamoylmethylcumarin
(ACC) in Ac-PRNK (SEQ. ID. NO: 13) durch Chlormethylketon (CMK)
ein Inhibitor sowohl für
rekombinante menschliche Haut-(βI)
Tryptase (12) als auch für rekombinante
menschliche Lungen-(βII)
Tryptase (13) erhalten wird.
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14 ist
ein Diagramm, das zeigt, dass der Inhibitor Ac-PRNK-CMK (SEQ. ID.
NO: 14) weitestgehend unwirksam für Faktor Xa ist, eine von Tryptase
verschiedene, aus dem Blut stammende Protease, deren Spezifität für eine bestimmte
Peptidsequenz PRNK (SEQ. ID. NO: 2) nicht erfüllt.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Abkürzungen und Definitionen:
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Für ein klares
und einheitliches Verständnis
der Beschreibung und der Ansprüche
werden hier die folgenden Definitionen verwendet. Ausdrücke, die
nicht ausdrücklich
beschrieben werden, haben ihre Standardbedeutung wie sie Fachleute
verstehen.
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ACC – bedeutet
7-Amino-4-carbamoylmethylcumarin.
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Amiono-Säuren-Abkürzungen
für die
Aminosäuren
sind in Tabelle 1 gezeigt:
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Enzymatisch
aktive Tryptase – bezogen
auf die Expression von heterologen Proteinen in einer gentechnisch
veränderten
Wirtszelle ist ein Protein enzymatisch aktiv, wenn im Anschluss
an die Expression oder im Anschluss an die Isolierung keine chemische
Behandlung wie künstliche
Abspaltung eines Signalpeptids für
die Sekretion oder künstliche
Glykosylierung erforderlich ist, damit das exprimierte/isolierte
Protein die gewünschte
Aktivität
aufweist. Proteolytische Tryptase muss korrekt in der tetrameren
Form ausgebildet sein, damit sie enzymatisch aktiv ist.
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Fmoc – bezieht
sich auf 9-Fluorenylmethoxycarbonyl.
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Gentechnik – Viele
der Schritte, die nachstehend für
die Manipulierung von DNA beschrieben sind, einschließlich Verdauung
mit Restriktionsendonukleasen, Amplifizierung mittels PCR, Hybridisierung,
Verknüpfung,
Auftrennung und Isolierung mittels Gelelektrophorese, Transformierung
von Zellen mit heterologer DNA, Auswahl erfolgreicher Transformanten
und so weiter sind allgemein bekannt und werden in weitem Umfang von
Fachleuten eingesetzt und werden hier nicht im Einzelnen dargelegt.
Sofern nicht anders angegeben, werden hier die von Sambrook, Fritsch
und Manjatis (1989) beschrieben DNA Protokolle verwendet.
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Tryptase-Substrate
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Anhand
multipler positional scanning synthetischer kombinatorischer Tetrapeptidbibliotheken (PS-SCL
positional scanning synthetic combinatorial tetrapeptide libraries)
wird die Substratspezifität
von heterolog exprimierten menschlichen βI- und βII-Tryptasen bestimmt. In 1 ist
die Standardnomenklatur für Substrataminosäurepräferenzen
in Bezug auf die Schnittstelle mit zu spaltender Bindung gezeigt.
Die Aminosäuren
am Aminoende des Substrats, werden Pn, Pn – 1, ... P2, P1 bezeichnet.
Die Aminosäuren
am Carboxylende des Substrats werden P1', P2',
..., Pm – 1' bezeichnet. Folglich
sind Substrate, die in einem P4-P3-P2-P1-Format geschrieben sind,
vom Aminoende zum Carboxylende dargestellt. Die Hydrolyse der Amidbindung
erfolgt zwischen P1 und P1'.
Die entsprechenden Enzymbindungsstellen werden Sn, Sn – 1, ..., S2,
S1, S1', S2', ..., Sm – 1', Sm' bezeichnet.
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Eine
positional scanning synthetische kombinatorische Substratbibliothek
(PS-SCL) wurde zur
Identifizierung der erweiterten Substratspezifität von menschlichen rekombinanten βI- und βII-Tryptasen
an den P1-P4-Positionen relativ zur Schnittstelle mit zu spaltender
Bindung verwendet. Die Informationen aus diesen Bibliotheken wurden
dann benutzt, um bevorzugte optimierte fluorogene Substrate herzustellen,
wobei Acetyl-Prolyl-Arginyl-Asparaginyl-Lysyl-Aminoacetamidcumarin (Ac-PRNK-AAC) (SEQ.
ID. NO: 12) am meisten bevorzugt wurde. Wie hier beschrieben, kann
dieses optimierte Substrat dazu verwendet werden, auch noch kleinste
Konzentrationen an aktiver Tryptase in komplexen biologischen Fluiden
nachzuweisen. Dieses Substrat kann auch als Aktivitätsreporter
in Screening-Anwendungen mit hohem Durchsatz eingesetzt werden.
Die aus den PS-SCL erhaltenen Informationen wurden auch zur Herstellung
eines bevorzugten, für
das aktive Zentrum spezifischen Inhibitors, Acetyl-Prolyl-Arginyl-Asparaginyl-Lysyl-Chlormethylketon
(AC-PRNK-CMK) (SEQ. ID. NO: 14) verwendet.
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Materialien:
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DNA
modifizierende Enzyme wurden von Promega Corporation (Madison, Wisconsin)
bezogen. Heparin und andere Biochemikalien wurden von Sigma (St.
Louis, Missouri) bezogen.
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positional scanning synthetische
kombinatorische Bibliotheken:
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ACC-Harz-Synthese:
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7-Fmoc-Aminocumarin-4-essigsäure wurde
durch Behandlung von 7-Aminocumarin-4-Essigsäure (Kanaoka,
Y., et al., Besson, T., et al.) mit Fmoc-Cl hergestellt. 7-Aminocumarin-4-essigsäure (10,0
g, 45,6 mmol) und H2O (228 ml) wurden vermischt.
NaHCO3 (3,92 g, 45,6 mmol) wurde in kleinen
Portionen zugegeben und anschließend wurde Aceton (228 ml)
zugesetzt. Die Lösung
wurde in einem Eisbad gekühlt
und Fmoc-Cl (10,7 g, 41,5 mmol) wurde unter Rühren im Verlauf einer Stunde
zugegeben. Das Eisbad wurde entfernt und die Lösung über Nacht gerührt.
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Aceton
wurde mit dem Rotationsverdampfer entfernt und der erhaltene gummiartige
Feststoff durch Filtrieren gesammelt und mit mehreren Portionen
Hexan gewaschen. Das Material wurde über P2O5 getrocknet, wobei 14,6 g (80%) cremfarbiger
Feststoff erhalten wurde. 1H NMR (400 MHz):
3,86 (s, 2), 4,33 (t, I, J = 6,2), 4,55 (d, 2, J = 6,2), 6,34 (s,
1), 7,33–7,44
(m, 5), 7,56 (s, 1), 7,61 (d, 1, J = 8,6), 7,76 (d, 2, J = 7,3),
7,91 (d, 2, J = 7,4), 10,23 (s, 1), 12,84 (s, 1). 13C
NMR (101 MHz): 37,9, 47,4, 66,8, 67,2, 105,5, 114,6, 115,3, 121,1, 125,9,
126,9, 128,0, 128,6, 141,6, 143,6, 144,5, 150,7, 154,1, 154,8, 160,8,
171,4.
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ACC-Harz
wurde durch Kondensation von Rink Amid-AM-Harz mit 7-Fmoc-aminocumarin-4-essigsäure erhalten.
Rink Amid-AM-Harz (21 g, 17 mmol) wurde in DMF (200 ml) solvatisiert.
Die Mischung wurde 30 min gerührt
und mit einer Filterkanüle
filtriert, worauf 20% Piperidin in DMF (200 ml) zugesetzt wurden.
Nach 25 min Rühren
wurde das Harz filtriert und mit DMF (3 mal, jeweils 200 ml) gewaschen.
7-Fmoc-aminocumarin-4-essigsäure
(15 g, 34 mmol), HOBt (4,6 g, 34 mmol) und DMF (150 ml) wurden zugesetzt
und anschließend
DICI (5,3 ml, 34 mmol). Die Mischung wurde über Nacht gerührt, filtriert,
gewaschen (DMF, 3 mal mit 200 ml; Tetrahydrofuran, 3 mal mit 200
ml; MeOH, 3 mal mit 200 ml), und über P2O5 getrocknet. Der Substitutionsgrad des Harzes
war 0,58 mmol/g (> 95%)
bestimmt mittels Fmoc-Analyse (Harris et al., (2000)).
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Synthese von P1-substituiertem
ACC-Harz:
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Fmoc-ACC-Harz
(100 mg, 0,058 mmol) wurde 20 Reaktionsgefäßen eines Argonaut Quest 210
Organic Synthesizers zugesetzt und in DMF (2 ml) solvatisiert. Das
Harz wurde filtriert und 20% Piperidin in DMF (2 ml) wurde jedem
Gefäß zugesetzt.
Nach 25 minütigem
Rühren
wurde das Harz filtriert und mit DMF gewaschen (3 mal mit 2 ml).
Fmoc-Aminosäure
(0,29 mmol), DMF (0,7 ml), Collidin (76 μl, 0,58 mmol) und HATU (110
mg, 0,29 mmol) wurden dem vorgesehenen Reaktionsgefäß zugesetzt
und anschließend
20 Stunden gerührt.
Die Harze wurden dann filtriert, mit DMF gewaschen (3 mal mit 2
ml) und ein zweites Mal den Kopplungsbedingungen ausgesetzt. Eine
Lösung
aus AcOH (40 μl,
0,70 mmol), DICI (110 μl,
0,70 mmol) und Nitrotriazol (80 mg, 0,70 mmol) in DMF (0,7 ml) wurden
jedem Reaktionsgefäß zugesetzt
und anschließend
24 Stunden gerührt.
Die Harze wurden filtriert, gewaschen (DMF, 3 mal mit 2 ml; Tetrahydrofuran,
3 mal mit 2 ml; MeOH, 3 mal mit 2 ml) und über P2O5 getrocknet. Der Substitutionsgrad von jedem
Harz wurde mittels Fmoc-Analyse bestimmt (Bunin (1998)).
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Synthese einer P1-Diverse-Bibliothek:
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Einzelne
P1-substituierte Fmoc-Aminosäure-ACC-Harze
(25 mg, 0,013 mmol) wurden den Mulden einer MultiChem 96-Well Reaktionsvorrichtung
zugesetzt. Den Harz enthaltenden Mulden wurden DMF zugesetzt (0,5
ml). Nach Filtrierung wurde eine 20% Piperidin-Lösung in DMF (0,5 ml) zugesetzt
und anschließend 30
Minuten gerührt.
Die Mulden des Reaktionsblocks wurden filtriert und mit DMF gewaschen
(3 mal mit 0,5 ml). Zur Einführung
der randomisierten P2-Position
wurde eine isokinetische Mischung (Ostresh et al.) von Fmoc-Aminosäuren (4,8
mmol, 10 Äquivalente
pro Mulde; Fmoc-Aminosäure,
mol%: Fmoc-Ala-OH, 3,4; Fmoc-Arg(Pbf)-OH, 6,5; Fmoc-Asn(Trt)-OH,
5,3; Fmoc-Asp(O-t-Bu)-OH, 3,5; Fmoc-Glu(O-t-Bu)-OH, 3,6; Fmoc-Gln(Trt)-OH,
5,3; Fmoc-Gly-OH,
2,9; Fmoc-His(Trt)-OH; 3,5; Fmoc-Ile-OH, 17,4; Fmoc-Leu-OH, 4,9; Fmoc-Lys(Boc)-OH,
6,2; Fmoc-Nle-Oh, 3,8; Fmoc-Phe-OH, 2,5; Fmoc-Pro-OH, 4,3; Fmoc-Ser(O-t-Bu)-OH, 2,8;
Fmoc-Thr(O-t-Bu)-OH, 4,8; Fmoc-Trp(Boc)-OH, 3,8; Fmoc-Tyr(O-t-Bu)-OH,
4,1; Fmoc-Val-OH, 11,3) mit DICI (390 μl, 2,5 mmol) und HOBt (340 mg,
2,5 mmol) in DMF (10 ml) voraktiviert. Die Lösung (0,5 ml) wurde jeder Mulde
zugesetzt. Der Reaktionsblock wurde 3 Stunden gerührt, filtriert
und mit DMF gewaschen (3 mal mit 0,5 ml). Die randomisierten P3-
und P4-Positionen wurden auf die selbe Weise eingeführt. Fmoc
der P4 Aminosäure
wurde entfernt und das Harz mit DMT (3 mal mit 05, ml) gewaschen
und mit 0,5 ml Capping-Lösung
aus AcOH (150 μl,
2,5 mmol), HOBt (340 mg, 2,5 mmol) und DICI (390 μl, 2,5 mmol)
in DMF (10 ml) behandelt.
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Nach
4 Stunden Rühren
wurde das Harz mit DMF (3 mal mit 0,5 ml) und CH2Cl2 (3 mal mit 0,5 ml) gewaschen und mit einer
Lösung
aus 95:2,5:2,5 TFA/TIS/H2O behandelt. Nach
einer Inkubation von einer Stunde wurde der Reaktionsblock geöffnet und
auf eine 96-deep well Titerplatte gegeben und die Mulden wurden
mit zusätzlicher
Spaltungslösung
(2 mal mit 0,5 ml) gewaschen. Die Kollektionsplatte wurde konzentriert und
das Material in den Substrat enthaltenden Mulden mit Ethanol (0,5
ml) verdünnt
und zweifach konzentriert. Der Inhalt der einzelnen Mulden wurde
aus CH3CN/H2O-Mischungen
lyophilisiert. Die Gesamtmenge an Substrat in jeder Mulde wurde
auf Basis einzelner Substratergebnisse konservativ auf 0,0063 mmol
(50%) geschätzt.
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Synthese von P1-fixierten
Bibliotheken:
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Multigrammmengen
an P1-substituiertem ACC-Harz können
nach den beschriebenen Verfahren synthetisiert werden. Es wurden
3 Bibliotheken hergestellt, bei denen die P1-Position definiert
Lys, Arg, oder Leu war. Fmoc-Aminosäure substituiertes
ACC-Harz (25 mg, 0,013 mmol Lys, Arg oder Leu) wurde in 57 Mulden eines
96-Mulden-Reaktionsblocks gegeben: 3 Subbibliotheken gekennzeichnet
durch die zweite definierte Position (P4, P3, P2) von 19 Aminosäuren (ohne
Cystein und Ersatz von Methionin durch Norleucin).
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Synthese,
Capping und Spaltung der Substrate waren identisch zu dem vorstehend
beschriebenen Abschnitt mit der Ausnahme, dass für die P2, P3 und P4-Subbibliotheken
einzelne Aminosäuren
(5 Äquivalente
an Fmoc-Aminosäuremonomer,
5 Äquivalente
DICI und 5 Äquivalente
HOBt in DMF) anstelle der isokinetischen Mischungen in die räumlich adressierten
P2-, P3- oder P4-Positionen
inkorporiert wurden.
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Synthese einzelner Substrate:
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Substrate
in den positional scanning synthetischen kombinatorischen Bibliotheken,
Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12), Ac-PANK-ACC (SEQ. ID. NO: 15), Ac-PRTK-ACC
(SEQ. ID. NO: 16) und Ac-PRNR-ACC (SEQ. ID. NO: 17) wurden wie kürzlich beschrieben
hergestellt. Siehe hierzu Harris, J. et al. (2000). Die Einzelheiten
der Synthese folgen im Anschluss.
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Einzelne
Substrate für
die kinetische Analyse wurden nach den vorstehend beschriebenen
Methoden hergestellt. Die ungereinigten Produkte wurde einer präparatorischen
Reversphasen-HPLC und anschließend einer
Lyophilisierung unterzogen.
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Fluoreszenzeigenschaften
von ACC:
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Die
Fluoreszenz von freien ACC und Peptidyl-derivatisierten ACC wurde
mit einem Spex Fluorimeter bestimmt, das auf 25°C thermostatisiert war. Es wurden
Anregungswellenlängen
von 300 bis 410 nm, 5-nm Intervalle, mit Emissionswellenlängen von
410 bis 500 nm, 5-nm Intervalle, verwendet, um die optimalen Anregungs-
und Emissionsparameter zu bestimmen.
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Enzymatischer Assay der
Bibliothek:
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Der
enzymatische Assay der Bibliothek wurde wie bei Harris et al. (2000)
beschrieben, durchgeführt. Die
Konzentration der proteolytischen Enzyme wurde durch Messung der
Absorbtion bei 280 nm bestimmt (Gill, S C. & von Hippel, P. H.). Die Anteile
an katalytisch aktiven Thrombin, Plasmin, Trypsin, uPA, tPA und Chymotrypsin
wurden durch Titration des aktiven Zentrums mit 4- Methylumbelliferyl-p-guanidinbenzoat (MUGB)
oder Methylumbelliferyl-p-trimethylammoniocinnamatchlorid
(MUTMAC) (Jameson, G. W. et al.) quantifiziert.
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Die
Substrate aus den positional scanning synthetischen kombinatorischen
Bibliotheken (PS-SCLs) wurden in DMSO gelöst. Annähernd jeweils 1,0 × 10–9 mol
einer P1-Lys, P1-Arg, oder P1-Leu-Subbibliothek (361 Verbindungen)
wurden 57 Mulden einer 96 well Mikrofluorplatte (Dynex Technologies,
Chantilly, Virginia) mit einer Endkonzentration von 0,1 μm zugesetzt.
Annähernd
jeweils 1,0 × 10–10 mol
einer P1-diverse-Subbibliothek (6.859 Verbindungen) wurden 20 Mulden
einer 96 well Platte mit einer Endkonzentration von 0,01 μM für jede Verbindung
zugesetzt.
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Die
Hydrolysereaktionen wurden durch Zugabe von Enzym (0,02–100 nM)
gestartet und fluorometrisch mit einem Lumineszenzspektrometer LS50B
von Perkin-Elmer mit Anregung bei 380 nm und Emission bei 450 nm
oder 460 nm beobachtet. Bestimmungen der Serinproteasen wurden bei
25°C in
einem Puffer durchgeführt,
der 50 mM Tris mit pH 8,0, 100 mM NaCl, 0–5 mM CaCl2,
0,01% Tween-20 und 1% DMSO (aus den Substraten) enthielt. Die Bestimmung
der Cysteinproteasen, Papain und Cruzain, wurden bei 25°C in einem
Puffer durchgeführt,
der 100 mM Natriumacetat mit pH 5,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM
EDTA, 0,01% Brij-35 und 1% DMSO (aus den Substraten) enthielt.
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Kinetische Assays der
einzelnen Substrate:
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βI- und βII-Tryptasekonzentrationen
lagen in einem Bereich von 5 nM bis 15 nM. Die Endkonzentration an
Substrat lag in einem Bereich von 5 μM bis 200 μM; die Konzentration an DMSO
in dem Assay war weniger als 5%. Die Hydrolyse der ACC-Substrate
wurde fluorometrisch mit einer Anregungswellenlänge von 380 nm und einer Emissionswellenlänge von
460 nm mit einem Fluoromax-2-Spektrofluorimeter
beobachtet.
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Konstruktion des βII-Tryptasegens:
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pPIC9-Hu
Try (menschliches βI-Tryptaseplasmid)
wurde wie bei Niles et al., Biotechnology and Applied Biochemistry,
28(Pt. 2) 125–31
(1998) erzeugt.
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Expression und Reinigung:
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Rekombinante
menschliche βI-
und βII-Tryptasen
wurden exprimiert und gereinigt wie kürzlich beschrieben (Niles,
A. et al., US. Pat. Anmeldung S. N. 09/598,982, eingereicht am 21.
Juni 2000 und U.S. Pat. Anmeldung S. N. 09/079,970, eingereicht
am 15. April 1998). Kurz gesagt wurde pPIC9-Hu Try/N113K mittels Sac-I-Verdauung
linearisiert und in den GS115 Stamm von Pichia pastoris (Pichia
pastoris Expressionssystem, Invitrogen, San Diego, Californien)
transformiert. Ein Tryptase exprimierender Klon wurde isoliert und
für die Expression
im großen
Umfang durch Fermentation in gepufferten Minimal Methanol Komplexmedien
mit 0,5 mg/ml Heparin eingesetzt. Sekretierte reife βI- und βII-Tryptasen
wurden bis zur Homogenität
gereinigt, wobei ein bekanntes 2-Säulen-Affinitätschromatographieverfahren
eingesetzt wurde. Die Enzyme wurde in einem Puffer zur Endlagerung
suspendiert, der 2 M NaCl und 10 mM MES enthielt, pH 6,1.
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Die
Anteile an katalytisch aktiven βI-
und βII-Tryptasen
wurde durch Titration des aktiven Zentrums mit 4-Methylumbelliferyl-p-guanidinbenzoat
(MUGB) (Jameson, G., et al.) quantifiziert. Kurz gesagt, wurde die
Fluoreszenz mit Anregung bei 360 nm und Emission bei 450 nm nach
Zusatz von Enzym zu MUGB beobachtet. Die Konzentration an Enzym
wurde anhand der Zunahme der Fluoreszenz im Vergleich zu einer Standardkonzentrationskurve
bestimmt.
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Screening der positional
scanning synthetischen kombinatorischen Bibliothek:
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Herstellung
und Screening der positional scanning synthetischen kombinatorischen
Bibliothek (PS-SCL) wurde wie vorstehend beschrieben, durchgeführt (Harris,
J., et al. (2000), Backes, B. J., et al.). Die Konzentration von
jedem der 361 Substrate pro Mulde der P1-Lysin- und P1-Arginin- Bibliotheken war
0,25 μM, die
Konzentration der 6859 Verbindungen pro Mulde der P1-diverse-Bibliothek
war 0,013 μM.
Die Enzymaktivität
der PS-SCL wurde in 100 mM Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES)
pH 7,5, 10% Glycerin und 0 oder 0,1 mg/ml Heparin bei Anregungs-
und Emissionswellenlängen
von 380 nm beziehungsweise 450 nm bestimmt.
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Kinetische Analyse des
einzelnen Substrats:
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Tryptaseaktivität wurde
bei 30°C
in einem Assaypuffer mit 100 mM HEPES, pH 7,5, 10% w/v Glyzerin und
0,1 mg/ml Heparin beobachtet.
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Die
Substratstocklösungen
wurden in DMSO hergestellt. Die Endkonzentration an Substrat lag
in einem Bereich von 5 μM
bis 2000 μM,
die Konzentration an DMSO in dem Assay betrug weniger als 5%. Die Tryptasekonzentration
war 5 nM.
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Fluorogene Verbindungen:
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Fluorogene
Verbindungen werden als Sonden für
eine Reihe von Anwendungen eingesetzt, einschließlich der strukturellen Aufklärung von
Materialien, der Substratspezifität von Enzymen, der Hybridisierung
von Nukleinsäuren,
der Substrattransformation, Verdauung oder Abbau von Biomolekülen wie
Peptiden, Nukleinsäuren,
Sacchariden und so weiter.
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Die
vorliegende Erfindung stellt einen festen Träger zur Verfügung, der
die Konjugation eines fluorogenen Teils mit Verbindungen unterschiedlicher
Art erlaubt, die an dem erfindungsgemäßen festen Träger synthetisiert
worden sind.
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Ein
bevorzugter fester Träger
ist ein Harz, obwohl jeder beliebige andere feste Träger, zum
Beispiel eine Platte, gleichfalls eingesetzt werden kann.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein fluorogenes Peptid mit einer
fluorogenen Abgangsgruppe, die kovalent an eine Peptidsequenz P4-P3-P2-P1
an ein carboxyterminales Ende von P4-P3-P2-P1 gebunden ist. Vorzugsweise
ist die Bindung eine Amidbindung. Beispielhaft für eine erfindungsgemäße Abgangsgruppe ist
7-Amino-4-carbamoylmethylcumarin (ACC).
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Gemäß einer
illustrativen Ausführungsform,
wobei Fmoc Syntheseprotokolle verwendet werden, können alle
20 proteinogenen Aminosäuren
direkt an die Träger
gebundene ACC-Abgangsgruppe gekoppelt sein, so dass allgemeine Sets
an Substraten erhalten werden für
die Analyse der Substratspezifität
der Proteasen. Die Vielseitigkeit der Festphasensynthesestrategie
ermöglicht
die schnelle Herstellung von Substratarrays (Lee, D. et al. (1999))
und positional scanning Bibliotheken (Rano, T. A. et al. (1997))
mit beliebiger Konfiguration. Die Profile der Substratspezifität von zahlreichen
repräsentativen
Serin- und Cystein-Proteasen
belegen den Nutzen und die Allgemeingültigkeit von Bibliotheken,
die mit der ACC-Methode erzeugt werden.
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Die
erfindungsgemäßen fluorogenen
Polypeptide haben vorzugsweise eine Peptidsequenz, die mindestens
eine Peptidbindung beinhaltet, die durch Tryptase gespalten wird.
Durch Spaltung der Peptidbindung wird vorzugsweise die fluorogene
Abgangsgruppe aus dem Peptid freigesetzt.
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Die
Hydrolyse der ACC-Substrate wurde fluorometrisch mit einer Anregungswellenlänge von
380 nm und eine Emissionswellenlänge
von 450 nm mit einem Fluoromax-2 Spektrofluorometer beobachtet.
Das aminoterminale Ende von jedem Polypeptid war acetyliert.
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Verbindungsbibliotheken:
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Es
wurde eine Bibliothek von fluorogenen Peptiden geschaffen. Die Bibliothek
wird verwendet, um die Substratspezifität von Tryptase zu bestimmen.
Bibliotheken mit positional array oder geordneten array sind bevorzugt.
Diese Bibliotheken erlauben die Identifizierung von Peptiden oder
anderen Verbindungen, die mit Aktivitätsbereichen verbunden sind,
die beim screening der Bibliothek lokalisiert werden. Genauer gesagt,
kann die Bibliothek geordnet sein, so dass die Position des Peptids
auf dem array der Identität
des Peptids entspricht. Das heißt,
sobald eine Bestimmung durchgeführt
worden ist, und die Position auf dem array für ein aktives Peptid bestimmt
worden ist, kann die Identität
des Peptids ohne Weiteres festgesetzt werden.
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Fluorogenes Polypeptid:
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein isoliertes Polypeptid, das vom aminoterminalen
zum carboxyterminalen Ende gesehen P4-P3-P2-P1 aufweist, wobei P4 P, P3 R
oder K, P2 eine beliebige Aminosäure
und P1 K oder R ist (SEQ. ID. NO: 1). Das Polypeptid ist vorzugsweise
acetyliert und enthält
eine fluorogene Abgangsgruppe, die kovalent an P4-P3-P2-P1 an einem
carboxyterminalen Ende von P4-P3-P2-P1 gebunden ist. Vorzugsweise
ist die fluorogene Abgangsgruppe über eine Amidbindung gebunden.
Eine bevorzugte fluorogene Abgangsgruppe ist 7-Amino-4-carbamoylmethylcumarin.
Das heißt,
ein bevorzugtes Polypeptid ist Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12).
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Bestimmung der Tryptaseaktivität:
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität einer
enzymatisch aktiven β-Tryptase
in einer Probe. Proben, die für
die Bestimmung eingesetzt werden können, umfassen ohne jedoch
darauf beschränkt
zu sein Plasma, Urin, Tränenflüssigkeit,
Lavage, Serum oder andere klinische Proben von Körperflüssigkeiten. Das Verfahren umfasst
die Schritte des Inkontaktbringens der Probe mit einem isolierten
Polypeptid enthaltend P4-P3-P2-P1, gesehen vom aminoterminalen zum carboxyterminalen
Ende. In dieser bevorzugten Ausführungsform
ist P4 P, P3 R oder K, P2 eine beliebige Aminosäure und P1 K oder R (SEQ. ID.
NO: 1). P4 ist vorzugsweise acetyliert und eine fluorogene Abgangsgruppe ist über eine
Amidbindung an P4-P3-P2-P1 an ein carboxyterminales Ende von P4-P3-P2-P1
gebunden. Wird die Probe mit dem isolierten Polypeptid in Kontakt
gebracht, wird die fluorogene Abgangsgruppe durch die β-Tryptase
von P4-P3-P2-P1 abgespalten. Die Probe kann dann untersucht werden,
um zu bestimmen, ob eine nachweisbare Änderung der Fluoreszenz eingetreten
ist, wobei die nachweisbare Änderung
ein Indikator für
die Aktivität
der enzymatisch aktiven β-Tryptase in der Probe
ist.
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Aprotininbestimmung:
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Aprotinin
inhibiert von β-Tryptase
verschiedene Proteasen. Daher kann es Proben zugesetzt werden, um
die unspezifische Abspaltung der fluorogenen Abgangsgruppe aus P4-P3-P2-P1
durch andere Proteasen als β-Tryptase
zu verringern. Entsprechend betrifft die Erfindung auch ein Nachweissverfahren,
das als zusätzlichen
Schritt den Zusatz von Aprotinin zu der Probe enthält, um von β-Tryptase verschiedene
Proteasen zu inhibieren.
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Tryptase-Polypeptidinhibitor:
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Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypeptid, das
Tryptase inhibiert. Das isolierte Polypeptid umfasst, vom aminotermialen
zum carboxyterminalen Ende gesehen, P4-P3-P2-P1, wobei P4 P, P3
R oder K, P2 eine beliebige Aminosäure und P1 K oder R ist. (SEQ.
ID. NO: 1). Das Polypeptid enthält
einen reaktiven Inhibitorteil für
Serinprotease, wie zum Beispiel Chlormethylketon, der mit P1 verknüpft ist,
und wobei P4 acetyliert ist.
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Tryptaseinhibierung:
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Das
mit Chlormethylketon modifizierte Polypeptid, das vorstehend beschrieben
worden ist, kann zur Inhibierung von β-Tryptase eingesetzt werden.
Damit wird ein Verfahren zur Inhibierung einer enzymatisch aktiven β-Tryptase
in einer Probe bereitgestellt, das das in Kontaktbringen der Probe
mit einem isolierten Polypeptid umfasst, das, vom aminoterminalen
zum carboxyterminalen Ende gesehen, P4-P3-P2-P1 aufweist, wobei
P4 acetyliert ist, und wobei P1 mit einem Chlormethylketon verknüpft ist.
Vorzugsweise ist P4 P, P3 R oder K, P2 eine beliebige Aminosäure und
P1 K oder R (SEQ. ID. NO: 1). Das in Kontaktbringen erfolgt derart,
dass das isolierte Peptid mit der β-Tryptase wechselwirkt und dadurch
die β-Tryptase
inhibiert. Auf Wunsch kann der Grad der Inhibierung der β-Tryptase
verfolgt werden.
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Kits:
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Kits zur Bestimmung der Aktivität von β-Tryptase in Proben.
Die Kits beinhalten einen oder mehrere Behälter, die ein oder mehrere
erfindungsgemäße fluorogene
Polypeptide enthalten. Die fluorogenen Polypeptide können in
Lösung,
lyophilisiert oder an einen festen Träger gebunden vorliegen. Die
Kits können
Indikatorlösungen
oder Indikator-„Messstäbe", Plättchen,
Kulturmedien und so weiter enthalten. Die Kits können auch Indikatorkassetten
(wobei das fluorogene Polypeptid an einen festen Träger gebunden
ist) für
die automatisierte Bestimmung der Tryptaseaktivität enthalten.
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Die
Kits können
zudem Gebrauchseinweisungen enthalten, die das erfindungsgemäße Verfahren
und den Einsatz der Polypeptide des Kits beschreiben. Zusätzlich können die
Kits weitere Reagenzien, Puffer, verschiedene Konzentrationen an
Enzyminhibitoren, Stockenzyme (zur Erzeugung von Standardkurven
etc.), Kulturmedien, Einwegküvetten
usw. enthalten, die für
die Bestimmung der Tryptaseaktivität unter Verwendung der erfindungsgemäßen fluorogenen
Peptide nützlich
sind.
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Es
ist anzumerken, dass die Kits zusätzlich oder alternativ beliebige
andere Indikatoren enthalten können,
wie zum Beispiel Indikatoren auf Basis von Nukleinsäuren, Oligosaccharidindikatoren,
Lipidindikatoren.
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Ebenso
ist ein weiteres Kit umfasst, das ein isoliertes Polypeptid enthält, das β-Tryptase inhibiert.
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Strukturmodellierung eines
optimierten Substrats in das aktive Zentren von Tryptase:
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Die
Tryptasestruktur (PDB-Code 1aO1) wurde für die Modellierung vorbereitet,
indem Inhibitor- und Wassermoleküle
entfernt wurden, Wasserstoffe mit Sybyl6.5 eingeführt und
atomzentrierte Punktladungen (partial atomic charge) mit AMBER zugeordnet
wurden. Alle 4 Untereinheiten des Tetramers wurden beibehalten.
Da die Struktur einen kovalenten Inhibitor enthält, erfolgte eine Modellierung
von katalytischen Ser-195 in eine Geometrie, die mit einem nichtkovalenten
Inhibitor konsistent ist, indem die Wasserstoffbindung mit His-57
wiederhergestellt wurde. Hierfür
wurde eine Torsionsminimierung mit Sybyl6.5 in zwei Schritten durchgeführt (Tripos
Kraftfeld, eps = lr). Im ersten Schritt wurde die Position des Hydroxylwasserstoffs
von Ser-195 mittels Torsion um die CCOH-Bindung minimiert und im zweiten Schritt
wurden sowohl Sauerstoff als auch Wasserstoff mittels Torsion um
die CCOH- und CCCO (chi I)-Bindungen minimiert. Die Koordinaten
von allen Atomen des Enzyms wurden für die übrige Modellierung festgehalten.
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Das
Peptidrückgrat
von Ac-PRNK-Nme (SEQ. ID. NO: 18) (das heißt das Peptid war N-methyliert)
wurde in das aktive Zentrum der Tryptasestruktur wie folgt modelliert.
Als Templat für
die Rückgratkonfiguraton wurde
die Struktur des P1-P3-Teils
von Ovomucoid (komplexiert mit Chymotrypsin, PDB-Code I cho) benutzt. Dieser
Teil des Inhibitors wurde in das aktive Zentrum der Tryptase mit
least squares superposition der Reste 57, 102, 195 und 214 bis 216
des aktiven Zentrums der Protease mit den entsprechenden Resten
des Tryptase-„A"-Protomer übertragen. Die Peptidseitenketten
wurden dann an C-β trunkiert,
Wasserstoffe und AMBER-Ladungen wurden (wie vorstehend) eingefügt und die
Konfiguration des resultierenden (Ac-AAA-Nme)-Peptids wurde mit
sukzessiven Minimierungen für
das aktive Zentrum der Tryptase optimiert. Mit DOCK4.0 wurden zunächst die
Atome der zu spaltenden Amidbindung minimiert. Dann wurden sukzessive die
starren Segmente des Peptids (wobei die Torsionswinkel des Ovomucoidinhibitors
benutzt wurden) im Wechsel mit Minimierung zugefügt. Die Minimierungen umfassten
starre und flexible Freiheitsgrade und wurden mit dem Simplexalgorithmus
durchgeführt,
wobei die Größe der Anfangsschritte
kleiner als der Fehlerwert war (zum Beispiel betrug die maximale
Anfangstranslation 0,02 Angst.) und mit bis zu 500 Wiederholungen
für jede
Minimierung.
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Der
Scoring-Term, der sowohl für
intermolekulekulare als auch für
intramolekulare Atompaare benutzt wurde, enthielt die Coulomb- und
van der Waals-Terme aus AMBER mit einem interatomaren Cutoff von
25 Angst. und eps. = 4r. Die Peptidseitenketten (PRNK) (SEQ. ID.
NO: 2) wurden dann eingeführt
und die Konformation der P1 bis P3-Seitenketten und von P4 Prolin
wurden mit DOCK 4.0 gemäß Lamb,
M. et al., „Design, Docking,
and Evaluation of Multiple Libraries Against Multiple Targets," Proteins (in Druck)
modelliert. Zum Schluss wurden 10 unabhängige Minimierungen durchgeführt und
die Konfiguration mit der niedrigsten Energie ausgewählt.
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BEISPIELE
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Die
folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung. Es ist
selbstverständlich,
dass die folgenden Beispiele die Erfindung in keiner Weise einschränken.
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Beispiel 1: Substratspezifität von βI- und βII-Tryptasen:
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Rekombinante βI- und βII-Tryptasen
wurden erzeugt und in Pichia pastoris als reife Enzyme sekretiert. Die
Fähigkeit
das aktive reife Enzym anstelle des inaktiven Vorläufers Zymogen
zu erzeugen, ist wichtig für
die Untersuchung der Substratspezifität, da dadurch vermieden wird,
dass das Propeptid durch Zusatz einer aktivierenden Protease entfernt
werden muss, deren Aktivität
die anschließende
Untersuchung der Spezifität
komplizieren könnte.
Es besteht ein Unterschied in einer einzigen Aminosäure zwischen βI- und βII-Tryptasen
mit Asparagin beziehungsweise Lysin an Position 113. Durch Ersatz
von Asparagin durch Lysin wird eine N-verknüpfte Glykosylierungsstelle
in Tryptase βII
entfernt, so dass sie eine einzige Glykosylierungsstelle enthält. Die
Reduzierung der Anzahl an Glykosylierungsstellen kann bei der rekombinanten
Expression der beiden Enzyme beobachtet werden, wobei βI-Tryptase
in mehrfach glykosylierten Banden und βII-Tryptase in glykosylierten
und nichtglykosylierten Banden wandert. Der einzige Unterschied
bei der Expression und Reinigung der zwei Enzyme liegt in der Endausbeute
des aktiven Enzyms, wobei βI-Tryptase
10 mal mehr exprimiert als βII-Tryptase.
Das Phänomen
der verringerten Expression aufgrund der Entfernung der Glykosylierungsstelle wurde
auch bei anderen Proteasen beobachtet und es wird angenommen, dass
damit eine verringerte Stabilität
oder Löslichkeit
des Enzyms ohne post-translatorische Glykosylierung einhergeht (Harris,
J. L. et al. (1998)).
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Beispiel 2: Substratspezifitäten von βI- und βII-Tryptase:
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Zur
Bestimmung ob dieser einzige Unterschied in der Glykosylierung die
Substratspezifität
von βI-
und βII-Tryptasen
beeinflusst, wurden mehrere kombinatorische Peptidbibliotheken mit
fluorogenen Abgangsgruppen eingesetzt. Zunächst wurde die P1-Position
mit einer Bibliothek bestimmt, bei der jede P1-Aminosäure in einem Tetrapeptid konstant
gehalten wurde, und die anderen 3 Positionen eine äquimolare
Mischung aus 19 Aminosäuren
(ohne Cystein und Ersatz von Metheonin durch Norleuzin) aufwiesen.
Beide βI-
und βII-Tryptasen
bevorzugen die Spaltung nach Lysin gegenüber der nach Arginin, wobei
keine andere Aminosäure
an dieser Position akzeptiert wurde (2).
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Beispiel 3: Erweiterte
Substratspezifität
von βI-
und βII-Tryptasen:
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Zur
Feststellung der erweiterten Substratspezifitäten der β-Tryptasen als auch zur Bestimmung,
ob die erweiterte Spezifität
von dem Kontext der P1-Aminosäure abhängig ist,
wurden βI-
und βII-Tryptasen
mit zwei Bibliotheken untersucht, die sich lediglich in der konstanten
P1-Aminosäure,
Lysin beziehungsweise Arginin, unterschieden. Die erweiterten P4
bis P2-Substratspezifitäten von
beiden β-Tryptasen
ergaben, dass die Enzyme eine ähnliche
Substratpräferenz
aufweisen, die unabhängig
davon ist, ob die P1-Aminosäure Lysin
oder Arginin ist (3A und 3B). Obwohl
aus dem Spezifitätsnachweis
ersichtlich ist, dass beide Enzyme an jeder Position Selektivität aufweisen,
können
viele weniger optimale Aminosäuren
ebenso in das Substrat eingebaut werden, was darauf hinweist, dass
zusätzliche
Mechanismen der Substratdiskriminierung vorliegen können. Beide
Tryptasen zeigen eine ungewöhnliche
Präferenz
für Prolin
in der P4-Position. Keine andere Serinprotease, die bis heute untersucht
worden ist, zeigt diese Präferenz.
Für die
P3-Position ergibt sich eine Präferenz
für positiv
geladene Aminosäuren,
nämlich Lysin
und Arginin. Schließlich
ergibt sich für
die P2-Position eine Präferenz
für Asparagin
(3A und 3B).
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Beispiel 4: Kinetische
Charakterisierung der Leitsubstrate:
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Zur
Quantifizierung der Abhängigkeit
von Tryptase βI
und βII
von der erweiterten Substratspezifität wurden verschiedene Peptidsubstrate
synthetisiert und die kinetischen Konstanten für jedes Enzym bestimmt. Die
geringfügige
Bevorzugung von Lysin gegenüber
Arginin wie sie in der P1-diverse Peptid-Bibliothek festgestellt worden ist,
wurde mit den Substraten Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) und Ac-PRNK-ACC
(SEQ. ID. NO: 17) bestätigt.
Das Substrat Ac-PRNR-ACC (SEQ. ID. NO: 17) zeigt etwa 70–90% der
Aktivität
von Ac-PRNK-ACC
(SEQ. ID. NO: 12) mit kcat/Km (1,12 ± 0,14) × 106 M–1s1– beziehungsweise
(1,23 ± 0,15) × 106 M–1s1– für Tryptase βI und (1,31 ± 0,19) × 106 M–1s1 beziehungsweise
(1,89 ± 0,17) × 106 M–1s1 für Tryptase βII (Tabelle
II). Für
beide Enzyme konnte eine geringfügige
Präferenz,
ungefähr
das zweifache, für
P2-Asparagin gegenüber
P2-Threonin bei Vergleich von Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) und
Ac-PRTK-ACC (SEQ. ID. NO: 16) beobachtet werden mit kcat/Km (0,78 ± 0,07) × 106 M–1s1 beziehungsweise (1,23 ± 0,15) × 106 M–1s1 für Tryptase βI und (1,27 ± 0,12) × 106 M–1s1 beziehungsweise
(1,89 ± 0,17) × 106 M–1s1 für Tryptase βII. Der größte Unterschied
findet sich in der P3-Position mit einer annähernd 10 mal höheren Präferenz für Ac-PRNK-ACC (SEQ.
ID. NO: 12) gegenüber
Ac-PANK-ACC (SEQ.
ID. NO: 15), mit kcat/Km (1,23 ± 0,15)
106 M–1s1 beziehungsweise
(0,14 ± 0,01) × 106 M–1s1 für Tryptase βI und (1,89 ± 0,17) × 106 M–1s1 beziehungsweise
(0,18 ± 0,01) × 106 M–1s1 für Tryptase βII. All diese
Effekte zeigen sich in dem Km-Wert, nicht
in dem kcat-Wert. Dies weist darauf hin,
dass die Bindung im Grundzustand und Erkennung wichtige Faktoren
der Tryptasekatalyse sind.
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Beispiel 5: Kinetische
Vergleiche:
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Tabelle
2 zeigt einen kinetischen Vergleich von fluorometrischen Tryptasesubstratkandidaten,
wie sie mit PS-SCL vorherbestimmt wurden. Kinetische Parameter wurden
unabhängig
für beide
rekombinante βI
und βII- Tryptasen für rationale
Substitutionen in den Substraten an den P2-P4-Positionen erhalten.
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Beispiel 6: Ac-PRNK-ACC
zeigt Spezifität
gegenüber
andere Proteine:
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Menschliche
rekombinante βI-Tryptase
(Promega) wurde 2-fach seriell dreimal in einer Mikrotiterplatte von
10.000 auf 156 pg/ml verdünnt,
wobei ein „Assaypuffer" verwendet wurde,
der 100 mM HEPES, 10% v/v Glycerin und 0,1 mg/ml Heparin, pH 7,5,
enthielt. Menschliches α-Thrombin
(Haematologic Technologies, Inc.) und bovine factor Xa-Protease
(Promega) wurden gleichermaßen
von 200.000 auf 190 pg/ml verdünnt. Ac-PRNK-ACC
(SEQ. ID. NO: 12) wurden zu 100 μM
zugesetzt und die Platte bei Raumtemperatur eine Minute inkubiert
vor Auslesen bei einer Anregungswellenlänge von 355 nm und Emissionswellenlänge von
460 nm. 5 zeigt, dass Ac-PRNK-ACC (SEQ.
ID. NO: 12) ein spezifisches Substrat für Tryptase im Vergleich zu
anderen, aus dem Blut stammenden Serinproteasen ist.
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Beispiel 7: Tryptaseaktivität über einen
weiten Proteinbereich
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Menschliche
rekombinante β-I
Tryptase (Promega) wurde zweifach seriell dreimal in einer Mikrotiterplatte
von 125 auf 7,8 ng/ml und 125.000 auf 195 pg/ml verdünnt, wobei
ein „Assaypuffer" eingesetzt wurde, der
100 mM HEPES, 10% v/v Glycerin und 0,1 mg/ml Heparin, pH 7,5, enthielt.
Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) wurde zu 100 μM zugegeben und die Platte bei
Raumtemperatur 10 Minuten inkubiert bevor sie bei einer Anregungswellenlänge von
355 nm und Emissionswellenlänge
von 460 nm ausgelesen wurde.
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6 und 7 zeigen
typische Standardkurven der Aktivität, die mit Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12)
in Pufferlösungen
mit rekombinanter Tryptase erhalten wurden. Die Kurven wurden über 2 Logarithmus Tryptaseproteinkonzentrationsbereich
erzeugt.
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Beispiel 8: Aktivität von menschlicher β-Tryptase
in Serum:
-
Menschliche
rekombinante βI-Tryptase
(Promega) wurde zweifach seriell dreimal in einer Mikrotiterplatte
von 31,25 ng auf 0,488 ng/ml entweder in menschlichen Serum (Sigma)
oder einem Puffer verdünnt,
der 100 mM HEPES, 10% v/v Glyzerin und 0,1 mg/l Heparin, pH 7,5,
enhielt. Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) wurde zu 100 μM zugegeben
und die Platte bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubiert, bevor bei
einer Anregungswellenlänge
von 355 nm und Emissionswellenlänge
von 460 nm ausgelesen wurde.
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8 zeigt,
dass lineare Tryptase-Standardkurven mit geimpften menschlichem
Serum mit Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO: 12) möglich sind. Die intrinsische
Fluoreszenz ist über
die Standardkurve konsistent.
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Beispiel 9: Nicht-Tryptase
proteolytische Aktivitäten
im Serum:
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Menschliche
rekombinante βI-Tryptase
(Promega) wurde zweifach seriell in menschlichem Serum von 10.000
pg auf 190 pg/ml verdünnt.
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Aprotinin,
Soyabohnentrypsininhibitor (SBTI) oder Antitrypsin wurden jeder
Verdünnung
mit 25 μg/ml zugesetzt
und für
30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Gleichermaßen wurde
eine Serumstandardkurve ohne Inhibierung erzeugt. Von jeder der
behandelten und unbehandelten Serumverdünnungen wurden 100 μl 3-fach
auf eine Mikrotiterplatte pipettiert. Ac-PRNK-ACC (SEQ. ID. NO:
12) wurde auf 100 μM
zugegeben und die Platte bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubiert,
bevor bei einer Anregungswellenlänge
von 355 nm und Emissionswellenlänge
von 460 nm ausgelesen wurde.
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9 zeigt,
dass die intrinsische Fluoreszenz aufgrund Nicht-Tryptaseproteolyse beträchtlich
und spezifisch im Serum mit dem Serinproteaseinhibitor Aprotenin
unterdrückt
werden kann.
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Beispiel 10: Aprotinin
unterdrückt
Nicht-Tryptase-Aktivität:
-
10 zeigt,
dass lineare Tryptasestandardkurven in Serum und Puffer in Gegenwart
von exogen zugesetztem Aprotinin möglich sind.
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Der
Nachweis wurde im Wesentlichen wie in 9 durchgeführt mit
der Ausnahme, dass Aprotinin für eine
menschliche rekombinante βI-Tryptase
Pufferstandardkurve von 15.600 bis 237 pg/ml zugesetzt wurde.
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Beispiel 11: Tryptaseaktivität in Urin:
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Menschliche
rekombinante βI-Tryptase
(Promega) wurde zweifach seriell in unfiltrierten, first-void, normalen
menschlichen Urin von 10.000 pg auf 190 pg/ml verdünnt. Aprotinin
wurde mit einer Endkonzentration von 25 μg/ml einem Set der Standardkonzentrationen
zugesetzt und die Lösung
bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert, bevor Ac-PRNK-ACC (SEQ.
ID. NO: 12) zugegeben wurde. Die Platte wurde dann bei Raumtemperatur
inkubiert und nach 15 und 30 Minuten gelesen. „Normal" bedeutet, dass keine Krankheitsgeschichte
auf allergene Empfindlichkeiten oder Symptome vorliegt.
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11 zeigt,
dass lineare Tryptasestandardkurven für Urin ohne beträchtliche
Nicht-Tryptaseproteolyse möglich
sind. Praktische Nachweisgrenzen treten bei Annäherung an 300 pg/ml aktiver
Tryptase auf.
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Beispiel 12: Peptidkandidat
gekoppelt mit CMK:
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Ac-PRNK-CMK
(SEQ. ID. NO: 14) wurde zweifach seriell von 1000 auf 3,9 μM in einem „Assaypuffer" verdünnt, der
aus 100 mM HEPES, 10% v/v Glyzerin und 0,1 mg/ml Heparin, pH 7,5,
bestand. Menschliche rekombinante βI-Tryptase (Promega) wurde jedem
Röhrchen
in einer Menge von 1 μg
zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die kinetische
Geschwindigkeit wurde dann durch Zusatz von CBZ-Lys-Thiobenzylestersubstrat
und DNTB mit Endkonzentrationen von 400 μM beziehungsweise 1 mM bestimmt
und bei 450 nm analysiert.
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12 und 13 zeigen,
dass die Substitution von 7-Amino-4-Carbamoylmethylcumarin (ACC) durch Chlormethylketon
(CMK) in Ac-PRNK einen Inhibitor für Tryptase Isoformen ergibt.
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Beispiel 13: Bestimmung
der Spezifität
des Inhibitorkandidaten:
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Ac-PRNK-CMK
(SEQ. ID. NO: 14) wurde zweifach seriell von 16130 auf 31 μM und von
1000 auf 31 μM
für Faktor
Xa beziehungsweise Thrombin in „Assaypuffer" verdünnt, bestehend
aus 100 mM HEPES, 10% v/v Glyzerin und 0,1 mg/ml Heparin mit pH
7,5. Es wurden pro Verdünnung
6,6 μg Thrombin
und pro Verdünnung
5 μg Faktor
Xa zugegeben. Jede Reihe der Inhibierungsverdünnungen wurde bei Raumtemperatur
30 Minuten inkubiert. Die kinetische Geschwindigkeit wurde dann
durch Zusatz von CBZ-Lys-Thiobenzylestersubstrat
und DNTB mit einer Endkonzentration von 400 mM beziehungsweise 1
mM bestimmt und bei 450 nm analysiert.
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14 zeigt,
dass der Ac-PRNK-CMK (SEQ. ID. NO: 14) Inhibitor weitestgehend gegenüber aus
dem Blut stammenden Serinproteasen mit einer von Tryptase abweichenden
proteolytischen Spezifität,
zum Beispiel Faktor Xa und Thrombin, unwirksam ist.
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Potentielle/zwingende
physiologische Substrate, die durch PS-SCL identifiziert worden
sind.
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Weitere
nützliche
Substrate, die gefunden worden sind, umfassen die folgenden.
PRTK
(SEQ. ID. NO: 7) latentes TGF-b Bindungsprotein, Integrin E, Methioninaminopeptidase
PRFK
(SEQ. ID. NO: 19) für
aktives Zentrum von Pro-Urokinase
IRSK (SEQ. ID. NO: 20) Granzym-K-Vorläufer
SKGR
(SEQ. ID. NO: 21) PAR-2
FRTK (SEQ. ID. NO: 22) PAR-2
IKTK
(SEQ. ID. NO: 23) Hepatozyt-Wachstumsfaktor
-
Auf
die selbe Weise wie vorstehend für
Tryptase beschrieben, können
diese Substrate für
die Bestimmung der Aktivität
der angeführten
Enzyme eingesetzt werden. Andere Enzyme und mögliche korrespondierende synthetische
Substrate können über Datenbanksuche
mit Software wie BLAST identifiziert werden. Beispielsweise kann
eine geeignete BLAST-Suche mit Hilfe folgender Parameter durchgeführt werden:
Software: NCBI BlastP 2.0.10; Datenbank: nicht-redundante Genbank
CDS; Translations, PDB, SwissProt, Spupdate, PIR; fortgeschrittene
Suche: -e 10.000, -w2.
-
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