JPH09511390A

JPH09511390A - Ｗｄ−４０由来ペプチドおよびその使用

Info

Publication number: JPH09511390A
Application number: JP7520680A
Authority: JP
Inventors: ダリアモコリー−ローゼン，; ドリットロン，
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1994-02-01
Filing date: 1995-01-31
Publication date: 1997-11-18
Also published as: CA2182299A1; EP0742824A1; AU1910095A; US6342368B1; WO1995021252A2; DE69535948D1; WO1995021252A3; EP0742824B1; US5519003A; AU706585B2; ATE430801T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、第２のタンパク質と相互作用する第１のタンパク質の活性を変化させるのに効果的なポリペプチド組成物に関する。第２のタンパク質は少なくとも１つのWD-40領域を含む。本発明のポリペプチドは、代表的には４および50の間のアミノ酸を有し、その配列が第２のタンパク質のWD-40領域中の同じ長さの配列と同じである。本発明はさらに、上記第１のタンパク質の活性を変化させる方法を包含する。本発明の１つの実施態様において、ポリペプチド組成物はプロテインキナーゼＣの活性を変化させるのに効果的であり、ここでプロテインキナーゼＣは第２のタンパク質と相互作用し、そして第２のタンパク質は少なくとも一つのWD-40領域(例えば、RACK1)を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 WD-40由来ペプチドおよびその使用発明の分野本発明は、一般に、タンパク質-タンパク質相互作用に関与するタンパク質の機能を調整する組成物および方法に関する。さらに詳細には、相互作用するタンパク質ペアのうちの第１のタンパク質の機能を調整することに関する。ここでこのペアの第２のタンパク質は、「WD-40」または「β-トランスデューシン」アミノ酸反復モチーフを有する。背景技術多くの細胞内プロセスは、多サブユニットタンパク質複合体により行われるかまたは調節される。この多サブユニットタンパク質複合体は、個々のポリペプチドサブユニットの会合または解離により活性化されるかまたは抑制される。このようなタンパク質の１グループまたはファミリーはトランスデューシンの βサブユニットに関連する。このグループのメンバーはすべて、アミノ酸レベルでトランスデューシンのβサブユニットに少なくとも多少相同であり、そしてβ -トランスデューシン中で同定された特定のモチーフの不特定数の反復を有する。この反復は、「β-トランスデューシン」、または「WD-40」反復と呼ばれる(F ongら)。このタンパク質ファミリーのメンバー(Duronioら)には、多くのレセプターをその細胞内エフェクター分子に結合させるGβサブユニット、別のプロテインキナーゼ(β-アドレナリンレセプターキナーゼ、βARK)を固定するGβ/γサブユニット、DNA結合タンパク質、および酵母細胞環状タンパク質がある。これらすべては、その機能のために一過性のタンパク質-タンパク質相互作用を必要とする。しかし、これらのタンパク質およびそれらのパートナーの界面の配列は同定されていない。以下は、上記の参考文献および本明細書全編にわたって記載される参考文献である：米国特許書類 Crea、R.、米国特許第4,888,286号(1989年12月19日発行） Eaton、M.A.W.ら、米国特許第4,719,180号(1988年１月12日発行） Yoshio、T.ら、米国特許第4,849,350号(1989年７月18日発行）他の参考文献 Ausubel、F.Mら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons、Inc.,Media PA Bohinski、R.C.、Modern Concepts in Biochemistry、第２版、Allyn and Bac on，Inc. Dayhoff、M.O.、Atlas of Protein Sequence and Structures(1972)第５巻、N ational Biomedical Research Foundation、101〜110頁、および本巻の補遺２、１〜10頁 Duronio、R.J.ら、(1992)Proteins：Structure、Function、and Genetics 13: 41-56 Escobedo、J.A.ら、Mol．Cell．Biol、11:1125-1132(1991) Fongら、(1986)Proc Natl Acad Sci USA 83:2162-2166 Hariら、Endocrinology、120:829-831(1987) Kleuss、C.ら、Science 259:832-834(1993) Makowske、O.M.およびRosen、O.M．J．Biol．Chem．264:16155-16159(1989) Maniatis、T.ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Har bor Laboratory(1982) Miller、J.F.ら、Nature（London）216:659-63(1969) Mochly-Rosen、D.およびKoshland、D.E.，Jr．J．Biol．Chem．262:2291-2297 (1987) Mochly-Rosenら、Molec．Biol．Cell．1:693-706(1990) Mochly-Rosen、D.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:3997-4000(1991) Orr、J.W.ら、J．Biol．Chem．267、16155-16159(1992) Pitcher、J.ら、Science 257:1264-1267(1992) Reinerら、Nature 364:717-721(1993) Schulz、G.E.およびR.H.Schirmer．Principles of Protein Structure、Sprin ger-Verlag Smith、B.L.およびMochly-Rosen、D．Biochem．Biophys．Res．Commun．188:1 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Wolf、M.およびN．Sahyoun、Chem．261:13327-13332(1986)発明の開示１つの局面において、本発明は、第１のタンパク質(例えば、プロテインキナーゼＣ、またはβ-アドレナリンレセプターキナーゼ(βARK))の活性を変化させるのに効果的なポリペプチド組成物を包含する。このポリペプチドは、第１のタンパク質と、WD-40領域を有する第２のタンパク質との間の相互作用(例えば、結合相互作用)をブロックまたは阻害する。このポリペプチドは４および50の間のアミノ酸を有し、その配列は第２のタンパク質のWD-40領域中の同じ長さの配列と同じである。ポリペプチドは、第１のタンパク質と第２のタンパク質との結合をブロックし得るか、あるいは第１のタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。WD-40領域は、好ましくは配列番号76〜261により定義される配列に相同かまたは同一のアミノ酸配列を有する。第２の実施態様において、本発明は、上記の定義されたタイプの第１のタンパク質の活性を変化させる方法を包含する。この方法は、４および50の間のアミノ酸を有しその配列が第２のタンパク質のWD-40領域中の同じ長さの配列と同じであるポリペプチドを選択する工程、およびこのポリペプチドと第１のタンパク質との間に複合体を形成させる条件下で、このポリペプチドを第１のタンパクと接触させる工程を包含し、ここで、この相互作用は第１のタンパク質の活性を変化させる。１つの実施態様においては、上記接触工程は第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用を阻害するのに効果的である。別の実施態様においては、接触工程は第１のタンパク質の活性を刺激するのに効果的である。さらに別の実施態様において、上記接触工程は第１のタンパク質の活性を阻害するのに効果的である。ポリペプチドは、好ましくは配列番号76〜261により定義される配列に相同かまたは同一なアミノ酸配列を有する。本発明のさらなる特定の局面において、本発明は、プロテインキナーゼＣの活性を変化させるのに効果的なポリペプチド組成物を包含する。ここで、このプロテインキナーゼＣは第２のタンパク質と相互作用し、そして第２のタンパク質は少なくとも１つのWD-40領域を有する。ポリペプチドは４および50の間のアミノ酸を有し、その配列は第２のタンパク質のWD-40領域中の同じ長さの配列と同じである。好ましい実施態様において、第２のタンパク質は活性化されたプロテインキナーゼＣに対するレセプターであり、そして配列番号27により表される配列を有する。他の特定の実施態様において、上記ポリペプチドは(ｉ)プロテインキナーゼＣのアゴニストであり、そしてこのポリペプチドは配列番号７により表される配列を有する；(ii)プロテインキナーゼＣの活性のアンタゴニストである；および/ または(iii)プロテインキナーゼＣと第２のタンパク質との間の相互作用のインヒビターである。後者の実施態様において、上記ポリペプチドは配列番号４または配列番号７に対応する配列を有する。 WD-40領域は、好ましくは配列番号69〜75に相同かまたは同一なアミノ酸配列を有する。関連する実施態様において、本発明は、第２のタンパク質と相互作用するプロテインキナーゼＣの活性を変化させる方法を包含する。ここで、上記第２のタンパク質は少なくとも１つのWD-40領域を有する。この方法は、４および50の間のアミノ酸を有し、その配列が第２のタンパク質のWD-40領域中の同じ長さの配列と同じであるポリペプチドを選択する工程、およびこのポリペプチドとプロテインキナーゼＣとの間で複合体を形成させる条件下でこのポリペプチドをプロテインキナーゼＣと接触させる工程を包含し、ここで、上記相互作用は上記プロテインキナーゼＣの活性を変化させる。本発明の他の局面は、ポリペプチドが固体支持体に結合される本発明のポリペプチド組成物、および上記第１のタンパク質を選択的に結合させるための方法を含み、この方法は、上記第１のタンパク質を含有すると推定される試料を固体支持体に結合されたポリペプチド組成物と接触させる工程、および上記組成物から試料のいずれもの結合していない成分を除去する工程を包含する。さらに別の局面において、本発明は、第１のタンパク質と第２のタンパク質中に含まれるアミノ酸配列により表されるポリペプチドとの相互作用を評価する方法に関する。ここで、上記第２のタンパク質は少なくとも１つのWD-40領域を有し、この方法は、上記第１のタンパク質を含有する試料を、４および50の間のアミノ酸を有し、その配列が第２のタンパク質のWD-40領域中の同じ長さの配列と同じであるポリペプチド組成物と接触させる工程、および第１のタンパク質と上記ポリペプチド組成物との任意の相互作用を観察する工程を包含する。本発明はまた、第１のタンパク質を結合させる候補化合物の能力を評価する方法に関する。この方法は、上記候補化合物の存在下および非存在下で、上記第１のタンパク質をこの第１のタンパク質を結合させるポリペプチド組成物と接触させる工程( ここで、上記組成物のポリペプチドは４および50の間のアミノ酸を有し、その配列は第２のタンパク質のWD-40領域の同じ長さの配列と同じであり、この第２のタンパク質は上記第１のタンパク質と相互作用する)；および上記候補物の存在下および非存在下での上記ポリペプチドの結合を測定する工程(ここで、上記候補物の非存在下に対してその存在下でのポリペプチドの結合が減少することは、上記候補物が上記第１のタンパク質と結合することを示す)を包含する。さらに他の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドの生産のための組換え物質およびその生産のための方法に関する。本発明のこれらのおよび他の目的および特徴は、添付の図面と共に以下の発明の詳細な説明を読むとさらに十分に明らかになる。図面の簡単な説明図1Aは、ラットの脳のRACK1のcDNA配列を示す。図1Bは、RACK1のアミノ酸自己相同性マトリックス分析を示す。図1Cは、分子中に表される７つのWD-40反復を示すように並べられたRACK1のアミノ酸配列を示す。図２は、PKCアクティベーターの存在下および非存在下で固定化RACK1へのPKC 結合を検出する重層アッセイ(overlay assay)の結果を示す。図３は、WD-40由来ペプチドの存在下および非存在下で固定化RACK1へのPKC結合を検出する重層アッセイの結果を示す。図４は、種々の条件下でニトロセルロース膜上に固定化されたペプチドI(配列番号１)またはペプチドrVI(配列番号７)のどちらかとのβPKCの結合を検出する重層アッセイの結果を示す。図5Aは、インスリン誘導卵母細胞成熟の尺度であるPKC仲介卵核胞崩壊(GVBD) におけるペプチドI(配列番号１)およびペプチドrVI(配列番号７)注入の効果を示す。図5Bは、インスリン誘導の非存在下、PKC仲介卵核胞崩壊(GVBD)におけるペプチドI(配列番号１)およびrVI(配列番号７)の注入の効果を示す。図5Cは、インスリン誘導の非存在下、PKC仲介卵核胞崩壊(GVBD)におけるペプチドrIII(配列番号４)の注入の効果を示す。図６は、インスリン刺激を用いるかまたは用いない、ペプチドI(配列番号１) またはペプチドrVI(配列番号７)のいずれかの注入溶液の微量注入後のアフリカツメガエル卵母細胞における細胞質ゾル画分と膜会合画分との間のβPKCの分布を示す。図７は、βPKCのArg-Cエンドペプチターゼに対する感受性におけるペプチドI およびrVIの効果を示す。図８は、PKCアクティベーターの非存在下、PKC自己リン酸化におけるペプチド IおよびrVIの効果を示す。図９は、PKCアクティベーターの非存在下、ヒストンのPKCリン酸化におけるペプチドIおよびrVIの効果を示す。図10は、PKCアクティベーターの非存在下、ヒストンのPKCリン酸化におけるペプチドrIIIの効果を示す。図11は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有する56kDaヒトタンパク質のアミノ酸配列を示す。図12は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するAAC-リッチタンパク質のアミノ酸配列を示す。図13は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するB-TRCPタンパク質のアミノ酸配列を示す。図14は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するβ-プライムCOPタンパク質のアミノ酸配列を示す。図15は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するCDC4タンパク質のアミノ酸配列を示す。図16は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するChlam-3タンパク質のアミノ酸配列を示す。図17は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するCOP-1タンパク質のアミノ酸配列を示す。図18は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するCOROタンパク質のアミノ酸配列を示す。図19は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するCoronin p55タンパク質のアミノ酸配列を示す。図20は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するCstf 50kDaタンパク質のアミノ酸配列を示す。図21は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するウシG-β-1タンパク質のアミノ酸配列を示す。図22は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するウシG-β-2タンパク質のアミノ酸配列を示す。図23は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するショウジョウバエG-βタンパク質のアミノ酸配列を示す。図24は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するヒトG-β-1タンパク質のアミノ酸配列を示す。図25は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するヒトG-β-2タンパク質のアミノ酸配列を示す。図26は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するマウスG-βタンパク質のアミノ酸配列を示す。図27は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するショウジョウバエグラウチョ(groucho)タンパク質のアミノ酸配列を示す。図28は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するイカ(squid)GTP-結合タンパク質のアミノ酸配列を示す。図29は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有すHSIEF 930タンパク質のアミノ酸配列を示す。図30は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するヒト12.3タンパク質のアミノ酸配列を示す。図31は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するヒトIEF-7442タンパク質のアミノ酸配列を示す。図32は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するインスリン様成長因子結合タンパク質複合体のアミノ酸配列を示す。図33は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するラットインスリン様成長因子結合タンパク質のアミノ酸配列を示す。図34は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するヒトLIS1タンパク質のアミノ酸配列を示す。図35は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するMD6タンパク質のアミノ酸配列を示す。図36は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有する酵母MSI1タンパク質のアミノ酸配列を示す。図37は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するマウスpc326 MUSタンパク質のアミノ酸配列を示す。図38は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するORD RB1タンパク質のアミノ酸配列を示す。図39は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有する周期性trpタンパク質のアミノ酸配列を示す。図40は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するPLAPタンパク質のアミノ酸配列を示す。図41は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有する網膜芽腫結合タンパク質のアミノ酸配列を示す。図42は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するS253タンパク質のアミノ酸配列を示す。図43は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するSOF1タンパク質のアミノ酸配列を示す。図44は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するSTE4酵母タンパク質のアミノ酸配列を示す。図45は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するTF1転写因子タンパク質のアミノ酸配列を示す。図46は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するTUP1タンパク質のアミノ酸配列を示す。図47は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するTUP1相同物タンパク質のアミノ酸配列を示す。図48は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するYCU7タンパク質のアミノ酸配列を示す。図49は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するYCW2タンパク質のアミノ酸配列を示す。図50は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するYKL25タンパク質のアミノ酸配列を示す。図51は、並べられたWD-40反復および四角枠で図示される推定結合ペプチド領域を有するYRB140タンパク質のアミノ酸配列を示す。発明の詳細な説明 I．定義他で示されない限り、本明細書中のすべての用語は、本発明の当業者に対して意味する用語と同一の意味を有する。定義および当該分野の用語について、当業者は特にCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubel)を参照する。アミノ酸残基についての略号は、20個の通常のＬ-アミノ酸の１つを意味するために当該分野で使用されている標準的な３文字および/または１文字の表記である。同様に、核酸の略号は、当該分野で使用されている標準的な表記である。「アミノ酸グループ」とは、疎水性、電荷、または大きさのような一般の特性に基づくアミノ酸のグループを意味する。アミノ酸の「保存セット(conserved set)」とは、タンパク質のグループのメンバー間で保存されるアミノ酸の隣接する配列を意味する。保存セットは、長さ２〜50以上のアミノ酸残基のいずれでもあり得る。代表的には、保存セットは長さ２および10の間の隣接する残基である。保存セット中の個々の位置は、それぞれ代表的にはアミノ酸グループから選択されるいくつかのアミノ酸の１つを含む。残基ga特定の位置で100％保存される場合、保存セットはその位置ではその残基のみを含有する。例えば、２つのペプチドWRTAA(配列番号263)およびWRTAV(配列番号264)については、４つの同一の位置(WRTA；配列番号265)、および残基が「Ａ］または「Ｖ」である１つの位置がある。タンパク質は、代表的には、２次構造および３次構造を形成し得るアミノ酸ベースのポリアミド(ポリペプチド)の長鎖である。タンパク質は、１、２またはそれ以上のポリペプチド鎖から構成され得、そしてさらにポリペプチド鎖と共にいくつかの金属イオンまたは炭水化物のような他のタイプの物質を含有し得る。タンパク質の大きさは約5,000〜数十万g/モルのかなり広い範囲にわたる。5,000数はおよそ40〜45のアミノ酸の存在に相当する。他に示されない限り、タンパク質およびペプチドの配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で与えられる。同様に、核酸の配列は５’末端から３’末端の順序で与えられる。用語「相互作用するタンパク質」とは、例えば、生理学的な条件下での静電気、疎水、イオンおよび/または水素結合相互作用により安定な会合複合体を形成し得るペアのポリペプチドを意味する。約5,000g/モルより小さなタンパク質は、代表的には、ポリペプチドまたは単にペプチドと呼ばれる(Bohinski)。２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列は、変異ギャップ行列および６またはそれ以上のギャップペナルティでALIGNプログラムを用いて、それらが５より大きいアラインメントスコア(標準偏差単位で)を有するならば、(この用語が本明細書中で好ましく使用されるように)相同であると考えられる(Dayhof f)。さらに好ましくは、この２つの配列(またはその部分)は、上記ALIGNプログラムを用いて最適に並べられたときに、それらのアミノ酸が50%、より好ましくは70%、さらに好ましくは80%等しいかまたはそれ以上同一である場合、相同である。ペプチドまたはペプチドフラグメントは、親ペプチドまたは親ポリペプチドのアミノ酸配列に同一または相同なアミノ酸配列を有する場合、親ペプチドまたはポリペプチドに「由来」する。相同なペプチドは先に定義した。由来ペプチドの例はペプチドrIII(配列番号４)およびペプチドrVI(配列番号７)であり、これらはそれぞれRACK1(配列番号27)の３番目および７番目のWD-40反復に由来する。用語「発現ベクター」とは、外来細胞中で異種DNAフラグメントを取り込み、そして発現する能力を有するベクターを意味する。多くの原核および真核発現ベクターが市販されている。適切な発現ベクターの選択は当業者の知識内である。用語「PKC」とは、プロテインキナーゼＣまたはＣ-キナーゼを意味する。用語「RACK」とは、活性化Ｃ-キナーゼのレセプターを意味する。用語「PS」とは、ホスファチジルセリンを意味する。用語「DG」とは、ジアシルグリセロールを意味する。用語「PL」とは、リン脂質を意味する。リン脂質はホスファチジルセリンとジアシルグリセロールとの両方を包含する。用語「GVBD」とは、アフリカツメガエル卵母細胞におけるインスリン誘導成熟の尺度である卵核胞崩壊を意味する。用語「PCR」とは、ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。用語「NMR」とは、核磁気共鳴を意味する。用語「βARK」とは、β-アドレナリンレセプターキナーゼを意味する。 II．発明の一般的概説本発明は、少なくとも１つのタンパク質が１以上のWD-40と呼ばれる(Fongら) 特徴的な反復を有するアミノ酸配列を含む、相互作用するタンパク質に関する。本発明の１つの局面によれば、相互作用するタンパク質ペアの第１のタンパク質の機能は、このタンパク質を含有する溶液または培地に、相互作用するタンパク質ペアの第２のタンパク質に存在するWD-40モチーフ含有反復の配列の１部と同一であるかまたは相同な配列を有するペプチドを添加することにより、調整、変化、破壊され得る。第１のタンパク質の機能の調整または破壊は、「結合ペプチド」と呼ばれるWD -40由来ペプチドと第１のタンパク質との結合または会合による。結合ペプチドと第１のタンパク質との結合または会合の結果はこのペプチドの配列に依存する。代表的には、この結合ペプチドの存在は第１のタンパク質と第２のタンパク質との結合を阻害する。この結合は、例えば、重層アッセイによりインビトロでアッセイされ得、これにより１つのタンパク質と別のタンパク質の結合の程度が評価され得る。本発明の実施態様に適用されたいくつかの重層アッセイの適応例が本明細書中に記載されている。 WD-40由来ペプチドが第１のタンパク質と第２のタンパク質との会合に影響するか否かに関係なく、このペプチドは第１のタンパク質の定義された活性を変化または調節させ得る。これらの活性は、インビボおよび/またはインビトロの種々の方法によりアッセイされ得る。使用される方法は、活性が測定されるタンパク質に依存する。相互作用するタンパク質ペアの第１のタンパク質の例はプロテインキナーゼＣ (PKC)である。活性化により、PKCは、活性化されたＣキナーゼのレセプター(RAC K)と相互作用する。ここで、少なくとも１つのRACK(RACK1)はWD-40反復を含む。 RACK1のWD-40領域に由来するペプチドの存在下および非存在下でPKCの活性を測定するためのいくつかのアッセイは本明細書中で詳細に記載されている。特定の「相互作用するタンパク質」は、それらの１つまたはそれ以上が外因性または内因性の因子により刺激された後のみ相互作用する。例えは、本明細書で示されるように、PKCは、例えば、ホスファチジルセリン(PS)、ジアシルグリセロール(DG)、およびカルシウムにより活性化されるまで、RACKタンパク質に結合しない。しかし、このようなペアの第２のタンパク質のWD-40反復に由来するペプチドは、第１のタンパク質アクティベーターの非存在下でさえ、第１のタンパク質と会合または結合し得、そのようにして、第１のタンパク質の機能に影響を与える(例えば、活性化する、不活性化する、効力を高める、感受性を増大させる、感受性を低減させる、特異性を変化させるなど)。相互作用するタンパク質ペアの第２のタンパク質のWD-40反復に由来する結合ペプチドは、このペアの第１のタンパク質の特異的アゴニスト、アンタゴニスト、機能の増強剤(potentiator)などとして有用であり得る。これらの特性が、多くの適用(例えば、治療適用における直接使用または他の治療剤(例えば、小有機分子)の開発のためのリード化合物として)においてペプチドを有用にし得る。 III．RACK1に結合する活性化PKCの阻害における本発明の利点プロテインキナーゼＣ(PKC)は、共通の構造および生化学的特徴を有する少なくとも10のアイソザイムのファミリーである。いくつかのアイソザイムは単一の細胞型に存在することが示され、そして個々のPKCアイソザイムは異なる細胞機能に関連すると仮定された。しかし、これまでのところ、PKCの利用可能なアクティベーターおよびインヒビターはアイソザイムに特異的でないようである。それゆえ、現在正常な細胞機能ならびに疾患における個々のPKCアイソザイムの役割を決定することが不可能である。例えば、ジアシルグリセロールおよびカルシウムによるPKC活性化は、本明細書中の実験(実施例８)に示されるように、可溶性(細胞質ゾル)画分から細胞微粒子(膜に結合する)画分へのトランスロケーションを誘導する。活性化PKCは、膜結合レセプター(活性化Ｃ-キナーゼのレセプターまたはRACK)に結合することにより細胞微粒子画分中に固定される。本発明のサポートのために行われ、本明細書中に記載される実験において、RA CKをコードするクローン(pRACK1)が単離された(実施例１)。RACK1は、トランスデューシンのβサブユニットに相同であり、そしてWD-40モチーフを有するタンパク質の成長中のファミリー(growing family)に属する(Fongら)。ペプチドI(配列番号１)は、精製PKCに結合し(実施例６および図４を参照のこと)、PKCと精製組換えRACK1タンパク質との結合を阻害し(実施例４および図３を参照のこと)、そしていくつかのインビボおよびインビトロアッセイにおいて、PKC活性を阻害する(実施例７〜11および図５〜９を参照)ことが示された。ペプチドI(配列番号１)は、RACK1の６番目のWD-40反復中で同定される配列に相同である(図１Ｃを参照)。合成ペプチドがこの配列に基づき調製された(ペプチドrVI；配列番号７；図１Ｃの反復VI中の下線部のアミノ酸)。また、６以上のペプチドが、反復I〜VおよびVII中の対応する領域に基づいて調製された(ペプチドrI〜rV、rVII；配列番号２〜６、８；図１Ｃの対応する反復の下線部領域)。いくつかのペプチドはまた、PKCとRACK1との結合を阻害することが見出された( 実施例４および図３を参照のこと)。さらに、いくつかのペプチドは、精製PKCに結合し(実施例６、図４を参照のこと)、他のアクティベーターの非存在下で部分的にPKCを活性化し(ペプチドrVI；実施例７、10、11および図５、８および９を参照のこと)、そして酵素における公知のPKCアクティベーターの効果を高める( 実施例７〜９および図５〜７を参照のこと)ことが見出された。アフリカツメガエル卵母細胞成熟研究において(例えば、実施例７を参照のこと)、ペプチドrVI(配列番号７)はβPKCのアゴニストである。ペプチドrIIIもまた、その能力がより低いが、PKCのアンタゴニストである；これは50μMおよび50 0μMでインスリン誘導卵母細胞成熟を増強する。心筋細胞において、ノルエピネフリン(NE、2μM)はδPKCおよびεPKCアイソザイムの細胞質ゾル画分から微粒子画分へのトランスロケーションを引き起こす。心筋細胞へのペプチドrIIIおよびより少ないペプチドrVIの導入は、ホルモンの刺激の非存在下で、δPKCおよびεPKCアイソザイムの即座のトランスロケーションを引き起こした。このペプチド誘導トランスロケーションに続いてδPKCおよびεPKCアイソザイムの分解が起こった。さらに、ペプチドrIIIを含有する細胞において、NE誘導トランスロケーションはさらに増強された。対照的に、これらの細胞へのペプチドIの導入は、ホルモン刺激の非存在下でP KCの分布に影響を与えず、PKC分解を誘導しない。さらに、NE誘導トランスロケーションはペプチドIにより阻害される。同様の濃度の多くのコントロールペプチドは、コントロール細胞またはNE処理細胞においてPKC分布またはPKC分解に影響しなかった。ラット心筋細胞での研究において、ペプチドrIIIはδPKCおよびεPKCの活性化を誘導し、続いて、これらの活性化アイソザイムの分解が起こった。ペプチドrVIはまた、PKCアイソザイムのホルモン誘導トランスロケーションを増大させる(例えば、実施例８および図６を参照のこと)。対照的に、ペプチドI( 配列番号１)は、PKCアイソザイムのホルモン誘導トランスロケーションを阻害し (実施例８、図６)、そして分解を引き起こさなかった。上記の要約されたデータは、RACK1のWD-40反復に由来するペプチドが、インビボでPKCのアゴニストおよびアンタゴニストの役割を果たし得ることを示し、そしてRACK1のWD-40領域に由来するペプチドは、PKCとRACK1とのタンパク質-タンパク質界面の少なくとも１部分を含むことを示唆する。さらに、この結果は、(i)Gβサブユニットのような他のタンパク質に存在する WD-40反復はまた、タンパク質-タンパク質相互作用に関与する表面あるいはその近くに位置し得ること、(ii)これらの反復に由来するペプチドはタンパク質とそれらのパートナー(例えば、β-アドレナリンレセプターキナーゼ(βARK))との相互作用を破壊するのに効果的であり得ること、(iii)これらのペプチドはWD-40反復含有タンパク質と相互作用するタンパク質の活性を調整または変化させ得ること、および(iv)それゆえこれらのペプチドは、インビボで投与される場合、特異的な生物学的効果を有し得ることを示唆する。 IV．相互作用するタンパク質の対の同定。 A．生化学的アプローチ新規な相互作用するタンパク質を、当業者に公知の多数の方法により同定および単離し得る。例えば、抗原の混合物（特定の組織ホモジネートなど）に対して惹起されたモノクローナル抗体を、特徴付けおよび使用して、組織中に存在する単一のクラスの抗原分子を免疫沈降し得る。次に、沈降されたタンパク質をさらに特徴付けし、そしてそれらが本来相互作用する他のタンパク質を沈降するために使用し得る（Hariら、Escobedoら）。既知の単離されたタンパク質と相互作用する未知のポリペプチドを同定するための別の方法は、例えば、重層アッセイ（overlay assay）の使用による（Wolf ら、Mochly-Rosenら、1991）。既知の単離されたタンパク質に結合するタンパク質を潜在的に含有する混合物（組織ホモジネートの画分、例えば、Triton不溶性タンパク質画分など）を、PAGEを用いて分離し、ニトロセルロースまたはナイロンメンブランにブロットし、そして既知のタンパク質および任意の必要な補因子または小分子を含有する溶液と接触させ得る。洗浄後、メンブランを既知のタンパク質に対するプローブ（例えば、単一の抗体または抗体の混合物）と接触させ、そしてシグナルを可視化し得る。 B．分子的アプローチ既知のタンパク質の推定の結合タンパク質を、上記のように組織ホモジネートから単離し得る。あるいは、推定の結合タンパク質をコードするDNAクローンを、例えば適切なcDNA発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定し得る。多種の組織から作製された発現ライブラリーが、市販されている（例えば、 Clonetech，Palo Alto，CAから）。発現ライブラリーをまた、当業者により選択される生物および組織から新たに作製し得る。目的のタンパク質またはタンパク質フラグメントを発現するクローンについての発現ライブラリーのスクリーニングを、当該分野に公知の技法（例えば、重層アッセイ）を用いて容易に達成し得る。重層アッセイスクリーニング方法を用いて、手持ちのプローブに結合する（既知または未知の）タンパク質またはタンパク質フラグメントを発現するクローンを同定し得る。プローブは、スクリーニングのために選択されたcDNAライブラリー中に存在することが期待されるタンパク質とのタンパク質−タンパク質相互作用に関与することが仮定されるタンパク質であり得る（実施例１に詳細に記載する、RACK1のクローニングについての場合のように）。選択されたcDNAライブラリーの実際のスクリーニングは、プレートされたクローンを誘導してクローン化された外因性配列を発現させる工程、誘導されたプラークまたはコロニーのレプリカをフィルターメンブランに移す工程、およびメンブランを適切なプローブでスクリーニングする工程により達成され得る。この方法によれば、（例えば、IPTGに誘導された）適切に誘導されたcDNAライブラリープレート由来のフィルター（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース）のリフト（lift）を、洗浄し、ブロックし、そして選択されたプローブとともに選択されたプローブ（単数または複数）をフィルター上に存在するポリペプチドフラグメントに特異的に結合させるために十分な時間インキュベートする。次に、フィルターを洗浄し、そして試薬（例えば、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体または抗マウス抗体などの抗体、Boehringer Mannheim Biochemicals，In dianapolis，INから入手可能）と反応させ得る。追加の反応を、結合したプローブの存在を検出するために必要であれば、行い得る。実施例１に記載の１つのこのような重層アッセイを用いて、PKCアクチベーター（ホスファチジルセリン、ジアシルグリセロール、およびカルシウム）の存在下で精製PKCと結合するタンパク質についてラット脳cDNA発現ライブラリーをスクリーニングした。フィルターを、ラット脳PKCアイソザイムの混合物（α、β 、γ、δ、ε、およびζ）を用いてスクリーニングした。一連の洗浄の後、結合したPKCアイソザイムを、抗α、β、γPKCマウスモノクローナル抗体、ならびに抗δ、ε、およびζPKCウサギポリクローナル抗体の混合物を用いて検出した。結合した抗体を、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギまたは抗マウス抗体ならびに基質としての5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェートp-トルイジン塩を用いて検出した。一旦クローンが上記のスクリーニングのようなスクリーニングにおいて同定されれば、クローンを単離またはプラーク精製して配列決定し得る。次に、挿入物を他のクローニング反応、例えば組換え融合タンパク質の効率的な産生を可能にする発現ベクターへのクローニングに使用し得る。適切な発現ベクターの例は、 pGEX（Smithら、1988）およびpMAL-c2（New England BioLabs，Beverly，MA）である。目的の挿入物を含む発現ベクターを用いて適切な宿主細胞（例えば、E．c oli）を形質転換し得、そして形質転換された宿主細胞を用いて組換えタンパク質を大量に産生し得る。代表的には、組換えタンパク質は細菌遺伝子産物またはウイルス遺伝子産物（内因性ポリペプチド）と直列に融合タンパク質の一部分として発現し得る。内因性ポリペプチドと組換えタンパク質との間の連結部は、代表的には稀切断プロテアーゼ（rare-cutting protease）の認識部位を含む。内因性ペプチドは、親和性タグ（affinity tag）に対する抗体のような親和性試薬を用いた融合タンパク質の精製を容易にする独特の親和性タグ（短いペプチド配列）を取り込むように設計し得る。次に、組換えタンパク質を適切なプロテアーゼを用いて融合タンパク質から精製し得る。精製された組換えタンパク質を、多くの方法（組換えタンパク質と相互作用するタンパク質との間の結合を阻害するペプチドまたは物質をスクリーニングするための重層結合アッセイを含む）に使用し得る。タンパク質を発現するためのcDNAクローンの使用の例を、実施例２に詳細に記載する。RACK1 cDNA（先および実施例１に記載のように単離した）を、発現ベクター（pMAL-c2，New England BioLabs，Beverly，MA）にサブクローニングした。この発現ベクターは、クローン化挿入物をマルトース結合タンパク質（MBP）と直列に発現し得る。RACK1挿入物を含むベクターを用いてTB1 E.coliを形質転換し、これを次にIPTGを用いて誘導した。この細胞は、MBPに融合したRACK1からなる78kDa融合タンパク質を産生した。過剰発現された融合タンパク質を、製造者のプロトコル（New England BioLabs，Beverly，MA）に従ってアミロースアフィニティーカラムで精製し、そして発現された挿入物をMBPから分離するためにプロテアーゼXaとインキュベートした。インキュベートの後、36 kDa RACK1タンパク質を得た。 V．WD-40反復の同定。本発明の方法によれば、相互作用するタンパク質の少なくとも１つが、１つのタンパク質のWD-40反復（単数または複数）由来のペプチド（単数または複数）を有する、WD-40モチーフ、または領域を含む場合、タンパク質−タンパク質相互作用を破壊し得る、そして/または相互作用するタンパク質の活性を改変し得る。 WD-40反復は代表的にはトランスデューシンのβサブユニットと少なくとも限定された相同性を有するタンパク質のファミリー中に見出される。このファミリーの選択されたメンバー中に存在するWD-40反復を、(A)選択されたタンパク質について相同性マトリックス（例えば、Christian Marck，Service de Biochemie et de Genetique Moleculaire，Department de Biologie Cellulaire et Molecu laire，Direction des Sciences de la Vie - CEA - FRANCEから入手可能なコンピュータープログラムDNA Strider 1.2により実行される）を用いる自己相同性解析（self-homology analysis）を実行する工程、(B)相同性マトリックス解析により示された反復するエレメントを含む配列を並べる工程、および(C)WD-40反復を定義するために代表的に役立つ保存されたアミノ酸配列を同定する工程により同定し得る。この工程を、以下で個別に考察する。 A．相同性マトリックス解析特定のアミノ酸配列が反復モチーフを含むかどうかの決定は、当業者に公知の多くの方法により達成し得る。これらの方法は、配列の簡単な目視検査から反復モチーフを同定し得るコンピュータープログラムの使用までおよぶ。１つの広く供給されたコンピューター支援方法は、自己相同性マトリックスの生成である。自己相同性マトリックスは、特定の配列中の各々のアミノ酸残基とその配列中のすべての他の残基との相同性を算出する。相同性スコアは２次元マトリックス中に蓄積される。選択された基準レベルよりも高い値は、印をつけられ（flag）てx-y座標上の点として表示される。x-軸およびy-軸は、配列中の連続的なアミノ酸の位置に対応する。自己相同性マトリックス解析の例を、図1Bに示す。このマトリックスは、コンピュータープログラムDNA Strider 1.2（Christian Marck，Service de Biochem ie et de Genetique Moleculaire，Department de Biologie Cellulaire et Mol eculaire，Direction des Sciences de la Vie - CEA - FRANCE）を用いてRACK1 のアミノ酸配列（配列番号27）と、ウインドウ設定（window setting）21および厳密性（stringency）６で生成した。自己相同性マトリックスのいくつかの代表的な特徴が、図中で明白である。グラフは、原点から一定した勾配で伸張する「一次」対角線を示し、これは配列がそれ自身と同一であるという事実に対応する。配列が（RACK1のように）反復エレメントを含む場合は、他のより短い、対角線上に整列した、実質的に一次対角線に平行で一次対角線からx-方向またはy-方向に外れた、数組の連続する点が存在する。これらのより短い線は、配列の反復エレメントの位置を同定する。各々の反復エレメントは、２組の表示された点を生じ、それらは一次対角線に対称に分布する。相同性マトリックス解析に表示されたデータを用いて、反復エレメントの配列をより詳細な解析のために位置づけておおまかに並べ得る。図1B中のy-軸上の〜 100と〜130との間の領域を示す水平な帯は、RACK1のその領域（すなわちアミノ酸約100とアミノ酸130との間のアミノ酸）の部分が、RACK1の配列中で総数７回反復しているという事実を際立たせる。矢印は、相同性マトリックスにおける反復を指す。おおまかなアラインメントの目的のために矢印により示された短い対角線を、y-軸上のアミノ酸〜100の水平線および指示された交差に対応するx-軸位置まで伸張し得る。例えば、第二の反復に対応する交差は（左から２番目の矢印）はx=〜50である。次に、この方法で決定された値を用いて、各々の連続的な反復と反復のアミノ酸配列を先行する反復の下に並べ得る。各々の反復の開始は、先行するパラグラフにおける解析により決定されたアミノ酸の位置におおよそ対応する。この方法で並べられたRACK1のアミノ酸配列を図1Cに示す。大部分の市販のDNAおよびタンパク質配列解析プログラムは、自己相同性マトリックス解析を実行する能力を有する。１つの例は、DNA Strider 1.2（Christi an Marck，Service de Biochemie et de Genetique Moleculaire，Department d e Biologie Cellulaire et Moleculaire，Direction des Sciences de la Vie - CEA - FRANCE）である。一旦反復エレメントが同定され、そして反復エレメントに対応する配列がおおまかに並べられれば、下記のように、反復内の特定の位置での個々の反復間の相同性の程度の定義に進み得る。 B．アミノ酸配列の整列自己相同性マトリックスを用いておおまかなアラインメントを得る場合は、配列を目でパーソナルコンピューターなどの上で、例えばテキストエディター、ドローイングプログラム、または配列解析プログラムを用いて並べ得る。アラインメントを達成するために有効なプログラムの例は、「MACDRAW PRO」（Claris Co rp.，Santa Clara，CA）および「WORD」（Microsoft Corp.，Redmond，WA）を包含し、これらの両方が「MACINTOSH」シリーズコンピューター（Apple Computer Corporation，Cupertino，CA）および「WINDOWS」（Microsoft Corp.）を作動するIBM互換性コンピューターで利用可能である。内部反復に対応するアミノ酸配列をまた、「MACVECTOR」（Eastman Kodak Co. , New Haven，CT）のようなタンパク質配列解析プログラムを使用して自動的に並べ得る。本発明方法によれば、並べられた配列をさらに検討してそれらがWD-40反復であると定義されるべき基準を満たすかどうかを決定する。これらの基準を、以下のパートＣで詳細に記載する。 C．WD-40反復を定義するアミノ酸配列。先のパートＡおよびＢで略述した工程、すなわち特定のタンパク質が内部反復を有するかどうかの決定が完了し、そしてそれらの反復を並べてそうであれば、並べられた反復がWD-40領域を含むかどうかを決定する必要がある。 WD-40モチーフは、配列の２つの末端（アミノ末端およびカルボキシ末端）に比較的良好に保存されたアミノ酸のセットを有する約25〜50アミノ酸の連続した配列としておおまかに定義される。WD-40反復含有タンパク質の少なくとも１つのWD-40反復の保存されたセットは、代表的には保存されたアミノ酸を特定の位置で含む。２つの連続するアミノ酸からなるアミノ末端のセットは、しばしばHi sが後に続くGlyを含む。６〜８の連続するアミノ酸からなるカルボキシ末端のセットは、代表的にはその第一位にAsp、そして最後の２つの位置にTrpおよびそれに続くAspを含む。 WD-40モチーフのより正確な定義は、先に同定されたような特定の残基が、WD- 40モチーフ内で常に保存されているわけではないが、モチーフ内の保存された位置が、代表的には制限されたクラスのアミノ酸から選択される残基により占められるという観察を組み入れる。選択された位置での保存された残基のクラスをより良好に定義するためには、アミノ酸を特定の共通の性質に基づいて分類することが必要である。個々のアミノ酸間の共通の性質を定義するための機能的な方法は、相同性の生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の標準化した頻度の解析である（Schulz）。このような解析によれば、アミノ酸のグループが定義され得る。ここで１つのグループ内のアミノ酸は互いに好ましく交換され、それゆえ全体のタンパク質構造に対するそれらの効果において互いに最も類似している（Schulz）。この方法で定義されたアミノ酸グループの例は（それらのいくつかは本明細書中でWD-40モチーフの定義に使用されている）、以下を包含する： (i)荷電グループ、GluおよびAsp、Lys、ArgならびにHisからなる、 (ii)正荷電グループ、Lys、ArgおよびHisからなる、 (iii)負荷電グループ、GluおよびAspからなる、 (iv)芳香グループ、Phe、TyrおよびTrpからなる、 (v)窒素環グループ、HisおよびTrpからなる、 (vi)大脂肪族非極性グループ、Val、LeuおよびIleからなる、 (vii)微極性グループ、MetおよびCysからなる、 (viii)小残基グループ、Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、GlnおよびPro からなる、 (ix)脂肪族グループ、Val、Leu、Ile、MetおよびCysからなる、および (x)小ヒドロキシルグループ、SerおよびThrからなる。先に示したグループに加え、各々のアミノ酸残基はそれ自身のグループを形成し得、そして個々のアミノ酸により形成されたグループは、単純に当該分野で一般に用いられるアミノ酸の１文字および/または３文字略記で呼ばれ得る。「WD-40」モチーフは本明細書中で、（包括的な）２セットの比較的良好に保存された残基の間のアミノ酸の連続したセットとして定義され、本明細書中で「アミノ末端セット」および「カルボキシ末端セット」と呼ばれる。アミノ末端セットは、２つの隣接したアミノ酸を含む。第１位の残基は代表的にはグループii、viまたはviiiから選択され、一方第２位の残基は代表的にはグループi、xまたはIleから選択される。第１位および第２位はしばしばそれぞれG lyおよびHisからなる。GlyおよびHis残基は、代表的にはWD-40含有タンパク質の並べられた反復の少なくとも１つの中に存在する。カルボキシ末端保存セットは、代表的には８残基を含むが、最低６残基を含み得る。このように同定されたWD-40モチーフ中の最も良好に保存された残基は、カルボキシ末端保存セットの第１のアミノ酸を構成するAsp残基である。Asp残基は、本明細書に示される実際のすべてのWD-40反復に存在する。Asp残基が存在しないこれらの反復において、その位置はグループiiiまたはGlyからの残基により占められる。カルボキシ末端保存セット中の最後の２つのアミノ酸は、代表的にはグループ ivまたはIle、およびiグループまたはviiiからそれぞれ選択される。第１のこれらの位置で最も一般的に用いられる残基はTrpである。Trpは代表的には任意の所定のタンパク質の少なくとも１つのWD-40反復に存在する。第２位は、単一の残基ではさほど一貫して占められないが、しばしばAspで占められる。Trp-Asp（WD ）の組み合わせは、WD-40反復の名称の起源の一部である。カルボキシ末端保存セットの内部部分に存在するアミノ酸は、末端残基に比較してさほど良好には保存されておらず、それらの総数は異なるWD-40反復において２残基まで異なり得る。カルボキシ末端保存セットのカルボキシ末端から第３位は、代表的にはグループviiiまたはixから選択され、より代表的にはixから選択される。カルボキシ末端保存セットのカルボキシ末端から第５位もまた、代表的にはグループviiiまたはixから選択され、より代表的にはixから選択される。 WD-40反復の長さ（アミノ末端保存セットおよびカルボキシ末端保存セットを含む）は、代表的には約25残基と約50残基との間であり、より代表的は、約29残基と約34残基との間である。分布は主に、アミノ末端保存セットとカルボキシ末端保存セットとの間に存在する残基数の差から生じる。特定のタンパク質におけるWD-40反復の数は、２から８より多くまでの範囲であり得る。平均の数は約５である。並べられた内部反復のセットがWD-40反復であるか否かの決定は、各々の反復を個別に検討するよりも、すべての反復を全体で検討することにより促進し得る。これは部分的には、すべての並べられた反復が、WD-40反復を同定するために役立つすべての保存配列を必ずしも含まないが、保存残基は代表的には反復の少なくとも１つにおいて出現するからである。例えば、図1Cは配列中に存在する内部反復を例示するために並べられたRACK1 アミノ酸配列を示す。すべての反復はWD-40反復であるが、例えば、反復VIのアミノ末端保存セットは、より通常の「GH」に反して「LD」を含み、そしてカルボキシ末端保存セットは、その第１位に高度に保存された「D」に反して「G」を含む。同様に、例えば、反復Iのカルボキシル保存セットは、最後の位置により通常の「WD」に反して「WK」を含む。特定の残基または残基のセットが、選択されたタンパク質のWD-40反復において良好に保存されるが、これらはWD-40反復において一般に保存され得ないことが認識される。このような残基または残基のセットは、いくつかの点で有用であり得る。例えば、これらは上記パートＢで記載のように、選択されたタンパク質中の内部反復のアラインメントの実行において使用され得る。この残基はまた、それに基づいて効果的な結合ペプチドが設計され得る領域の同定に有用であり得る（下の第VI節を参照のこと）。 D．RACK1におけるWD-40反復の同定本発明を支持して行われる実験において、結合してPKCを活性化するタンパク質をクローン化して配列決定した（実施例１を参照のこと）。推定アミノ酸配列の配列解析により、反復の存在が示された。この反復を並べて図1Cに示す。並べられた反復は、上記パートＡ、ＢおよびCで同定された基準の適用によりW D-40反復であると同定された。例えば、反復I、II、IIIおよびV中の保存アミノ末端セットは、代表的な「GH」からなるが、一方反復IV、VIおよびVIIにおいてセットは他の残基からなる。しかし、これらの他の残基は、先に適切な位置で保存されていると同定された少なくとも１つのアミノ酸グループに含まれる。保存カルボキシ末端セットは、高度に保存された「D」を反復VIを除くすべての反復中の第１位に含む。このセットの最後から２番目は、各々の反復において比較的良好に保存された「W」を含む。一方、最後の位置は反復II、VおよびVIにおいて代表的な「D」を含むが、他の反復においては他の残基を含む。まとめると、これらのデータはRACK1中に含まれる反復がWD-40反復であることを示す。データはまた、すべての反復がWD-40モチーフに代表的なエレメントのすべてを含むのではないが、配列を並べて全体で一緒に見た場合、WD-40モチーフはすべての反復において明白であることを例示する。 E．配列決定したタンパク質中のWD-40反復の同定。データを本発明を支持して、種々のタンパク質におけるWD-40反復がいかにして同定され得るかを例示し、そして本明細書中に記載の指図に従って当業者によりWD-40反復であると適切に同定され得るアミノ酸配列の多様性を例示するために蓄積した。WD-40含有タンパク質配列を同定するために用いられた２つの方法を実施例７に詳細に記載する。第１の方法において、それらの記載においてβ-トランスデューシンに相同性を有することが同定されたタンパク質を、上記パートＢ〜Ｄで詳細に記載したように、WD-40反復について検討した。30のタンパク質をこの方法で同定した。これらのタンパク質のアミノ酸配列を、並べられそして描写されるWD-40領域とともに、図12〜18、20〜27、29〜30、34〜35、37〜38、40および42〜50に示す。これらの配列は配列表中に、配列番号29〜35、37〜44、46〜47、51〜52、54〜55、 57および59〜67として示される。第２の方法において、その配列がコンセンサスWD-40モチーフ（配列番号262）に相同なタンパク質を同定し、WD-40反復について検討した。10のさらなるWD-40 反復含有タンパク質をこのストラテジーを用いて同定した。それらのタンパク質のアミノ酸配列を、並べられそして描写されるWD-40領域とともに、図11、19、2 8、31〜33、36、39、41および51に示す。これらの配列は配列表中に、配列番号2 8、36、45、48〜50、53、56、58および68として示される。他のタイプの検索は、WD-40反復を含み得るタンパク質の同定において同等に有効であり得る。例えば、GenBankまたはSwissProtのようなオンラインデータベースを、WD-40含有タンパク質の全体配列またはコンセンサスWD-40反復配列のいずれかを用いて検索し得る。種々の検索アルゴリズムおよび/またはプログラムを使用し得る。それらはFASTA、BLASTまたはENTREZを包含する。FASTAおよびBLA STはGCG配列解析パッケージ（University of Wisconsin，Madison，Wisconsin）の一部として入手可能である。ENTREZは、National Center for Biotechnology Information，National Library of Medicine，National Institutes of Health ，Bethesda，MDを通じて入手可能である。次に、タンパク質相同性検索で同定された配列を上記パートＡ、ＢおよびＣに記載のように解析して、潜在的なWD-40モチーフを同定する。一旦位置づけされれば、モチーフを並べ、そして有効な結合ペプチドを設計し得る。 F．新規なポリペプチド中のWD-40領域の同定。 WD-40反復を、新規なタンパク質中に、例えば上記パートＡ〜Ｄに記載の方法により、同定し得る。しかし、上記工程Ａ（相同性マトリックス）がWD-40反復の同定において必要とされないことが認識され得る。本発明の指図に従って、当業者は、例えば、単にWD-40反復に特徴的な性質の１以上の認識により、ある、おそらく新規なポリペプチドの配列をスキャンする間にWD-40モチーフを同定し得る。当業者が、それによって特定のモチーフがWD-40反復であるという結論に達する正確な方法は、それらがどのように同定されたかにかかわらず、相互作用するタンパク質の対の１つのメンバーの活性を改変または調節するために、および/ またはタンパク質−タンパク質相互作用を破壊するために有効なペプチドを設計するためのWD-40モチーフ由来の配列の使用ほど本発明に問題ではない。 VI．活性改変ペプチドの同定。特定のタンパク質中のWD-40反復のアラインメントおよび認識をして、WD-40含有タンパク質が本来会合するタンパク質と会合または結合するために有効であり得るペプチドまたは１組のペプチドの設計に進み得る。このような結合または会合は、タンパク質の活性を改変または調節することおよび/または相互作用するタンパク質の対の会合を破壊することが期待される。このようなペプチドの配列は代表的には、少なくとも１つのWD-40反復内に含まれる連続したアミノ酸配列と、同一でなければ相同である。タンパク質−タンパク質相互作用を破壊するために有効なWD-40由来のペプチドの選択の例は、RAC K-PKCおよびGβ/γ-βARK相互作用についてそれぞれ下のパートＣおよびＤに記載されている。 A．WD-40反復内の適切な領域の選択。推定の結合ペプチドを、WD-40反復の任意の部分から選択し得る。種々のWD-40 含有タンパク質間のある程度の相違を得ることが所望される場合は、ペプチドはアミノ末端保存セットとカルボキシ末端保存セットとの間の領域から選択されるべきであり、アミノ末端保存セットおよびカルボキシ末端保存セットを含むべきではない。この「中央領域」は、代表的に異なるWD-40含有タンパク質の間で末端領域に比べてより大きな配列の多様性を示し、そしてそれは図11〜51中で四角によりおおまかに示される。これらの図は種々のWD-40反復含有タンパク質のアミノ酸配列および並べられたWD-40反復を示す。中央領域内で、ペプチドは、破壊の標的となるタンパク質（単数または複数）の配列（単数または複数）を除いて、いかなる他の既知の配列にもほとんどまたはまったく相同でない配列から選択されるべきである。例えば、ペプチドrIII（配列番号４、７アミノ酸）およびrVI（配列番号７、８アミノ酸）は、それらが由来するWD-40反復のアミノ末端から５アミノ酸からのRACK1 WD-40反復のセグメント（それぞれIIIおよびVI）と同一である（図1Cを参照のこと、下線を付したセグメント）。結合ペプチドに対応するWD-40反復セグメントは、それぞれのWD-40反復の中央領域の左部分を含み、これらはRACK1中で良好に保存されていない。例えば、特定のWD-40含有タンパク質ファミリーのすべてのイソ型の相互作用を阻害することが所望される場合は、配列は、各々の標的されたイソ型の少なくとも１つのWD-40反復において共通するか高度に相同である有意な数の残基を含むように選択される。他方、イソ型特異的な試薬が所望される場合は、配列は特異的なイソ型のWD-4 0反復（単数または複数）から選択される。ここでこの配列は、関連するイソ型由来のWD-40配列中の残基と同一または高度に相同な有意な数の残基を含まない。 B．ペプチドのために適切な長さの選択。有効な結合ペプチドは、長さがわずか約４残基から40残基以上までの範囲で設計され得る。好ましくは、結合ペプチドは、少なくとも約６残基で、約20残基未満の長さを有する。長さは、部分的には、上記パートＡに記載のように他のWD-4 0反復に対する所望される相同性の程度により決定され、要求されるタンパク質間の多様性のレベルにより決定される。例えば、RACK1/PKC相互作用を阻害するためにRACK1配列から選択された結合ペプチドは、長さが７および８アミノ酸であった。ペプチドは標的配列に特異的に結合するために十分に長いが、他のWD-40反復結合タンパク質と交差反応しないために十分に短い。これらの性質により、以下の実施例６〜11に示すように、ペプチドは非常に選択的で特異的な効果を有し得る。 C．RACK1-PKC相互作用を阻害するためのRACK1 WD-40由来ペプチドの設計。ペプチドrIII（配列番号４、７アミノ酸）およびrVI（配列番号７、８アミノ酸）を、部分的に上記パートＡおよびＢに示された指図に従って設計した。これらのペプチドは、それらが由来するWD-40反復のアミノ末端から５アミノ酸からのRACK1 WD-40反復配列のセグメントと同一である。結合ペプチドに対応するWD- 40反復セグメントは、WD-40反復の中央領域の左部分を含む。これらのペプチドを、下記の第VII節および実施例６〜11に記載のように、インビトロおよびインビボでタンパク質−タンパク質相互作用を破壊するそれらの能力について試験した。 D．ヒトG-βのWD-40反復由来ペプチドはG-βサブユニットとβARKとの相互作用を阻害する。第Ｖ節パートＥに記載の方法を用いて、ヒトG-β（配列番号41）中のWD-40反復（配列番号128〜134）を同定した。最初の６つのWD-40反復由来のセグメントを、G-β結合ペプチド（配列番号13〜18）の設計のために選択した。セグメントを、上記パートＡおよびＢに詳細に記載した基準に基づいて選択した。 G-β結合ペプチドを用いてG-βサブユニットとβARKとの相互作用を破壊する。この破壊は、実施例４に記載の重層アッセイの改変を用いてアッセイされる。 VII．推定結合ペプチドの試験。以下で、それによってWD-40由来ペプチドの標的タンパク質への結合、タンパク質−タンパク質相互作用の阻害、および標的タンパク質の活性の改変または調節における有効性を測定し得るいくつかのアッセイを詳細に記載する。２つのタンパク質の互いへの結合を評価するために広く用いられている、１つのクラスのアッセイは、重層アッセイである。重層アッセイは、ほとんどのタンパク質に一般に適用し得る。例えばそれらは、実施例６に示され下記のパートＢに記載されるように、WD-40由来ペプチドのそれらの標的への結合を評価するために用いられ得る。重層アッセイはまた、WD-40由来ペプチドの、２つの相互作用するタンパク質（その１つがペプチドが由来したWD-40モチーフを含む）の結合を阻害する能力を評価するために用いられ得る（例えば、下記の実施例４およびパートＣを参照のこと）。他のアッセイを、標的タンパク質の活性へのWD-40由来ペプチドの効果を評価するために使用し得る。これらのアッセイは、インビボアッセイ、インビトロアッセイ、またはインビボおよびインビトロアッセイの組み合わせであり得る。使用されるアッセイは、関与するタンパク質ならびにペプチドがそれに対して標的される相互作用するタンパク質を含む系（単数または複数）および/またはプロセス（単数または複数）に依存する。例えば、下記のパートＤ〜Ｉに記載のアッセイは、PKCのインビボおよびインビトロでの活性の特徴付けに適切である。下記の多くのアッセイがPKCの活性の特徴付けに特に有用であるが、これらはまた、それによってWD-40由来ペプチドの他のタンパク質への効果が評価され得る実験の一般的な枠組みを例示する。Ａ．WD-40領域由来の推定の結合ペプチドの効力を評価するための重層アッセイ重層アッセイは、タンパク質ペアの結合する能力の破壊を評価するために使用され得る。重層アッセイを行うための方法は当分野で周知である（例えば、Moch ly-Rosenら、1991を参照せよ）。 PKC/RACK1の相互作用についての推定の結合ペプチドを評価するための重層アッセイの適用は、本明細書の実施例４および５に示されている。これらのアッセイは一般に以下のように説明され得る。相互作用するタンパク質（「固定化」タンパク質）ペアの１つのタンパク質は、当業者に公知の方法により、SDS/PAGEゲルで分離され、そして適切な膜（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン）上にブロットされ得る。続いて、ブロットは、推定の結合ペプチドの存在下および非存在下で、相互作用するタンパク質ペアの他方のタンパク質（「重層」タンパク質）を含む溶液と接触され得る。適切な洗浄工程の後に、結合された重層タンパク質は、適切なプローブ（例えば、この重層タンパク質に対する抗体）の使用により検出され得る。上記プロトコールに対する変形が、結合していない結合ペプチドと結合された重層タンパク質の存在を検出するために使用した抗体との間の可能な妨害を最小限にするために行われ得る。この修飾は、重層タンパク質を結合させる工程と抗体または他のプローブを用いてこの重層タンパク質を検出する工程との間での別のSDS/PAGE電気泳動を行う工程からなる。これは、重層タンパク質が（結合ペプチドの存在下または非存在下で）ブロットと接触されかつ結合された後に、ブロットをブロットされた固定化タンパク質により占められた面積を丁度含むサイズで片に切ることにより達成される。膜の片を、続いて、試料緩衝液でインキュベートし、第２のSDSポリアクリルアミドゲルのウェルに置き、そして電気泳動にかける。電気泳動の後、ゲルを上記のようにブロットし、そしてプローブ（例えば、抗体）と接触させて、結合された重層タンパク質を検出する。Ｂ．RACK1のWD-40領域と相同のペプチドにβPKCを結合させるペプチドＩ(配列番号１)、ペプチドrVI(配列番号７)およびコントロールペプチド(配列番号９)へのβPKCの結合は、実施例６で、実施例３に記載のPKC重層アッセイと類似のPKC重層アッセイを用いて評価した。ペプチドの漸増量を、スロット−ブロット装置を用いてニトロセルロースにのせた。これらの膜を、PS、DG 、およびカルシウムの存在下および非存在下でPKCと共にインキュベートした。データは図４に示されており、これらデータは、活性化されたPKCが５μmole のような低いペプチド量でペプチドＩおよびrVIの両方と結合するが、コントロールペプチドと結合しないことを示す。活性化されていないPKCはペプチドＩと結合しないが、同じ濃度のペプチドrVIと結合する。これらの結果は、これらのペプチドが互いに相同であり、かつ同じタンパク質と結合し得る一方、その挙動は異なることを示す。ペプチドrVI(配列番号７；８残基)は活性化型のPKCおよび活性化されていない型のPKCの両方と結合し得るが、ペプチドＩ(配列番号１；15残基)は活性化されたPKCのみと結合し得る。この結合特性間の相違は、例えば、２つのペプチド間の荷電の差および／または長さの差によるかもしれない。Ｃ．RACK1へのPKCの結合に対するRACK1のWD-40領域と相同のペプチドの効果 RACK1 WD-40反復(図１Ｃ、下線部分)の領域と同じ２つのペプチド(ペプチドrI II；配列番号４およびペプチドrVI；配列番号７)を、組換えRACK1へのPKCの結合を阻害するそれらの能力について、先に記載の重層方法の修飾を用いて試験した。実験は実施例４で詳述し、その結果は図３に示す。ペプチドＩは、ペプチドを添加しない場合の結合に比べて、組換えRACK1へのP KCの結合の81±6％の阻害を引き起こした。ペプチドrIIIおよびrVIの両方は共に PKCのRACK1への結合を阻害した。さらに、ペプチドrIおよびrIIもまた、PKCとRA CK1との相互作用の効果的な阻害剤であった。ペプチドrIVおよびrVでは、より少ない阻害効果が得られ、そしてペプチドrVIIでは、阻害が得られなかった。結合を阻害するペプチドの能力の相違は、PKCとRACK1との間のタンパク質−タンパク質相互作用における対応のWD-40反復により果たされる役割の相違を反映し得る。しかし、重層アッセイによりアッセイされたタンパク質−タンパク質相互作用を阻害するペプチドの能力または無能は、インビボおよびインビトロでのアッセイの両方により測定され、そして以下パートＤ−Ｉで記載されるように、これらのペプチドが有し得る、標的タンパク質の活性に対する効果とは必ずしも相関しない。Ｄ．PKC仲介の卵母細胞成熟に対するRACK1のWD-40領域と相同のペプチドの効果ペプチドＩ(配列番号１)、rIII(配列番号４)およびrVI(配列番号７)はまた、実施例７で詳述され、そして図5Aおよび5Cに示されるように、アフリカツメガエル卵母細胞におけるインスリン誘導の、PKC仲介の成熟に影響を及ぼすそれらの能力について試験された。 PKCはアフリカツメガエル卵母細胞の成熟に関与する。PKCを活性化させるホルボールエステル、またはPKCの構成的に活性な変異体の微量注入は、ホルモンの非存在下で卵母細胞の成熟の第１期を誘導する。インスリンへの曝露は、ジアシルグリセロールレベルの増加をもたらし、そして活性化されたPKCの微量注入はインスリン誘導の成熟を促進する（Stithら）。精製されたRACKタンパク質の微量注入は、卵母細胞成熟率の有意な低下をもたらす（Smithら、1992）。従って、インスリン誘導の卵母細胞成熟アッセイは、PKCの機能を妨害する化合物のための効果的なインビボアッセイを提供する。成熟応答は、卵母細胞の動物半球における白斑の出現（このことは、卵核胞崩壊(GVBD)および成熟を示す）をモニターすることにより定量された。指示されたペプチドをアフリカツメガエル卵母細胞に微量注入し、そしてインスリン曝露後のGVBDを有する卵母細胞の割合を時間の関数として図5AおよびＣに記入した。インスリンに曝露した擬似注入（コントロール）の卵母細胞の約80〜85％は成熟に達するのに対して、ペプチドＩで注入した卵母細胞は45〜50％しか成熟していない。これらの成熟した卵母細胞の成熟率は２つ場合で類似であった。ペプチドＩの効果と対照的に、ペプチドrIIIおよびrVIは共に、成熟率および実験の間に成熟する卵母細胞の全画分に関して、卵母細胞の成熟に対するインスリンの効果を促進した。ペプチドrIIIまたはrVIの注入は、成熟する卵母細胞の画分を実質的に100％まで増加させる。さらに、ペプチドrVIは、インスリン刺激の非存在下で卵母細胞成熟を誘導した（図5B）。上記のデータは共に、RACK1のWD-40領域と相同のペプチドはRACK1と相互作用するタンパク質（例えば、PKC）の機能を調整し得ること、この調整はインビボで起こり得ること、およびこの調整は明確かつ大きな生理的効果を有し得ることを示す。さらに、ペプチドrVIでの結果は、適切な条件下では、このペプチドが他の活性化物質の非存在で単独でPKCを活性化させるように作用し得ることを示唆する。Ｅ．アフリカツメガエル卵母細胞におけるPKCトランスロケーションに対するR ACK1のWD-40領域と相同のペプチドの効果インスリンは、卵母細胞ホモジネートの可溶性画分対粒子画分におけるPKCの相対的レベルによって示されるように、βPKCのサイトゾル型から膜結合型への再分布を引き起こすが、他のPKCイソザイムのサイトゾル型から膜結合型への再分布を引き起こさない。インスリン誘導のPKCトランスロケーションに対するRAC K1 WD-40由来のペプチドの効果を評価するために、指示されたペプチドを含む20 mMのNaCl溶液50nlをアフリカツメガエル卵母細胞に微量注入した。続いて、卵母細胞をホモジナイズし、そして可溶性画分および粒子画分中のPKCの相対的な量をアッセイした。続いてのプロトコールはSmithら(1992)により記載の方法の修飾であった。結果は図６に示される。ペプチドＩ(50μM)は、処理されていない卵母細胞におけるβPKCの分布に影響を及ぼさなかったが、インスリン誘導のβPKCトランスロケーションを阻害した( 図３、レーン７、８)。これに対して、ペプチドrVI(50μM)はインスリン処理の非存在下のβPKCトランスロケーションを誘導した（図３、レーン３、４）。これらの結果は、ペプチドＩがホルモン誘導PKCトランスロケーションのアンタゴニストであるが、ペプチドrVIがPKCトランスロケーションのアゴニストおよびアクチベーターであることを示唆する。実施例７に示された結果を照らして見れば、これらのデータはまた、ペプチドＩ微量注入後のインスリン誘導のGVBDの阻害が βPKCトランスロケーションの阻害に起因することを示唆する。Ｆ．Arg-CエンドペプチダーゼへのβPKCの感受性に対するRACK1のWD-40領域と相同のペプチドの効果 PKCを活性化すると、PKCのN末端の偽基質自己阻害性配列は、触媒部位から解離し、そしてこの分子をエンドペプチダーゼArg-Cに感受性にする（Orrら）。活性化されたβPKCのArg-Cへの曝露により、この酵素の制限タンパク質加水分解または「ニッキング(nicking)」が起こる。ニッキングにより、代表的には、78kDa のフラグメントおよびいくつかの小さなフラグメントが生じる。Arg-Cへの連続的な曝露の結果、代表的には、βPKCが消失する（Orrら）。ペプチドrIII(配列番号４)およびrVI(配列番号７)が他のアッセイでPKCアゴニスト活性を示した（例えば、実施例７および８を参照せよ）ため、実験を行って、これらのペプチドがPKCをエンドペプチダーゼArg-Cに感受性にするようにPKC を活性化し得るかどうかを測定した。この実験は実施例９に詳述され、そして結果は図７に示されている。 PKCアクチベーターの効果的濃度(0.8μg/ml DG、50μg/ml PSおよび1mM CaCl₂ )の存在下では、βPKCのArg-Cへの曝露の結果、ニッキングが起こり、78kDaフラグメントが生じた（図７、レーン２）。PKCアクチベーターの非存在下では、βP KC(80kDa)のエンドペプチダーゼArg-Cへの曝露は、この酵素に効果を有しなかった（図７、レーン１）。低濃度のアクチベーター(2.5μg/ml PSおよび50μM CaCl₂)では、βPKCとArg- Cとのインキュベーションによっては、添加ペプチドの非存在下、コントロールペプチド(配列番号９)の存在下およびペプチドＩ(配列番号１)の存在下で有意なニッキング活性が生じなかった（それぞれ、図７のレーン４、レーン８およびレーン９に示す）。しかし、ペプチドrIIIまたはrVIの存在下で同じ低濃度のアクチベーターとのβPKCのインキュベーションにより、78kDaのニッキングされたPK Cフラグメントが出現した（図４、レーン５〜７中のペプチドrVIの効果）。ペプチドrVIは10nMのような低濃度で、βPKC活性化を示すニッキング活性を生じるのに十分であった。これらの結果は、ペプチドrIIIおよびrVI（ペプチドＩではない）は、PKCを活性化されたコンホメーションに安定化するのに効果的であることを示す。この活性化されたコンホメーションは、PKCをArg-Cに感受性にしないような低PKCアクチベーターの条件下でこの酵素をArg-Cに感受性にする。Ｇ．βPKCの自己リン酸化に対するRACK1のWD-40領域と相同のペプチドの効果活性化されたPKCは自己リン酸化し得る。この自己リン酸化は、[γ-³²P]ATPとのインキュベーションによりアッセイされ得、そしてゲルのオートラジオグラフ上に可視化される。抗偽基質抗体は、PKCアクチベーターの非存在下で自己リン酸化を誘導することが以前に示された（Makowskeら）。ペプチドrVI(配列番号７ )は、PKCアクチベーターの非存在下でPKCトランスロケーションおよびGVBDを誘導するのに効果的であるため、実験を行って、このペプチドがPKCの自己リン酸化も誘導し得るかどうかを測定した。実験は実施例10に詳述され、そしてデータは図８に示される。 PS(50μg/ml)、DG(0.8μg/ml)およびCaCl₂(1 mM)で活性化したPKCは、自己リン酸化の正常レベルを示す（レーン１）。PKCアクチベーターの非存在下(レーン２)、あるいはPKCアクチベーターの非存在下であるがペプチドＩの存在下(配列番号１；レーン５)またはコントロールペプチドの存在下(配列番号９；レーン６ )では、自己リン酸化が見られなかった。これに対して、PKCアクチベーターの非存在下のペプチドrVIは、PKC自己リン酸化をPS、DG、およびカルシウムの最適濃度の存在下でのPKC単独で得られたレベルの80％以上まで誘導した（図８のレーン１(コントロール)とレーン４(ペプチドrVI)とを比較する）。Ｈ．βPKCによるヒストンリン酸化に対するRACK1のWD-40領域と相同のペプチドの効果 PKC活性の他の尺度は、ヒストンをリン酸化する活性化PKC酵素の能力である。ヒストンのPKCリン酸化を、Mochly-Rosenら(1987)により記載されたプロトコールの修飾を用いて行った。リン酸化を、PKCアクチベーター(PS、DGおよびカルシウム)およびRACK1由来のペプチドの存在下または非存在下で行った。リン酸化されたヒストンを、10％ゲル上のSDS-PAGEおよびそれに続くオートラジオグラフにより検出した。ペプチドrVI(配列番号７)はPKCアクチベーターの非存在下でPKCの自己リン酸化を誘導するのに効果的であり、そしてペプチドrIII(配列番号４)およびrVIの両方は共にPKCをArg-Cによるタンパク質加水分解に感受性にさせるため、実験を行って、PKCによるヒストンIII型リン酸化に対するこのペプチドの効果を特徴づけた。この実験を実施例11で詳述し、そして結果を図９および10に示す。これらの結果は、PKCの自己リン酸化に対するペプチドrVIの効果について得られた結果と同様であった。すなわち、ペプチドrVIは、PKCアクチベーターPS、DG およびカルシウムの非存在下でPKC仲介のヒストンリン酸化を誘導するのに効果的であり、このことは、ペプチドrVIがPKC活性化のアゴニストであることを再び裏つけた。ペプチドrIIIは同様にヒストンのリン酸化を誘導した（図10）。 VIII．有用性Ａ．標的細胞の同定のためのプローブとしてのペプチド WD-40由来のペプチドは、例えば、標的タンパク質をコードするクローンを発現ライブラリーから単離するために使用され得る。本明細書中で記載のクローニング方法に対する変形は、このペプチドに結合し得る配列を発現するクローンを同定するために使用され得る。例えば、WD-40由来のペプチドは、標準結合アッセイを用いて膜上の標的タンパク質を検出するために使用され得る。ポシティブなクローンは、例えば、このペプチドを放射標識し、そして膜をフィルムに曝すことにより検出され得る。このような方法で単離した標的タンパク質は完全に新規で有り得、またはそれらは、（例えば、ホモジネート中の生物学的活性、またはタンパク質ゲル上のバンドによって）部分的に特徴づけられ得る。結合タンパク質をコードするcDNAを単離すると、このcDNAは、例えば、本明細書に詳述されるように発現され得、そしてこのタンパク質は特徴づけられ得る。このように単離した精製タンパク質は、抗体の生成を含む多くの用途のために使用され得る。本発明の方法に従って設計されたペプチドはまた、例えば、組織ホモジネートのウェスタンブロットにおけるプローブとして使用されて、公知または推定の標的タンパク質の分子量を同定および測定し得る。先に記載のようなスクリーニングは、スクリーニングのために使用されるペプチドの種々のレポーター部分のいずれかを組み込む修飾により促進され得る。例えば、このペプチドが、¹²⁵Ｉで放射標識され得る。あるいは、これらのペプチドは、配列標識（sequence-tag）または親和性カラムためのリガンドを用いて、当業者に公知の方法により修飾され得る。これらのペプチドはまた、例えば、架橋のための当業者に公知の種々の親和性試薬のいずれかを用いて修飾されて、結合の後のこれらの標的に共有的に架橋され得る。このことは、これらのペプチドと比較的に弱く結合する標的タンパク質の単離を可能にする。Ｂ．欠損WD-40含有タンパク質のための代用品としてのペプチド WD-40含有タンパク質がある疾患に関連する場合（例えば、Reinerらを参照せよ）、欠損タンパク質のWD-40領域由来のペプチドは、例えば、標的酵素を活性化するための代用品として使用され得る。このようなアプローチは、無傷のタンパク質を用いる治療の試みよりも容易であり得る。このアプローチは、冒された遺伝子の染色体位置の知見を必要としないというさらなる利点を有する。これらのペプチドは、当業者に公知のいくつかの方法（適切な発現ベクターの使用、またはインビトロでの合成および効果的で便利な経路による投与を含む）のいずれかにより、冒された細胞に導入され得る。インビトロ研究は、スキニング(skinning)または微量注入技術を用いて行われ得る。Ｃ．薬剤としてのペプチド本発明のWD-40由来のペプチドは、先に記載のように、治療上に使用され得る。このようなペプチドは、内因性の標的分子と相互作用してそれらの機能を増加させるかまたは矯正するように設計され得る。あるいは、ペプチドは病原性生物に対して特有な標的分子と特異的に相互作用するように設計され得る。Ｄ．タンパク質-タンパク質の相互作用に関与するタンパク質の酵素活性の調整因子としてのペプチド本発明の方法に従って合成したペプチドは、標的分子の機能を調整するのに効果的で有り得る（例えば、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用する）。本明細書に示されるように、例えば、ペプチドrVIIIおよびrVIは、PKCの活性化を活性化するかまたは促進するために作用し得るが、ペプチドＩはPKCを阻害し得る。これらの活性は、PKCのような標的分子の機能に影響し得る他の化合物を同定するためのスクリーニングに使用され得る。特に、WD-40由来のペプチドがPKCとインビボでの相互作用（すなわち、タンパク質結合）とより類似した方式で相互作用し得るため、それらは、インビボでPKCの機能を妨害し得る分子または化合物を同定するために有用であり得るが、インビトロでは必ずしもPKCを妨害しないかもしれない。例えば、ペプチドrVIは、伝統的なPKCアクチベーターの非存在下でPKCを刺激するために使用され得、そしてrVIで刺激された酵素は、例えば、新規なPKC阻害化合物またはPKC増強化合物を同定するためのスクリーニングに使用され得る。標的酵素の構造的活性化または不活性化が所望される場合、ペプチドは、組み込まれたまたは誘導された架橋部を有して設計され得る。これらのペプチドは、標的分子が標的分子の寿命の間に活性の所望の状態を帯びるように、結合によってそれらの標的と架橋され得る。逆に、PKCについて本明細書で記載のように、ペプチドはまた、標的分子の分解を促進するように設計され得る。例えば、ペプチドrIIIは、心筋細胞中のPKC の分解を促進した。Ｅ．イソザイムの特異的な調整因子としてのWD-40由来のペプチド本発明の方法に従って設計したペプチドはまた、標的イソザイムに特異的な調整因子分子を提供するために使用され得る。例えば、ほとんどの細胞はいくつかのPKCイソザイムを有し、これらの全ては同じ細胞刺激により活性化される。従って、個々のイソザイムの機能を測定することは、困難である。特異的な標的イソザイムまたはイソザイムのグループを選択的に刺激または阻害するWD-40由来のペプチドは、治療の価値の点、ならびに細胞の機能および疾患における異なるイソザイムの役割の測定の点の両方において有用で有り得る。このような情報は、以下のパートＦに記載されているように、薬物開発用の新しい分子標的の同定のために有用で有り得る。Ｆ．薬剤としての結合ペプチドの予測された構造に基づいて設計した化合物 WD-40反復由来のペプチドは、薬物開発用のリード化合物（lead compound）を同定するに有用で有り得る。７残基のような小さなペプチドは、インビボでのそれらの標的との相互作用において特異的な生物活性を有することが本明細書で示された。このような小さなペプチドの構造は、多くの方法（例えば、NMRおよびＸ線結晶学）により容易に決定され得る。配列が同様であるが、標的分子においてそれらが引き出す生物学的活性が異なるペプチドの構造の比較は、標的酵素の構造−活性相関(SAR)に関する情報を与え得る。例えば、ペプチドＩならびにRACK1由来のペプチドrIII(配列番号４)およびrVI (配列番号７)は、それらの配列が相同であるにもかかわらず、インビボで反対の効果を有していた。構造−活性相関の試験から集めた情報は、標的酵素に関連して、予測された性質（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）について試験され得る修飾ペプチド、あるいは他の小分子またはリード化合物を設計するために使用され得る。リード化合物の活性は、ペプチド結合効果の評価に使用されるアッセイと同様のアッセイを用いて評価され得る。標的酵素のSARに関する情報はまた、共同結晶化研究により得られる。このような研究では、所望の活性を有するペプチドが標的タンパク質と共同して結晶化され、そしてこの複合体のX線構造が決定される。続いて、構造は、例えば、天然状態の標的タンパク質の構造と比較され得、そしてこのような比較からの情報は、特異的活性を有することが期待される化合物を設計するために使用され得る。これらの化合物は、ペプチド結合効果の評価に使用されるアッセイと同様のアッセイを用いて評価され得る。Ｇ．WD-40含有タンパク質における変異を同定するためのWD-40反復に対応する cDNAのPCR 本明細書で示した結果は、WD-40モチーフの中部領域がWD-40タンパク質とその標的タンパク質との結合に関与することを示唆する。この結合は、相互作用するタンパク質からなるポリペプチド複合体の活性に中心的役割を果たしているようであり、特定の遺伝的疾患は、WD-40含有タンパク質のこれらの領域における変異を含み得る。従って、WD-40含有タンパク質が遺伝子疾患に関与する場合、PCR を用いてWD-40領域由来のDNAを増幅させ、変異がWD-40モチーフの１つに含有されるかどうかを迅速にチェックすることが可能である。プライマーは、(i)各反復の隣接する領域または(ii)冒された遺伝子由来の一連のタンデム反復の隣接する領域のいずれかに対応して作成され得る。標準的な配列決定技術は、変異が存在するがどうかを決定するために使用され得る。この方法は、冒された遺伝子の事前の染色体マッピングを必要とせず、そして欠損WD-40タンパク質をコードする全遺伝子を配列決定する必要を除くことにより時間を節約し得る。Ｈ．親和性リガンドとしてのWD-40に基づくポリペプチド本発明のポリペプチド組成物は、一般に「第１のタンパク質」と呼ばれる目的のタンパク質に結合し得るため、このポリペプチド組成物はまた、試料からの目的のタンパク質を回収するために使用され得、そしてこのペプチドは、該タンパク質を精製および分析するクロマトグラフィー手順のための親和性リガンドとして使用され得る。代表的には、このポリペプチドは、固体支持体にカップリングされ、そして第１のタンパク質を含有すると推定される試料は本発明のポリペプチド組成物と接触され、試料の結合されていない成分は除去され、そして所望であれば、支持体に結合されたこの第１のタンパク質は溶出および回収される。Ｉ．候補物スクリーニング試験におけるペプチドの使用必ずしもポリペプチドではない、種々の候補化合物は、本発明のポリペプチドを競合物として用いて、第１のタンパク質に結合することが示され得る。これらのスクリーニングアッセイでは、第１のタンパク質に結合する候補化合物の能力は、この候補化合物の存在下および非存在下で第１のタンパク質を本発明のポリペプチド組成物と接触させること、および候補物の非存在に対立した候補物の存在下でのポリペプチドの結合のレベルを評価することにより評価され得る。候補物の存在下でのポリペプチド結合の低下は、候補物が第１のタンパク質に結合することを示す。より一般的には、タンパク質と第２のタンパク質に含まれたポリペプチドサブ配列との相互作用は、第１のタンパク質をサブ配列を表すポリペプチドと接触させ、そしてポリペプチド組成物とのすべての相互作用を観察することにより評価され得る。 IX．本発明のペプチドの生産本発明のポリペプチドは、アミノ酸からのペプチドの合成用の標準技法を用いて調製され得る。このような技法は、固相化学で行う場合、市販されている。本発明のポリペプチドはまた、組換え方法を用いて生産され得る。これらの方法は現在まで当分野で周知のものであり、所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNA分子は容易に合成され、そして当分野で理解されるようにペプチドの生産のための発現系に結合され得る。広範囲の宿主が利用可能であり、これには、原核宿主および真核宿主が挙げられる。これらの宿主を修飾する手段である発現ベクターの構築、およびポリペプチドの組換え生産のために修飾された宿主を培養することは、標準的な技法用いて行われる。以下の実施例は本発明を説明するが、本発明を限定しない。材料および方法ニトロセルロースフィルターをSchleicher and Schuell(Keene、NH)から得た。合成ペプチドを市販の自動ペプチド合成機を用いて調製した。あるいは、注文設計されたペプチドを、例えば、Bachem Bioscinece（King of Prussia、PA）から購入し得る。ペプチドはまた、ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列を発現することにより調製され得る。オリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド合成の標準方法により直接合成され得るか、または大きなコーディング配列の場合はコーディング配列に対応する複数のオリゴヌクレオチドフラグメントのタンデム配置を含む一連のクローニング工程により合成され得る（Crea；Yosh ioら；Eatonら）。オリゴヌクレオチドコーディング配列は、標準的な組換え手順により発現され得る（Maniatisら；Ausubelら）。「Triton」とは、ポリオキシエチレンエーテルおよび他の表面活性化合物を含む非イオン性界面活性剤を意味する。Triton界面活性剤の１例には、「TRITON X -100」があり、Sigma Chemical Company（St．Louis、MO）から入手できる。「Tween」とは、約55％のラウリン酸、および主としてミリスチン酸、パルミチン酸およびステアリン酸から構成される残量を有する脂肪酸組成物を伴うポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを含む非イオン性界面活性剤を意味する。Tweenの１例は、「TWEEN 20」であり、Sigma Chemical Company（St．Louis 、MO）から入手できる。「SDS」とは、ドデシル硫酸ナトリウムを意味する。「PAGE」とは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を意味する。「IPTG」とは、イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシドを意味する。実施例１ PKC結合タンパク質の発現クローニングＡ．緩衝液。重層ブロック緩衝液：50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.2M NaCl、3%ウシ血清アルブミン(BSA)、および0.1% ポリエチレングリコール。重層緩衝液：50mM Tris-HCl pH7.5)、0.2M NaCl、12mM 2-メルカプトエタノール、0.1% BSA、１% ポリエチレングリコール、10μg/mlのダイズトリプシンインヒビターおよび10μg/mlのロイペプチン。Ｂ．重層アッセイによる、PKC結合cDNAクローンの単離。 λファージクローニングベクター「UNI-ZAP XR」(Stratagene，La Jolla，CA) 中に構築された、ラット脳(Sprague Dawley)のcDNA発現ライブラリーを以下のように重層アッセイすることにより、スクリーニングした。 IPTGで誘導したcDNAライブラリープレートからのニトロセルロースフィルターのリフトを重層ブロック緩衝液中で２時間インキュベートした。次いで、フィルターを、１ユニットのラット脳PKCアイソザイムの混合物(α、β、γ、δ、εおよびζ、各約10nMの最終濃度)を含むまたは含まない重層緩衝液に移して、20分間、室温で、PKCアクチベーター(60μg/ml ホスファチジルセリン(PS)、２μg/m l ジアシルグリセロール(DG)、１mM CaCl₂)とともにインキュベートした。重層緩衝液中で３回の15分間洗浄を行った後、フィルターを、重層ブロック緩衝液中、抗αPKCモノクローナル抗体、抗βPKCモノクローナル抗体、および抗γ PKCモノクローナル抗体(1:1000希釈；Seikagaku Kogyo,Tokyo,Japan)、および抗 δPKCポリクローナル抗体、抗εPKCポリクローナル抗体および抗ζPKCポリクローナル抗体(1:500希釈；Life Technologies，Gaithersburg，MD)の混合物の存在下でインキュベートした。室温で16時間インキュベートした後、重層緩衝液中、フィルターを１回の洗浄当たり15分間で３回洗浄した。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗-ウサギ抗体またはアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗-マウス抗体(1:2000希釈、Boehringer Mannheim Biochemicals，In dianapolis，IN)を使用して、PKCの結合を測定した。アルカリホスファターゼ反応は、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイルリン酸p-トルイジン塩を基質として使用し、そして製造業者のプロトコルに従って実施した。 2.4×10⁶の組換え「UNI-ZAP」λファージプラークのライブラリースクリーニングは１つのクローン、pRACK1を与え、これはPKC重層膜において抗-PKC抗体と反応したが、コントロールの重層メンブレンにおいては反応しなかった。これらの結果は、pRACK1が、PKC結合タンパク質をコードすることを示唆する。Ｃ．陽性プラークからのcDNAのクローニングおよび配列決定。上記Ｂにおいて詳述されるようにして同定されたpRACK1クローンを、プラーク精製し、そして製造業者のプロトコルに従って(Stratagene，La Jolla，CA)、クローニングベクターのインビボ切除によりcDNA挿入片をファージミドとして単離した。pRACK1のDNA配列決定を、標準的なダイデオキシ配列決定技術(Maniatisら )を使用して行った。RACK1のDNA配列を図１Ａに示す。この配列はまた、配列表の配列番号19に含まれる。実施例２ E.coliにおける組換えRACK1タンパク質の発現および精製 pRACK1の推定翻訳開始部位(図１Ａにおける下線を付したATG参照)から317アミノ酸のオープンリーディングフレームおよび開始メチオニンの上流の８個の付加的なヌクレオチドを含むPstI/XhoI DNAフラグメントを、E.coli発現ベクターpMA L-c2(New England BioLabs，Beverly,MA)にサブクローニングした。このベクターは、マルトース結合タンパク質(MBP)をコードするma1E遺伝子を含有している。ベクターを含有するE.coliを誘導することにより、MBP融合タンパク質を生成する(Ausubelら)。このベクターはまた、プロテアーゼ因子Xaの認識部位を含み、これにより、精製後タンパク質にベクター由来の任意の残基を付加することなく、目的のタンパク質をMBPから切断することが可能になる。 RACK1含有pMAL-c2で形質転換したTB1 E.coliの培養物を、1.8mMのIPTGと３時間インキュベートすることにより誘導した。MBPに融合したRACK1からなる78kDa 融合タンパク質を含むタンパク質画分を、標準的な方法(Ausubel)によって培養したE.coliから単離した。製造業者のプロトコルに従って(New England BioLabs ，Beverly，MA)、アミロースアフィニティーカラム上で融合タンパク質を精製し、そしてプロテアーゼXa(New England BioLabs)とインキュベートして、36kDaタンパク質(RACK1)および34kDaタンパク質(おそらくはRACK1分解産物)を得た。実施例３組換えRACK1に対するPKCの結合Ａ．緩衝液。 PBS/Tween緩衝液：140mM NaCl、８mM Na₂PO₄、1.5mM KH₂PO₄、３mM KClおよび 0.05% Tween、pH7.0。重層洗浄緩衝液：50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.2M NaCl、12mM 2-メルカプトエタノール、0.1% ポリエチレングリコールおよび0.1mM CaCl₂ Ｂ．重層アッセイ。精製された組換えRACK1タンパク質(100-250μg／レーン、実施例２において詳述されるように生成した)をSDS/PAGEで泳動し、そしてニトロセルロースメンブレンにブロットした(Ausubel)。ニトロセルロースメンブレンを小片に切り、PKC アイソザイム(α、β、γ、δ、εおよびζ、各最終濃度約10nM)、およびPKCアクチベーター(60μg/ml ホスファチジルセリン(PS)、２μg/ml ジアシルグリセロール(DG)、および1mM CaCl₂)の混合物の存在下または非存在下で、0.5時間、重層緩衝液(実施例１)中でインキュベートした。非結合物質を、重層洗浄緩衝液中で、各５分間の５回の洗浄により除去した。示される場合、ニトロセルロース小片とともにPKCをインキュベートする間、PKCアクチベーターが在した。各サンプルの条件および対応する結果は、以下のＤに示す。Ｃ．結合したPKCの検出。ニトロセルロース小片上に固定化されたRACK1に対して結合したPKCを次のように検出した。実施例１のＢにおいて詳述されるように、小片を、抗PKC抗体の混合物とともに室温で16時間インキュベートし、次いでPBS/Tween緩衝液で１回の洗浄当たり15分間で３回洗浄した。小片を、2%のBSAを補充したPBS-Tween緩衝液で、1:1000希釈した抗マウスおよび抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合２次抗体(Amersham Life Science，Arlington Heights,IL)とともに１時間、室温でインキュベートした。PBS／Tween緩衝液で１回の洗浄当たり15分間で３回洗浄した後、小片について製造業者のプロトコル(Amersham Life Science，Arlingto n Heights,IL)に詳述されるように、ルミノール(ジアシルヒドラジド)とともに化学ルミネセンス反応を行い、次いで30秒間〜５分間オートラジオグラフィーフィルム(Eastman Kodak，Rochester，NY)に直ちに感光した。Ｄ．RACK1へのPKC結合に対するPKC活性化の効果。図２において表される結果は、ニトロセルロースメンブレン上で固定化された RACK1へのPKCの結合に対するPKCアクチベーターの影響を示す。重層アッセイは、上記Ｂにおいて詳述されたように行った。各サンプル中に含まれる試験試薬および図２において示されるブロット上の対応するレーンは次のようである。レーン１：PKC、60μg/ml PS、２μg/ml DGおよび１mM CaCl₂；レーン２：PKCおよび１ mM EGTA；レーン３：PKC、60μg/ml PSおよび２μg/ml DG；レーン４：PKCおよび１mM CaCl₂；レーン５：PKC添加せず；レーン６および７：PKC、60μg/ml PS 、２μg/ml DG、１mM CaCl₂、および10μM基質ペプチド(配列番号11；レーン６) または10μM偽基質ペプチド(配列番号12；レーン７)。結果は３回の独立した実験の代表例である。抗PKC抗体により検出されるように、PKCの結合は、EGTAまたはカルシウム単独の存在下では最少であり(それぞれ図２、レーン２、４)、ホスファチジルセリン (PS)およびジアシルグリセロール(DG；レーン３)の存在下ではより大きく、そしてPS、DGおよびカルシウムの存在下で最大である(レーン１)ことが理解され得る。抗体結合は、添加PKCの非存在下においては見られなかった(レーン５)。さらに、マルトース結合タンパク質単独、または非形質転換E.coli由来の抽出物は、 PKCに結合しなかった。 RACK１に対するPKC結合の濃度依存性は、βPKCで特徴づけた。なぜなら、このこのアイソザイムは重層アッセイで使用したPKC混合物の主要成分であるからである。半最大結合(half maximal binding)の平均は約0.375nMであり、そして最大結合は約4nMであった(n=３；値は他のPKCアイソザイム存在下でのβPKCアイソザイムの結合を反映し、そしてMochly-Rosenら(1991)において詳述されるように、検出の直線範囲でオートラジオグラムを走査することにより測定した。上記で示した結果は、PKCがRACK1に結合するために、それが活性化されねばならないことを示す。インビトロでは、活性化は、例えば、ホスファチジルセリンおよびジアシルグリセロールにより、または、より好ましくは、ホスファチジルセリン、ジアシルグリセロールおよびカルシウムにより達成され得る。実施例４ RACK1に特異的なWD-40相同ペプチドによる、RACK1へのPKC結合の阻害推定の結合ペプチドによるRACK1へのPKC結合の阻害についてのアッセイを、上記の実施例３のＢにおいて詳述される重層プロトコルの改変プロトコルと下記のＢにおいて詳述される重層抽出アッセイとを組み合わせることにより行った。重層プロトコルの改変プロトコルは、PKCアイソザイム混合物を、固定化RACK1を含有するニトロセルロース小片に接触するために使用する前に、推定の結合ペプチドをPKCアイソザイムの混合物と15分間室温でインキュベートすることからなった。Ａ．緩衝液。サンプル緩衝液：0.3M Tris HCl、５% SDS、50% グリセロール、0.01% ブロモフェノールブルーおよび５% β-メルカプトエタノール。Ｂ．重層抽出プロトコル。 PKCアイソザイムの混合物を含有する溶液と接触させた、固定化RACK1を含有するニトロセルロース小片を洗浄し、そして36kDa(RACK1含有)のバンドに対応する領域を切出した。この小断片(PKC/RACK1複合体含有)を、サンプル緩衝液とともに10分間、80℃でインキュベートした。次いで、サンプル緩衝液およびニトロセルロース片をPAGEゲル中のウェルにおき、そしてSDS-PAGEを行い、結合したタンパク質を溶出した。ゲルをニトロセルロース上にブロットし、そして実施例１のＢにおいて記載した抗体の混合物(PKCα、β、γ、δ、εおよびζアイソザイムに特異的)を使用して、ウェスタンブロット分析を行った。結合した抗体を¹²⁵I- プロテインＡにより検出した。Ｃ．結合性ペプチドの存在下でのPKC重層。 RACK1のWD-40反復に由来するペプチドまたは相同なペプチドを、組換えRACK1 に対するPKCの結合を阻害するそれらの能力について試験した。RACK1に対するPK Cの結合を、実施例３のＢにおいて記載される重層手順の改変手順を使用して行った。実験サンプルにおいて、ペプチドをラット脳PKCアイソザイム類(各約10nM )の混合物を含有する溶液と、15分間、室温でインキュベートした。改変された重層プロトコルが完了した後、サンプルについて、上記Ｂにおいて詳述される重層抽出プロトコルを行った。図３における結果は、ペプチドを、PKCとプレインキュベートしないで(レーン１)またはプレインキュベートして(レーン２〜４)行った、RACK1に対するPKCの結合を示す。レーン２は、10μMのペプチドI(配列番号１)とプレインキュベートした後のPKCの結合を示す。ペプチドIは、添加されるペプチドが存在しない場合の結合に比べると、組換えRACK1に対するPKCの結合を81±６%阻害した(n=３)。レーン３および４は、それぞれ、10μMのペプチドrIII(配列番号４)および10μM のペプチドrVI(配列番号７)とプレインキュベートした後のPKCの結合を示す。両方のペプチドがRACK1に対するPKCの結合を阻害する。ペプチドrIIIは、幾分ペプチドrVIよりも効果的であることが観察され得る。示される結果は、３回の独立した実験の代表である。重層抽出法(上記、Ｂ)を、RACK1に対するPKC結合阻害のある部分が、PKC/RACK 1複合体への抗-PKC抗体の結合阻害を表す可能性を減少するために、PKC結合のペプチド阻害に関する実験で使用した。抗-PKC抗体により固定化されたPKC/RACK1 複合体をブロットおよび検出する前に、２回目のSDS/PAGEの間に、遊離ペプチドはPKC/RACK1複合体から効果的に除去される。実施例５ WD-40反復を含有する配列決定されたタンパク質の同定 ENTREZプログラム、リリース6.0(National Center for Biotechnology Inform ation，National Library of Medicine，National Institutes of Health，Beth esda，MD)を使用して、WD-40モチーフを含有するタンパク質についてサーチを行った。ENTREZデータベースをトランスデューシン(transducin)のβサブユニットに関連するタンパク質配列についてサーチした。 βトランスデューシンに相同なタンパク質配列を、上記の明細書のセクションＶに示されるWD-40反復の同定のための指針に従って、WD-40反復の存在について試験した。これらのタンパク質はまた、WD-40反復を含み得るが、トランスデューシンの βサブユニットには相同でない他のタンパク質を同定するため、データベースのさらなるサーチを行うために使用した。２回目のサーチの間に同定された配列を、再度WD-40反復について試験した。このサーチ戦略で、WD-40配列を含有する30のタンパク質を同定した。並べられ、輪郭が示されたWD-40領域を有するこれらのタンパク質のアミノ酸配列は、図12〜18、20〜27、29〜30、34〜35、37〜38、40および42〜50に示される。配列は、配列番号29〜35、37〜44、46〜47、51〜52、54〜55、57および59〜67として配列表に表される。図中の配列の検査で、異なるタンパク質のWD-40モチーフ間に相違があり得るものの、一致したパターンが、上記の明細書の第Ｖ部において示される技術に基づいて推論され得る。 WD-40のコンセンサス配列(配列番号262)を使用した別のサーチを、「MACVECTOR」プログラム(Eastman Kodak Co.，New Haven，CT)を用いて行い、GenBank(1993 年12月にリリース)をサーチした。デフォルト設定(default setting)(マトリクス=250)をサーチのために使用した。サーチによりコンセンサス配列に最も高い相同性を有する250個のタンパク質を同定した。これらのタンパク質を、上記の第Ｖ部において詳述されるように、WD-40反復について検査した。WD-40反復を含有する10個の別のタンパク質が、この戦略で同定された。並べられ、輪郭を示されたWD-40反復を有するこれらのタンパク質のアミノ酸配列を、図11、19、28、3 1〜33、36、39、41および51に示す。配列を、配列番号28、36、45、48〜50、53 、56、58および68として配列表に示す。実施例６ RACK1 WD-40に由来するペプチドに対するβPKCの結合Ａ．緩衝液。ペプチド重層ブロック緩衝液：20mM Tris-HCl(pH7.5)、0.2M NaCl、３%ウシ血清アルブミン(BSA)および0.1% ポリエチレングリコール。重層洗浄緩衝液：50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.2M NaCl、12mM 2-メルカプトエタノール、0.1% ポリエチレングリコールおよび0.1mM CaCl₂。Ｂ．固定化ペプチドのPKC重層。ペプチドI(配列番号１)、ペプチドrVI(配列番号７)およびコントロールペプチド(配列番号９)に対するβPKCの結合を、実施例３において詳述したアッセイと類似のPKC重層アッセイを用いて評価した。20mM NaClに懸濁した増加する量のペプチド(0.5μモル、1.0μモル、5.0μモルおよび10.0μM)を、スロットブロット装置(SchleicherおよびSchuell，Keene，NH)を使用してニトロセルロース上に個別に適用した。ニトロセルロースメンブレンをペプチド重層緩衝液中、１回の洗浄当たり15分間で３回洗浄し、そしてペプチド重層ブロック緩衝液中で２時間インキュベートした。メンブレンを切片に切断し、そして切片を異なるPKC含有溶液に移し、そして30分間、室温でインキュベートした。全ての溶液は、ペプチド重層緩衝液中に５nMのラット脳PKCを含んでいた。いくつかの溶液は、さらに、P S、DGおよびカルシウムを含んでいた。次いで、メンブレンをペプチド重層緩衝液中、１回の洗浄当たり15分間で３回洗浄し、そして抗-βPKCモノクローナル抗体(1:1000希釈；Seikagaku Kogyo，Tokyo，Japan)を含有するペプチド重層ブロック緩衝液中でインキュベートした。室温で16時間インキュベートした後、フィルターをペプチド重層緩衝液中、１回の洗浄当たり15分間で３回洗浄した。 PKCの結合を、実施例３のＣにおいて記載されるように、化学ルミネセンス反応を使用して測定した。PKC結合の定量を、「MICRO SCAN」1000ゲル分析器(Galai Inc.,Yokneam，Israel)を使用して行った。データは、５μモルという低ペプチド量で、活性化されたPKCがペプチドIおよびrVIの両方に結合したが、コントロールペプチドには結合しなかったことを示す。活性化されないPKCは、同じ濃度で、ペプチドIには結合しなかったが、ペプチドrVIには結合した。これらの結果は、ペプチドrVIが活性化された形態のPKCおよび活性化されない形態のPKCの両方に結合し得るのに対して、ペプチドIは、活性化されたPKCにのみ結合することを示す。実施例７ PKC介在卵母細胞成熟に対するRACK1 WD-40由来ペプチドの効果インスリンへの曝露は、PKC依存性経路を介してアフリカツメガエル卵母細胞における成熟を誘導する(Smithら、1992)。成熟応答は、卵核胞崩壊(GVBD)および成熟を示す卵母細胞の動物半球(animal hemisphere)における白点の出現をモニターすることにより定量され得る。インスリンで誘導されるPKC介在成熟に対するRACK1 WD-40由来ペプチドの効果を評価するために、示されたペプチド[ペプチドI(配列番号１；●)、ペプチドrVI(配列番号７；■)、または注入液(□)](50 μMのペプチド)を含む50nlの20mM NaCl溶液をアフリカツメガエル卵母細胞中へマイクロインジェクトした。記号は、この実施例に由来するデータを示す図５で使用される記号である。ペプチドを注入した１時間後、卵母細胞をインスリン(8 .25μg/ml)を含有する溶液に２分間曝した(t=0)。10〜15個の卵母細胞を各サンプルについて使用した。３回の独立した実験の代表であるデータを、インスリン曝露後にGVBDを有する卵母細胞のパーセントとして表し、図５に時間の関数としてプロットする。緩衝液またはコントロールペプチドを注入した卵母細胞において、成熟の開始は、代表的には、インスリンへの曝露後４〜５時間後であった。この遅延の後は、％GVBDは、ほぼ指数的時間経過に従い、約10〜12時間で約85〜90% GVBDのプラトーに達した。これらのデータは、t=0でインスリンに曝された偽注入された卵母細胞の約80〜85%が成熟に達し、実験の時間経過(20時間)に対して比較的速く( 約10時間以内)成熟に達することを示す。ペプチドI(配列番号１)を注入した卵母細胞は、プラトーが約45〜50% GVBDであった以外は、コントロール卵母細胞に類似した様式で応答した。これらのデータは、ペプチドIの注入が、通常は成熟へと促進し得る卵母細胞の約40〜45%で成熟をブロックしたが、残り(50〜55%)の卵母細胞の成熟の動態または範囲にはほとんど影響がなかったことを示す。ペプチドrVI(配列番号７)を注入した卵母細胞は、僅かにより短かい遅延(約３〜４時間)で応答したが、コントロールの卵母細胞よりも速く(約５時間以内)、より高いプラトー(約95〜100%のGVBD)に達した。これらのデータは、ペプチドrV Iが、成熟速度に関しておよび実験の間に成熟する卵母細胞の全画分においての両方で、卵母細胞の成熟に対するインスリンの効果を増すことを示唆する。ペプチドrVIの注入は、成熟する画分を本質的に100%まで増加する。 GVBDに対するペプチドIおよびペプチドrVIの両方の効果は、５μm〜500μMの間で濃度依存性であった。ペプチドrVIが、インスリンで誘導されるGVBDを増強するので、ペプチドrVIが、インスリンの非存在下でGVBDを誘導し得るかどうかを決定するために実験を行った。これらの実験からのデータを図５Ｂに示す。ペプチドrVI(50μM)単独のマイクロインジェクションは、GVBDを誘導したが、ペプチドI、コントロールペプチドまたは緩衝液はGVBDを誘導しなかった。成熟は、図５Ａ中の、コントロールのインスリン誘導卵母細胞において(約４〜５時間)よりも長い遅延(約６〜７時間)で開始され、そして約50%GVBDのプラトーに到達した。同時に、上記のデータは、RACK1のWD-40領域に相同なペプチドがPKCの機能を調節することを示す。ペプチドIは、PKCが介在する卵母細胞成熟を約40%阻害し、その一方ペプチドrVIは、インスリン誘導成熟を増加し、そしてインスリンの非存在下でさえ限られた成熟応答を生じた。後者の結果は、適切な状況下で、ペプチドrVIが、他の活性化物質の非存在下で、PKCを活性化するために作用し得ることを示唆する。実施例８アフリカツメガエル卵母細胞におけるPKCトランスロケーションに対する RACK1 WD-40由来ペプチドの効果Ａ．緩衝液。ホモジナイズ緩衝液：20mM Tris HCl(pH7.5)、10mM EGTA、2mM EDTA、0.25M スクロース、10μM フェニルメチルスルホニルフルオライド、ロイペプチンおよびダイズトリプシンインヒビター各20μg/ml。Ｂ．卵母細胞におけるPKCのトランスロケーション。インスリンは、可溶性画分と卵母細胞ホモジネートの粒子画分におけるPKCの相対レベルにより証明されるように、βPKCの細胞質ゾル形態から膜結合形態へのトランスロケーションを引き起こすが、他のPKCアイソザイムのトランスロケーションは引き起こさない。インスリンで誘導されるPKCトランスロケーションに対するRACK1 WD-40由来ペプチドの効果を評価するために、示されたペプチドを含有する50nlの20mM NaCl溶液をアフリカツメガエル卵母細胞にマイクロインジェクションした。次いで、卵母細胞をホモジナイズし、そして可溶性画分および粒子画分におけるPKCの相対量をアッセイした。従ったプロトコルは、Smithら (1992)により記載される方法の改変方法である。結果を図６に示す。 50個の卵母細胞のバッチにペプチドrVI(配列番号７；50μM；レーン３、４)、ペプチドI(配列番号１；50μM、レーン７、８)または注入液(NaCl 20mM、レーン１、２および５、６)のいずれかをマイクロインジェクトした。各バッチ由来のホモジネートを、マイクロインジェクションの60分後(レーン１〜４)、またはインスリン添加の60分後(レーン５〜８)に調製した。ホモジネートを10,000gで３分間遠心分離し、上層(脂質および卵母細胞黄を含有)を除去し、そして残りを-7 0℃で凍結した。使用する前に、サンプルを解凍し、200μlのホモジナイズ緩衝液を添加し、そしてサンプルを100,000gで30分間、４℃で遠心分離した。上清( 可溶性画分)を取り出して「CENTRICON」濃縮装置(Amicon，Beverly，MA)を用いて2 0μlに濃縮した。ペレット(粒子画分)を20μlのホモジナイズ緩衝液に溶解した。サンプルを８%のSDS/PAGEゲルで分析し、そしてニトロセルロース上にブロットした。各画分におけるPKCの量を抗-βPKC抗体(1:1000希釈；Seikagaku Kogyo ，Tokyo,Japan)を使用してウェスタンブロットにより測定した。結合した１次抗体を実施例３のＣにおいて記載したように化学ルミネセンスにより検出した。抗体は、βPKCに対応する約80kDaタンパク質との免疫反応性を示した。データは、３回の実験の代表である。データを図６に示す。レーン１、３、５および７は、粒子画分(p)を含有し、レーン２、４、６および８は、可溶性(細胞質ゾル)画分(c)を含有する。ペプチドI(50μM)は、未処理の卵母細胞においてβPKCの分布に影響しなかったが、インスリンで誘導されるβPKCのトランスロケーションを阻害した(図３、レーン７、８)。対照的に、ペプチドrVI(50μM)は、インスリン処理をしない場合においてβPKCのトランスロケーションを誘導した(図３、レーン３、４)。上記の結果は、ペプチドIはインスリンで誘導されるPKCのトランスロケーションのアンタゴニストであり、その一方ペプチドrVIはアゴニストおよびPKCトランスロケーションのアクチベーターであることを示唆する。実施例７において示される結果を考慮すれば、このデータはまた、ペプチドIのマイクロインジェクション後にインスリンで誘導されるGVBDの阻害は、βPKCトランスロケーションの阻害に起因したことも示唆している。実施例９ Arg-CエンドペプチダーゼへのPKCの感受性に対するRACK1 WD-40 由来ペプチドの効果Ａ．緩衝液。サンプル緩衝液：0.3M Tris HCl、５% SDS、50% グリセロール、0.01% ブロモフェノールブルーおよび５% β-メルカプトエタノール。Ｂ．Arg-CエンドペプチターゼによるβPKCのニッキング(nicking)。 PKCの活性化に際し、分子のＮ末端で偽基質の自己阻害配列は触媒部位から分離され、そしてエンドペプチダーゼArg-Cに対して感受性になる(Orrら)。PKCアクチベーターの非存在下では、80kDa βPKCのエンドペプチダーゼArg-Cへの曝露は、酵素に対してなんら影響を有さない(図７、レーン１を参照のこと)。しかし、PKCアクチベーターであるPS、DGおよびカルシウムの存在下では、βPKCのArg- Cへの曝露は、PKCのニッキング(すなわち、78kDaのフラグメントおよびいくつかの小さなフラグメントを生成する限定されたタンパク質分解(図７、レーン２を参照のこと))を生じる。Arg-Cへの曝露を続けるとβPKCが消失する(Orrら)。本実験は、RACK1のWD-40領域に由来するペプチドが、エンドペプチダーゼArg-Cに対するβPKCの感受性を改変するかどうかを試験する。 Arg-C感受性をアッセイするために使用される方法は、Orrらにより記載される方法の改変方法である。ラット脳PKC(約５nM)を、示されるペプチド(最終濃度10 μMまたは示されるように)、PS、DG、およびカルシウム(示されるように)の存在下または非存在下で、500μlの20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)単独またはArg-C(５ユニット/ml)中室温でインキュベートした。示されるような(レーン５および６を除き、全てのレーンでサンプルを30分間インキュベートし、レーン５および６は、それぞれ５分間および15分間インキュベートした)反応の間、50μlのアリコートを20μlのサンプル緩衝液中に移した。サンプルを10分間、80℃で煮沸し、そして８%のSDS/PAGEにかけた。βPKCを、実施例６および８において記載したように抗-βPKC抗体を用いてウェスタンブロット分析により検出した。結果を図７に示す。PKCを、単独で示される時間(レーン１)、またはArg-Cの存在下(レーン２〜９)で、DG(0.8μg/ml)、PS(50μg/ml)およびCaCl₂(１mM；レーン２)とともに、PS(50μg/ml)およびCaCl₂(１mM；レーン３)とともに、PS(2.5μ g/ml)およびCaCl₂(50μM；レーン４)とともに；PS(2.5μg/ml)、CaCl₂(50μM)およびペプチドrVI(配列番号７；10μM；レーン５〜７)、コントロールペプチド( 配列番号９；レーン８)のいずれかとともにまたはペプチドI(配列番号１；レーン９)とともにインキュベートした。ペプチドを添加せずに低濃度のアクチベーター(2.5μg/mlのPSおよび50μMのC aCl₂)で、Arg-CとβPKCとをインキュベートすると、感知し得るニッキング活性を生じなかった(図７レーン４)。同様に、この濃度のアクチベーターの存在下では、ペプチドI(レーン９)またはコントロールペプチド(レーン８)を使用しても、βPKCのニッキングは生じなかった。しかし、ペプチドrVIの存在下では同じ濃度のアクチベーターとβPKCのインキュベーションで、78kDaのニックの入ったPK Cフラグメントが時間に依存して出現した(図４、レーン５−７)。10nM程度の低濃度のペプチドrVIが、βPKC活性化を指示するニック活性を生じるに十分であった。この結果は、ペプチドIではなく、ペプチドrVIが低濃度のPKCアクチベーター条件下で(そうでなければArg-Cに酵素感受性を与えないであろう)、PKCをArg- C感受性にする活性化形態に安定化するために有効であることを示す。実施例10 PKCの自己リン酸化に対するRACK1 WD-40由来ペプチドの効果活性化PKCは自己リン酸化し得る。ペプチドrVI(配列番号７)は、インスリンなどのアクチベーターの非存在下で、PKCのトランスロケーションおよびGVBDを誘導するために効果的であるので、PKCアクチベーターの非存在下でペプチドがPKC 自己リン酸化を誘導する能力を評価した。 Makowskeらにより記載される方法の改変方法を使用して、βPKCの偽基質抗体または示されたペプチドの存在下で、PKC自己リン酸化を行った。先に、PKCアクチベーターの非存在下で自己リン酸化を誘導することが示された抗-偽基質抗体( Makowskeら)を陽性コントロールとして使用した。結果を図８に示す。ラット脳PKC(約10nM)を、実施例１のように、抗-βPKC偽基質抗体(1:10希釈、 Life Technologies，Gaithersburg，MD)または示されたペプチド(10μM)のいずれかとともに、最終容量250μlの重層緩衝液中、穏和な撹拌でインキュベートした。示される場合、PS(50μg/ml)、DG(0.8μg/ml)およびCaCl₂(１mM)もまた添加した。自己リン酸化の量を、抗-偽基質抗体との反応については２時間後、または他のサンプルについては15分後に測定した。50μlの緩衝液は、20m MTris-HCl (pH7.5)、20mM MgCl₂、20μM ATPおよび５μci/ml[γ-³²P]ATPからなった。混合液を15分間室温でインキュベートし、そして反応を60μlのサンプル緩衝液を添加することにより停止した(実施例９を参照のこと)。次いでサンプルを10分間煮沸し、10%のSDS/PAGEミニゲルにロードし、そして電気泳動した。ゲルを50%メタノールおよび10%の酢酸で１時間固定し、そしてPKCの自己リン酸化をオートラジオグラフィーにより測定した。図８における結果は、DG、PS、およびカルシウムの存在下(レーン１)、EGTAの存在下(レーン２)、抗-βPKC偽基質抗体の存在下(20mM Tris-HCl中1:10希釈；レーン３)、ペプチドrVIの存在下(配列番号７；10μM；レーン４)、ペプチドIの存在下(配列番号１；10μM；レーン５)またはコントロールペプチドの存在下(配列番号９；10μM；レーン６)におけるPKCの自己リン酸化を示す。 PKCアクチベーターの非存在下におけるペプチドrVIは、至適濃度のPS、DG、およびカルシウムの存在下において得られる自己リン酸化の80％以上のPKC自己リン酸化を誘導した(図８レーン１(コントロール)とレーン４(ペプチドrVI)を比較のこと)。ペプチドIまたはコントロールペプチドのいずれも、PKCアクチベーターの非存在下で、PKCの自己リン酸化を誘導しなかった(それぞれ、図８のレーン５および６)。実施例11 PKCによるヒストンリン酸化に対するRACK1 WD-40由来ペプチドの効果 PKCをペプチドrVI(配列番号７)とインキュベートすると、PKCによるヒストンリン酸化を誘導した。使用した方法は、Mochly-Rosenら(1987)によって記載されるプロトコルの改変プロトコルであった。結果を図９に示す。ペプチドrVIの非存在下(レーン１)および存在下(10μM)で(レーン２および３) およびDG(0.8μg/ml)、PS(50μg/ml)およびCaCl₂(1mM)の存在下および非存在下で(レーン３)、ヒストンIII型(Sigma Chemical Company，St．Louis，MO)をPKC( 約10nM)によりリン酸化した。結果を、DG(0.8μg/ml)、PS(50μg/ml)およびCaCl₂ (1mM)の存在下のPKCによるヒストンリン酸化の量をコントロールとしたパーセンテージとして表す。結果は２回の独立した実験の平均±SEMである。PKCをまず、上記のように重層緩衝液中、ペプチドrVI(10μM)とともに15分間インキュベートした。ヒストンIII型(40μg/ml)を、PS(50μg/ml)、DG(0.8μg/ml)およびCaCl₂ (1mM)を含むかまたは含まないTris-HCl(20mM)、MgCl₂(20mM)、ATP(20μM)および[γ-³²P]ATP(５μci/ml)中に添加した。ヒストンリン酸化を上記のようにオートラジオグラフィーにより測定した。 PKCアクチベーターであるPS、DG、およびカルシウムは、ペプチドrVIで誘導される自己リン酸化またはヒストンリン酸化のいずれにも必要とされず、ペプチド rVIがPKC活性化のアゴニストであることを示唆した。関連する実験において、ヒストンIII型(25μM)のPKC(10nM)によるリン酸化は、RACK1により阻害されず；むしろ、約100nMのRACK1を同時にインキュベートした場合、ヒストンリン酸化を4.5±0.1倍増加した(n=2)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/573 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/573 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ロン，ドリットアメリカ合衆国カリフォルニア 94114, サンフランシスコ，アルバラドストリート 840

Claims

【特許請求の範囲】１．第１のタンパク質の活性を変化させるのに効果的なポリペプチド組成物であって、ここで、第１のタンパク質は第２のタンパク質と相互作用し、そして第２のタンパク質は少なくとも１つのWD-40領域を含み、該ポリペプチドは４および50の間のアミノ酸を有し、その配列が該第２のタンパク質のWD-40領域中の同じ長さの配列と同じである、組成物。２．前記ポリペプチドが前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間の相互作用を阻害し；そして/または前記ポリペプチドが前記第１のタンパク質の活性のアゴニストであり；そして/または前記ポリペプチドが前記第１のタンパク質の活性のアンタゴニストである、請求項１に記載の組成物。３．前記WD-40領域が配列番号76から261よりなる群に由来するアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の組成物。４．前記WD-40領域が配列番号76から261よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の組成物。５．前記ポリペプチドが固体支持体に結合される、請求項１に記載のポリペプチド組成物。６．前記第１のタンパク質を選択的に結合させる方法であって、該第１のタンパク質を含有すると推定される試料を請求項５に記載のポリペプチド組成物と接触させる工程；および該組成物からいずれもの結合しなかった試料成分を除去する工程を包含する、方法。７．第２のタンパク質のWD-40領域中に含まれる同じ長さの配列と同じ配列を有するポリペプチドとの第１のタンパク質の相互作用を評価する方法であって、該第１のタンパク質を含有する試料をポリペプチド組成物と接触させる工程であって、ここで、該ポリペプチドは４および50の間のアミノ酸を有し、その配列が該第２のタンパク質のWD-40領域中の同じ長さの配列と同じである、工程、および該第１のタンパク質と該ポリペプチド組成物とのいずれもの相互作用を観察する工程を包含する、方法。８．候補化合物の第１のタンパク質に結合する能力を評価する方法であって、該候補化合物の存在下および非存在下で、該第１のタンパク質を該第１のタンパク質に結合するポリペプチド組成物と接触させる工程であって、ここで、該組成物のポリペプチドは４および50の間のアミノ酸を有し、その配列が該第１のタンパク質と相互作用する第２のタンパク質のWD-40領域中の同じ長さの配列と同じである、工程；および該候補物の存在下および非存在下での該ポリペプチドの結合を測定する工程を包含し、ここで、該候補物の非存在下に対して該候補物の存在下での該ポリペプチドの結合が減少することが、該候補物が該第１のタンパク質に結合することを示す、方法。９．第２のタンパク質と相互作用する第１のタンパク質の活性を変化させる方法であって、ここで該第２のタンパク質は少なくとも１つのWD-40領域を含み、４および50の間のアミノ酸を有し、その配列が第２のタンパク質中のWD-40領域中の同じ長さの配列と同じであるポリペプチドを選択する工程、および該ポリペプチドと該第１のタンパク質との間で複合体を形成させる条件下で該ポリペプチドと該第１のタンパク質とを接触させる工程であって、ここで、該相互作用が該第１のタンパク質の活性を変化させるのに効果的である、工程を包含する、方法。１０．前記接触工程が前記第１および第２のタンパク質間の相互作用を阻害するのに効果的であり；そして/または前記接触工程が前記第１のタンパク質の活性を刺激するのに効果的であり；そして/または前記接触工程が前記第１のタンパク質の活性を阻害するのに効果的である、請求項９に記載の方法。１１．前記ポリペプチドが配列番号76から261よりなる群に由来する、請求項５から１０のいずれかに記載の方法。１２．前記ポリペプチドが配列番号76から261よりなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。１３．請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するDNA分子からなる、DNA分子組成物。１４．請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドの生産のための発現系を含むDNA分子であって、ここで、該発現系は該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し、該ヌクレオチド配列が、該コーディングヌクレオチド配列の発現に影響を与え得る制御配列に作動可能に連結される、DNA分子。１５．請求項１４に記載の発現系を含むように改変された、組換え宿主細胞。１６．４および50の間のアミノ酸を有し、その配列が第１のタンパク質と相互作用する第２のタンパク質のWD-40領域中の同じ長さの配列と同じであるポリペプチドを生産する方法であって、前記ヌクレオチド配列が発現されて該ポリペプチドを生産する条件下で請求項１５に記載の細胞を培養する工程；および必要に応じて該培養物から該ポリペプチドを回収する工程；を包含する、方法。１７．プロテインキナーゼＣの活性を変化させるのに効果的なポリペプチド組成物であって、該プロテインキナーゼＣは第２のタンパク質と相互作用し、そして該第２のタンパク質は少なくとも１つのWD-40領域を含み、該ポリペプチドは４および50の間のアミノ酸を有し、その配列が第２のタンパク質のWD-40領域中の同じ長さの配列と同じである、組成物。１８．前記第２のタンパク質が活性化プロテインキナーゼＣのレセプターである、請求項１７に記載の組成物。１９．前記第２のタンパク質が配列番号27により表される配列を有する、請求項１８に記載の組成物。２０．前記ポリペプチドがプロテインキナーゼＣの活性のアゴニストであり；そして/または前記ポリペプチドがプロテインキナーゼＣの活性のアンタゴニストであり；そして/または前記ポリペプチドがプロテインキナーゼＣと前記第２のタンパク質との間の相互作用を阻害する、請求項１７に記載の組成物。２１．前記ポリペプチドが、配列番号７、配列番号４、または配列番号２により表される配列を有する、請求項２０に記載の組成物。２２．前記WD-40領域が、配列番号69から75よりなる群に由来するアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載の組成物。２３．前記WD-40領域が配列番号69から75よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２２に記載の組成物。２４．前記ポリペプチドが固体支持体に結合される、請求項１７に記載のポリペプチド組成物。２５．プロテインキナーゼＣを選択的に結合させる方法であって、プロテインキナーゼＣを含有すると推定される試料を請求項２４に記載のポリペプチド組成物と接触させる工程；および該組成物からいずれもの結合しなかった試料成分を除去する工程を包含する、方法。２６．プロテインキナーゼＣと第２のタンパク質のED-40領域中に含まれる同じ長さの配列と同じ配列を有するポリペプチドとの相互作用を評価する方法であって、該プロテインキナーゼＣを含有する試料をポリペプチド組成物と接触させる工程であって、ここで、該ポリペプチドが、４および50の間のアミノ酸を有し、その配列が第２のタンパク質のWD-40領域中の同じ長さの配列と同じである、工程、およびプロテインキナーゼＣと該ポリペプチド組成物とのいずれもの相互作用を観察する工程を包含する、方法。２７．候補化合物のプロテインキンーゼＣを結合する佳力を評価する方法であって、該候補化合物の存在下および非存在下で、該プロテインキナーゼＣを、該プロテインキナーゼＣを結合するポリペプチド組成物と接触させる工程であって、ここで、該組成物のポリペプチドは４および50の間のアミノ酸を有し、その配列が、該プロテインキナーゼと相互作用する第２のタンパク質のWD-40領域中の同じ長さの配列と同じである、工程；および該候補物の存在下および非存在下での該ポリペプチドの結合を測定する工程を包含し、ここで、該候補物の非存在下に対して該組成物の存在下で該ポリペプチドの結合が減少することが、該候補物が該プロテインキナーゼＣに結合することを示す、方法。２８．第２のタンパク質と相互作用するプロテインキナーゼＣの活性を変化させる方法であって、ここで、該第２のタンパク質は少なくとも１つのWD-40領域を有し、４および50の間のアミノ酸を有し、その配列が第２のタンパク質のWD-40領域中の同じ長さの配列と同じであるポリペプチドを選択する工程、および該ポリペプチドと該プロテインキナーゼＣとの間で複合体を形成させる条件下で該ポリペプチドを該プロテインキナーゼＣと接触させる工程であって、ここで、該相互作用が該プロテインキナーゼＣの活性を変化させる、工程を包含する、方法。２９．前記接触工程が前記プロテインキナーゼＣと前記第２のタンパク質との間の相互作用を阻害するのに効果的であり；そして/または前記接触工程が前記プロテインキナーゼＣの活性を刺激するのに効果的であり；そして/または前記接触工程が前記プロテインキナーゼＣの活性を阻害するのに効果的である、請求項２８に記載の方法。３０．前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、または配列番号７により表されるアミノ酸配列を有する、請求項２９に記載の方法。３１．前記ポリペプチドが、配列番号69から75よりなる群に由来する、請求項２８に記載の方法。３２．前記ポリペプチドが、配列番号69から75よりなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。３３．請求項１７から２３のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するDNA分子からなる、DNA分子組成物。３４．請求項１７から２３のいずれかに記載のポリペプチドを生産するための発現系を含むDNA分子であって、ここで、該発現系が該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し、該ヌクレオチド配列が、該コーディングヌクレオチド配列の発現に影響を与え得る制御配列に作動可能に連結される、DNA分子。３５．請求項３４に記載の発現系を含むように改変された、組換え宿主細胞。３６．４および50の間のアミノ酸を有し、その配列が、プロテインキナーゼＣと相互作用する第２のタンパク質のWD-40領域中の同じ長さの配列と同じであるポリペプチドを生産する方法であって、前記ヌクレオチド配列が発現されて該ポリペプチドを生産する条件下で請求項３５に記載の細胞を培養する工程；および必要に応じて該培養物から該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。