DE60115935T2

DE60115935T2 - Verfahren zur herstellung optisch aktiver 4-hydroxy-2-pyrrolidinone und n-substituierten 4-hydroxy-2-pyrrolidinonen durch enzymatische hydroxylierung

Info

Publication number: DE60115935T2
Application number: DE60115935T
Authority: DE
Inventors: Zhi Li; Dongliang Chang; Bernard Witholt
Original assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Current assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Priority date: 2000-10-13
Filing date: 2001-10-12
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2021-10-13
Also published as: WO2002031174A3; ATE312938T1; EP1197561A1; AU2002210542A1; WO2002031174A2; US20040009562A1; DE60115935D1; EP1325146B1; EP1325146A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem 4-Hydroxy-2-pyrrolidinons und N-substituierten 4-Hydroxy-2-pyrrolidinonen, das/die als Zwischenverbindungen zur Herstellung von verschiedenen pharmazeutischen Produkten nützlich sind, worin ein Sauerstoffatom durch die Verwendung eines Biokatalysators regio- und stereoselektiv in die entsprechenden 2-Pyrrolidinone eingefügt wird.
Beschreibung des Stands der Technik
Optisch aktives 4-Hydroxy-2-pyrrolidinon und dessen N-substituierte Derivate sind als Zwischenverbindungen zur Synthese von verschiedenen Arzneimitteln nützlich.
In der Praxis ist es häufig vorteilhaft, optisch aktives 4-Hydroxy-2-pyrrolidinon in seiner N-geschützten Form zu verwenden.
Es ist bekannt, dass (S)- und (R)-4-Hydroxy-2-pyrrolidinon aus dem korrespondierenden (R)-4-Chlor-3-hydroxybutanoat [Pellegata, R. et al, Tetrahedron, 1985, 41, 5607] oder (S)-4-Tosyl-3-hydroxybutanoat [Seiki, M. et al, Synthesis, 1999, 5, 745] durch Cyclisierung mit Ammoniak hergestellt werden kann. Sie können auch durch direkte Cyclisierung von (S)- oder (R)-4-Amino-3-hydroxybutanoat [Kobayashi, S., et al, Synlett. 1999, S1, 909; EP 0947505 A2 (6. Okt. 1999); EP 0844242 A1 (27. Mai 1998); JP 9031058 A2 (4. Feb. 1997)] bzw. (S)- oder (R)-4-Azido-3-hydroxybutanoat [ JP 8119935 (14 Mai 1996); EP 0844242 A1 (27. Mai 1998); WO 9636603 (21. Nov. 1996)] hergestellt werden. (S)- und (R)-N-substituierte 4-Hydroxy-2-pyrrolidinone können durch Cyclisierung von (R)- oder (S)-4-Halogen-3-hydroxybutanoat mit Alkyl- oder Aralkylamin [ JP 7324071 A2 (12. Dez. 1995); JP 1045360 A2 (17. Feb. 1989)] und durch direkte Cyclisierung von (S)- oder (R)-N- substituiertem 4-Amino-3-hydroxybuttersäure oder -ester [ EP 0787718 A1 (6. Aug. 1997); Orena, M., et ai, J. Chem. Res. (S), 1990, 376; Srairi, D. et al, Bull. Sec. Chim. Fr., 1987, 2, 297–301], (S)- oder (R)-N-substituiertem 4-Halogen-3-hydroxybutanonamid [ JP 8319271 A2 (3. Dez. 1996)] bzw. (S)-4-Mesyl-3-benzyloxybutanonsäurebenzylamid [Inagaki, S., et al, Enantiomer, 1998, 3, 187] hergestellt werden. Jedoch weisen alle derartigen Verfahren allgemeine Nachteile auf: (S)- und (R)-Vorläufer sind nicht leicht verfügbar und müssen in mehrstufigen Reaktionen hergestellt werden; die Cyclisierungsverfahren sind nicht effizient und erfordern spezielle Mittel.
Ein Verfahren zur Herstellung von (S)-N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinonen beinhaltet die mehrstufige Reduktion von (S)-N-Benzyl-4-hydroxypyrrolidin-2,5-dion [Huang, P. Q. et al, Tetrahedron: asymmetry, 1999, 10, 3309]. Diese Synthese ist zur Herstellung von größeren Maßstäben nicht praktisch und erfordert spezielle Reagenzien.
(R)-N-substituiertes 4-Hydroxy-2-pyrrolidinon kann in mehreren Schritten aus dem teueren (2S,4R)-4-Hydroxyprolin hergestellt werden [Haeusler, J. Monatsh. Chem. 1987, 118, 865]. Dieses Verfahren ist jedoch für die industrielle Herstellung nicht geeignet.
(R)-N-substituiertes 4-Hydroxy-2-pyrrolidinon kann auch durch Fotolyse von 5-Phenylmethyloxy-2-(1'-phenylethyl)-1-oxa-2-azaspiro[2,3]-hexan hergestellt werden [Aube, J., et al, Syn. Commun. 1991; 21, 693]. Die Ausbeute ist gering (16%).
Die Auflösung von racemischen 4-Hydroxy-2-pyrrolidinonen mit einer stereoselektiven Esterase ist bekannt [ JP 10165195 A2 (23. Jun. 1998)]. Jedoch ist die Ausbeute gering, und das Racemat muss in mehreren Schritten hergestellt werden.
Bei einem direkteren und wirtschaftlicheren Verfahren zum Herstellen von optisch aktivem 4-Hydroxy-2-pyrrolidinon und dessen N-substituierten Derivaten könnte es sich um das regio- und stereoselektive Einbringen eines Sauerstoffatoms in die korrespondierenden leicht verfügbaren 2-Pyrrolidinone handeln. Jedoch ist diese Reaktion mit klassischen chemischen Synthesen nicht möglich.
In dem einzigen Bericht über eine enzymatische Hydroxylierung von 2-Pyrrolidinonen [Srairi, D., et al, Bull. Sec. Chim. Fr. 1987, 297] wurde Beauveria sulfurescens (ATCC 7159), ein bekannter Pilz, zur Biohydroxylierung zum Katalysieren der Hydroxylierung von N-Benzoyl-2-pyrrolidinon und N-Phenylacetyl-2-pyrrolidinon verwendet. Jedoch ist die Regio- und Stereoselektivität sehr schlecht. In jedem Fall wurden mehrere Produkte gebildet, und N-Benzoyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon und N-Phenylacetyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon wurden nur mit 21% bzw. 5% mit einem geringen Enantiomerenüberschuss (enantiomeric excess; e.e.) gebildet. Des Weiteren ist die Produktkonzentration zu gering, die Reaktion zu langsam und die Abtrennung des Produkts von dem Biotransformationsgemisch schwierig. Dieses Verfahren ist zur Herstellung des Produkts in großem Maßstab nicht geeignet.
Beschreibung der Erfindung
Hier wurde ein Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven 4-Hydroxy-2-pyrrolidinons oder eines N-substituierten 4-Hydroxy-2-pyrrolidinons durch Hydroxylierung eines korrespondierenden nicht hydroxylierten 2-Pyrrolidinons oder N-substituierten 2-Pyrrolidinons unter Verwendung von Alkan abbauenden Bakterien mit hydroxylierender Aktivität als Biokatalysatoren, um regio- und stereoselektiv ein Sau erstoffatom in das korrespondierende nicht hydroxylierte 2-Pyrrolidinon oder N-substituierte 2-Pyrrolidinon einzubringen, entwickelt.
Durch die Verwendung eines miniaturisierten Durchmusterungssystems auf der Basis einer Mikrotiterplatte fanden wir, dass viele Bakterien die regio- und stereoselektive Einbringung eines Sauerstoffatoms in 2-Pyrrolidinon oder N-substituierte 2-Pyrrolidinone unter Erhalt des/der korrespondierenden optisch aktiven 4-Hydroxy-2-pyrrolidinons oder N-substituierten 4-Hydroxy-2-pyrrolidinone katalysieren.
In einem in Beispiel 1 dargestellten typischen Durchmusterungsverfahren ließ man 96 Alkan abbauende Stämme auf dem Dampf eines Gemischs aus n-Hexan/n-Octan/n-Decan/n-Dodecan/n-Tetradecan (1:1:1:1:1) in einem Mineralwachstumsmedium auf Agarbasis auf einer Mikrotiterplatte für eine Dauer von 3–6 Tagen wachsen. Die Zellen wurden von jeder Mulde geerntet und in 150 μl 50 mM Phosphatpuffer (pH = 7,2), enthaltend 1–2% Glucose, in den Mulden einer Mikrotiterplatte resuspendiert. N-Benzyl-2-pyrrolidinon (0,1–1,0 mM) wurde zugesetzt und das Gemisch mit 200 UpM und bei 25°C für eine Dauer von 2 Stunden geschüttelt. Die Bildung von N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), gekoppelt mit MS-Detektion, für jede der Mulden bestimmt.
Es wurde gefunden, dass viele Alkane abbauende Bakterien die regio- und stereoselektive Hydroxylierung von 2-Pyrrolidinon oder N-substituierten 2-Pyrrolidinonen unter Erhalt des/der korrespondierenden optisch aktiven 4-Hydroxy-2-pyrrolidinons oder N-substituierten 4-Hydroxy-2-pyrrolidinone katalysieren können. Bevorzugte Biokatalysatoren sind Bakterien, die 4–20 C-Atome enthaltende Alkane abbauen können, wie Bakterien, die n-Hexan, n-Heptan, n-Octan, n-Nonan, n-Decan, n-Undecan, n-Dodecan, n-Tridecan oder n-Tetradecan abbauen. Beispiele für derartige Biokatalysatoren sind die Isolate von Sphingomonas sp. HXN-200, HXN-100 und HXN-1500.
Es wurde auch gefunden, dass viele cyclische Kohlenwasserstoffe abbauende Bakterien die regio- und stereoselektive Hydroxylierung von 2-Pyrrolidinon oder N-substituierten 2-Pyrrolidinonen unter Erhalt des/der korrespondierenden optisch aktiven 4-Hydroxy-2-pyrrolidinons oder N-substituierten 4-Hydroxy-2-pyrrolidinone katalysieren können. Bevorzugte Biokatalysatoren sind die Bakterien, die 4–20 C-Atome enthaltende cyclische Verbindungen abbauen können, wie die Bakterien, die Cyclopentan, Cyclohexan, Cycloheptan, Cyclooctan, Cyclononan, Cyclodecan, Cycloundecan, Cyclododecan, Cyclotridecan oder Cyclotetradecan abbauen.
Es wurde gefunden, dass viele Bakterien mit Alkanhydroxylase(n) die regio- und stereoselektive Hydroxylierung von 2-Pyrrolidinon oder N- substituierten 2-Pyrrolidinonen unter Erhalt des/der korrespondierenden optisch aktiven 4-Hydroxy-2-pyrrolidinons oder N-substituierten 4-Hydroxy-2-pyrrolidinone katalysieren können.
Es wurde gefunden, dass viele Bakterien, die Kohlenwasserstoffe oxidieren können, die regio- und stereoselektive Hydroxylierung von 2-Pyrrolidinon oder N-substituierten 2-Pyrrolidinonen unter Erhalt des/der korrespondierenden optisch aktiven 4-Hydroxy-2-pyrrolidinons oder N-substituierten 4-Hydroxy-2-pyrrolidinone katalysieren können.
Die Biotransformation kann mit ruhenden Zellen, mit wachsenden Zellen oder mit beiden als Biokatalysatoren durchgeführt werden.
Die Biotransformation kann auch mit rohen Zellextrakten als Biokatalysatoren durchgeführt werden.
Die Biokatalysatoren können auf oder in einem wasserunlöslichen Träger oder Trägersystem immobolisiert werden.
Die Biotransformation kann in wässrigem Medium durchgeführt werden. Sie kann auch in mehrphasigen Medien, die möglicherweise zwei oder mehr von Folgendem enthalten: eine feste Phase, eine wässrige Phase, eine organische Phase oder eine gasförmige Phase, durchgeführt werden. Die organische Phase kann eines oder mehrere von Folgendem umfassen: Alkane mit 5 oder mehr C-Atomen; Dialkylether mit 4 oder mehr C-Atomen; Carbonsäureester mit 3 oder mehr C-Atomen; aromatische oder heteroaromatische Kohlenwasserstoffe mit 6 oder mehr C-Atomen; oder alkylaromatische oder alkylheteroaromatische Kohlenwasserstoffe mit 7 oder mehr C-Atomen. Ein Beispiel für ein geeignetes organisches Lösungsmittel ist Hexadecan.
Die enzymatischen Hydroxylierungen können bei einer Temperatur von 5–50°C, vorzugsweise bei 20–40°C durchgeführt werden, obwohl dies kein entscheidender Parameter ist. Der Druck kann in breiten Grenzen variieren. In der Praxis wird die Biotransformation bei Atmosphärendruck durchgeführt. Der pH-Wert des Reaktionsmediums kann zwischen 4 und 10, vorzugsweise zwischen 6 und 8 liegen.
Das Produkt kann durch chromatographische Techniken mit einem als Träger verwendeten anorganischen, organischen oder synthetischen Adsorptionsmittel abgetrennt werden. Bei den geeigneten Adsorptionsmitteln handelt es sich z.B. um Aluminiumoxid und Silicagel. Das Produkt kann auch durch Membranfiltration isoliert werden.
Das Produkt kann auch durch Extraktion abgetrennt werden, worin das Substrat zuerst aus dem Reaktionsgemisch durch Extraktion mit wenig polarem Lösungsmittel gewonnen wird, das übrige Reaktionsgemisch auf einen pH-Wert von 8 bis 12 eingestellt wird und das Produkt mit mehr polarem Lösungs mittel heraus extrahiert wird. Das geeignete verwendete Extraktionsmittel ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Alkanen mit 5 oder mehr C-Atomen; Alkylethern mit 4 oder mehr C-Atomen; chlorhaltigen Alkanen mit 3 oder weniger C-Atomen; Carbonsäureestern mit 3 oder mehr C-Atomen; aromatischen oder heteroaromatischen Kohlenwasserstoffen mir 6 oder mehr C-Atomen; alkylaromatischen oder alkylheteroaromatischen Kohlenwasserstoffen mit 7 oder mehr C-Atomen. Beispiele für besonders geeignete Extraktionsmittel sind Hexan und Ethylacetat als apolare bzw. polare Lösungsmittel.
Es wurde gefunden, dass das Produkt auch durch Festphasenextraktion abgetrennt werden kann.
Es wurde gefunden, dass Sphingomonas sp. HXN-200 (isoliert von Plaggemeier, Th.; Schmid, A.; Engesser, K. an der Universität von Stuttgart; in der Stammsammlung des Instituts für Biotechnologie, ETH Zürich) ein ausgezeichneter Biokatalysator für die regio- und stereoselektive Hydroxylierung von 2-Pyrrolidinon oder N- substituierten 2-Pyrrolidinonen unter Erhalt des/der korrespondierenden optisch aktiven 4-Hydroxy-2-pyrrolidinons oder N-substituierten 4-Hydroxy-2-pyrrolidinone ist. Beispiele für substituierte 4-Hydroxy-2-pyrrolidinone sind N-Benzyl-, N-tert-Butoxycarbonyl-, N-Benzyloxycarbonyl-, N-Phenoxycarbonyl-, N-Benzoyl- und N-Tosyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinone.
Die Zellen von Sphingomonas sp. HXN-200 können in großem Maßstab hergestellt werden, indem man sie in E2-Medium (Lageveen, R. G. et al, Appl. Environ. Microbiol. 1988, 54, 2924) entweder mit n-Octan als Kohlenstoffquelle oder mit Glucose als Kohlenstoffquelle wachsen lässt, gefolgt von Induktion des Alkanoxidationsystems mit Dicyclopropylketon (DCPK) oder n-Octan. Die Zellen können bei –80°C für mehrere Monate aufbewahrt und wie normale chemische Reagenzien in einer Bioumwandlung mit ruhenden Zellen verwendet und gehandhabt werden.
Ein typisches Verfahren zur Hydroxylierung von ruhenden Zellen ist in Beispiel 2 dargestellt. N-Benzyl-2-pyrrolidinon (2–5 mM) wurde zu 10 ml Zellsuspension (4,0 g/l) von Sphingomonas sp. HXN-200 in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH = 8,0), enthaltend Glucose (0 oder 2%), zugesetzt und das Gemisch bei 30°C für eine Dauer von 5 Stunden geschüttelt. Die Reaktion wurde durch HPLC-Analyse verfolgt: Proben (0,10 ml) wurden zu verschiedenen Zeitpunkten direkt aus dem Reaktionsgemisch entnommen, die Zellen durch Zentrifugation entfernt und die Überstände durch analytische HPLC [Säule: Hypersil BDS-C18 (5 μm, 125 mm × 4 mm), Eluent: Acetonitril/10 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) 2:8, Fluss: 1,0 ml/Min., und UV-Detektion: 210, 225 und 254 nm] analysiert. Retentionszeit von N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon: 2,7 Min.; Retentionszeit von N-Benzyl-2-pyrrolidinon: 8,1 Min.
Ein Verfahren für eine Standardaufarbeitung wurde eingesetzt: Die Zellen wurden abzentrifugiert, die Überstände auf durch die Zugabe von KOH pH = 8–12 eingestellt, gefolgt von Extraktion mit Ethylacetat. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel abgedampft.
Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie über Silicagel (R_f = 0,14, Ethylacetate/CHCl₃ 9/1) gereinigt. Die Struktur wurde durch ¹H- und ¹³C-NMR- und MS-Spektren identifiziert.
Wie in Tabelle 2 dargestellt, wurde durch die Hydroxylierung von N-Benzyl-2-pyrrolidinon mit ruhenden Zellen (4,0 g/l) von Sphingomonas sp. HXN-200 in Gegenwart von 2 Glucose N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon mit hoher Umwandlung erhalten. 70% und 47% N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon wurden nach 5-stündiger Hydroxylierung von 2 mM bzw. 5 mM N-Benzyl-2-pyrrolidinon gebildet.
Die Hydroxylierung von N-tert-Butoxycarbonyl-2-pyrrolidinon mit ruhenden Zellen von Sphingomonas sp. HXN-200 wurde in Beispiel 3 dargestellt. Die Bioumwandlung wurde mit 2–18 mM N-tert-Butoxycarbonylpyrrolidinon (Anm. d.Ü. N-tert-Butoxycarbonyl-2-pyrrolidinon?) in 10 ml Zellsuspension (4 g/l) von Sphingomonas sp. HXN-200 in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH = 8,0) in Gegenwart von Glucose (2%) bei 30°C für eine Dauer von 5 Stunden durchgeführt. Die Reaktion wurde durch HPLC-Analyse verfolgt, Proben wurden durch Entnehmen von 0,10 ml des Reaktionsgemischs zu verschiedenen Zeitpunkten und Abzentrifugieren der Zellen hergestellt.
Retentionszeit von N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon: 2,7 Min.; Retentionszeit von N-tert-Butoxycarbonyl-2-pyrrolidinon: 6,7 Min. [Säule: Hypersil BDS-C18 (5 μm, 125 mm × 4 mm), Eluent: Acetonitril/10 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) 2:8, Fluss: 1,0 ml/Min., und UV-Detektion: 210, 225 und 254 nm].
Wie in Tabelle 3 dargestellt, wurde durch die Hydroxylierung von N-tert-Butoxycarbonyl-2-pyrrolidinon eine hohe Umwandlung zu N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon erhalten. 80% Produkt wurden für die Hydroxylierung von 2 mM für eine Dauer von 5 Stunden gebildet. Die Hydroxylierung hängt nicht stark von der Ausgangskonzentration des Substrats ab. Eine Hydroxylierung von 18 mM N-tert-Butoxycarbonyl-2-pyrrolidinon ergab 48% N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon. Die höchste Aktivität wurde für die Hydroxylierung von 14 mM Substrat erzielt: 10,7 U/g CDW. In diesem Fall wurde eine 63%ige Umwandlung innerhalb von 5 Stunden erreicht.
Es wurde gefunden, dass eine Hydroxylierung in präparativem Maßstab leicht in einem Schüttelkolben durchgeführt werden kann. Beispiel 4 zeigt die Hydroxylierung von N-Benzyl-2-pyrrolidinon mit ruhenden Zellen von Sphingomonas sp. HXN- 200 in 50 ml 50 mM K-Phosphatpuffer (pH = 8,0), enthaltend Glucose (2%), in einem Schüttelkolben mit einem Volumen von 500 ml. Die Biotransformation wurde bei 200 UpM und 30°C für eine Dauer von 5 Stunden durchgeführt. Eine Hydroxylierung von 3 mM N-Benzyl-2-pyrrolidinonen mit 4,0 g/l Zellsuspension bildete 66% (1,98 mM) N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon. Eine Standardaufarbeitung und Säulenchromatographie über Silicagel (R_f = 0,14, Ethylacetat/CHCl₃ 9:1) ergab 55% (0,32 g/l) Rohprodukt als weißes Pulver.
Es wurde gefunden, dass die Produktkonzentration durch die Verwendung einer höheren Substratkonzentration und höheren Zelldichte erhöht werden kann. Wie in Tabelle 4 dargestellt, bildete die Hydroxylierung von 6,0 mM N-Benzyl-2-pyrrolidinon mit 8,0 g/l Zellsuspension nach 5 Stunden 51 (3,06 mM) Produkt. Eine Standardaufarbeitung und Säulenchromatographie ergab 42% (0,48 g/l) Rohprodukt.
Eine Hydroxylierung von 6,0 mM N-Benzyl-2-pyrrolidinon mit 10,0 g/l Zellsuspension ergab nach 5 Stunden 75% (4,5 mM) Produkt. 68% (0,78 g/l) Rohprodukt wurden isoliert.
Der e.e. von N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon wurde durch analytische HPLC mit einer chiralen Säule [Chiralpak AS (Daicel), 250 mm × 4,6 mm; Eluent: Hexan/Isopropanol (4:1); Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/Min.; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeiten: 20,3 Min. für die (S)-Form und 30,5 Min. für die (R)-Form] gemessen.
Es wurde gefunden, dass der e.e. von aus der Biohydroxylierung erhaltenem N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon > 99,9% e.e. (S) beträgt.
Beispiel 5 zeigte die Herstellung von N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon in einem Schüttelkolben mit einem Volumen von 500 ml. Die Hydroxylierung von N-tert-Bu toxycarbonyl-2-pyrrolidinon wurde mit ruhenden Zellen von Sphingomonas sp. HXN-200 in 50 ml 50 mM K-Phosphatpuffer (pH = 8,0), enthaltend Glucose (2%), bei 200 UpM und 30°C für eine Dauer von 5 Stunden durchgeführt. Die Hydroxylierung von 14 mM N-tert-Butoxycarbonyl-2-pyrrolidinon mit 4,0 g/l Zellsuspension bildete 48% (6,72 mM) N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon. Eine Standardaufarbeitung und Säulenchromatographie über Silicagel (R_f = 0,28, Ethylacetat) ergab 39% (1,10 g/l) Rohprodukt als weißes Pulver.
Es wurde gefunden, dass die Konzentration von N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon durch die Verwendung einer höheren Zelldichte erhöht werden kann. Eine Hydroxylierung von 14 mM N-tert-Butoxycarbonyl-2-pyrrolidinon mit 8,0 g/l Zellsuspension für eine Dauer von 5 Stunden führte zu 66% (9,24 mM) des gewünschten Produkts. Eine Standardaufarbeitung und Säulenchromatographie über Silicagel ergab 46% (1,29 g/l) Rohprodukt als weißes Pulver.
Es wurde auch gefunden, dass die Konzentration von N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon durch die Verwendung noch höherer Substrat- und Zellkonzentrationen weiter erhöht werden kann. Eine Hydroxylierung von 20 mM N-tert-Butoxycarbonyl-2-pyrrolidinon mit 10,0 g/l für eine Dauer von 5 Stunden bildete 49% (9,8 mM) N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon. Das Rohprodukt wurde mit einer Ausbeute von 42% (1,69 g/l) isoliert.
Der e.e. von N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon wurde durch analytische HPLC mit einer chiralen Säule [Chiralcel OB-H (Daicel), 250 mm × 4,6 mm; Eluent: Hexan/Isopropanol (7:1); Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/Min.; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeiten: 17,9 Min. für die (R)-Form und 22,6 Min. für die (S)-Form] bestimmt. Das durch Biohydroxylierung erhaltene N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon wies einen e.e. von 90–92 (S) auf.
Es wurde gefunden, dass der e.e. von N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon mit einer Ausbeute von 92 bis 99,9% (S) durch einfache Kristallisation aus n-Hexan/Ethylacetat (2/1) zu einer Ausbeute von 82% leicht erhöht werden kann.
Es wurde gefunden, dass die Herstellung von 4-Hydroxy-2-pyrrolidinonen leicht in einem Bioreaktor durchgeführt werden kann. Beispiel 6 zeigt die Herstellung von N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon in einem Maßstab von einem Liter in einem Bioreaktor. Die Hydroxylierung von N-Benzyl-2-pyrrolidinon (10,0 mM) mit einer Zellsuspension (10,0 g/l) von Sphingomonas sp. HXN-200 in 1 l 50 mM K-Phosphatpuffer (pH 8,0), enthaltend Glucose (2%), für eine Dauer von 5 Stunden bildete 80% N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon. Eine Standardaufarbeitung und Säulenchromatographie über Silicagel ergab 70% (1,408 g) reines (S)-N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon als weißes Pulver mit einem e.e. von > 99,9%.
In Beispiel 7 wurde die Hydroxylierung von N-tert-Butoxycarbonyl-2-pyrrolidinon (14 mM) mit einer Zellsuspension von Sphingomonas sp. HXN-200 von 10,2 g/l in 1 l 50 mM K-Phosphatpuffer (pH 8,0) enthaltend Glucose (2%), in einem Bioreaktor durchgeführt. Eine 85%ige Umwandlung von N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon wurde nach 5 Stunden erzielt. Eine Standardaufarbeitung und Säulenchromatographie ergab 2,008 g (75%) reines N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon als weißes Pulver mit einem e.e. von 90% (S).
Eine Biohydroxylierung mit wachsenden Zellen als Biokatalysator wurde in Beispiel 8 dargestellt. Eine Hydroxylierung von N-Benzyl-2-pyrrolidinon wurde mit wachsenden Zellen von Sphingomonas sp. HXN-200 in einem Maßstab von 1 Liter durchgeführt. Man ließ die Zellen in E2-Medium zu erst auf Glucose und dann auf n-Octan auf eine Zelldichte von 6,2 g/l wachsen. N-Benzyl-2-pyrrolidinon (4,0 mM) wurde zugesetzt und das Gemisch bei 1536 UpM und 30°C unter Lufteinbringung mit 2 l/Min. gerührt. Während der Bioumwandlung wurde weiterer n-Octandampf eingebracht, und man ließ die Zellen immer noch wachsen. Zusätzliches Substrat wurde nach 1 Stunde (2,0 mM), 2 Stunden (2,0 mM) und 3 Stunden (2,0 mM) zugesetzt. Die Bioumwandlung wurde nach 4 Stunden mit einer 84%igen Umwandlung zu N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon gestoppt. Eine Standardaufarbeitung und Säulenchromatographie ergab 76% (1,529 g) Rohprodukt als weißes Pulver mit einem e.e. von > 99.9% (S).
Eine Biohydroxylierung mit rohen Zellextrakten als Biokatalysator wurde in Beispiel 9 dargestellt. Zellen von Sphingomonas sp. HXN-200 wurden in 10 ml Tris-HCl-Puffer (pH = 7,5) auf eine Dichte von 20 g/l suspendiert. Nach dreimaligem Durchlauf durch die French-Presse wurden die Zelldebris und -membranen durch Zentrifugation bei 45.000 UpM für eine Dauer von 45 Minuten unter Erhalt von löslichen zellfreien Extrakten, enthaltend keine Membranproteine, entfernt. Diesen rohen zellfreien Extrakten wurden NADH (2,0 mM) und N-Benzylpiperidin (2,0 mM) zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 200 UpM und 30°C für eine Dauer von 1 Stunde geschüttelt, wodurch 80% (S)-N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidion mit > 99,9% erhalten wurden.
Die hier bereitgestellten spezifischen Beispiele dienen nur der Veranschaulichung der Erfindung und sollen nicht als Beschränkung des Umfangs der Erfindung angesehen werden.
N-Substituiertes 4-Hydroxy-2-pyrrolidinon, das durch dieses Verfahren erhalten wurde, kann durch Abspaltung von Schutzgruppen leicht zu 4-Hydroxy-2-pyrrolidinon umgewandelt werden.
Zusammenfassend stellt die Erfindung hier ein nützliches Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven 4-Hydroxy-2-pyrrolidinonen und N-substituiertem 4-Hydroxy-2-pyrrolidinon bereit.
Beispiele
Beispiel 1: Durchmustern eines Biokatalysators zur Hydroxylierung von N-Benzyl-2-pyrrolidinon unter Erhalt von N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon.
Man ließ Alkan abbauende Stämme auf dem Dampf eines Gemischs aus n-Hexan/n-Octan/n-Decan/n-Dodecan/n-Tetradecan (1:1:1:1:1) in Evans-Medium auf Agarbasis in den Mulden einer Mikrotiterplatte für eine Dauer von 3–6 Tagen wachsen. Die Zellen jeder Mulde wurden geerntet und in 150 μl 50 mM Phosphatpuffer (pH 0 7,2), enthaltend 100 mM Glucose, in den Mulden einer Mikrotiterplatte resuspendiert. N-Benzyl-2-pyrrolidinon wurde auf eine Endkonzentration von 150 μM zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 200 UpM und 25°C für eine Dauer von 2 Stunden geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation der Mikrotiterplatte entfernt und die Überstände durch HPLC-MS auf die Bildung von N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon analysiert.
Bedingungen für die HPLC-MS-Analyse: C18-Vorsäuledes Typs Nucleosil 100-5; Eluent: AIB 9416 von 0 bis 0,8 Min., Gradient zu A/B 65135 bis 1,10 Min., NB 65135 von 1,10 bis 3,5 Min. (A: Acetonitril/10 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0), 119, B: Acetonitril); Fluss mit 0,5 ml/Min.; MS-Detektion bei 176 und 192; Retentionszeit von N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon: 0,7 Min.; Retentionszeit von N-Benzyl-2-pyrrolidinon: 2,0 Min. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1:

¹ Stämme werden durch die Verwendung von n-Hexan oder n-Octan als Kohlenstoffquelle isoliert; alle Stämme befinden sich in der Stammsammlung des Instituts für Biotechnologie, ETH, Zürich.
² Die Aktivität wurde mit derjenigen von Spinghomonas sp. HXN-200 verglichen.

Beispiel 2: N-Benzyl-2-pyrrolidinon unter Erhalt von N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon mit ruhenden Zellen von Sphingomonas sp. HXN-200
Sphingomonas sp. HXN-200 (isoliert von Plaggemeier, Th.; Schmid, A.; Engesser, K. an der Universität von Stuttgart; in der Stammsammlung des Instituts für Biotechnologie, ETH Zürich) wurden in 2 Liter E2-Medium mit dem Dampf von n-Oktan als Kohlenstoffquelle geimpft, und man ließ sie bei 30°C wachsen, die Zellen wurden mit einer Zelldichte von 2–10 g/l geerntet und bei –80°C aufbewahrt.
N-Benzyl-2-pyrrolidinon (2–5 mM) wurde zu 10 ml Zellsuspension (4,0 g/l) von HXN-200 in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH 8,0), enthaltend Glucose (0 oder 2%), zugesetzt und das Gemisch bei 30°C für eine Dauer von 5 Stunden geschüttelt. Die Reaktion wurde durch analytische HPLC verfolgt: Proben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten direkt aus dem Reaktionsgemisch entnommen, die Zellen abzentrifugiert und die Überstände analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgelistet. Tabelle 2

¹Aktivität wurde über die ersten 30 Minuten bestimmt.

Bedingung der analytischen HPLC: Säule: Hypersil BDS-C18 (5 μm), 125 mm × 4 mm; Eluent: Acetonitril/10 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) 2:8; Fließgeschwindigkeit: 1 ml/Min.; Detektionswellenlänge: 210, 225 und 254 nm. Retentionszeit von N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon: 2,7 Min.; Retentionszeit von N-Benzyl-2-pyrrolidinon: 8,1 Min.
Das Rohprodukt wurde durch Standardaufarbeitung erhalten: Die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt, die Überstände durch Zugabe von KOH auf einen pH-Wert von 8–12 eingestellt, gefolgt von Extraktion mit Ethylacetat. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel abgedampft.
Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie über Silicagel (R_f = 0,14, Ethylacetat/CHCl₃ 9/1) gereinigt und durch Vergleichen der MS-Spektren und NMR-Spektren mit denjenigen der authentischen Verbindung als N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon identifiziert.
Beispiel 3: Hydroxylierung von N-tert-Butoxycarbonyl-2-pyrrolidinon unter Erhalt von N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon mit ruhenden Zellen von Sphingomonas sp. HXN-200
N-tert-Butoxycarbonyl-2-pyrrolidinon (2–18 mM) wurde zu 10 ml Zellsuspension (4,0 g/l) von Sphingomonas sp. HXN-200 in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH 8,0), enthaltend Glucose (0 oder 2%), zugesetzt und das Gemisch bei 30°C für eine Dauer von 5 Stunden geschüttelt. Die Reaktion wurde durch analytische HPLC verfolgt: Proben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten direkt aus dem Reaktionsgemisch entnommen, die Zellen abzentrifugiert und die Überstände analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgelistet. Tabelle 3:

¹Die Aktivität wurde über die ersten 30 Minuten bestimmt.

Bedingung der analytischen HPLC: Säule: Hypersil BDS-C18 (5 μm), 125 mm μ 4 mm; Eluent: Acetonitril/10 mM K-Phosphat puffer (pH 7,0) 2:8; Fließgeschwindigkeit: 1 ml/Min.; Detektionswellenlänge: 210, 225 und 254 nm. Retentionszeit von N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon: 2,7 Min.; Retentionszeit von N-tert-Butoxycarbonyl-2-pyrrolidinon: 6,7 Min.
Das Rohprodukt wurde durch Standardaufarbeitung erhalten: Die Zellen wurden abzentrifugiert, die Überstände durch Zugabe von KOH auf einen pH-Wert von 8–12 eingestellt, gefolgt von Extraktion mit Ethylacetat. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel abgedampft.
Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie über Silicagel (R_f = 0,28, Ethylacetat) gereinigt und durch Vergleichen der MS-Spektren und NMR-Spektren mit denjenigen der authentischen Verbindung als N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon identifiziert.
Beispiel 4: Herstellung von (S)-N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon durch Hydroxylierung von N-Benzyl-2-pyrrolidinon mit ruhenden Zellen von Sphingomonas sp. HXN-200
N-Benzyl-2-pyrrolidinon (26,3 mg, 0,15 mmol) wurde zu 50 ml Zellsuspension (4,0 g/l) von Sphingomonas sp. HXN-200 in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH = 8,0), enthaltend Glucose (2%), in einem Schüttelkolben mit einem Volumen von 500 ml zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 200 UpM und 30°C geschüttelt und die Bioumwandlung durch HPLC-Analyse verfolgt. Proben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen (6 × 0,10 ml). Die Reaktion wurde nach 5 Stunden mit 66%iger Umwandlung zu N-Benzyloxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon wie in Eintrag 1 von Tabelle 4 dargestellt gestoppt. Eine Standardaufarbeitung und Säulenchromatographie über Silicagel (R_f = 0,14, Ethylacetat/CHCl₃ 9:1) ergab 55% (15,8 mg) N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon.
¹H(CDCl₃): δ 7,35–7,19 (m, 5H, aromatischer H), 4,52–4,38 (m, 3H, NCH₂Ph, H-C(4)), 3,48 (dd, 1H, J = 10,9 und 5,6 Hz, H_A C(5)), 3,26 (s, br., 1H, OH), 3,18 (dd, 1, H, J = 10,8 Hz, 2,0 Hz, H_B-C(5)), 2,70 (dd, 1H, J = 17,4 Hz, 6,6 Hz, H_A-C(3)), 2,43 ppm (dd, 1H, J = 17,3 Hz, 2,5 Hz, H_B-C(3)).
¹³C NMR(CDCl₃): δ 172,99 (s, CO); 135,97 (s), 128,70 (d), 127,98 (d), 127,60 (d) (aromatischer C); 64,27 (d, C-4); 55,71 (t, CH₂Ph); 46,32 (t, C-5); 41,14 ppm (t, C-3).
MS: 192,1 (M⁺ + 1, 100), 174,1(9).
Der e.e. von N-Benzyl-4-hydroxypyrrolidon wurde durch analytische HPLC mit einer chiralen Säule [Chiralpak AS (Daicel), 250 mm × 4,6 mm; Eluent: Hexan/Isopropanol (4:1); Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/Min.; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeiten: 20,3 Min. für die (S)-Form und 30,5 Min. für die (R)-Form] gemessen. Der e.e. von erhaltenem N-Benzyl-9-hydroxy 2-pyrrolidinon beträgt hier > 99,9% (S).
In Eintrag 2 bildete die Hydroxylierung von 6 mM (52,5 mg) N-Benzyl-2-pyrrolidinon mit ruhenden Zellen (8,0 g/l) von Sphingomonas sp. HXN-200 für eine Dauer von 5 Stunden 51 N-Benzyl-9-hydroxy-2-pyrrolidinon. Eine Standardaufarbeitung und Säulenchromatographie ergab 42% (23,5 mg) N-Benzyl-4-hydroxy 2-pyrrolidinon in > 99,9% (S).
Eine Hydroxylierung von 6 mM (52,5 mg) N-Benzyl-2-pyrroli dinon mit ruhenden Zellen (10.0 g/l) von Sphingomonas sp. HXN-200 für eine Dauer von 5 Stunden ergab, wie in Eintrag 3 dargestellt, eine 75%ige Umwandlung zu N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon. Die reine Verbindung wurde in 68%iger (39,0 mg) Ausbeute mit > 99,9% (S) isoliert.
Beispiel 5: Herstellung von (S)-N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon durch Hydroxylierung von N-tert-Butoxycarbonyl-2-pyrrolidinon mit ruhenden Zellen von Sphingomonas sp. HXN-200
N-tert-Butoxycarbonyl-2-pyrrolidinon (129,5 mg, 0,70 mmol) wurde zu 50 ml Zellsuspension (8,0 g/l) von Sphingomonas sp. HXN-200 in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH 8,0), enthaltend Glucose (2%), in einem Schüttelkolben mit einem Volumen von 500 ml zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 200 UpM und 30°C geschüttelt und die Bioumwandlung durch HPLC-Analyse von zu verschiedenen Zeitpunkten entnommenen Proben(6 × 0,10 ml) verfolgt. Die Reaktion wurde nach 5 Stunden mit 66%iger Umwandlung zu N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon gestoppt. Eine Standardaufarbeitung und Säulenchromatographie über Silicagel (R_f = 0,28, Ethylacetat) ergab 46% (63,3 mg) Rohprodukt. Das Ergebnis wurde in Eintrag 2 von Tabelle 5 dargestellt.
¹H NMR (CDCl₃): 4,47 (s, 1H, H-C(4)), 3,88 (dd, 1H, J = 11,9 Hz, 5,1 Hz, H_A-C(5)), 3,77 (d, 1H, J = 11,8 Hz, H_B-C(5)), 3,15 (s, 1H, OH), 2,77 (dd, 1H, J = 17,7 und 6,1 Hz, H_A-C(3)), 2,43 (d, 1H, J = 17,7 Hz, H_B-C(3)), 1,52 ppm (s, 9H, 3CH₃).
¹³C NMR (CDCl₃): δ 172,8 (s, COO); 150,05 (s; CO); 83,19 (s, C(CH₃)₃); 63,03 (d, C-4); 55,31 (t, C-5); 42,71 (t, C-3); 28,03 ppm (q, CH₃).
MS: 202 (M⁺ + 1, 2), 146,0 (100), 128,0 (13), 113,0 (12), 102,1 (81).
Der e.e. von N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon wurde durch analytische HPLC mit einer chiralen Säule [Chiralcel OB-H (Daicel), 250 mm × 4,6 mm; Eluent: Hexan/Isopropanol (7:1); Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/Min.; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeiten: 17,9 Min. für die (R)-Form und 22,6 Min. für die (S)-Form] gemessen. Das Produkt wies einen e.e von 92% (S) auf.
Tabelle 5
Eine Hydroxylierung von 14 mM (129,5 mg) N-tert-Butoxycarbonyl-2-pyrrolidinon mit ruhenden Zellen (4,0 g/l) von Sphingomonas sp. HXN-200 für eine Dauer von 5 Stunden ergab eine 48%ige Umwandlung zu N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon. Das reine Produkt wurde mit einer Ausbeute von 39% (54,6 mg) mit einem e.e. von 90% (S) erhalten. Die Ergebnisse sind in Eintrag 1 von Tabelle 5 zusammengefasst.
Eine Hydroxylierung von 20 mM (185,0 mg) N-tert-Butoxycarbonyl-2-pyrrolidinon mit ruhenden Zellen (10,0 g/l) von HXN-200 für eine Dauer von 5 Stunden bildete 49% N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon, das mit einer Ausbeute von 42% (84,2 mg) mit einem e.e. von 90% (S), wie in Eintrag 3 von Tabelle 5 dargestellt, isoliert wurde.
Erhöhung des e.e. von (S)-N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon durch Kristallisation
Dass Biohydroxylierungsprodukt (S)-N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon (92%iger e.e., 26,3 mg) wurde in 1,5 ml n-Hexan/Ethylacetat (2/1) gelöst und bei 0°C für eine Dauer von 24 Stunden kristallisiert. Eine Filtration ergab 21, 6 mg (82%) der Kristalle von reinem Produkt mit einem e.e. von 99,9% (S).
Beispiel 6: Herstellung von (S)-N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon durch Hydroxylierung von N-Benzyl-2-pyrrolidinon mit ruhenden Zellen (10,0 g/l) von Sphingomonas sp. HXN-200 in einem Bioreaktor.
N-Benzyl-2-pyrrolidinon (1,852 g, 10,0 mmol) wurde einer Zellsuspension (10,0 g/l) von Sphingomonas sp. HXN-200 in 1 Liter 50 mM K-Phosphatpuffer (pH 8,0), enthaltend Glucose (2% G/V), in einem Bioreaktor mit einem Volumen von 3 Liter zugesetzt, das Gemisch bei 1500 UpM und 30°C unter Lufteinbringung mit 2 l/Min. gerührt. Die Biotransformation wurde nach 5 Stunden mit einer 80%igen Umwandlung zu N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon gestoppt. Eine Standardaufarbeitung und Säulenchromatographie über Silicagel (R_f = 0,14, Ethylacetat/CHCl₃ 9:1) ergab 1,408 g (70%) Rohprodukt als weißes Pulver mit einem e.e. von > 99,9% (S).
Beispiel 7: Herstellung von (S)-N-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon durch Hydroxylierung von N-tert-Butoxycarbonyl-2-pyrrolidinon mit ruhenden Zellen (10,2 g) von Sphingomonas sp. HXN-200 in einem Bioreaktor.
N-tert-Butoxycarbonyl-2-pyrrolidinon (2,453 g, 10 mmol) wurde einer Zellsuspension (10,2 g/l) von Sphingomonas sp. HXN-200 in 1 Liter 50 mM K-Phosphatpuffer (pH 8,0), enthaltend Glucose (2% G/V), in einem Bioreaktor mit einem Volumen von 3 Liter zugesetzt, das Gemisch bei 1500 UpM und 30°C unter Lufteinbringung mit 2 l/Min. gerührt. Die Biotransformation wurde nach 5 Stunden mit einer 85%igen Umwandlung zu N-tertButoxycarbonyl-2-pyrrolidinon gestoppt. Eine Standardaufarbeitung und Säulenchromatographie über Silicagel (R_t = 0,128, Ethylacetat/CHCl₃ 9:1) ergab 2,008 g (75%) Rohprodukt als weißes Pulver mit einem e.e. von 90% (S).
Beispiel 8: Herstellung von (S)-N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinoe durch Hydroxylierung von N-Benzyl-2-pyrrolidinon mit wachsenden Zellen von Sphingomonas sp. HXN-200 in einem Bioreaktor.
Man ließ die Zellen von Sphingomonas sp. HXN-200 in 1 Liter E2-Medium zuerst auf Glucose und dann auf n-Octan auf eine Zelldichte von 6,2 g/l wachsen. N-Benzyl-2-pyrrolidinon (0,741 g, 4,0 mmol) wurde zugesetzt und das Gemisch bei 1536 UpM und 30°C mit Lufteinbringung mit 2 Liter/Min gerührt. Während der Bioumwandlung wurde immer noch n-Octandampf eingebracht, und man ließ die Zellen immer noch wachsen. Zusätzliches Substrat wurde nach 1 Stunde (0,370 g, 2,0 mmol), 2 Stunden (0,370 g, 2,0 mmol) und 3 Stunden (0,370 g, 2,0 mmol) zugesetzt. Die Reaktion wurde durch analytische HPLC verfolgt und nach 4 Stunden mit einer 83%igen Umwandlung zu N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon gestoppt. Eine Standardaufarbeitung und Säulenchromatographie ergab 1,529 g (76%) reines Produkt mit einem e.e. von > 99,9% (S).
Beispiel 9: Herstellung von (S)-N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon durch Hydroxylierung von N-Benzyl-2-pyrrolidinon mit zellfreiem Extrakt von Sphingomonas sp. HXN-200
Zellen von HXN-200 wurden in 10 ml Tris-HCl-Puffer (pH = 7,5) auf eine Dichte von 20 g/l suspendiert. Nach dreimaligem Durchleiten durch die French-Presse wurde die Zelldebris durch Zentrifugation bei 45.000 UpM (Rotortyp 50.2 Ti) für eine Dauer von 45 Minuten unter Erhalt von löslichen zellfreien Extrakten, enthaltend keine Membranproteine, entfernt. Diesen zellfreien Extrakten wurden NADH (40 μl 500 mM wässrige Lösung 0,02 mmol) und N-Benzyl-2-pyrrolidinon (3,7 mg, 0,02 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 200 UpM und 30°C für eine Dauer von 1 Stunde geschüttelt und ergab 80% N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon mit einem e.e. von > 99,9% (S).

Claims

Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven 4-Hydroxy-2-pyrrolidinons oder eines N-substituierten 4-Hydroxy-2-pyrrolidons durch Hydroxylierung eines korrespondierenden nicht hydroxylierten 2-Pyrrolidinons oder N-substituierten 2-Pyrrolidinons unter Verwendung von Alkan abbauenden Bakterien mit hydroxylierender Aktivität als Biokatalysatoren, um regio- und stereoselektiv ein Sauerstoffatom in das korrespondierende nicht hydroxylierte 2-Pyrrolidinon oder N-substituierte 2-Pyrrolidinon einzubringen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Alkan abbauende Bakterium aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bakterien besteht, die Alkane, die 4 bis 20 Kohlenstoffatome enthalten, abbauen.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Alkan abbauende Bakterium aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bakterien besteht, die n-Hexan, n-Heptan, n-Octan, n-Nonan, n-Decan, n-Undecan, n-Dodecan, n-Tridecan, oder n-Tetradecan abbauen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Alkan abbauende Bakterium aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bakterien besteht, die zyklische 4 bis 20 Kohlenstoffatome enthaltende Verbindungen abbauen.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das Alkan abbauende Bakterium aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bakterien besteht, die Cyclopentan, Cyclohexan, Cycloheptan, Cyclooctan, Cyclononan, Cyclodecan, Cycloundecan, Cyclododecan, Cyclotridecan oder Cyclotetradecan abbauen.
Verfahren nach Anspruch 1; worin ruhende Bakterienzellen, wachsende Bakterienzellen oder beide als Biokatalysator verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin ein roher Zellextrakt als Biokatalysator verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Biokatalysator auf oder in einem wasserunlösslichen Träger oder Trägersystem immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die biokatalytische Reaktion in wässerigem Medium durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die biokatalytische Reaktion in mehrphasigen Medien durchgeführt wird, welche zwei oder mehrere der folgenden Phasen enthält: eine feste Phase, eine wässerige Phase, eine organische Phase und eine gasförmige Phase.
Verfahren nach Anspruch 10, worin eine organische Phase verwendet wird, welche zwei oder mehrere der folgenden Verbindungen umfasst: Alkane mit 5 oder mehr C-Atomen; Dialkylether mit 4 oder mehr C-Atomen; Carbonsäureester mit 3 oder mehr C Atomen; aromatische oder heteroaromatische Kohlenwasserstoffe mit 6 oder mehr C-Atomen; oder alkylaromatische oder alkyl-heteroaromatische Kohlenwasserstoffe mit 7 oder mehr C-Atomen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Reaktionstemperatur 5 bis 50°C, vorzugsweise 20 bis 40°C ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der pH-Wert des Mediums 4 bis 10, vorzugsweise 6 bis 8 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Produkt mittels einer chromatographischen Technik unter Verwendung eines anorganischen, organischen oder synthetischen Adsorptionsmittels als Träger abgetrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Produkt mittels Extraktion abgetrennt wird, worin das Substrat zuerst durch Extraktion mit einem ersten Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch entfernt, das verbleibende Reaktionsgemisch auf einen pH = 8–12 eingestellt und das Produkt mit einem zweiten Lösungsmittel extrahiert wird, wobei das zweite Lösungsmittel, verglichen mit dem ersten Lösungsmittel, polarer ist.
Verfahren nach Anspruch 15, worin jeweils eine der verwendeten Extraktionsmittel oder beide aus der Gruppe, bestehend aus Alkanen mit 5 oder mehr C-Atomen; Dialkylethern mit 4 oder mehr C-Atomen; chlorhaltigen Alkanen mit 3 oder weniger C-Atomen; Carbonsäureestern mit 3 oder mehr C-Atomen; aromatischen oder heteroaromatischen Kohlenwasserstoffen mit 6 oder mehr C-Atomen; und alkyl-aromatischen oder alkyl-heteroaromatischen Kohlenwasserstoffen mit 7 oder mehr C-Atomen ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Produkt mittels Festphasenextraktion abgetrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Produkt mittels Membranfiltration abgetrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das N-substituierte 4-Hydroxy-2-pyrrolidinon N-Benzyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das N-substituierte 4-Hydroxy-2-pyrrolidinon N-tert Butoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das N-substituierte 4-Hydroxy-2-pyrrolidinon N-Benzoyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das N-substituierte 4-Hydroxy-2-pyrrolidinon N-Benzyloxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das N-substituierte 4-Hydroxy-2-pyrrolidinon N-Phenoxycarbonyl-4-hydroxy-2-pyrrolidinon ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das N-substituierte 4-Hydroxy-2-pyrrolidinon N-tosyl-4-Hydroxy-2-pyrrolidinon ist.