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BEREICH DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung wurde mit Mitteln der Regierung der Vereinigten
Staaten gefördert,
bewilligt mit: NOAA NA86RG0047.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Protein-Hydrogele. Im Besonderen
betrifft die vorliegende Erfindung chemisch modifizierte Protein-Hydrogele,
welche zur Aufnahme einer großen
Menge Wasser oder einer anderen Flüssigkeit pro Masseneinheit
in der Lage sind.
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LITERATUR
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Die
kompletten Angaben zu dem hierin diskutierten, nummerierten Schrifttum
sind im Kapitel "Literatur", direkt vor den
Ansprüchen
enthalten.
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BESCHREIBUNG
DES STANDES DER TECHNIK
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Seit
seinen Anfängen
in den frühen
Siebzigerjahren bis zum heutigen Tage ist das Bewusstsein um die
mögliche
ernste Bedrohung für
die Umwelt, die von der fortgesetzten und weitverbreiteten Verwendung
von nicht-bioabbaubaren, Erdöl-basierten
polymeren Materialien ausgeht, stetig gewachsen. Diese Besorgnis
wird durch Produktionsstatistiken, die das enorme und immer noch
weiter wachsende Volumen an nicht-bioabbaubaren Kunststoffen, die
jährlich
produziert werden und von denen der Großteil letztendlich vergraben
depo niert wird, noch gesteigert. Dies gibt nicht nur Anlass zu Besorgnis
hinsichtlich des zur Deponierung von festen Abfällen zur Verfügung stehenden
Raumes (der immer schneller schwindet), sondern erweckt auch die
ebenso ernste Besorgnis, dass das Herauslösen von toxischen Monomeren
und Oligomeren aus deponierten Kunststoffen das Grundwasser kontaminiert
und damit gesundheitliche Probleme für Mensch und Tier verursacht.
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Neben
der Besorgnis hinsichtlich der Bedrohung für die Gesundheit des Menschen
und die Umwelt zeigt die weltweite Erschöpfung der Erdölreserven
in Kombination mit drastisch fluktuierenden Erdölpreisen infolge politischer
und wirtschaftlicher Konflikte ferner, dass es klug wäre, wenn
wir unsere Abhängigkeit
von Erdöl-basierten
Produkten reduzieren würden.
Aus diesem Grunde ist die Entwicklung von alternativen und erneuerbaren
Ressourcen für
industrielle Produkte vonnöten.
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Wegen
der faktischen und/oder empfundenen Bedrohung für die Wirtschaft, Umwelt und öffentliche Gesundheit,
welche mit nicht-bioabbaubaren, erdölbasierten Produkten verbunden
ist, wird eine nicht-erdölbasierte,
umweltfreundliche, biologisch abbaubare und erneuerbare Quelle für industrielle
Produkte nötig.
Wie die nachfolgenden Schriften belegen, sind bereits verschiedene
Arten von nützlichen
Produkten unter Verwendung von erneuerbaren Quellen als Ausgangsmaterialien
erzeugt worden.
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So
beschreibt zum Beispiel Mann, US-Patent Nr. 2 729 628, ein Verfahren
zur Erhöhung
der Grenzviskosität
eines langkettigen Polypeptids, insbesondere von natürlichen
Proteinen wie Fisch, Erdnussprotein, Sojabohnenprotein, Casein,
Eialbumin und Blutalbumin, durch Acylieren des Proteins mit Terephthalyldichlorid.
Hierbei wird das Protein mit dem Terephthalyldichlorid nach dem
Schotten-Baumann-Verfahren bei einer Temperatur von ca. 0° bis 30 °C reagieren
gelassen.
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Young
et al., US-Patent Nr. 2 923 691, beschreiben die Polymerisation
von Tierproteinen zur Verbesserung deren Eigenschaften zur Verwendung
als tierischer Leim. Young et al. führen Aldehyde in ein Tierleimprotein
ein, um die Viskosität
und Geliereigenschaften des Leimproduktes zu modifizieren, ohne
das Protein zu verfestigen oder unlöslich zu machen. Hierbei sind
Young et al. daran interessiert, die Viskosität und Gelierstärke des
Nachlauftierleims, welcher zu minderer Qualität neigt, zu verbessern. Das
von Young et al, beschriebene Verfahren beinhaltet zwei Schritte:
als Erstes wird ein Cyansäuresalz
mit dem Proteinmaterial reagieren gelassen; zweitens wird dem Proteinmaterial
ein Aldehyd, z.B. Formaldehyd oder Glucose, zugesetzt.
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Zwei
Patente, erteilt an Miller (US-Patent Nr. 3 685 998 und Nr. 3 720
765) und übertragen
an die Firma Monsanto Company, beschreiben verbesserte Proteinfuttermaterialien
für Wiederkäuer. In
den Miller-Patenten werden Proteinfuttermittel resistent gemacht
gegen digestiven Abbau im Rumen, nicht aber im Labmagen und Intestinum,
indem proteinhaltiges Futtermaterial mit einer polymerisierten ungesättigten
Carbonsäure
oder einem Anhydrid behandelt wird. Beispielsweise wird das proteinhaltige
Futtermittel mit einem Polyanhydrid, z.B. Poly(maleinsäureanhydrid),
behandelt. Dies bewirkt, dass das Proteinfuttermittel im Fluidmedium
des Rumens unverdaulich wird, im sauren Medium des Labmagens und
des Intestinums aber immer noch verdaulich ist. Auf diese Weise
bleiben die Proteine des Futtermittels von einem Abbau im Rumen
verschont und stehen zur Aufnahme in den nachfolgenden Verdauungsorganen
zur Verfügung.
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Drei
Patente, erteilt an Battista (US-Patent Nr. 4 264 493; Nr. 4 349
470 und Nr. 4 416 814), beschreiben die Bildung von Protein-Hydrogelstrukturen,
gebildet aus natürlichen
Proteinen mit Molekulargewichten nicht über 100 000 durch Auflösen des
Proteins in einer wässrigen
sauren Lösung,
Vernetzen des Proteins und Lufttrocknen der Lösung auf einen Feuchtigkeitsgehalt
von nicht mehr als 10 %. Die Battista-Patente zielen im Wesentlichen
auf die Bildung von klaren Produkten ab, wie weiche Kontaktlinsen,
ophthalmologische Filme und dergleichen.
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Zwar
bezeichnet Battista die in seinen Patenten beschriebenen Zusammensetzungen
als Hydrogele, wobei dieser Ausdruck in den Battista-Schriften jedoch
definiert ist als die folgende Bedeutung habend: "ein vernetztes Proteinpolymer
natürlichen
Ursprungs mit einem mittleren Molekulargewicht von ca. 100 000 oder weniger,
welches durch Wasser aufgequollen werden kann, und zwar über einen
weiten Bereich von Wassergehalten, die von so gering wie 30 % bis
hin zu 1000 % und mehr reichen können,
und welches zugleich nützliche
rheologische Kontrolleigenschaften für spezifische Endprodukteinsätze besitzt." (Siehe zum Beispiel US-Patent
Nr. 4 264 493, Spalte 1, Zeilen 19–27.) Die von Battista beschriebenen
Hydrogele sind nicht darauf ausgerichtet, superabsorbierend zu sein.
Sie sind mehr darauf ausgerichtet, optisch klar zu sein und ausreichend
mechanische Integrität
aufzuweisen, um als weiche Kontaktlinsen fungieren zu können.
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Die
in den Battista-Patenten beschriebenen Protein-Hydrogelstrukturen
sind aus natürlichen
Proteinrohmaterialien hergestellt, welche in Wasser klare Lösungen bilden.
Das Proteinrohmaterial wird zuerst in einer sauren wässrigen
Lösung
mit einem pH-Wert von 3,5 bis ca. 5,5 gelöst. Sodann wird ein Vernetzungsmittel
zu der sauren Proteinlösung
hinzugegeben. Battistas bevorzugtes Vernetzungsmittel ist Formalin
(37 % Formaldehyd); jedoch beschreibt Battista, dass andere geeignete
Vernetzungsmittel Verwendung finden können, einschließlich Glutaraldehyd.
Anzumerken ist jedoch, dass die eattista-Patente keine Acyl-Modifizierung des
Proteinausgangsmaterials beschreiben. Ebenso wenig beschreiben die
Battista-Patente ein superabsorbierendes Protein-Hydrogel. Die in
den Battista-Patenten beschriebenen Protein-Hydrogele sind darauf
ausgerichtet, erhöhte
Nassfestigkeitseigenschaften aufzuweisen, um dadurch ihre Verwendung
für weiche
Kontaktlinsen zu ermöglichen.
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Viele
Nachteile, welche synthetische Hydrogele begleiten (z.B. die Nicht-Bioabbaubarkeit),
können überwunden
werden durch die Verwendung von Hydrogelen, welche sich von natürliche Polymerquellen
ableiten. Neben chemisch vernetzten Protein-Hydrogelen, wie z.B.
die von Battista beschriebenen, kann bei vielen Proteinen die Gelbildung
auch auf thermischem Wege induziert werden. Zu den besonders kritischen
Anforderungen an jede Art von Biopolymer-Hydrogel gehört, dass das Gel die Fähigkeit
zur Aufnahme einer großen Menge
Wasser, bezogen auf seine Masse, bei Rehydratation aufweisen sollte
und dass das Gelmaterial selbst der Auflösung widerstehen sollte.
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Konventionelle
thermisch induzierte Protein-Hydrogele quellen jedoch nicht auf
ihr ursprüngliches
Gelvolumen, nachdem sie dehydratisiert worden sind. Dieses verminderte
Quellungsvermögen
steht mit einer erhöhten
Wasserstoffbin dung in Zusammenhang sowie mit elektrostatischen und
hydrophoben Wechselwirkungen, welche in dem dehydratisierten Protein
auftreten. Der Verlust an Quellung von thermisch induzierten Protein-Hydrogelen
setzt dem Bereich ihrer industriellen Anwendbarkeit Grenzen.
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US-Patent
Nr. 5 847 089, Damodaran et al., beschreibt ein Protein-Hydrogel,
welches superabsorbierend, reversibel quellfähig, biologisch abbaubar und
zur Bindung von Kationen befähigt
ist. Das bei Damodaran et al. beschriebene Protein-Hydrogel wird
hergestellt durch Behandeln eines Proteins mit einem Acylierungsagens
und Vernetzen des acylierten Proteins mit einem bifunktionellen
Vernetzungsmittel, um ein Protein-Hydrogel zu bilden. Ein Nachteil
bei Damodaran et al. ist, dass Vernetzungsmittelreste in dem Gel
zurückbleiben
können,
wodurch das Gel für
gewisse Anwendungen, bei denen Reste von Vernetzern, wie Glutaraldehyd,
ein Problem darstellen, weniger wünschenswert ist.
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Im
Hinblick hierauf besteht eindeutig Bedarf nach einem Protein-Hydrogel,
welches hoch absorbierend, biologisch abbaubar, reversibel quellfähig und
im Wesentlichen frei von Resten von Vernetzern, welche zur Herstellung
derartiger Hydrogele verwendet werden, ist. Die vorliegende Erfindung
stellt ein derartiges Protein-Hydrogel bereit.
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Das
vielleicht wünschenswerteste
erneuerbare Produktionsmaterial ist Agrarbiomasse. Dies beruht zum
großen
Teil auf der enormen Menge und Vielfalt an Agrarprodukten, die in
den Vereinigten Staaten erzeugt werden. So wird zum Beispiel Biomasse
(hauptsächlich
Mais) derzeit zur Erzeugung von Ethanol als Brennstoff verwendet.
Faserige Biomasse hat breite Verwendung in der Papier- und Forstproduktindustrie
gefunden. Produkte, die sich von Stärke ableiten, sind – neben
ihrer Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie – auch weitverbreitet für verschiedene
industrielle Anwendungen im Einsatz, so etwa in der Verpackungsindustrie.
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Von
den Biopolymeren sind jedoch Proteine die vielleicht am schlechtesten
ausgenutzten und hinsichtlich ihrer industriellen Anwendbarkeit
am meisten unterschätzten.
Sie werden in der Hauptsache nur als funktionale und nutritive Inhaltsstoffe
von Lebensmitteln angesehen. Ihr enormes Potential als struk turelle
Elemente in industriellen Non-Food-Anwendungen ist weitgehend unerkannt
und unrealisiert. Dies ist bedauerlich, weil Proteine gegenüber konventionelleren
Arten von Biomasse mehrere klare Vorteile aufweisen.
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So
enthalten Proteine – anders
als Polyol-basierte natürliche
Polymere, wie Cellulose und andere Kohlenhydrate – mehrere
reaktive Seitengruppen, einschließlich Amino-, Hydroxy-, Sulfhydryl-,
Phenol- und Carboxygruppen. Diese reaktiven Gruppen können als
Orte der chemischen Modifikation und Vernetzung verwendet werden,
um neuartige polymere Strukturen zu erzeugen. Die vorliegende Erfindung
betrifft eine derartige neuartige polymere Struktur: ein proteinbasiertes,
bioabbaubares, superabsorbierendes Hydrogel.
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Als
eine generische Klasse von Polymeren finden Hydrogele aller Art
großvolumige
Verwendung in industriellen Anwendungen, Konsumgütern und Umweltanwendungen.
Derartige Anwendungen umfassen Windeln, Produkte zur Verwendung
während
der Menstruation und industrielle Absorbenzien. Im vorliegenden
Text bezeichnet der nicht eingeschränkte Ausdruck "Hydrogel" ein beliebiges natürlich vorkommendes
oder synthetisches Material, welches die Fähigkeit zeigt, in Wasser oder
einer anderen Flüssigkeit
zu quellen und einen wesentlichen Anteil der Flüssigkeit in seiner Struktur
zurückzuhalten,
ohne sich jedoch in der Flüssigkeit
zu lösen.
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Derzeit
sind verschiedene synthetische Hydrogel-Materialien im Einsatz.
Diese umfassen synthetische Hydrogele wie Poly(hydroxyalkylmethacrylat),
Polyacrylat, Poly(acrylamid), Poly(methacrylamid) und Derivate hiervon,
Poly(N-vinyl-2-pyrrolidon) und Poly(vinylalkohol). Zwar zeigen diese
synthetischen Hydrogelpolymere verschiedene interessante Eigenschaften,
jedoch ist ihre Verwendung in industriellen, Konsum- und Umweltanwendungen
weniger wünschenswert
wegen der Toxizität
der restlichen Monomere und Oligomere, die normalerweise in diesen
Gelen anwesend sind. Ferner wirft die schlechte Bioabbaubarkeit
dieser synthetischen Hydrogele das im Vorstehenden diskutierte langfristige
Umweltproblem auf.
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Es
ist also klar erkennbar, dass Bedarf nach einem biologisch abbaubaren,
superabsorbierenden, von Biomasse abgeleiteten Hydrogel besteht,
welches reversible Quellung zeigt und welches im Wesentlichen frei ist
von Resten von Vernetzern, die zur Erzeugung derartiger Hydrogele
verwendet werden.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Im
Hinblick auf die obige Diskussion liegt ein Hauptziel der vorliegenden
Erfindung in der Bereitstellung eines Protein-Hydrogels, welches
superabsorbierend, reversibel quellfähig, biologisch abbaubar und
zur Bindung von bivalenten Kationen befähigt ist. Das Protein-Hydrogel
ist ferner im Wesentlichen frei von Resten von Vernetzern, welche
zur Erzeugung derartiger Hydrogele verwendet werden.
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Ein
weiteres Ziel der Erfindung liegt in der Bereitstellung eines Protein-Hydrogels,
welches aus einem weiten Bereich von Protein-Ausgangsmaterialien
gebildet werden kann und welches als Ersatz für vollsynthetische Hydrogele
verwendet werden kann.
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In
ihrer einfachsten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Protein-Hydrogel, welches eine
acylierte Protein-Matrix umfasst, die mit einem bifunktionellen
Vernetzungsmittel vernetzt ist und die mit einem polaren organischen
Lösemittel
behandelt ist, um Restvernetzer zu entfernen.
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Im
Einzelnen umfasst die vorliegende Erfindung ein Protein-Hydrogel,
welches ein Fischprotein-Isolat umfasst, das durch Behandlung mit
Ethylendiamintetraessigsäuredianhydrid
(EDTAD) acyliert ist, um eine acylierte Proteinmatrix zu ergeben.
Die acylierte Proteinmatrix wird dann mit Glutaraldehyd vernetzt,
um ein biologisch abbaubares, superabsorbierendes Protein-Hydrogel
zu ergeben. Das vernetzte Gel wird dann mit einem polaren organischen
Lösemittel
behandelt (bevorzugt Ethanol).
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Die
Lösemittelbehandlung
induziert eine Konformationsreorganisation in Proteinketten in dem
Gelnetzwerk, was offensichtlich die Flexibilität erhöht und damit die Rate und das
Ausmaß der
Relaxation des Polymernetzwerkes bei Eindiffusion von Wasser in
das Netzwerk. Neben der Verbesserung der Quellungseigenschaften
bietet die Ethanol-Behandlung folgende Vorteile: 1) Ethanol dehydratisiert
das Gel und eliminiert dadurch die Notwendigkeit, das Gel zu trocknen;
2) Ethanol extrahiert Fehlgeruchsverbindungen niederen Molekulargewichts
aus dem Proteingel, speziell dem Fischproteingel, und verbessert
dadurch dessen Annehmbarkeit in verschiedenen Konsumgütern: es
wurde gefunden, dass das Ethanol-behandelte Fischprotein-Hydrogel vollkommen
frei von fischigem Fehlgeruch war, verglichen mit dem ohne Ethanolbehandlung
hergestellten; und 3) Ethanol extrahiert ferner restliches unreagiertes
Glutaraldehyd (von dem man glaubt, dass es krebserregend ist), welches
in dem Gel vorhanden sein kann.
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Die
Protein-Hydrogele gemäß der vorliegenden
Erfindung sind in der Lage, mehr als das 100fache (und vielfach
mehr als das 200fache) ihres Trockengewichts in Wasser aufzunehmen.
Sie sind ferner in der Lage, bivalente Kationen zu sequestrieren.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ferner ein Verfahren zur Herstellung
des unmittelbar vorstehend beschriebenen Protein-Hydrogels. Das
Verfahren umfasst die Schritte des Behandelns eines Proteins mit
einem Acylierungsmittel, um eine acylierte Proteinmatrix zu ergeben,
Vernetzen der acylierten Proteinmatrix mit einem bifunktionellen
Vernetzungsmittel und Behandeln der vernetzten Matrix mit einem
polaren organischen Lösemittel
(bevorzugt Ethanol), um das Protein-Hydrogel zu ergeben.
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Im
Einzelnen umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
eines Protein-Hydrogels, welches die Schritte umfasst: Dissoziieren
und/oder Entfalten von Proteinmolekülen innerhalb einer wässrigen
Proteinlösung
durch die Anwendung von Wärme,
und dann Zugabe eines Acylierungsmittels zu der Proteinlösung, um
ein acyliertes Protein zu ergeben. Das acylierte Protein wird dann
durch Zugabe eines bifunktionellen Vernetzungsmittels vernetzt.
Die vernetzte Matrix wird dann mit einem polaren organischen Lösemittel
(bevorzugt Ethanol) behandelt, um eine Konformationsreorganisation
in Proteinketten in dem Gelnetzwerk zu induzieren, um das Protein-Hydrogel
zu ergeben.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Protein-Hydrogel dar, welches die
im Vorstehenden beschriebenen Eigenschaften aufweist. Das Protein,
von dem sich das Protein-Hydrogel ableitet, kann von einer beliebigen pflanzlichen
oder tierischen Quelle stammen, ohne Einschränkung. Eine bevorzugte Proteinquelle,
deren Bevorzugung zum großen
Teil in ihrem reichlichen Vorhandensein und ihren niedrigen Kosten
ihren Ursprung hat, ist von Fischen gewonnenes Protein.
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Das
Protein-Hydrogel gemäß der vorliegenden
Erfindung wird hergestellt, indem als Erstes Lysyl-Reste eines Proteins
chemisch modifiziert werden durch die Zugabe einer oder mehrerer
Carboxygruppen hierzu. Bevorzugt wird dies durch Acylierung der
Lysyl-Reste mit einem Polycarbonsäureanhydrid durchgeführt. Hieran
schließt
sich die Vernetzung der Proteinketten mit einem bifunktionellen
Vernetzungsmittel und die Behandlung des Proteins mit einem polaren
Lösemittel
an, um ein Protein-Hydrogel zu ergeben, welches superabsorbierende,
pH-sensitive und ionenstärkensensitive
reversible Quellung zeigt und welches im Wesentlichen frei von Restvernetzer
ist.
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Das
Protein-Hydrogel gemäß der vorliegenden
Erfindung ist ferner in der Lage, starke Bindungen mit bivalenten
Kationen einzugehen. Dies erlaubt dem Protein-Hydrogel, als ein
Kationensequestrierungsmittel zu fungieren. Das Protein-Hydrogel
kann zur Entfernung von bivalenten Metallkationen und organischen
Kationen aus Grundwasser, effluenten Flüssigabfallströmen und
dergleichen verwendet werden.
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Im
Einsatz kann das Protein-Hydrogel immer dann verwendet werden, wenn
eine hohe Flüssigkeitsabsorption
oder Sequestrierung von bivalenten Kationen gewünscht wird. Potentielle Endnutzungen
für das Protein-Hydrogel
umfassen kosmetische Produkte, Windeln, Tampons und Menstruationsbinden,
industrielle Absorbenzien, Überlaufdämme und
Dichtmittel, Grund- und Abwasseraufbereitungsanwendungen, Schwermetallsequestrierung
und dergleichen.
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Die
Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden anhand der folgenden
Detailbeschreibung der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung in
Verbindung mit den beigefügten
zeichnerischen Darstellungen noch besser erkennbar.
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KURZBESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 ist
ein Graph, der die Wasseraufnahme von Hydrogelen aus unmodifiziertem
Fischprotein (FP) (Δ)
und 80 % EDTAD-modifiziertem FP (o) zeigt.
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2 ist
ein Graph, der die Wasseraufnahmerate der Gele aus Ethanol-behandeltem
unmodifizierten FP (Δ)
und Ethanol-behandeltem 80 % EDTAD-modifiziertem FP (o) zeigt.
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3 ist
ein Graph, der den Effekt der Ethanolbehandlung auf die Wasseraufnahme
von 60 % EDTAD-modifiziertem Sojaprotein (SP) (Δ) und Ethanol-behandeltem 60
% EDTAD-modifiziertem Sojaprotein (o) zeigt.
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4 ist
ein Graph, der CD-Spektren im fernen UV-Bereich von gequollenen
Gelen aus 80 % EDTAD-FP, hergestellt mit der Ethanolbehandlung (fette
Linie) und ohne die Ethanolbehandlung (dünne Linie), zeigt.
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5A ist
ein Graph, der den Effekt der Ethanolbehandlung auf die Quellungseigenschaften
von 80 % EDTAD-FP in 0,1 M NaCl bei 36 °C zeigt (Δ = EDTAD-modifiziertes FP; o
= Ethanol-behandeltes EDTAD-modifiziertes FP).
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5B ist
ein Graph, der den Effekt der Ethanolbehandlung auf die Quellungseigenschaften
von 80 % EDTAD-FP in 0,15 M NaCl bei 36 °C zeigt (Δ = EDTAD-modifiziertes FP; o
= Ethanol-behandeltes EDTAD-modifiziertes FP) zeigt.
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6 zeigt
Van't Hoff-Auftragungen
von log MS (maximale Quellung) gegen 1/T
für 80
% EDTAD-modifiziertes FP (Δ)
und Ethanol-behandeltes EDTAD-modifiziertes
FP (o), aus denen der Effekt der Temperatur auf die Gleichgewichtswasseraufnahme
hervorgeht.
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DETAILBESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Kern
der vorliegenden Erfindung ist die chemische Modifizierung eines
Proteins, wobei zuerst Carboxygruppen in die n-Butylamino-Seitengruppen
von Lysin-Resten innerhalb des Proteins eingeführt werden. Die modifizierten
Proteinmoleküle
werden sodann unter Verwendung eines bifunktionellen Vernetzungsmittels
vernetzt, um ein Protein-Hydrogel zu ergeben. Die vernetzte Proteinmatrix
wird dann mit einem polaren organischen Lösemittel behandelt, um Restvernetzer
zu entfernen und um ein biologisch abbaubares, superab sorbierendes
Protein-Hydrogel zu ergeben, welches im Wesentlichen frei von Restvernetzer
ist.
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Die
Quellungseigenschaften von Protein-Hydrogelen, welche in US-Patent
Nr. 5 847 089, Damodaran et al., beschrieben sind, können drastisch
verbessert werden durch Behandeln des vernetzten Gels mit Ethanol.
Ohne auf einen bestimmten Wirkmodus oder Wirkmechanismus beschränkt zu sein,
tritt diese Verbesserung offensichtlich wegen der Ethanol-induzierten
Konformationsreorganisation in Proteinketten in dem Gelnetzwerk
auf. Diese Umordnung erhöht
offenbar die Flexibilität
und damit die Rate und das Ausmaß der Relaxation des Polymernetzwerkes
bei Eindiffusion von Wasser in das Netzwerk. Neben der Verbesserung
des Quellverhaltens stellt die Ethanolbehandlung mehrere zusätzliche
Vorteile bereit:
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Behandeln
der vernetzten Proteinmatrix mit einem polaren organischen Lösemittel
dehydratisiert das Gel. Dies eliminiert die Notwendigkeit, das Gel
zu trocknen, nachdem es gebildet worden ist.
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Behandeln
der vernetzten Polymermatrix extrahiert ferner Fehlgeruchsverbindungen
niederen Molekulargewichts aus dem Proteingel. Dies ist besonders
vorteilhaft, wenn das Gel aus Fischprotein (oder Tierprotein) gebildet
ist, die dazu neigen, einen Fehlgeruch beizubehalten. Durch diesen
Effekt wird die kommerzielle Annehmbarkeit des Gels zur Verwendung
in zahlreichen Konsumgütern
stark verbessert. Von Ethanol-behandeltem Fischprotein-Hydrogel
in Einklang mit der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass
es vollständig
frei von fischigem Fehlgeruch war, verglichen mit ohne Ethanolbehandlung
hergestelltem Fischprotein-Hydrogel.
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Die
Behandlung mit einem polaren organischen Lösemittel extrahiert restliches
unreagiertes Vernetzungsmittel aus dem Gel. Dies ist besonders vorteilhaft,
wenn Glutaraldehyd (welches unter dem Verdacht steht, Krebs erregend
zu sein) als der Vernetzer verwendet wird. Die Behandlung mit dem
polaren organischen Lösemittel
entfernt jeglichen Restglutaraldehyd.
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Wie
im Vorstehenden erwähnt,
kann das Proteinausgangsmaterial von einer beliebigen Quelle stammen,
tierisch, pflanzlich oder mikrobiell, ohne Ein schränkung. So
wird zwar zum Beispiel Fischprotein wegen seiner niedrigen Kosten
bevorzugt; das hierin beschriebene Protein-Hydrogel kann jedoch
auch aus anderen, Ölsamenproteinen,
Blattproteinen (z.B. Alfalfa), mikrobiellen Proteinen, tierischen
Proteinen und Proteinen, welche aus Abfällen der Nahrungsmittelverarbeitung
zurückgewonnen
werden, hergestellt sein. Für
die vorliegende Erfindung funktionieren Rohproteinkonzentrate sowie
Protein-Isolate gleichermaßen
gut. Und: weil das Protein-Hydrogel im Wesentlichen nicht für den Verzehr
gedacht ist, muss das Ausgangsmaterial nicht in Lebensmittelreinheit
vorliegen.
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Die
bevorzugte Proteinquelle ist Fisch, welcher mit Wasser extrahiert
wird, um ein Fischprotein-Isolat zu ergeben. Die Isolierung von
rohem Fischprotein (FP) aus frischem Fisch wird nach konventioneller
Art durchgeführt,
wie an anderer Stelle beschrieben (1). Allgemein wird frischer Fisch
nach Ankunft filetiert, in Stücke
gehackt und mit entionisiertem Kaltwasser gemischt, wobei das Verhältnis von
Fleisch zu Wasser 1:9 beträgt.
Die Suspension wird dann auf pH 12 eingestellt und 30 min lang gerührt. Die
Suspension wird filtriert, um die unlöslichen Partikel zu entfernen,
und das Filtrat wird gegen Wasser dialysiert und gefriergetrocknet.
Polare organische Lösemittel,
welche für
die vorliegende Erfindung Verwendung finden können, umfassen C1-C4-Alkohole (bevorzugt), C1-C4-Ketone (bevorzugt Aceton) und C1-C4-Aldehyde (weniger
bevorzugt wegen des Geruchs). Besonders bevorzugte Lösemittel
zur Verwendung für
die vorliegende Erfindung sind Ethanol, Aceton, Propanol und Butanol.
Das am meisten bevorzugte polare organische Lösemittel ist Ethanol, welches
zur beispielhaften Erläuterung
der beanspruchten Erfindung verwendet wird. (Die Begrenzung der
Beschreibung auf die Verwendung von Ethanol für die Erfindung geschieht lediglich
der Kürze
halber.)
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Die
weitere Isolierung des Fischproteins kann nach beliebiger geeigneter
Art und Weise durchgeführt werden.
Beispielsweise kann dies durch Behandlung mit Säure durchgeführt werden,
um die in dem Extrakt gelösten
Proteine auszufällen,
um ein Fischprotein-Isolat (FPI) zu ergeben. Das Protein wird normalerweise bei
einem pH-Wert von ca. 4,5 aus der Lösung ausfallen. Das FPI kann
optional dialysiert oder weiter gereinigt werden (z.B. durch Umkristallisation),
falls gewünscht.
Andere Isolierungsmethoden, z.B. Abdampfen des Lösemittels oder chromatographische
Methoden, können
gleichermaßen
erfolgreich verwendet werden. Es gilt hier wieder, dass, wenngleich
die vorliegende Erfindung mit einer beliebigen Art von Protein realisiert
werden kann, allein der Kürze
und Klarheit halber die restliche Beschreibung auf die Beschreibung
von Protein-Hydrogelen beschränkt
wird, die unter Verwendung des im Vorstehenden beschriebenen FPI
(welches das bevorzugte Protein darstellt) hergestellt sind.
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Nach
der Isolierung wird das FPI dann mit einem Carboxygruppen-haltigen
Acylierungsmittel modifiziert. Das Acylierungsmittel reagiert mit
n-Butylamino-Gruppen
von Lysin-Resten innerhalb des FPI und bewirkt die Einführung von
Carboxygruppen in das FPI. Bevorzugt ist das Acylierungsmittel ein
Polycarbonsäureanhydrid,
ein Monoanhydrid, ein Dianhydrid oder eine Kombination hiervon.
Im Sinne des vorliegenden Textes bedeutet der Ausdruck "Anhydrid" eine beliebige der
im Vorstehenden genannten Arten von Anhydriden. Geeignete Dianhydride,
welche für
die vorliegende Erfindung Verwendung finden können, umfassen zum Beispiel
Benzoltetracarbonsäuredianhydrid,
Cyclobutantetracarbonsäuredianhydrid,
Diethylentriaminpentaessigsäuredianhydrid
und Ethylendiamintetraessigsäuredianhydrid
(EDTAD). EDTAD ist das bevorzugte Acylierungsmittel. Wieder der
Kürze wegen
wird die nachfolgende Beschreibung auf die Zugabe von EDTAD zu dem FPI
begrenzt. Dies geschieht lediglich der Kürze und der Klarheit halber
und soll die hierin beanspruchte Erfindung in keiner Weise begrenzen.
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Die
Einführung
des EDTAD in das FPI geschieht durch schrittweise Zugabe von festem
EDTAD zu einer wässrigen
Lösung
des FPI. Es muss jedoch daran gedacht werden, dass EDTAD ein bifunktionelles
Reagens ist, welches Polypeptide entweder inter- oder intramolekular
zu vernetzen vermag. Zwei mögliche
Reaktionswege für
die Reaktion von EDTAD mit einem Protein sind nachstehend aufgezeigt,
wobei PRO das zu modifizierende Protein ist:
REAKTION
II
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In
Reaktion I reagiert ein Molekül
von EDTAD mit zwei Lysyl-Resten, um eine Bindung zu bilden. Wenn die
Reaktion des Proteins mit EDTAD über
die Reaktion I abläuft,
ist das Ergebnis die Inkorporation von nur einer Carboxygruppe pro
Lysyl-Rest. Ferner: wenn Reaktion I zwischen Untereinheiten eines
Proteinmoleküls stattfindet,
kann die intramolekulare Vernetzung die Quellung des modifizierten
Proteins beeinträchtigen.
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In
Reaktion II reagiert ein Molekül
von EDTAD mit einem Lysyl-Rest und einem Wassermolekül. In dieser
Reaktion werden drei Carboxygruppe pro Lysyl-Rest in das Protein
eingebaut und es werden keine Bindungen gebildet. Dies bewirkt eine
starke Erhöhung
der Nettoanionenladung des modifizierten Proteins, was beim Entfalten
der Proteinstruktur hilft. Weil keine Bindungen gebildet werden,
wird die Quellfähigkeit
des modifizierten Proteins nicht beeinträchtigt.
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Im
Lichte der Bifunktionalität
von EDTAD sollte – zur
Bildung eines Protein-Hydrogels
mit maximalem Absorptionsvermögen – das EDTAD
dem FPI unter Bedingungen zugesetzt werden, welche die Reaktion
II gegenüber
der Reaktion I favorisieren. Bedingungen, welche die Reaktion II
gegenüber
der Reaktion I favorisieren, sind diejenigen Bedingungen, bei denen
das Protein in verdünnter
Lösung
vorliegt und die individuellen Proteinmoleküle partiell dissoziiert und/oder
denaturiert werden, wodurch die Möglichkeit, dass EDTAD mit zwei
Proteinmolekülen
reagiert, gemindert wird. Die Reaktion kann in einem Temperaturbereich
von ca. 5 °C bis
ca. 100 °C
durchgeführt
werden. Es ist bevorzugt, die Reaktion bei leicht erhöhten Temperaturen
durchzuführen,
von Umgebungstemperatur bis ca. 100 °C, unter basischen Bedingungen,
pH-Wert ca. 8 bis 12. Die Reaktionsbedingungen sollten jedoch nicht
so streng sein, dass eine hydrolytische Degradation der Proteinketten
verursacht wird.
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Das
bevorzugte Reaktionsprotokoll zur Optimierung der Reaktion des Proteins
nach dem Mechanismus von Reaktion II umfasst folgendes: als Erstes,
Inkubieren des FPI in einer verdünnten
wässrigen
Lösung bei
einem pH-Wert von ca. 12, bei einer leicht erhöhten Temperatur von ca. 65 °C. Die Konzentration
des FPI in der Lösung
sollte in der Größenordnung
von ca. 1 % liegen. Das FPI sollte für ca. 30 Minuten bei 65 °C inkubiert
werden. Längere
Inkubationszeiten sind akzeptabel, solange keine alkalische Hydrolyse
auftritt. Die Inkubationsperiode dient dazu, die Proteinmoleküle des FPI
zu dissoziieren und/oder zu denaturieren.
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Die
Inkubation kann ferner unter sauren Bedingungen durchgeführt werden,
bis hinab zu ca. pH 2. Weil aber die bevorzugte Acylierungsreaktion
in alkalischer Lösung
stattfindet, wird es bevorzugt, die Inkubation ebenfalls unter alkalischen
Bedingungen durchzuführen,
um Salzbildung während
der Acylierungsreaktion zu minimieren.
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Nach
der Inkubation wird die Lösung
auf Raumtemperatur gekühlt
und eine berechnete Menge von EDTAD wird in inkrementalen Mengen
unter fortwährendem
Rühren
zugesetzt. Nach vollständiger
Zugabe des EDTAD wird die Reaktionsmischung für 3 h konstant gerührt unter
Aufrechterhaltung des pH-Wertes
bei 12,0, bevorzugt durch die Zugabe einer Base (bevorzugt NaOH).
Dies kann automatisch durchgeführt
werden mit Hilfe einer kommerziell erhältlichen pH-Stat-Vorrichtung
(Fisher Scientific). Unter diesen Bedingungen findet eine alkalische
Hydrolyse des FPI kaum oder gar nicht statt. Am Ende der Reaktion
wird der pH-Wert der Proteinlösung
dann auf 4,5 eingestellt, um das Protein auszufällen. Die Suspension wird bei
10 000 × g
für 15
min zentrifugiert. Das Proteinsediment wird mit Wasser bei pH 4,5
gewaschen und zentrifugiert. Das schließlich erhaltene Proteinpräzipitat
wird dann in Wasser bei pH 7,0 wiedergelöst und gefriergetrocknet. Der
Grad der Acylierung, d.h. der Prozentsatz an mit EDTAD modifizierten
Lysyl-Resten, wird nach dem Trinitrobenzolsulfonsäure-(TNBS-)Verfahren
(2) bestimmt.
-
Das
Ausmaß der
Acylierung kann variiert werden, um die physikalischen Eigenschaften
des finalen Gelproduktes zu modulieren. Dies kann recht einfach
dadurch vorgenommen werden, dass der Anteil des zu dem EDTAD (oder
anderen Acylierungsmittel) hinzugefügten Proteins variiert wird.
Je größer die
EDTAD-Menge, die je Proteineinheit zugesetzt wird, desto größer das
Ausmaß der
Modifikation.
-
Es
versteht sich, dass ein Fachmann die Reaktionsbedingungen leicht
so einstellen kann, dass Reaktion I vorherrscht. Beispielsweise
ergibt sich durch eine verkürzte
inkubationsperiode oder vollständiges
Weglassen des Inkubationsschrittes die Tendenz zur Favorisierung
von Reaktion I; das gleiche gilt, wenn das EDTAD zu einer konzentrierteren
FPI-Lösung
hinzugegeben wird. Führt
man die Acylierung bei einer Alkalinität durch, die näher bei
pH 9 liegt, ergibt sich die Neigung, dass der Reaktionsweg I gegenüber dem
Reaktionsweg II favorisiert wird.
-
Durch
Einstellung der relativen Raten der beiden Reaktionen werden die
Eigenschaften des finalen Protein-Hydrogels verändert. Während ein Optimieren von Reaktion
II ein Protein-Hydrogel ergibt, welches eine überlegene Quellfähigkeit
und eine größere Gesamtanionenladung
aufweist, ergibt ein Optimieren von Reaktion I ein steiferes, weniger
absorbierendes Hydrogel, welches in einigen Anwendungen wünschenswert ist.
Durch Kenntnis des Wechselspiels zwischen den zwei Reaktionen lassen
sich die physikalischen Eigenschaften des finalen Gelproduktes für eine breite
Vielfalt von Endapplikationen maßschneidern.
-
Das
Reaktionsverhältnis
des Reaktionsweges I gegenüber
dem Reaktionsweg II kann durch elektrometrische Titration von verschiedenen
modifizierten und unmodifizierten FPI-Proben bestimmt werden. Die
Titrationskurven der modifizierten Proben werden dann mit unmodifizierten
Proben verglichen, die den gleichen Reaktionsbedingungen ausgesetzt
worden waren. Die Zahl der Carboxygruppen pro 105 gmol
Protein wird berechnet aus den Molen an H+-Ion (oder den Molen an NaOH), welche
durch das Protein während
der Titra tion von pH 2,0 bis zum isoionischen Punkt des Proteins
dissoziiert (bzw. verbraucht) wurden. Titrationskurven für natives
Sojaprotein und Sojaprotein, welches einem pH-Wert von 12 und 65 °C ausgesetzt
wurde, sind im Wesentlichen identisch (Daten nicht gezeigt), was
zeigt, dass die Wärmebehandlung
bei pH 12 nicht zu einer Desamidierung der Glutamin- und Asparagin-Reste
von Sojaprotein führt.
Es ist anzunehmen, dass FPI sich ähnlich verhält. Wenn man dies weiß, dann
muss jede Erhöhung
des Carboxygruppenanteils des unter diesen Bedingungen modifizierten
FPI auf die Inkorporation von EDTAD an den Lysyl-Resten des FPI
zurückzuführen sein.
-
Es
muss ferner daran gedacht werden, dass der Vernetzungsschritt, welcher
im Folgenden ausführlich beschrieben
wird, ferner Lysin-Reste innerhalb des Proteins benutzt, um die
Proteinketten zu vernetzen. Es ist deshalb bevorzugt, dass das Ausmaß der Modifikation
90 % der verfügbaren
Lysin-Reste nicht überschreitet. Dieser
maximale Modifikationsgrad sollte ferner herabgesetzt werden, wenn
das Ausgangsprotein einen besonders niedrigen Gehalt an Lysin-Resten
aufweist. Um die Vorteile eines erhöhten Carboxygruppenanteils
zu erhalten, ist es bevorzugt, dass mindestens 50 % der Lysin-Reste
des Ausgangsproteins acyliert sind.
-
Nach
der Acylierung wird die Proteinlösung
gegen deionisiertes Wasser erschöpfend
dialysiert, um bei der Reaktion gebildete Salze (in diesem Falle
hauptsächlich
Natrium-EDTA) zu entfernen. Das dialysierte modifizierte Protein
kann optional gefriergetrocknet werden, um ein acyliertes Protein
zu ergeben. Alternativ kann das Protein ausgefällt werden durch Senken des
pH-Wertes auf 4,5, mit anschließender
Zentrifugation. Das Proteinpräzipitat
kann dann in Wasser bei einem pH-Wert von 8 bis 9 gelöst werden.
-
EDTAD
ist das bevorzugte Acylierungsagens, weil es u.a. im Wesentlichen
nicht-toxisch ist. Die einzigen reaktiven Gruppen, die durch die
Zugabe von EDTAD in das Protein eingeführt werden, sind die Carboxygruppen.
Bei Zugabe zu dem Protein-Isolat in Einklang mit dem im Vorstehenden
beschriebenen Protokoll wird unreagiertes EDTAD leicht mit Wasser
und NaOH reagieren, um in Natriumethylendiamintetraessigsäure (Natrium-EDTA)
umgewandelt zu werden. Weil Natrium-EDTA ein "ein im Wesentlichen als sicher geltender" ("Generally Regarded
As Safe" (GRAS-))Lebensmittelzusatzstoff
ist, bestehen keine Befürchtungen
hinsichtlich Toxizität
oder Umweltsicherheit von in dem modifizierten Protein verbleibenden
Restmengen an Natrium-EDTA (falls überhaupt vorhanden). Anders
als Poly(acrylat)- oder Poky(acrylamid)-basierte Hydrogele, welche
Restmonomere enthalten können,
die toxisch sind, würde
das vorliegende Protein-Hydrogel, falls es überhaupt Restreagenzien enthält, nur
Rest-Natrium-EDTA enthalten.
-
Ohne
Beschränkung
auf eine bestimmte Vorgehensweise wird angenommen, dass das EDTAD-Acylierungsagens – durch
Reaktion mit den Lysyl-Resten des Proteins – eine extensive Entfaltung
der Proteinmoleküle über die
durch die Carbonsäure-Substituenten
an dem Acylierungsagens hervorgerufene intramolekulare elektrostatische
Abstoßung
verursacht. Es wird angenommen, dass dies die steife, globulare
Struktur von Fischglobulinen in ein polyanionisches Polymer vom
Zufallsknäuel-Typ
umwandelt. Von dem im Wesentlichen polyanionischen Charakter, den
die Carbonsäure-Gruppen
dem Protein-Isolat verleihen, wird angenommen, dass er zahlreiche
Plätze
zur Wasserbindung bereitstellt.
-
Nach
der Acylierung wird das dialysierte und optional gefriergetrocknete
modifizierte Protein-Isolat unter Verwendung eines bifunktionellen
Vernetzungsmittels vernetzt. Eine breite Vielfalt von geeigneten
bifunktionellen Vernetzungsmitteln ist auf dem Fachgebiet bekannt.
Dialdehyde zum Beispiel, so etwa Dianhydride, reagieren ferner mit
Lysin-Resten, um Vernetzungsstellen zwischen Polypeptid-Ketten zu
bilden. Bifunktionelle Aldehyde sind hervorragende Vernetzungsmittel.
Für die
vorliegende Erfindung kann ein beliebiger Typ von Dialdehyd, ohne
Einschränkung,
als Vernetzungsmittel fungieren. Das bevorzugte bifunktionelle Vernetzungsreagens
ist ein bifunktioneller Aldehyd der Formel OCH--(CH2)x--CHO worin X eine
ganze Zahl von 2 bis 8 ist. Der bevorzuge bifunktionelle Aldehyd
aus dieser kleinen Gruppe von Homologen ist Glutaraldehyd (X=3).
-
Die
Vernetzung wird bevorzugt in wässriger
Lösung
durchgeführt.
Hierbei wird zur Maximierung der Vernetzung (sowohl intra- als auch
intermolekulare Bindungen) eine relativ konzentrierte Proteinlösung verwendet,
und der pH-Wert wird bei ca. pH 7 bis pH 10 gehalten. Beispielsweise
wird zu einer 10 %igen wässrigen
Lösung
von acyliertem FPI bei pH 9,0 eine geeignete Menge einer 25 %igen
wässrigen
Lösung
von Glutaraldehyd gegeben. Beispielsweise werden ca. 150 μl der 25
%igen Glutaraldehyd-Lösung
zu 10 ml der 10 % Proteinlösung
gegeben.
-
Die
Mischung wird sodann gründlich
gerührt
und über
Nacht bei Raumtemperatur härten
gelassen. Das gehärtete
Gel wird dann in einem Ofen bei 40 °C luftgetrocknet.
-
1 zeigt
die Wasseraufnahme von Hydrogelen aus unmodifiziertem Fischprotein
(FP) und 80 % EDTAD-FP. Die Gleichgewichtswasseraufnahme des unmodifizierten
FP betrug nur ca. 6 g/g Gel, während
die Wasseraufnahme des 80 % EDTAD-FP-Hydrogels einen Gleichgewichtswert
von ca. 200 g/g nach 24stündigem
Quellen erreichte. Es wird klar, dass die Einführung von drei Carboxygruppen
an jedem Lysyl-Rest in dem Protein das Proteinnetzwerk in die Lage
versetzte, ein große
Menge Wasser zu absorbieren. Die Rate und das Ausmaß der Quellung
von Hydrogelen werden bestimmt durch die Diffusionsrate des Wassers
in das Gel und die Rate und das Ausmaß der Relaxation des Polymernetzwerks
in Abhängigkeit
von der Wasserdiffusion (5–7).
Die Daten in 1 zeigen, dass die Wasseraufnahmerate
durch das trockene (glasartige) Gel während der ersten Stunde rasch
anstieg und danach langsamer wurde. Die anfängliche schnelle Phase steht
möglicherweise
in Beziehung zu der Diffusion von Wasser in die geladenen Gruppen
in dem Polymernetzwerk und deren Hydratation. Während dieser Phase kann das
Wasser – neben
der Hydratation der ionischen Gruppen – die Neigung zeigen, polare
Protein-Protein-Wechselwirkungen in dem Gelnetzwerk zu unterbrechen.
Dies sollte die Relaxationsrate des Polymernetzwerkes verbessern.
Jedoch zeigt die Abnahme der Quellungsrate des Hydrogels nach der
ersten Stunde an, dass, wenngleich das Protein denaturiert wurde, dadurch,
dass es Bedingungen von pH 12 und 65 °C vor der Vernetzung mit Glutaraldehyd
ausgesetzt wurde, seine strukturelle Relaxationsrate in dem Gelnetzwerk
dennoch nicht vergleichbar mit ei nem wahren Zufallsknäuel-Polymer
scheint. Zuvor ist gezeigt worden (1, 4), dass, selbst wenn man
Soja- und Fischproteine den obigen Denaturierungsbedingungen aussetzte,
die Proteine einen beträchtlichen
Anteil an α-Helix-
und β-Blattstrukturen
wiedererlangten, wenn die Bedingungen auf pH 9 und Raumtemperatur
zurückgebracht
wurden. Diese gefalteten Sekundärstrukturen
in dem vernetzten Proteinnetzwerk könnten der Relaxation des Gelnetzwerkes
entgegenwirken, wenn Wasser in das Netzwerk eindiffundiert. Es ist
wahrscheinlich, dass, wenn man Proteinketten in einem vernetzten
Proteinnetzwerk denaturierenden Bedingungen unterwirft, diese einen
ungeordneten Zustand beibehalten, wenn der Denaturant entfernt wird,
wegen der durch die Vernetzungsstellen auferlegten sterischen Hinderungen.
-
Zur
Aufhellung dieser Hypothese wurde das Gel nach der Vernetzung mit
Glutaraldehyd (und vor dem Trocknen) in Ethanol suspendiert. Infolge
Osmose penetrierte Ethanol in das Gel und Wasser diffundierte aus dem
Gel heraus in das Ethanol-Lösemittel
hinein. Nach einer Expositionszeit von 3 h hatte das Gel den größten Teil
seines Wassergehaltes verloren und kollabierte zu einem trockenen
Feststoff. Das trockene Gel wurde durch Filtration entfernt, in
einem Ofen bei 35 °C
für wenige
Minuten getrocknet, um Ethanol zu entfernen, und seine Quellungseigenschaften
wurden studiert.
-
2 zeigt
die Rate der Wasseraufnahme der Gele aus unmodifiziertem FP und
80 % EDTAD-FP, welche mit der Ethanolbehandlung hergestellt werden.
Im Falle des unmodifizierten FP betrug die Gleichgewichtswasseraufnahme
ca. 15 g/g, was mindestens doppelt so viel ist wie ohne die Ethanol-Behandlung (1). Ähnlich betrug
die Gleichgewichtswasseraufnahme des 80 % EDTAD-FP 425 g/g, was mehr als doppelt so
viel ist wie ohne die Ethanol-Behandlung (1).
-
3 zeigt
den Effekt der Ethanol-Behandlung auf die Wasseraufnahme von 60
% EDTAD-modifiziertem Sojaprotein (60 % EDTAD-SP). Wie im Falle
der Fischproteine, führte
die Ethanol-Behandlung von Sojaprotein ebenfalls zu einem starken
Anstieg der Rate und des Ausmaßes
der Quellung. Dies zeigt an, dass das Quellverhalten aller Protein-basierten
Hydrogele drastisch verbessert werden kann durch Behandeln des frisch vernetzten
Gels mit Ethanol.
-
Ein
Vergleich der Daten von 1 und 2 legt nahe,
dass sowohl die anfängliche
Rate als auch das Ausmaß der
Quellung der Gele durch die Ethanol-Behandlung deutlich verbessert werden.
Dies ist vermutlich auf die Ethanolinduzierte Denaturierung des
Proteins in dem Gelnetzwerk zurückzuführen. Um
zu bestimmen, ob die Ethanol-Behandlung strukturelle Veränderungen
in Proteinen in dem Gelnetzwerk verursacht, wurden die CD-Spektren
von gequollenen Gelen analysiert.
-
4 zeigt
CD-Spektren im fernen UV-Bereich von gequollenen Gelen von 80 %
EDTAD-FP, hergestellt mit und ohne Ethanol-Behandlung. Qualitativ
zeigte das CD-Spektrum des Gels, welches der Ethanol-Behandlung
nicht unterworfen worden war, ein größeres negatives Tal bei 230
nm und einen positiven Peak bei 200 nm. Diese Art von CD-Spektrum
hat man Proteinen zugeschrieben, welche reich an β-turns vom
Typ I sind (8–11).
Demgegenüber
zeigt das CD-Spektrum des Ethanol-behandelten Gels zwei größere negative
Täler in den
Gebieten 209–210
nm und 221–223
nm, die typisch für
eine Helix-Struktur
sind. Wenngleich es schwierig ist, die Beziehung zwischen Wasseraufnahmeeigenschaften
und den CD-Spektren der gequollenen Gele quantitativ zu interpretieren,
so heben die Daten in 4 doch die Tatsache hervor,
dass die Ethanol-Behandlung die Konformationseigenschaften von Proteinen
in dem Gelnetzwerk verändert
und dies wiederum einen bedeutenden Einfluss auf die Wasseraufnahmeeigenschaften
der Gele hat.
-
Ferner
wurde der Effekt einer Propanol-, Butanol- und Aceton-Behandlung
auf die Quellungseigenschaften von 80 % EDTAD-FP-Gelen untersucht.
Das Ausmaß der
Gleichgewichtsquellung der mit diesen Lösemitteln behandelten Gele
war geringfügig
niedriger als bei mit Ethanol behandelten Gelen.
-
5A zeigt
den Effekt der Ethanol-Behandlung auf die Quellungseigenschaften
von 80 % EDTAD-FP in 0,1 M NaCl bei 36 °C. Die Salzlösungsaufnahme des Gels, welches
nicht mit Ethanol behandelt worden war, betrug ca. 24 g/g, während die
des mit Ethanol behandelten Gels ca. 35 g/g betrug. Ferner war offensichtlich
die Rate der Salzlösungsaufnahme
bei dem Ethanol-behandelten Gel höher als ohne Ethanol-Behandlung.
Ein ähnliches
Verhalten wird ferner bei der Aufnahme von 0,15 M Salzlösung beobachtet (5B).
-
Die
Verbesserung der Rate und des Ausmaßes der Salzlösungsaufnahme
des Ethanol-behandelten Gels muss mit einer Erhöhung der Rate und des Ausmaßes der
Relaxation der Proteinketten in dem Netzwerk in Beziehung stehen.
-
6 zeigt
den Effekt der Temperatur auf die Gleichgewichtswasseraufnahme von
80 % EDTAD-FP-Gelen. Die Auftragungen des Logarithmus der Gleichgewichtswasseraufnahme
gegen die reziproke Temperatur für
die mit Ethanol behandelten sowie die nicht mit Ethanol behandelten
Gele zeigten ein lineares Verhalten im Temperaturbereich von 5–40 °C. Die Steigungen
dieser Auftragungen waren gleich, was nahe legt, dass die Enthalpie-Änderung
(ΔH) für Wasseraufnahme
für diese
beiden Gele gleich ist. Somit muss die Nettodifferenz im Absolutbetrag
der Wasseraufnahme bei einer beliebigen gegebenen Temperatur aus
Unterschieden in der strukturellen Flexibilität des Netzwerkes entstehen
(d.h. Entropie-bezogen).
-
Die
folgenden Protokolle werden rein beispielhaft, zum vollkommenen
Verständnis
der beanspruchten Erfindung bereitgestellt. Es versteht sich, dass
die Beispiele die hierin beanspruchte Erfindung in keiner Weise begrenzen.
-
Materialien:
-
Frische
Starraugen(fische) wurden von einer örtlichen Fischfarm bezogen.
Ethylendiamintetraessigsäuredianhydrid
(EDTAD) und Butanol stammten von der Fa. Aldrich Chemical Co. (Milwaukee,
Wisconsin). Glutaraldehyd (50 % wässrige Lösung) und Propanol wurden von
der Fa. Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri) bezogen. Absoluter
Ethylalkohol wurde von der Fa. Apper Alcohol and Chemical Co. (Shelbyville,
Kentucky) bezogen. Warmsiegelbares, wasserbenetzbares Papier wurde
von der Fa. Bolmet Inc. (Dayville, Connecticut) beschafft. Dialyseröhrchen (Molmassenausschlussgrenze
6000–8000),
Aceton und Ether wurden von der Fa. Fisher Scientific (Pittsburgh,
Pennsylvania) bezogen. Alle anderen Chemikalien waren analysenrein.
Deionisiertes Wasser wurde für
die Quellungsstudien verwendet.
-
Proteinbestimmung:
-
Weil
die in dieser Studie verwendeten modifizierenden Gruppen alle kalorimetrische
Methoden zur Bestimmung der Proteinkonzentration beeinflussen, wurde
die Proteinkonzentration nach dem Trockengewichtverfahren (1) bestimmt.
Ein gewogenes Aliquot einer Proteinstammlösung in deionisiertem Wasser
wurde bei 105 °C
in einem Vakuumofen bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Die Proteinkonzentration
wurde in % w/v ausgedrückt.
-
Modifikation von Fischprotein:
-
Die
chemische Modifikation der Lysyl-Reste des Proteins mit EDTAD wurde
durchgeführt,
wie an anderer Stelle berichtet (1). Es wurde eine 1 %ige Proteinlösung in
Wasser bei pH 12 hergestellt und für 30 min bei 65 °C inkubiert.
Die Lösung
wurde auf Raumtemperatur gekühlt,
und unter kontinuierlichem Rühren
wurde eine berechnete Menge an EDTAD in inkrementalen Mengen zugegeben.
Nach vollständiger
Zugabe von EDTAD wurde die Reaktionsmischung für 3 h stetig gerührt, unter
Aufrechterhaltung des pH-Wertes bei 12,0. Am Ende der Reaktion wurde
der pH-Wert der Proteinlösung
auf 4,5 eingestellt, um das Protein auszufällen. Die Suspension wurde
bei 10 000 g für
15 min zentrifugiert. Das Proteinsediment wurde mit Wasser bei pH
4,5 gewaschen und zentrifugiert. Das schließlich erhaltene Proteinpräzipitat
wurde sodann in Wasser bei pH 7,0 wieder aufgelöst und gefriergetrocknet. Das
Ausmaß der
Acylierung, d.h. der Prozentsatz an mit EDTAD modifizierten Lysyl-Resten,
wurde nach dem Trinitrobenzolsulfonsäure-(TNBS-)Verfahren (2) bestimmt.
-
Herstellung eines vernetzten
Hydrogels:
-
Eine
10 % Dispersion des EDTAD-modifizierten Fischproteins wurde hergestellt
durch Lösen
der erforderlichen Mengen an Protein in deionisiertem Wasser bei
pH 10 und mit einem Schneebesen für 15 bis 20 min homogen gemischt.
Wegen der hohen Viskosität
sah die 10 % Protein-Dispersion wie eine dicke Paste aus. Zu dieser
wurde eine bekannte Menge einer 50 % Glutaraldehyd-Lösung gegeben
(die ferner vorab auf pH 10 eingestellt worden war), so dass das
Verhältnis
von Protein zu Glutaraldehyd in der schließlich erhaltenen Mischung ca.
1:0,035 (wt/wt) betrug. Die Mischung wurde unter Verwendung eines
Schneebesens für
ca. 15 min gleichmäßig gemischt
und über
Nacht bei Raumtemperatur härten
gelassen. Das gehärtete
Gel wurde in zwei gleiche Teile geteilt. Ein Teil wurde in einem
Ofen bei 40 °C
getrocknet. Der andere Teil wurde für 3 h in Ethanol suspendiert,
wobei der Ethanol während
dieser Zeit mindestens zweimal ausgetauscht wurde. Die Ethanol-Behandlung
verursachte sowohl Denaturierung von Protein als auch Dehydratation
des vernetzten Gels. Am Ende der Ethanol-Behandlung lag das Gel
in Form von getrockneten Partikeln vor. Die Partikel wurden ferner
in einem Ofen bei 40 °C
für zwei
Stunden getrocknet, um Ethanol und jegliche Restfeuchte zu entfernen.
Unmodifizierte Fischprotein-Kontrollgele wurde auf dieselbe Weise
hergestellt. Nach vollständiger Trocknung
wurden die Gele auf eine Partikelgröße von kleiner als 1,0 mm gemahlen
und für
Quellungsstudien verwendet.
-
Quellungskinetik:
-
Die
Quellungsstudien für
alle obigen Gele wurden gravimetrisch bei 36 °C durchgeführt. Ein gewogene Menge getrockneten
Gels wurde dreifach in warmsiegelbare Beutel gegeben und in deionisiertem
Wasser quellen gelassen. In spezifischen Zeitintervallen wurden
die Beutel entnommen und bei 214xg in einer klinischen Zentrifuge
zentrifugiert, welche mit Probenhaltern mit einem Kunststoffnetzgewebe
für die
richtige Drainage des zum Boden des Halters ausgetriebenen Wassers
versehen war. Das Gewicht des gequollenen Gels wurde sofort bestimmt.
Geeignete Kontrollen für
das Nassgewicht des Beutels waren umfasst. Der nasse Beutel mit
gequollenem Gel wurde in einem Ofen bei 104 °C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Das Endtrockengewicht des Gels wurde bestimmt durch Subtrahieren
des Trockengewichts eines äquivalenten
leeren Beutels, der in der gleichen Weise behandelt worden war.
Die Wasseraufnahme wurde als Gramm absorbiertes Wasser pro Gramm
trockenes Gel bestimmt. Der Effekt der Ionenstärke auf die Wasseraufnahme
wurde in ähnlicher
Weise wie oben beschrieben untersucht durch Eintauchen der Gelproben
in 0,1 M und 0,15 M NaCl-Lösungen.
Der Einfluss der Temperatur auf die Wasseraufnahme wurde in einem
Bereich von 5–40 °C in temperaturkontrollierten
Wasserbädern
untersucht.
-
Messungen des Zirkulardichroismus:
-
Qualitative
CD-Messungen wurden in einem computerisierten Spektropolarimeter
durchgeführt (On-Line
Instruments Systems, Inc., Jefferson, GA). Die Gele, in Wasser gequollen,
wurden zwischen zwei Quartzplatten (2,5 × 2,5 cm) angeordnet, welche
durch 0,8 mm dicke Abstandshalter voneinander getrennt waren, und
die Zelle wurde versiegelt. Das CD-Spektrum im fernen UV-Bereich
des sandwichartig angeordneten Gels wurde im Bereich 190–240 nm
aufgezeichnet. Zwanzig Scans von jeder Probe wurden gemittelt, und
alle Spektren wurden auf die geeignete Wasser-Basislinie korrigiert.
Weil die Proben in Gelform vorlagen, wurden die Spektren im Milligrad-Modus
aufgezeichnet an Stelle des Elliptizitäts-Modus, der die exakte Konzentration des
Proteins in dem Gel verlangen würde.
-
Der
Lysin-Gehalt des aus dem Fischmuskel isolierten Rohproteins enthielt
ca. 9 Reste pro Molmasse 10 000. Reaktion des Rohproteins mit EDTAD
bei einem Protein-zu-EDTAD-Gewichtsverhältnis von 1:0,2 resultierte
in der Acylierung von ca. 80 % der Lysyl-Reste in dem Fischprotein
(80 % MFP). Bei einem Protein-zu-EDTAD-Verhältnis von 1:0,25 (w/w) wurden
ca. 90 % der Lysyl-Reste
acyliert (90 % MFP). Zuvor ist berichtet worden, dass unter den
in dieser Studie verwendeten Reaktionsbedingungen die Reaktion von
EDTAD mit den Protein-Lysyl-Gruppen zur Einführung von ca. 3 Carboxy-Gruppen
pro modifiziertem Lysyl-Rest führt (3,
4).
-
Es
versteht sich, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die besondere(n)
Ausführungsform,
Reagenzien, Schritte oder Methoden begrenzt ist, welche hierin beschrieben
sind, sondern alle Formen derselben umfasst, welche in den Bereich
der beigefügten
Ansprüche
fallen.
-
LITERATUR
-
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