DE60101739T2

DE60101739T2 - Makrolide

Info

Publication number: DE60101739T2
Application number: DE60101739T
Authority: DE
Inventors: Gerhard Fleissner; Helmut HÄCKER; Ernst Küsters; Gerhard Penn
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2000-05-22
Filing date: 2001-05-21
Publication date: 2004-12-09
Anticipated expiration: 2021-05-22
Also published as: US6706727B1; CN1430620A; EP1289997A1; CA2405593C; DE60101739D1; EP1289997B1; AU2001278428A1; ATE257481T1; WO2001090110A1; GB0012383D0; PT1289997E; DK1289997T3; JP2003534345A; JP4043239B2; TR200400723T4; JP2007254483A; HK1054945A1; ES2214436T3; CA2405593A1; CN1229381C

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Makrolide, insbesondere auf Makrolactammakrolide. Sie betrifft die Verbindungen der Formel I
worin
entweder R₁ für Hydroxy in der β-Konfiguration steht und
R₂ für Methyl steht und
einer der Substituenten R₃ und R₄ Ethyl ist und der andere für Methyl steht,
oder R₁ für Chlor in der α-Konfiguration steht und
einer der Substituenten R₂, R₃ und R₄ Ethyl ist und die anderen für Methyl stehen,
in freier Form und, falls solche Formen existieren, in Salzform,
welche im Folgenden als die erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet werden.
Hat R₁ in der Formel I die α-Konfiguration, dann liegt dieser Rest oberhalb der Papierebene, während er im Fall der β-Konfiguration unterhalb der Papierebene liegt. R₁ ist vorzugsweise Chlor in der α-Konfiguration. R₃ oder R₄, insbesondere R₃, ist vorzugsweise Ethyl.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden hierin abgekürzt wie folgt bezeichnet:

– falls R₁ für Hydroxy steht R₃ für Ethyl steht, als 21-Ethylascomycin, oder R₄ für Ethyl steht, als 27-Ethylascomycin,
– falls R₄ für Chlor steht und R₂ für Ethyl steht, als 19-Ethyl-ASM, oder R₃ für Ethyl steht, als 21-Ethyl-ASM, oder R₄ für Ethyl steht, als 27-Ethyl-ASM,

– (1R,9S,12S,13R,14S,17R,18E,21S,23S,24R,25S,27R)-12-[(1E-2-[(1R,3R,4R)-4-Hydroxy-3-methoxy-cyclohexyl]-1-methylvinyl]-17,21-diethyl-1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,27-trimethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo-[22.3.1.0^4,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetron;
– (1R,9S,12S,13R,14S,17R,18E,21S,23S,24R,25S,27R)-12-[(1E-2-[(1R,3R,4R)-4-Hdroxy-3-methoxycyclohexyl]-1-methylvinyl]-17,27-diethyl-1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21-trimethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo-[22.3.1.0^4,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetron;
– (1R,9S,12S,13R,14S,17R,18E,21S,23S,24R,25S,27R)-12-[(1E-2-[(1R,3R,4S)-4-Chlor-3-methoxycyclohexyl]-1-methylvinyl]-17,19-diethyl-1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,21,27-trimethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo-[22.3.1.0^4,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetron;
– (1R,9S,12S,13R,14S,17R,18E,21S,23S,24R,25S,27R)-12-[(1E-2-[(1R,3R,4S)-4-Chlor-3-methoxycyclohexyl]-1-methylvinyl]-17,21-diethyl-1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,27-trimethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo-[22.3.1.0^4,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetron; und
– (1R,9S,12S,13R,14S,17R,18E,21S,23S,24R,25S,27R)-12-[(1E-2-[(1R,3R,4S)-4-Chlor-3-methoxycyclohexyl]-1-methylvinyl]-17,27-diethyl-1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21-trimethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo-[22.3.1.0^4,9]octacos-l8-en-2,3,10,16-tetron.

21-Ethylascomycin und 27-Ethylascomycin sind höhere Homologe von Ascomycin. 19-Ethyl-ASM, 21-Ethyl-ASM und 27-Ethyl-ASM sind höhere Homologe von Pimecrolimus (ASM) (33-Epichlor-33-desoxyascomycin).
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch ein Verfahren hergestellt werden, umfassend

a) zur Herstellung der Verbindungen der Formel I gemäß obiger Definition, worin R₁ für Hydroxy in der β-Konfiguration steht, Züchtung eines geeigneten Mikroorganismus und Isolierung der entsprechenden Verbindungen der Formel I, worin R₁ für Hydroxy in der β-Konfiguration steht, aus dem erhaltenen Kulturmedium, oder
b) zur Herstellung der Verbindungen der Formel I gemäß obiger Definition, worin R₁ für Chlor in der α-Konfiguration steht, Ersatz von Hydroxy unter Epimerisierung durch Chlor bei einer entsprechenden Verbindung der Formel I, worin R₁ für Hydroxy in der β-Konfiguration steht,

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in herkömmlicher Weise durchgeführt.
Bei der Verfahrensvariante a) kann jeder Ascomycin bildende Mikroorganismenstamm verwendet werden, welcher höhere Homologe von Ascomycin bildet, beispielsweise als Verunreinigungen, vorzugsweise ein Stamm von Streptomyces hygroscopicus. Solche Stämme sind bekannt und über öffentliche Hinterlegungsstellen verfügbar. Vorzugsweise werden Stämme verwendet, die signifikante Mengen an höheren Homologen von Ascomycin produzieren oder Kulturbedingungen gewählt, welche eine Herstellung erhöhter Mengen an höheren Homologen von Ascomycin erlauben. Solche Stämme sind bekannt und leicht zugänglich, wie als Streptomyces hygroscopicus subsp. Ascomyceticus (beispielsweise ATCC 14891, ATCC 53855, ATCC 55087, ATCC 55276, ATCC 55558, DSM 5085), Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 (FERM BP-927), Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis Nr. 7238 (FERM BP-928, NRRL 18488), oder als natürliche oder künstliche Mutanten hiervon, und die Kulturbedingungen für eine verbesserte Bildung höherer Homologen sind ebenfalls bekannt oder lassen sich daraus leicht in herkömmlicher Weise bestimmten. Es lassen sich bequem geeignete Mutantenstämme, die eine erhöhte Bildung an höheren Homologen ergeben, kreieren oder in herkömmlicher Weise selektieren, oder eine Züchtung kann unter modifizierten Bedingungen bewirkt werden, wie einer erhöhten Konzentration des als C₄-Vorläufer verwendeten Natriumbutyrats in Kulturmedium.
Die Verfahrensvariante b) ist eine Substitutionsreaktion unter simultaner oder gleichzeitiger Epimerisierung. Sie kann beispielsweise gemäß der Beschreibung von EP 0 427 680 A1 durchgeführt werden. Sie wird vorzugsweise in einem inerten Lösemittel, wie Tetrahydrofuran oder Toluol bewirkt. Vorzugsweise wird diese Reakti on mit Tetrachlormethan oder N-Chlorsuccinimid in Gegenwart von Triphenylphosphin, zweckmäßigerweise in einem alkalischen Medium, wie Collidin, durchgeführt.
Die erhaltenen erfindungsgemäßen Verbindungen können aus der Kultur oder dem Reaktionsgemisch unter Anwendung bekannter Methoden isoliert und gereinigt werden. Es hat sich jedoch überraschenderweise gezeigt, dass die Verwendung einer chiralen stationären Phase, wie von Kromasil^®, während einer chromatographischen Reinigung eine Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindungen, und zwar insbesondere der Verbindungen, worin R₁ für Chlor steht, stark erleichtern kann.
Die benötigten Ausgangsmaterialien und Zwischenprodukte sind entweder bekannt oder können nach bekannten Verfahren oder in Analogie zu bekannten Verfahren oder in Analogie zur Beschreibung in den Beispielen hergestellt werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert, die nicht als Beschränkung zu verstehen sind. Alle darin gemachten Temperaturen verstehen sich in Grad Celsius. Die Verbindungen liegen in freier Form vor, sofern nichts anderes gesagt ist. Dabei werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie

I. D. Innendurchmesser

THF Tetrahydrofuran

TLC Dünnschichtchromatographie

% Gewichtsprozent – Gewicht/Gewicht
Beispiel 1: 21-Ethylascomycin und 27-Ethylascomycin
Verfahrensvariante a)

a) Rohes Ascomycin wird in einem halbindustriellen Maßstab (kg) durch Fermentation eines Stammes von Streptomyces (ATCC 14891) gemäß der Beschreibung im Beispiel 4 von EP 0 184 162 A hergestellt und durch Gegenstromextraktion (Res. Dicl. 402 [Oktober 1997], Seiten 725 und 726) gereinigt. Das dabei erhaltene Rohprodukt enthält etwa 35% Ascomycin, 15% 21-Ethylascomycin und 10% 27-Ethylascomycin. Dieses Material wird zur weiteren Reinigung einer Filtrationsstufe mit Silicagel unter Verwendung von Isopropylacetatln-Heptan 7/3 (V/V) als Eluiermittel unterzogen, um Ascomycin zu entfernen. Das dabei erhaltene weitere Rohprodukt enthält etwa 25% 21-Ethylascomycin und 15% 27-Ethylascomycin.
b) Man löst 1 g rohes 21-Ethylascomycin der obigen Stufe a) in 3,5 ml Isopropylacetat/Heptan 7/3 (V/V) und injiziert diese Beschickungslösung in eine präparative Säule (36 cm × 5 cm Innendurchmesser}, die 300 g Silicagel [Kromasil^® 100-5 SIL (Eka Nobel)] als stationäre Phase enthält. Das Gemisch wird mit Isopropylacetat/Heptan 7/3 (V/V) als mobile Phase unter einer Flussrate von 100 ml/min bei Raumtemperatur eluiert. Die UV Defektion wird bei 245 nm durchgeführt. Die Ascomycinderivate eluieren nach 34,5 min und werden in Intervallen von 1,1 min fraktioniert. Das 21-Ethylascomycin wird in den Fraktionen 13 bis 28 gesammelt. Die zusammengefassten Fraktionen werden gesammelt und bei 40°C unter Vakuum zur Trockne eingedampft. 13 präparative Versuche ergeben mehr als 1 g der Titelverbindung 21-Ethylascomycin.

FAB-MS: Fragmente in absteigender Ordnung: 812 [M + Li]^–, 602, 794, 425;

2D-¹H-NMR: 21-Ethyl = 1,21 ppm, 1,50 ppm (Methylen) und 0,87 ppm (Methyl).
c) Man behandelt 1 g rohes 27-Ethylascomycin der obigen Stufe a) wie oben bei der Stufe b) beschrieben mit der Ausnahme, dass die coeluierenden Fraktionen 1 bis 7 gesammelt werden. Die zusammengefassten Fraktionen werden gesammelt und bei 40°C unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Man löst 379 mg des erhalte nen Rückstands in 30 ml n-Hexan/Ethanol/Methanol 90/5/5 (V/V) und injiziert diese Beschickungslösung auf eine präparative Säule (40 cm × 10 cm Innendurchmesser), die 2,0 kg Amylose-tris(3,5-dimethylphenylcarbamat) (auf Silicagel aufgezogen) (Chiralpak-AD^®) enthält. Die Elution wird mit n-Hexan/Ethanol/Methanol 90/5/5 (V/V/V) als mobile Phase unter einer Flussrate von 150 ml/min bei Raumtemperatur vorgenommen. Die UV Detektion erfolgt bei 210 nm. Das 27-Ethylascomycin eluiert zwischen 60 und 80 min. Die das 27-Ethylascomycin enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und bei 40°C unter Vakuum zur Trockne eingedampft, wodurch man 120 mg der Titelverbindung 27-Ethylascomycin erhält.

FAB-MS: Fragmente in absteigender Ordnung: 828,6 [M + Na]⁺, 508,3, 423,0, 563,6;

2D-¹H-NMR: 27-Ethyl = 1,59 ppm, 1,19 ppm (Methylen) und 0,92 ppm (Methyl).

Beispiel 2: 19-Ethyl-ASM
Verfahrensvariante b)

a) ASM wird in einem halbindustriellen Maßstab (kg) unter Anwendung des in EP 0 427 860 A1 , Beispiel 66a, beschriebenen Verfahrens ausgehend von rohem Ascomycin hergestellt und einer chromatographischen Reinigung über Silicagel bei 40°C bis 45°C unter Verwendung von Heptan/tert-Butylmethylether (mit Wasser gesättigt)/Isopropanol 200/50/8 (V/V) als Eluiermittel unterzogen. Als Nebenfraktion der chromatographischen Reinigung erhält man 56%iges rohes 19-Ethyl-ASM.
b) Man unterzieht 17 mg des bei der obigen Stufe a) erhaltenen Rohprodukts einer präparativen Dünnschichtchromatographie durch Auflösung in 1 ml Methylenchlorid und Beladung einer TLC Platte (Merck 5715, 20 × 20 cm Innendurchmesser). Das Chromatogramm wird unter Verwendung eines Gemisches aus Pentan/Isopropanol 9/1 (V/V) als mobile Phase innerhalb eines Abstands von 18 cm entwickelt. Die Zone, welche 19-Ethyl-ASM (Rf = 0,35) enthält, wird von der TLC Platte entfernt und mit 2 ml Pentan gewaschen. Das Produkt wird mit 5 ml Acetonitril extrahiert und bei 60°C unter Vakuum getrocknet, wodurch man 4,4 mg der Titelverbindung mit einer Reinheit von ≥ 90% erhält.

FAB-MS: Fragmente in absteigender Ordnung: 830 [M + Li]⁺, 602, 313, 578, 788;

2D-¹H-NMR: 19-Ethyl = 2,17 ppm, 1,82 ppm (Methylen) und 0,98 ppm (Methyl).

Beispiel 3: 19-Ethyl-ASM
Verfahrensvariante b)
Die Titelverbindung erhält man analog zur Beschreibung im folgenden Beispiel 4 ausgehend von 19-Ethylascomycin, nämlich (1R,9S,12S,13R,14S,17R,18E,21S,23S,24R,25S,27R)-12-[(1E-2-[(1R,3R,4R)-4-Hydroxy-3-methoxycyclohexyl]-1-methylvinyl]-17,19-diethyl-1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,21,27-trimethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo-[22.3.1.0^4,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetron. (B Junker et al., Biotechnol Bioeng 59 [1998] Seiten 595 bis 604):

FAB-MS: Fragmente in absteigender Ordnung: 830 [M + Li]⁺, 602, 313, 578, 788;

2D-¹H-NMR: 19-Ethyl = 2,17 ppm, 1,82 ppm (Methylen) und 0,98 ppm (Methyl).
Beispiel 4: 21-Ethyl-ASM
Verfahrensvariante b)

a) Man löst 0,733 g 21-Ethylascomycin [siehe obiges Beispiel 1b)] zweimal in 2,5 ml Toluol und dampft das Ganze bei 50°C unter Vakuum ein. In einem getrennten 25 ml Kolben löst man 0,298 g Triphenylphospin in 4,7 ml Tetrahydrofuran, versetzt die Lösung mit 0,152 g N-Chlorsuccinimid und rührt die Suspension während 30 min bei Raumtemperatur. Diese Suspension wird zuerst mit 0,202 ml s-Collidin versetzt und dann mit einer Lösung des in obiger Weise getrockneten 21-Ethylascomycins in 3,9 ml Tetrahydrofuran. Die Lösung wird dann während 1,5 h auf 50°C erhitzt und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Es werden 16,6 ml Cyclohexan zugesetzt, worauf die organische Phase mit 0,18 g Citronensäure in einem Gemisch aus 3,5 ml Wasser und 3,5 ml Methanol extrahiert wird. Die organische Phase wird erneut zweimal mit jeweils 7 ml Methanol/Wasser 1/1 (V/V) extrahiert, worauf die vereinigte Wasserphase mit 10 ml Cyclohexan reextrahiert wird. Das Lösemittel wird bei 50°C verdampft, wodurch man zu 0,79 g rohem 21-Ethyl-ASM gelangt.
b) Man löst 0,1 g rohes Produkt der obigen Stufe a) in 1,0 ml Ethanol und injiziert diese Beschickungslösung auf eine präparative Säule (25 cm × 2 cm Innendurchmesser), die 55 g Umkehrphasensilicagel [Kromasil^® RP-18 (5 μm)] als stationäre Phase enthält. Das Produkt eluiert man mit 70% Lösemittel B [Lösemittel A = Wasser/Phosphorsäure 1000/1 (V/V); Lösemittel B = Acetonitril/tert-Butylmethylether 825/175 (V/V)] als mobile Phase bei einer Flussrate von 15 ml/min bei 60°C. Eine UV Detektion erfolgt bei 210 nm. Das 21-Ethyl-ASM eluiert zwischen 11,5 min und 12,0 min. Die organischen Lösemittel der Produktfraktion werden bei 50°C unter Vakuum verdampft, und die zurückbleibende Wasserphase wird zweimal mit jeweils 15 ml Methylenchlorid extrahiert. Schließlich wird das Methylenchlorid bei 50°C unter Vakuum verdampft, wodurch man 30 mg der Titelverbindung erhält.

FAB-MS: Fragmente in absteigender Ordnung: 830 [M + Li]⁺, 397, 149;

2D-¹H-NMR: 21-Ethyl = 1,30 ppm, 1,20 ppm (Methylen) und 0,90 ppm (Methyl).

Beispiel 5: 27-Ethyl-ASM
Verfahrensvariante b)

a) Man löst 135 mg 27-Ethylascomycin [siehe obiges Beispiel 1c)] in 1,4 ml Toluol und verdampft das Lösemittel bei 60°C und 80 bis 20 mbar. Der Rückstand wird in 0,36 ml THF (< 0,01% H₂O) gelöst. In einem getrennten Kolben werden 41,4 mg Triphenylphosphin und 21,1 mg N-Chlorsuccinimid in 0,4 ml THF während 0,5 h bei 20°C gerührt, worauf man 27,4 mg s-Collidin zugibt und dann die obige Lösung von 27-Ethylascomycin zusetzt, welche mit 30 μl THF gespült wird. Die Suspension wird 2 h auf 50 bis 53°C erhitzt und dann einer HPLC Analyse unterzogen. Nach beendeter Umsetzung wird das Gemisch auf 30°C gekühlt und mit 1,25 ml Cyclohexan und schließlich mit 26,1 mg wasserfreier Citronensäure als Lösung in 0,53 ml Wasser/Methanol 1/1 (V/V) versetzt. Die obere Schicht wird abgetrennt und mit zweimal 0,3 ml Wasser/Methanol 1/1 (V/V) gewaschen. Die wässrigen Schichten werden zweimal mit je 0,3 ml Cyclohexan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden bei 50°C und 80 bis 20 mbar eingedampft, wodurch man 109 mg rohes 27-Ethyl-ASM (braunes Harz) erhält.
b) Man löst 0,052 g rohes Produkt der obigen Stufe a) in 1,0 ml Acetonitril und injiziert diese Beschickungslösung auf eine präparative Säule (25 cm × 2 cm Innendurchmesser), die 55 g Umkehrphasensilicagel [Kromasil^® RP-18 (5 μm)] als stationäre Phase enthält. Das Produkt wird mit Acetonitril/Wasser/tert-Butylmethylether 700/300/50 (V/V/V) als mobile Phase bei einer Flussrate von 15 ml/min bei 60°C eluiert. Die W Detektion erfolgt bei 210 nm. Das 27-Ethyl-ASM eluiert zwischen 15,0 min und 25,0 min. Die organischen Lösemittel der Produktfraktion werden verdampft, wodurch man 12,4 mg der Titelverbindung erhält.

FAB-MS: Fragmente in absteigender Ordnung: 846,7 [M + Na]⁺, 810,5 433;

2D-¹H-NMR: 27-Ethyl = 1,20 ppm, 1,20 ppm (Methylen) und 0,90 ppm (Methyl).

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind ursprünglich als Verunreinigungen während einer Aufbereitung bei der Herstellung von Ascomycin bzw. ASM detektiert worden. Nach ihrer Identifizierung und Charakterisierung hat sich gezeigt, dass sie unerwarterterweise über eine signifikante und überraschend starke pharmakologische Wirksamkeit verfügen. Sie sind daher zur Verwendung als Pharmazeutika angezeigt. Insbesondere zeigen sie eine immunsuppressive und antihyperproliferative sowie eine antiinflammatorische Wirksamkeit.
Die antiinflammatorische Wirksamkeit kann beispielsweise nach der folgenden Testmethode bestimmt werden.
Durch Oxazolon induzierte allergische Kontaktdermatitis (Maus)
F M Dietrich und R Hess, Int Arch Allergy 38 (1970) Seiten 246 bis 259
Die erfindungsgemäßen Verbindungen hemmen eine inflammatorische Schwellung um etwa 10% bis etwa 50% nach einer einzelnen topischen Anwendung in Form einer 0,1 mM Lösung und um etwa 40% bis etwa 60% in Form einer 1 mM Lösung.
Die immunsuppressive und antihyperproliferative Wirksamkeit kann beispielsweise durch die folgende Testmethode bestimmt werden:
Durch Allergen mediierte Stimulation eines Helfer-T-Zellklons durch Dendritenzellen
Br J Dermatol 141 (1999) Seiten 264 bis 273
Die erfindungsgemäßen Verbindungen hemmen eine Stimulation (IC₅₀) bei einer Dosis von etwa 0,1 nM bis etwa 10 nM, insbesondere von etwa 0,1 nM bis etwa 1 nM betreffend die Ascomycinhomologen und von etwa 1 nM bis etwa 10 nM betreffend die ASM-Homologen.
Diese Wirksamkeit wird weiter belegt in zusätzlichen Tests mit dem obigen Helfer-T-Zellklon und mit von Monozyten abgeleiteten Dendritenzellen.
Der CD4⁺ Antigen spezifische humane Helfer-T-Zellklon (TCC) wird durch limitierende Verdünnungskultur zubereitet (T C Van Reijsen et al, J Allergy Clin Immunol 90 [1992] Seiten 184 bis 193). Der TCC erkennt ein Peptid, welches abgeleitet ist vom größeren Allergen Der p1 der Hausstaubmilbe Dermatophagoides pteronyssinus (Dpt) in Assoziation mit dem MHC-Klasse-II-Retstriktionsmolekül HLA-DPw4 (P J Baselmanns et al, Human Immunol 61 [2000] Seiten 789 bis 798). Zur Erzielung einer ausreichenden Zellanzahl für Assayzwecke expandiert man den TCC in vitro durch Aktivierung mit immobilisiertem Anti-CD3 monoklonalen Antikörpern (Leu-4, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) und durch Züchtung in vollständigem Medium, welches mit rIL-2 und rhIL-4 (jeweils 50 U/ml) supplementiert ist (Van Reijsen et al, supra).
Humane, von Monozyten abgeleitete Dendritenzellen (M-DC) werden hergestellt aus gereinigten Monozyten durch Züchtung in RPMI 1640 Kulturmedium bei einer Zelldichte von 7 × 10⁵ Zellen/ml. Das Kulturmedium ist ergänzt mit 15% FCS und rh-GM-CSF (300 U/ml) und rh-IL-4 (100 U/ml). Am 7. Tag der Züchtung exprimieren 90 bis 95% der Zellen den Phenotyp von M-DC, wie durch Fließzytometrie verifiziert wird, und diese Zellen werden zur Antigen spezifischen Stimulation des TCC verwendet, das wenigstens 14 Tage nach der letzten Herausforderung mit Antigen oder Anti-CD3 mAb verwendet wird, um einen Ruhezustand der Zellen sicherzustellen. Zur Antigen spezifischen Stimulation wird das M-DC über Nacht (wenigstens 12 h) in Kulturmedium bebrütet, das 50 μg/ml des Extrakts von Dpt (ARTU Biologicals NV, Lelystad, Niederlande) enthält. Der Gehalt des hauptsächlich verwendeten Allergens Der p1 beträgt etwa 18,5 μg/mg des Dpt Extrakts. Das M-DC wird zweimal gewaschen, wobei Mengen von 50 μl der fertigen Zahl an M-DC zu 5 × 10⁴ T-Zellen pro Vertiefung in 100 μl Medium zugesetzt werden, sodass sich ein Verhältnis von M-DC zu T-Zellen von 1150 ergibt. Unmittelbar darauf werden Teilmengen von 50 μl zu einer vierfachen Endkonzentration der zu prüfenden Verbindung gegeben. Jede Probe wird vierfach geprüft. Die zu prüfende Verbindung wird derart in Ethanol gelöst, dass sich eine Vorratslösung von 1 mM ergibt und auf 1/1000 in dem vollständigen Kulturmedium verdünnt, das auch zur Herstellung der Endverdünnung der zu prüfenden Verbindung verwendet wird. Die T-Zellproliferation wird bestimmt durch Pulsierung mit 1 μCi/20 μl/Vertiefung an (Methyl-)³H-thymidin (Amersham, GB) während der letzten 16 h einer 4 Tage dauernden Züchtung.
Es werden die folgenden IC₅₀ Werte erhalten:
Tabelle
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind daher in freier Form und, wo solche Formen existieren, in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes indiziert als antiinflammatorische Mittel und als immunsuppressive und antiproliferative Mittel zur Anwendung bei der Verhinderung und Behandlung inflammatorischer Zustände und von Zuständen, welche eine Immunsuppression erfordern, wie

a) die Behandlung inflammatorischer und hyperproliferativer Hauterkrankungen, wie Psoriasis, atopischer Dermatitis, Kontaktdermatitis und ferner ekzematöser Dermatosen, Seborrhöischer Dermatitis, Lichen planus, Phemphigus, bullösem Pemphigoid, Epidermolysis bullosa, Vaskulitis, Erythema, kutaner Eosinophilie, Lupus erythematosus und Akne,
b) der Verhinderung und Behandlung allergischer Erkrankungen, wie extrinsischem Asthma, Rhinitis, Conjunctivitis, atopischem Ekzem, Urticaria/Angioödem, Nahrungsmittel/Arzneimittel-Allergie und Anaphylaxe,
c) der Verhinderung und Behandlung von
– Resistenz in Situationen von Organ- oder Gewebetransplantationen, beispielsweise von Herz, Niere, Leber, Knochenmark und Haut,
– Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankungen, wie nach Knochenmarktransplantationen,
– Autoimmunerkrankungen, wie rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus erythematosus, Hashimoto-Thyroiditis, multiple Sklerose, Myasthenia gravis, Diabetes Typ I und Uveitis,
– Hautmanifestationen immunologisch mediierter Störungen,
– Intestinalerkrankungen und
d) Alopecia areata.

Die Verbindungen können systemisch oder topisch angewandt werden. Für die obigen Indikationen schwanken die geeigneten Dosierungen natürlich in Abhängigkeit von beispielsweise dem Wirt, der Art der Verabreichung und der Natur sowie der Strenge des zu behandelnden Zustands. Im Allgemeinen lassen sich aber zufriedenstellende Ergebnisse bei systemischer Anwendung in Tagesdosen von etwa 0,15 mg/kg bis etwa 1,5 mg/kg Körpergewicht erzielen. Bei den größeren Säugern liegt eine indizierte Tagesdosis im Bereich von etwa 0,01 mg bis etwa 100 mg, zweckmäßigerweise verabreicht beispielsweise in unterteilten Dosen bis zu viermal täglich oder in Retardform. Für eine topische Anwendung lassen sich zufriedenstellende Ergebnisse erzielen durch eine lokale Verabreichung in einer Wirkstoffkonzentration von etwa 1 Gew.-% bis etwa 3 Gew.-% mehrmals täglich, beispielsweise zwei- bis fünfmal täglich. Beispiele für indizierte galenische Formen sind Lotionen, Gele, Cremes, Sprays und Lösungen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf irgendeinem herkömmlichen Weg verabreicht werden. Insbesondere enteral, beispielsweise oral, beispielsweise in Form von Tabletten oder Kapseln, oder topisch, beispielsweise in Form von Lotionen, Gelen, Cremes, Sprays, ophthalmischen oder nasalen Lösungen oder Aerosolen für eine lokale Behandlung von Haut und Mucosamembranen, beispielsweise des Auges, des Atmungstrakts, der Vagina, sowie der Mund- und Nasenkavität.
Pharmazeutische Zusammensetzungen für eine beispielsweise topische Anwendung, die eine erfindungsgemäße Verbindung in freier Form oder, wo solche Formen existieren, in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes in Assoziation mit wenigstens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel enthalten, können in herkömmlicher Weise hergestellt werden durch Vermischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel. Einheitsdosierungsformen enthalten beispielsweise etwa 0,0025 mg bis etwa 50 mg Wirkstoff.
Eine topische Verabreichung ist beispielsweise eine Behandlung der Haut. Eine weitere Form für eine topische Verabreichung ist eine Verabreichung in das Auge, beispielsweise zur Verhinderung oder Behandlung immunmediierter Zustände des Auges, wie Autoimmunerkrankungen, beispielsweise Uveitis, Keratoplastie und chronische Keratitis, allergische Zustände, beispielsweise vernale Conjunctivitis, inflammatorische Zustände und Corneatransplantate, und Glaucoma, durch topische Verabreichung auf die Augenoberfläche einer erfindungsgemäßen Verbindung in freier Form oder, wo solche Formen existieren, in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes in einem pharmazeutisch annehmbaren ophthalmischen Träger.
Der ophthalmische Träger ist so beschaffen, dass die zu verabreichende Verbindung so lange mit der Augenoberfläche in Kontakt gehalten wird, dass die Verbindung die Corneabereiche und inneren Bereiche des Auges penetrieren kann, beispielsweise die vordere Kammer, die hintere Kammer, den Glaskörper, den Humor aquosus, den Humor vitreus, die Cornea, die Iris/Cilia, die Linse, die Choroidea/Retina und die Sclera. Der pharmazeutisch annehmbare ophthalmische Träger kann beispielsweise eine Salbe, ein Pflanzenöl oder ein Einkapselungsmaterial sein.
Die antiinflammatorische und immunsuppressive sowie antiproliferative Wirksamkeit ist zwar die Hauptaktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen, doch verfügen diese Verbindungen auch über ein gewisses Ausmaß an Aktivität bei der Erhöhung der Empfindlichkeit oder der Wirksamkeit einer chemotherapeutischen Arzneimitteltherapie. Diese Wirksamkeit lässt sich beispielsweise bestimmen nach den Testmethoden, wie sie in EP 0 360 760 A beschrieben sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind daher auch angezeigt zur Anwendung bei einer revertierenden chemotherapeutischen Arzneimittehesistenz verschiedener Arten, beispielsweise bei einer erworbenen oder angeborenen Art, oder einer zunehmenden Sensitivität gegenüber einer verabreichten Wirkstofftherapie, beispielsweise als ein Mittel zur Erniedrigung regulärer chemotherapeutischer Dosierungshöhen, wie im Falle einer antineoplastischen oder zytostatischen Arzneimitteltherapie, als ein Mittel zur Herabsetzung der Gesamtarzneimitteltoxizität und spezieller als Mittel zur Umkehr oder Verringerung einer Resistenz unter Einschluss von sowohl einer ererbten als auch einer erworbenen Resistenz gegenüber einer Chemotherapie.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung in freier Form oder, wo solche Formen existieren, in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes als ein Pharmazeutikum, einer solchen erfindungsgemäßen Verbindung zur Verwendung als ein Pharmazeutikum, die Verwendung einer solchen erfindungsgemäßen Verbindung bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung oder Behandlung eines inflammatorischen Zustands oder eines eine Immunsuppression erfordernden Zustands, eines Verfahrens zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung durch Vermischung einer erfindungsgemäßen Verbindung zusammen mit wenigstens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel und einer Methode zur Verhinderung oder Behandlung inflammatorischer Zustände oder von Zuständen, die einer Immunsuppression bedürfen, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung an einen behandlungsbedürftigen Patienten.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als einzige Wirkkomponente verabreicht werden oder lassen sich zweckmäßigerweise auch in Kombination oder Assoziation mit ein oder mehr weiteren pharmazeutisch wirksamen und kompatiblen Mitteln verabfolgen, beispielsweise mit Makrolactammakroliden, vorzugsweise mit Ascomycinderivaten, wie Ascomycin selbst oder ASM.
Die Erfindung bezieht sich daher auch auf pharmazeutische Zusammensetzungen aus einer erfindungsgemäßen Verbindung in freier Form oder, wo solche Formen existieren, in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes zusammen mit wenigstens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel, optional in Kombination oder Assoziation mit ein oder mehr weiteren pharmazeutisch wirksamen und verträglichen Mitteln, beispielsweise mit Makrolactammakroliden, vorzugsweise Ascomycinderivaten, wie Ascomycin selbst oder ASM. Die erfindungsgemäße Verbindung kann in einer solchen Kombination oder Assoziation in breit variierenden Mengen vorhanden sein, beispielsweise in Mengen von etwa 99% bis etwa 1% oder allgemein von etwa 90% bis etwa 10% oder, falls sie in Kombination oder Assoziation mit einem Makrolactammakrolid vorliegt, vorzugsweise mit einem Ascomycinderivat, insbesondere mit Ascomycin selbst oder ASM, vor allem ASM, in Anbetracht der ähnlichen pharmakologischen Profile, in Mengen von etwa 99,99% bis etwa 0,01%, beispielsweise in Mengen von etwa 99,9% bis etwa 0,1%, oder von etwa 95% bis etwa 5%, bezogen auf das Gewicht der jeweiligen Wirkstoffe.
Geeignete Ascomycinderivate werden beispielsweise beschrieben in EP 0 184 162 A , EP 0 315 978 A , EP 0 323 042 A , EP 0 423 714 A, EP 0 427 680 A , EP 0 465 426 A , EP 0 474 126 A , WO 91 13 889 A, WO 91 19 495 A, EP 0 484 936 A , EP 0 523 088 A , EP 0 532 089 A , EP 0 569 337 A , EP 0 626 385 A , WO 93 05 059 und WO 97 08 182 A, besonders

– Ascomycin selbst,
– Tacrolimus (FK506; Prograf^®),
– Imdazolylmethoxyascomycin (WO 97 08 182 A in Beispiel 1 und als Verbindung der Formel I),
– 32-O-(1-Hydroxyethylindol-5-yl)ascomycin (L-732531) (Transplantation 65 [1998] 10 bis 18, 18 bis 26, auf Seite 11, 1, und
– (32-Desoxy,32-epi-N1-tetrazolyl)ascomycin (ABT-281) (J Invest Dermatol 12 [1999] 729 bis 738, auf Seite 730, 1), vorzugsweise
– {1R,5Z,9S,12S-[1E-(1R,3R,4R)]13R,14S,17A,18E,21S,23S,24R,25S,27R}-17-Ethyl-1-14-dihydroxy-12-[2-(4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0^4,9]octacos-5,18-dien-2,3,10,16-tetron (Beispiel 8 von EP 0 626 385 A ),
– {1E-(1R,3R,4R)]1R,4S,5R,6S,9R,10E,13S,15S,16R,17S,19S,20S}-9-Ethyl-6,16,20-trihydroxy-4-[2-(4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-15,17-dimethoxy-5,11,13,19-tetramethyl-3-oxa-22-azatricyclo[18.6.1.0^1,22]heptacos-10-en-2,8,21,27-tetron (Beispiele 6d und 71 in EP 0 569 337 A ) und
- Pimecrolimus (ASM) (Beispiel 66a von EP 0 427 680 A , 33-Epichlor-33-desoxyascomycin).

Claims

Verbindung der Formel I
worin entweder R₁ für Hydroxy in der β-Konfiguration steht und R₂ für Methyl steht und einer der Substituenten R₃ und R₄ Ethyl ist und der andere für Methyl steht, oder R₁ für Chlor in der α-Konfiguration steht und einer der Substituenten R₂, R₃ und R₄ Ethyl ist und die anderen für Methyl stehen, in freier Form oder, falls solche Formen existieren, in Salzform.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1 durch a) zur Herstellung der Verbindungen der Formel I gemäß Definition von Anspruch 1, worin R₁ für Hydroxy in der β-Konfiguration steht, Züchtung eines geeigneten Mikroorganismus und Isolierung der entsprechenden Verbindungen der Formel I, worin R₁ für Hydroxy in der β-Konfiguration steht, aus dem erhaltenen Kulturmedium, oder b) zur Herstellung der Verbindungen der Formel I gemäß Definition von Anspruch 1, worin R₁ für Chlor in der α-Konfiguration steht, Ersatz von Hydroxy unter Epimerisierung durch Chlor bei einer entsprechenden Verbindung der Formel I, worin R₁ für Hydroxy in der β-Konfiguration steht, und Gewinnung der erhaltenen Verbindung in freier Form oder, falls solche Formen existieren, in Salzform.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung gemäß Definition von Anspruch 1 in freier Form oder, falls solche Formen existieren, in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes zusammen mit wenigstens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin die Verbindung in Kombination oder Assoziation mit einem weiteren pharmazeutisch wirksamen und kompatiblen Mittel vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin die Verbindung in Kombination oder Assoziation mit ASM vorliegt.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 3 durch Vermischung der Verbindung mit wenigstens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel.
Verbindung gemäß Definition von Anspruch 1 in freier Form oder, falls solche Formen existieren, in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes zur Verwendung als Pharmazeutikum.
Verbindung gemäß Definition von Anspruch 1 in freier Form oder, falls solche Formen existieren, in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes zur Verwendung bei der Prävention oder Behandlung inflammatorischer Zustände oder von Zuständen, die eine Imunsuppression erfordern.
Verwendung einer Verbindung gemäß Definition von Anspruch 1 in freier Form oder, falls solche Formen existieren, in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention oder Behandlung inflammatorischer Zustände oder von Zuständen, die eine Imunsuppression erfordern.