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Fachgebiet
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Die
Erfindung bezieht sich auf die Untersuchung von Tumorprogression.
Sie betrifft insbesondere Modellsysteme zur Untersuchung der Metastasierung
von Tumoren in Wirbeltieren, und Modelle sowie Verfahren zur Evaluierung
von potentiellen Arzneimitteln.
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Hintergrund
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Es
ist seit langem anerkannt, daß die
Fähigkeit
von Tumorgeweben zu metastasieren einen wichtigen Teil der lebensbedrohlichen
Eigenschaften von bösartigen
Tumoren darstellt. Metastasierung bedeutet das Entstehen von Sekundärtumoren
an Stellen abseits des Primärtumors.
Deshalb kann es, trotz chirurgischer Entnahme des Primärtumors,
unmöglich
sein, das Fortschreiten der Erkrankung aufzuhalten. Das Verständnis des
Mechanismus, durch den Metastasierung auftritt, wird maßgebend
für die Entwicklung
von Protokollen sein, durch welche das Wachstum von Sekundärtumoren
kontrolliert werden kann. Um den Mechanismus der Metastasierung
zu verstehen, wird es notwendig sein, ein Modell bereitzustellen,
welches das Erkennen einer kleinen Zahl von Tumorzellen vor dem
Hintergrund vieler Wirtszellen erlaubt, so daß Sekundärtumoremboli und Mikrometastasen
in Echtzeit beobachtet werden können.
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Andere
haben die Extravasation und das initiale Einnisten bei der Tumormetastasierung
unter Verwendung von extern fluoreszenzmarkierten Tumorzellen in
vitro gezeigt. Khokha, R. et al., Cancer Metastasis Rev (1995) 14:
279–301;
Koop, S. et al., Cancer Res (1995) 55: 2520–2523. Weiterhin waren Margolis,
L. B. et al., In Vitro Cell Dev Biol (1995) 31: 221–226 in
der Lage, die Migration von extern fluoreszenzmarkierten Lungentumorzellen
in den Lungen von Wirtsmäusen
in Gewebekultur sichtbar zu machen. Eine Langzeitbeobachtung war
jedoch in allen Fällen
wegen der Limitierung der exogenen Fluoreszenzmarkierungen nicht
möglich.
Es wurde gezeigt, daß retroviraler
Transfer eines grün
fluoreszierenden Proteins (GFP) zu stabilen Transfektanten menschlicher
Krebszellen in vitro (Levy, J. P. et al., Nature Biotechnol (1996)
14: 610–614),
sowie hematopoetischer Zellen (Grignani, F. et al. Cancer Res (1998)
58: 14–19
und Cheng, L. et al., Gene Therapy (1997) 4: 1013–1022),
führt.
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Versuche,
solch ein Modell unter Verwendung des β-Galaktosidasegens als Marker
bereitzustellen, wurden unternommen (Lin, W. C. et al., Cancer Res
(1990) 50: 2808–2817;
Lin, W. C. et al., Invasion and Metastasis (1992) 12: 197–209). Dieser Marker
erwies sich jedoch als nicht zufriedenstellend, da frisches oder
prozessiertes Gewebe nicht verwendet werden kann. Die vorliegende
Erfindung stellt einen Marker zur Verfügung, der das Sichtbarmachen der
Tumorinvasion und der Bildung von Mikrometastasen in lebendem, frischem
Gewebe erlaubt. Durch das Bereitstellen geeigneter Kontrastmittel
kann das erfindungsgemäße Verfahren
zusätzlich
an das Sichtbarmachen der Angiogenese in etablierten und wachsenden
Tumoren angepaßt
werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren
können
nicht nur auf Modelle des Tumorwachstums und der Metastasierung angewandt
werden, sondern können,
durch die Verwendung von retroviralen Vektoren, eingesetzt werden,
um klinische Daten von menschlichen Patienten mit Tumoren zu erhalten.
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Die
vorliegende Erfindung verwendet grün fluoreszierendes Protein
(GFP) als Marker. Die heterologe Expression dieses Proteins wurde,
vor allem um die Expression fusionierter DNA zu beobachten, in
US-Patent Nr. 5,491,084 offenbart.
Dieses Dokument beschreibt die Expression von GFP in E. coli und
C. elegans und stellt die These auf, daß Zellen generell modifiziert
werden können,
um GFP zu exprimieren. Laut diesem Dokument erlaubt eine solche
Expression nicht nur ein Verfahren, um die Expression fusionierter
DNA zu beobachten, sondern auch die Möglichkeit, die Lokalisierung
von Proteinen innerhalb der Zelle zu beobachten.
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Der
Teil der Erfindung, der ein Metastasemodell bereitstellt, wurde
in einer Reihe von Publikationen gemeldet und beschrieben. Chishima,
T. et al., Cancer Research (1997) 57: 2042–2047 beschreiben die Konstruktion
eines dicistronischen Vektors, der das Gen für humanisiertes grün fluoreszierendes Protein
(GFP) und Dihydrofolatreduktase (DHFR) enthält. Dieser Vektor wurde in
CHO-K1 Zellen transfiziert, um Klon-38 zu erhalten. Klon-38 zeigte
stabile GFP-Expression, die in Anwesenheit von Methotrexat (MTX)
aufrechterhalten wurde. Zellen von Klon-38 wurden in Mäuse injiziert,
um Tumorfragmente zu erhalten, die dann durch chirurgische orthotope
Implantation (COI) auf die Eierstockserosa von Nacktmäusen implantiert
wurde. Eine Metastasierung konnte in diesem Modell verfolgt werden.
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Chishima,
T. et al., Proc Natl Acad Sci USA (1997) 94: 11573–11576 beschreiben
die Herstellung von Klon-26 durch die Transfektion von menschlichen
Anip 973 Lungenadenokarzinomzellen mit dem Kodon-optimierten hGFP-S65T
Klon von Clontech. Klon-26 wurde intravenös in Nacktmäuse injiziert und die daraus
entstandenen Tumore in Gewebekultur verfolgt.
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Chishima,
T. et al., Clin Exp Metastasis (1997) 15: 547–552 und Chishima, T. et al.,
Anticancer Res (1997) 17: 2377–2384
beschreiben ähnliche Arbeiten
mit Klon-26, wobei die Zellen subkutan in Nacktmäuse inokuliert wurden, was
zu einem visualisierbaren Tumor führte, der dann durch COI in
die viscerale Pleura von Nacktmäusen
implantiert wurde. Metastasen wurden auch in diesem Modell beobachtet.
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Chishima,
T. et al., In Vitro Cell Dev Biol (1997) 33: 745–747 beschreiben die Gewebekultur von
Klon-26 und das Sichtbarmachen des Wachstums unter Verwendung der
von GFP emittierten Fluoreszenz.
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WO 98/49336 beschreibt
ein Verfahren zur Beobachtung der Expression von Metastasen von Primärtumoren
unter Verwendung von grün
fluoreszierendem Protein als Marker. Die Fluoreszenz ist nur in
manchen Fällen
ausreichend hell, um direkt durch die Haut gesehen zu werden.
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Yang,
M. et al., Cancer Res (1998) 58: 4217–4221 beschreiben die Transduktion
der menschlichen Lungenkrebszelllinie H460 mit einem retroviralen
Expressionsvektor, der verbessertes GPF enthält, um einen stabilen, hoch-GFP-exprimierenden
Klon zu erhalten. Zellen aus dieser Zelllinie wurden in Nacktmäuse injiziert
und die entstehenden, subkutan wachsenden, markierten Tumore durch
COI in den linken Lungenflügel
von Nacktmäusen
transplantiert. Fluoreszenz von Metastasen im benachbarten Lungenflügel, in
der Pleuramembran und im gesamten Skelettsystem konnte beobachtet werden.
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Yang,
M. et al., Cancer Res (im Druck) berichten ähnliche Studien unter Verwendung
eines Prostatatumormodells und zeigen in Nacktmäusen Fluoreszenz im gesamten
Skelettsystem.
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Zusätzlich zum
Vorstehenden, beschreiben Cheng, L. et al., Gene Therapy (1997)
4: 1013–1022 die
Modifikation von hämatopoetischen
Stammzellen unter Verwendung des GFP-Gens unter Kontrolle eines
retroviralen Promotors. Obwohl die Autoren feststellen, daß humane
Stammzellen mit diesem System nur schwer unter Verwendung einer
verbesserten Form von GFP transfiziert werden können, konnte zufriedenstellende
Helligkeit erreicht werden.
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Zusätzlich berichten
Grignani, F. et al., Cancer Res (1998) 58: 14–19 die Verwendung eines hybriden
EBV/retroviralen Vektors der GFP exprimiert, um hoch effizienten
Gentransfer in menschliche hämatopoetische
Vorläuferzellen
zu bewirken.
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Vektoren,
die verschiedene modifizierte Formen von GFP enthalten, um verschiedene
Farben bereitzustellen, werden von Clontech vertrieben. Die Clontech-Vektoren zur Expression
in Säugerzellen stellen
GFP unter die Kontrolle des Cytomegalovirus (CMV) Promotors.
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Offenbarung der Erfindung
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Die
Erfindung stellt Modelle zur Verfügung, welche die gründliche
Untersuchung der Bildung von Metastasen aus Primärtumoren in realistischer Weise
und in Echtzeit erlauben. Durch Verwendung von grün fluoreszierendem
Protein (GFP) als einen stabilen und leicht zu visualisierenden
Marker, kann die Progression von Metastasen modelliert, und der
Mechanismus in einem unversehrten Labortier aufgeklärt werden.
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Daher
ist ein Aspekt der Erfindung auf ein Verfahren zur Verfolgung der
Progression von Metastasen eines Primärtumors gerichtet, wobei das
Verfahren das Sichtbarmachen von Fluoreszenz in einem ganzen Laborwirbeltier
durch fluoreszente optische Tumorbildgebung in Echtzeit (FOTB) umfaßt, wobei
das Tier verändert
wurde, um GFP-exprimierende Tumorzellen zu enthalten.
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Das
Laborwirbeltier kann ein Modellsystem darstellen, wie ein immungeschwächtes oder
syngenes Tier, wobei Tumorzellen oder ein Tumor, der verändert wurde,
um grün
fluoreszierendes Protein zu exprimieren, in das Tier eingebracht
wurden. Das Modellsystem kann verwendet werden, um potentielle Arzneimittel
oder Protokolle nach ihrer Fähigkeit, Metastasierung
zu verhindern, zu bewerten. Alternativ kann das Subjekt ein Labortier
sein, das einen natürlichen
Tumor enthält,
wobei jedoch der Tumor einer viralen Infektion oder Transfektion
mit einem retroviralen Vektor unterzogen wurde, um GFP zu produzieren.
Die Wirksamkeit von Arzneimitteln, die solchen Patienten oder Subjekten
verabreicht wurden, sowie der Verlauf der Krankheit, kann durch
das Verfolgen der Metastasierung in dem Subjekt bewertet werden.
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Die
Erfindung beinhaltet auch ein Verfahren, um die Angiogenese in soliden
Tumoren zu beobachten und zu verfolgen, wobei das Verfahren das
Beobachten der Tumore in einem Subjekt umfaßt, welche modifiziert wurden,
um GFP zu exprimieren, und wobei dem Subjekt ein Kontrastmittel
verabreicht worden sein wird, um diese Beobachtung zu ermöglichen.
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Kurze Beschreibung der Abbildungen
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Die 1a und 1b zeigen
die Konstruktion von Expressionsvektoren, die in der Erfindung nützlich sind.
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Ausführungsformen der Erfindung
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Die
Erfindung stellt Modellsysteme für
die generelle Untersuchung der Mechanismen der Metastasierung von
Tumoren zur Verfügung,
sowie für
die Untersuchung der Angiogenese in soliden Tumoren. Der sichtbare
Marker grün
fluoreszierendes Protein (GFP) wird benutzt, um die Tumorzellen
zu markieren, so daß ihre
Wanderung und Kolonisierung in Geweben, die distal des Tumors liegen,
verfolgt werden kann, während
diese Wanderung und Kolonisierung voranschreitet. Des Weiteren kann
das Wachstum von Blutgefäßen in soliden
Tumoren, die mit GFP markiert wurden, durch das Verabreichen eines
Kontrastmittels, wie z. B. Rhodamin, an das Subjekt, beobachtet
werden.
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Da
ausreichende Intensität
erreicht werden kann, um die Wanderung der fluoreszenten Zellen
im unversehrten Labortier zu beobachten, kann die Progression der
Metastasierung im unversehrten Subjekt in Echtzeit beobachtet werden.
Jedes dieser Verfahren, bei denen das Tier geöffnet wird, kann eingesetzt
werden, um Metastasierung bei der Bewertung der Wirksamkeit von
potentiellen antimetastatischen Arzneimitteln, in Modellsystemen,
zu beobachten. Der Erfolg oder Mißerfolg von Behandlungsformen, die
Patienten mit potentiell metastasierenden Krebsarten zur Verfügung gestellt
werden, kann ebenfalls unter Verwendung der Materialien und Verfahren
der Erfindung verfolgt werden.
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Die
Markierung, die in den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung
verwendet wird, ist grün
fluoreszierendes Protein (GFP). Das native Gen, das dieses Protein
kodiert, wurde aus der biolumineszenten Qualle Aequorea victoria
kloniert (Morin, J. et al., J Cell Physiol (1972) 77: 313–318). Die Verfügbarkeit
dieses Gens hat es ermöglicht,
GFP als Marker für
die Genexpression zu verwenden. GFP selbst ist ein Protein aus 283
Aminosäuren,
mit einem Molekulargewicht von 27 kD. Es erfordert weder weitere,
aus seiner nativen Quelle stammenden Proteine, noch Substrate oder
Kofaktoren, die nur in seiner nativen Quelle vorhanden wären, um
zu fluoreszieren (Prasher, D. C. et al., Gene (1992) 111: 229–233; Yang,
F. et al., Nature Biotechnol (1996) 14: 1252–1256; Cody, C. W. et al.,
Biochemistry (1993) 32: 1212–1218).
Mutanten des GFP-Gens haben sich als nützlich für die Verbesserung der Expression und
die Modifizierung der Anregung und Fluoreszenz erwiesen. GFP-S65T (worin Serin
an Position 65 durch Threonin ersetzt ist) ist im erfindungsgemäßen Verfahren
besonders nützlich
und weist ein einzelnes Anregungsmaximum bei 490 nm auf (Heim, R.
et al., Nature (1995) 373: 663–664);
U.S. Patent Nr. 5,625,048 ).
Andere Mutanten wurden außerdem
von Delagrade, S: et al., Biotechnology (1995) 13: 151–154; Cormack,
B. et al. Gene (1996) 173: 33–38 und
Cramer, A. et al., Nature Biotechnol (1996) 14: 315–319 offenbart.
Zusätzliche
Mutanten sind auch in
U.S. Patent
Nr. 5,625,048 offenbart. Durch geeignete Modifizierungen
kann das Spektrum des von GFP emittierten Lichts verändert werden.
Deshalb sind, obwohl in der vorliegenden Anmeldung der Begriff "GFP" verwendet wird,
die Proteine, die in dieser Definition beinhaltet sind, nicht notwendigerweise grün in ihrer
Erscheinung. Verschiedene Formen von GFP zeigen andere Farben als
grün, und
auch diese sind in der Definition von "GFP" beinhaltet
und nützlich
in den Verfahren und Materialien der Erfindung. Zusätzlich wird
festgestellt, daß grün fluoreszierende Proteine,
die in die hierin verwendete Definition von "GFP" fallen,
aus anderen Organismen, wie z. B. der Seefeder Renilla reriformis
isoliert wurden. Jede geeignete und dienliche Form des GFP-Gens
kann verwendet werden, um die Tumorzellen, die in den erfindungsgemäßen Modellen
verwendbar sind, zu modifizieren und um endogene Tumore retroviral
zu transformieren. Zu Illustrationszwecken wird in den unten ausgeführten Beispielen
der spezielle, humanisierte Klon hGFP-S65T verwendet.
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Allgemeine
Techniken, um Zellen mit GFP zu markieren, sind in
US 5,491,084 offenbart (supra).
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In
einer Anwendung stellt die erfindungsgemäße Methode ein Modellsystem
für die
Untersuchung der Effekte von verschiedenen therapeutischen Kandidatenprotokollen
und -substanzen auf das metastatische Wachstum von Tumoren bereit.
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Im
Allgemeinen schließt
das Modell das Modifizieren eines Wirbeltiers, vorzugsweise eines
Säugetiers,
ein, um Tumorgewebe zu enthalten, wobei die Tumorzellen selber modifiziert
wurden, um ein Expressionssystem für GFP zu enthalten. Die Tumorzellen
können
von Zelllinien stammen, wobei die Tumorzellen modifiziert wurden,
um Expressionssysteme für
GFP, sowie optional für
einen Immortalisierungsfaktor, z. B. SV40 T-Antigen, zu beinhalten.
Tumore können
in solchen Wirbeltiersystemen durch die Verabreichung der transformierten
Zellen, die das GFP-Expressionssystem beinhalten, und durch das Zulassen,
daß diese
transformierten Zellen Tumoren bilden, gebildet werden. Typischerweise
ist solch eine Verabreichung subkutan und die Tumore werden als
feste Anhäufungen
gebildet. Die so gebildeten Tumore können in jedes geeignete Wirtsgewebe implantiert
und progredieren, metastasieren und sich entwickeln gelassen werden.
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Daher
beinhalten geeignete Vorgehensweisen, um den ursprünglichen
Tumor wachsen zu lassen, die transkutane Injektion von GFP produzierenden
Tumorzellen, wie z. B. CHO-Zellen, HeLa-Zellen, Karzinom- und Sarkomzelllinien,
gut etablierte Zelllinien wie z. B. die menschliche Lungenadenokarzinomlinie
Anip 973, oder die Lungenkrebszelllinie H460, sowie die GFP beinhaltenden
menschlichen Brustkrebslinien MDA-MB468 und MDA-MB435, die menschlichen
Prostatakrebslinien PC3 und DU-145, die menschliche Glioblastomlinie
324, das Mausmelanom B16 und andere, die im Gebiet verfügbar werden
könnten,
sowie Zellen, die durch erfindungsgemäße Verfahren immortalisiert
wurden. Die verabreichten Zellen werden modifiziert worden sein,
um ein Expressionssystem für
GFP zu beinhalten. Nach der Verabreichung entwickeln sich im allgemeinen solide
Tumore, typischerweise an der Stelle der subkutanen Injektion. Das
Tier in welches diese Zellen implantiert werden, sollte entweder
immungeschwächt
oder syngen mit den implantierten Zellen sein. Diese Tumore, die
selber fluoreszent sind, können
dann entfernt und für
die Implantation in das Modellwirbeltier verwendet werden.
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Techniken
zur Implantation von soliden, jetzt mit GFP markierten Tumoren in
Wirbeltiere, insbesondere in Säugetiere,
beinhalten die direkte Implantation durch chirurgische orthotope
Implantation (COI) an der gewünschten
Stelle, die typischerweise die Stelle ist, von der die Tumorzellen
abstammen. Geeignete Stellen beinhalten die Lunge, die Leber, die
Bauchspeicheldrüse,
den Magen, die Brust, das Ovar, die Prostata, das Knochenmark, das
Gehirn und andere Gewebe, die für
bösartige
Erkrankungen empfänglich
sind. Abermals sollte das Subjekt immungeschwächt oder mit dem Tumor syngen
sein. Sobald die soliden Tumore implantiert worden sind, wird das
Wirbeltier zum Modellsystem für
die Untersuchung der Metastasierung. Der Tumor wird deshalb progredieren
und sich entwickeln gelassen und das Wirbeltier auf das Auftreten
von GFP markierten Zellen an Stellen, die distal von der ursprünglichen Implantationsstelle
liegen, hin beobachtet. Die Beobachtung wird in Echtzeit am gesamten
Wirbeltier vorgenommen, da die Tumoren ausreichend hell sind, um
das Öffnen
des Tieres unnötig
zu machen – sie, wie
auch die Stellen der Metastasierung, können direkt durch die Haut
gesehen werden. GFP ist für
das bloße
Auge sichtbar, so daß keine
Entwicklungssysteme zum Anfärben
des Gewebes notwendig sind. Obwohl die Beobachtung im unversehrten
Tier bevorzugt ist, kann das Tier für Modellsysteme in Arzneimittelüberwachungsprotokollen
geöffnet und/oder
Gewebe entnommen werden, wenn erwünscht. Des Weiteren ist der
Vergleich mit einem Kontrolltier wünschenswert.
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Insbesondere
ist es dienlich, die Wanderung von Tumorzellen im unversehrten Tier
mit Hilfe von fluoreszenter optischer Tumorbildgebung (FOTB) sichtbar
zu machen. Dies erlaubt die kontinuierliche Beobachtung und Überwachung
des Fortschreitens der Metastasierung in Echtzeit, insbesondere
was die Evaluierung von potentiellen antimetastatischen Arzneimitteln
in Modellsystemen betrifft. So zeigt das relative Fehlen von Metastasierung,
das direkt in Versuchstieren, die ein potentielles Arzneimittel
verabreicht bekommen haben, im Vergleich mit Kontrolltieren, die
das Arzneimittel nicht verabreicht bekommen haben, beobachtet wurde,
die Wirksamkeit des potentiellen Arzneimittels und dessen Leistungsvermögen als
Behandlungsform an. In Subjekten, die gegen Krebs behandelt werden,
erlaubt die Verfügbarkeit
von FOTB denjenigen, die Behandlungsprotokolle entwerfen, kontinuierlich über die
Zweckmäßigkeit, das
Protokoll zu ändern
oder nicht zu ändern,
informiert zu sein.
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Geeignete
Wirbeltiere zur Verwendung als Modellsysteme sind zweckdienliche
Labortiere wie Hasen, Ratten, Mäuse
und ähnliche.
Wegen der größeren Ähnlichkeit
zum Menschen könnten
auch Primaten verwendet werden. Nützlich sind Subjekte, die besonders
empfänglich
für die
Entwicklung von Tumoren sind, z. B. Subjekte mit beeinträchtigtem
Immunsystem, wie Nackt- oder „SCID"-Mäuse. Eine Schwächung des
Immunsystems kann in jedem Wirbeltier durch die Gabe von Arzneimitteln
oder anderen Techniken, die allgemein im Feld bekannt sind, bewerkstelligt
werden. Jedes geeignete Wirbeltier kann verwendet werden, wobei
die Auswahl hauptsächlich
durch Zweckmäßigkeit
und Ähnlichkeit
zu dem letztendlich interessanten System bestimmt wird.
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Jedes
geeignete Expressionssystem, das in den zu implantierenden Tumorzellen
funktionsfähig ist,
kann verwendet werden. Eine Vielzahl von Vektoren, die Expression
in verschiedenen Arten von Tumorzellen bewirken, ist kommerziell
erhältlich.
Die Art des Vektors kann mit der Art des Tumors und dem Wirbeltier,
in dem er seinen Ursprung findet, variieren. Es wird jedoch bevorzugt,
Vektoren zu verwenden, die keine retroviralen oder anderen viralen
Promotoren verwenden, welche das Modellsystem komplizierter machen
könnten,
wenn GFP zur Visualisierung der Metastasierung in einem Modellsystem
verwendet wird.
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Es
ist oft vorteilhaft Expressionsvektoren einzusetzen, welche die
Zellen mit dem SV40 T-Antigen ausstatten, um Zelllinien zur Verfügung zu
stellen, die hilfreich sind, Tumore für diese Modellsysteme zu etablieren.
Die Anwesenheit dieses Antigens gewährleistet die Unsterblichkeit
der Kultur. So sind Vektoren in der Erfindung besonders nützlich,
die Expressionssysteme umfassen, die zur Produktion von sowohl GFP
als auch SV40 T-Antigen führen.
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Um
transformierte Zellen, die effektiv Tumore erzeugen, zu transfizieren
und zu modifizieren, kann jedes geeignete Transfektionsverfahren,
wie z. B. Liposomen, Kalziumphosphatfällung, Elektroporation und
die Verwendung einer Genkanone eingesetzt werden. Die Lipofektion
ist bevorzugt.
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Im
Gegensatz dazu sind Vektoren bevorzugt, die retrovirale oder andere
virale Promotoren einsetzen, wenn das erfindungsgemäße Verfahren
verwendet wird, um Metastasierung in natürlich vorkommenden Tumoren
in einem Subjekt wie einem menschlichen Krebspatienten zu visualisieren.
Die Verwendung solcher Vektoren erlaubt das Einbringen eines Expressionssystems
für GFP
in den bereits existenten Tumor. Zusätzlich kann das Expressionssystem eine
Nukleotidsequenz enthalten, die andere nützliche Proteine kodiert, wie
z. B. therapeutische Proteine, die eine gleichzeitige Diagnose der
Metastasierung und Behandlung erlauben. Unter solchen geeigneten
Proteinen ist die Methioninase beinhaltet (siehe, z. B.,
PCT/US93/11311 und
PCT/US96/09935 ). Solche
Proteine können
entweder als Fusionsproteine mit dem GFP, oder unabhängig, entweder
durch Verwendung eines dicistronischen Expressionssystems oder eines
unabhängigen
Expressionssystems, wobei eines für das therapeutische Protein
und das andere für
das GFP verwendet wird, hergestellt werden.
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Retroviral
basierte Expressionssysteme für GFP
sind bereits von Grignani, F. et al. Cancer Res (1998) 58: 14–19 und
Cheng, L. et al. Gene Therapy (1997) 4: 1013– 1022 beschrieben worden. In
diesen Berichten wurde das retrovirale Expressionssystem selbst
zur Transfektion von hämatopoetischen
Vorläuferzellen
verwendet, oder es wurden Verpackungszellen eingesetzt, um virusenthaltende Überstände bereitzustellen,
die direkt für
die Infektion der Säugerzellen
verwendet werden können.
Daher ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren
der Tumor, der in dem Wirbeltiersubjekt enthalten ist, typischerweise mit
einem Virus infiziert, der modifiziert und verpackt wurde, um das
Expressionssystem für
GFP zu enthalten. Die in situ Infektion mit Virus führt zu der
Fähigkeit
des Tumors, GFP zu produzieren und sich im Endeffekt selbst zu markieren.
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Verschiedene
retrovirale Systeme, die in der Herstellung von Proteinen in Säugerzellen
nützlich sind,
sind im Feld bekannt. Beispiele hierfür enthalten kommerziell erhältliche
Vektoren und Verpackungssyteme, wie solche, die von Clontech, San
Diego, Kalifornien, verkauft werden, einschließlich derer Retro-X Vektoren
pLNCX und pLXSN, welche die Expression von GFP unter einer Vielzahl
von Promotoren, durch Insertion in die multiple Klonierungsstelle, erlauben.
Diese Vektoren beinhalten ψ*
(das erweiterte virale Verpackungssignal) und Antibiotikaresistenzgene
zur Selektion. Eine Anzahl dieser Systeme wurde für die Verwendung
in der Gentherapie entwickelt, einschließlich Vektoren die eine multiple
Klonierungsstelle zur Verfügung
stellen, die zwischen, von retroviralen Quellen stammenden 5' und 3' langen terminalen
Wiederholungen (LTRs), eingeschoben ist, und so in der Markierung
von Tumoren menschlicher Patienten nützlich wären.
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Daher
können
retroviral basierte Vektoren, wie die, welche in den 1a–1b dargestellt sind,
in Verpackungszellen transfiziert werden und direkt zu Zielkrebszellen
transferiert werden, oder es können Überstände der
Verpackungszellen verwendet werden, um Tumorzellen mit dem Retrovirus
zu infizieren. Bevorzugte Kombinationen von Retrovirus und Verpackungszellen
beinhalten den GFP-Retrovirus-Vektor pLEIN in PT-67 Verpackungszellen.
Die Kokultur der Verpackungszellen mit Kolonkarzinomzellen führt zum
Transfer des GFP-Retrovirus in die Krebszellen.
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Die
erfolgreiche Modifizierung von menschlichem Krebsgewebe, um die
mit GFP assoziierte Fluoreszenz zu zeigen, wurde unter Verwendung
von Gewebekulturtechniken und Überständen von
PT-67 Verpackungszellen, die GFP-pLEIN
Viren erzeugen, gezeigt. Zur Verwendung in vivo wird das Virus,
vorzugsweise lokal in den Tumor, verabreicht, der innerhalb von
Stunden nach Injektion von entweder den Verpackungszellen oder den
Virus enthaltenden Überständen beobachtet
werden kann. Die bösartigen
Zellen können
durch ihre grüne
Farbe identifiziert werden, die manchmal ausreichend hell ist, so
daß der
Tumor durch die Haut gesehen werden kann.
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Zusätzlich zur
direkten Beobachtung von Tumormetastasierung und -wachstum entweder
in einem Modellsystem oder in einem Labortier, das bereits von einem
Tumor befallen ist, können
die erfindungsgemäßen Verfahren
an die Beobachtung der Angiogenese in soliden Tumoren angepaßt werden. Der
Tumor selbst ist wie oben beschrieben mit GFP markiert. Dem Subjekt
wird dann ein Kontrastmittel verabreicht, typischerweise durch Injektion,
vorzugsweise intravenöse
Injektion, welches die Beobachtung von Blutgefäßen im Tumor ermöglicht.
Geeignete Farbstoffe schließen
Rhodamin und andere Kontrastmittel ein. Jeder Farbstoff, der eine
Kontrastfarbe mit der grünen
Farbe des GFP bildet, kann verwendet werden. Der Farbstoff ist vorzugsweise
an ein inertes Polymer, wie Polyethylenglykol, gebunden, um die
Dauer der Zeit, die der Farbstoff in dem Blutgefäß verbleibt, zu verlängern. Eine
ausreichende Menge von Farbstoff wird bereitgestellt, um eine leichte Sichtbarmachung
zu ermöglichen;
die benötigte Menge
an Farbstoff hängt
von der Wahl des Farbstoffs, dem Ort des Tumors, der Art des GFP
im Hintergrund und von der Beobachtungsmethode ab. Innerhalb weniger
Minuten können
Gefäße, die
in dem soliden Tumor wachsen, in Bereichen wie dem Mesenterium,
der Kolonwand und dem Omentum beobachtet werden. Die Beobachtungen
können über einen
beträchtlichen
Zeitraum lang fortgesetzt werden; beispielsweise kann die Angiogenese
durch Verwendung dieses Verfahrens noch nach mehreren Stunden beobachtet
werden.
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Die
folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen aber nicht
limitieren.
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Beispiel 1
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Herstellung von Tumorzellen, die GFP produzieren
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Der
humanisierte Klon hGFP-S65T, der von Zolotukhin, S. et al., J Virol
(1996) 70: 4646–4654
beschrieben wurde, wurde als grün
fluoreszierendes Protein kodierende Sequenz verwendet. Dieses Kodon-optimierte
Gen wurde von Clontech Laborstories, Inc. (Palo Alto, CA) erworben
und in den dicistronischen Expressionsvektor pED-mtx1 ligiert,
welcher vom Genetics Institute, Cambridge, MA erhalten und in Kaufman,
R. J. et al., Nucleic Acids Res (1991) 19: 4485–4490 beschrieben wurde. hGFP-S65T
wurde mit HindIII verdaut und abgestumpft (blunted); die gesamte
hGFP kodierende Region wurde mit XbaI ausgeschnitten und dann unidirektional
in pED-mtx1 subkloniert, welcher mit PstI
verdaut, abgestumpft, und dann weiter mit XbaI verdaut wurde.
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CHO-K1
Zellen wurden in DMEM, das 10% fötales
Kälberserum,
2 mM L-Glutamin und 100 μM nicht-essentielle
Aminosäuren
enthielt, kultiviert. Beinahe konfluente Zellen wurden mit einer
präzipitierten
Mischung von LipofectAMINETM-Reagenz (GIBCO)
und einer sättigenden
Menge von Plasmiden für sechs
Stunden inkubiert und dann mit frischem Medium wieder aufgefüllt. Die
Zellen wurden 48 Stunden später
durch Trypsin/EDTA geerntet, und bei einem Verhältnis von 1:15 in Selektionsmedium,
das 1,5 μM Methotrexat
(MTX) enthielt, subkultiviert. Zellen mit stabil integriertem Plasmid
wurden in MTX-haltigem Medium selektiert und mit Klonierungszylindern (Bel-Art
Products, Pequannock, NJ) durch EDTA isoliert. Klon-38 wurde nach Amplifikation
und Transfer wegen seiner hochintensiven GFP-Fluoreszenz und Stabilität ausgewählt.
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Ähnlich wie
für CHO-K1
Zellen oben beschrieben wurden auf ähnliche Weise Anip 973-Zellen,
eine menschliche Lungenkarzinomzelllinie, die von der Harbin Medical
University, China, erhalten wurden, kultiviert mit dem Unterschied,
daß anstelle von
DMEM RPM11640 (GIBCO) verwendet wurde. Die Transfektion, Selektion,
Amplifikation und der Transfer wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Klon-26
wurde wegen seiner hochintensiven GFP-Fluoreszenz und Stabilität ausgewählt.
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Beispiel 2
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Konstruktion eines retroviralen Expressionsvektors für GFP und
Herstellung einer markierten Tumorzelllinie
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Die 1a und 1b zeigen
die Konstruktion eines Expressionsvektors für GFP unter Kontrolle des SV40-Promotors.
Die Konstrukte setzen kommerziell erhältliche Vektoren der pEGFP-Serie,
die von Clontech erhältlich
sind, ein. Sowohl bakterielle als auch Säugerexpressionsvektoren sind
erhältlich,
welche die Herstellung von zusätzlichen
Proteinen sowie von GFP entweder als Fusionsproteine oder in dicistronischen
Systemen erlauben. 1a zeigt die Herstellung eines
Expressionsvektors pGFP/Met zur Fusion von GFP mit Methioninase; 1b zeigt
die Herstellung eines Vektors pGFP/SV40 zur Herstellung eines Fusionsproteins aus
GFP und dem SV40 T-Antigen.
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Kommerzielle
Vektoren, welche die GFP kodierende Sequenz mit den gewünschten
spektralen Eigenschaften beinhalten und die das in Beispiel 6 beschriebene
pLEIN System verwenden, wurden in Zelllinien transfiziert, die von
Tumoren wie menschlichem Brustkrebs, menschlichem Prostatakrebs, menschlichem
Glioblastom und Mausmelanom stammten. Auf diese Weise wurden die
mit grün
fluoreszierendem Protein markierten menschlichen Brustkrebszelllinien
MF-7, MDA-MB468
und MDA-MB435, die menschlichen Prostatakrebszelllinien PC3 und
DU145, die menschliche Glioblastomzelllinie 324, die menschlichen
Lungenkrebszellen Anip 73 und H460, die menschlichen Kolonkrebszelllinien
Colo-205, HCT-15 und WiDr, die menschliche Magenkrebszelllinie NVGC-4,
die menschliche Nierenkrebszelllinie SN12C, die menschliche Zungenkrebszelllinie
SCC-25, die menschlichen Melanomazelllinien LOX und SK-mel-5, markierte
chinesischer Hamster Ovarzellen der Zelllinie CHO-K1 und die Mausmelanomzelllinie
B16 etabliert.
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Das
SV40 T-Antigen ist nützlich,
um kultivierte Zellen zu immortalisieren, um permanente Zelllinien
zu etablieren. Dementsprechend wurde der Vektor pGFP/SV40 in eine
Reihe von Tumorzellkulturen transfiziert, um fluoreszierende, immortalisierte
Zelllinien bereitzustellen.
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Beispiel 3
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In vivo Markierung von etablierten Tumoren
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Unmarkierte
Tumore, die von der menschlichen Lungenkrebszelllinie Anip 973 stammten,
wurden in Mäusen
nach folgendem Verfahren etabliert. Tumore wurden in sechs Wochen
alten, männlichen Balb/C „nu/nu" Mäusen wachsen
gelassen, denen, innerhalb von 40 Minuten nach Ernte durch Trypsinisierung
und dreimaligem Waschen mit kaltem, Serum enthaltenden Medium subkutan
eine einzelne 0,4 ml Dosis von 107 Anip
973 Zellen injiziert wurde. Die Zellen wurden vor der Injektion
auf Eis gehalten. Die Tiere wurden geopfert, als die Tumore ungefähr 1,2 cm
Durchmesser erreicht hatten. Die 1,2 cm Tumore bildeten sich nach
etwa 5 Wochen.
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Die
Tumorstücke,
1 mm3, wurden wie von Astoul, P. et al.,
Anticancer Research (1994) 14: 85–92; Astoul, P. J Cell Biochem
(1994) 56: 9–15,
die beide hierin als Referenz aufgenommen werden, beschrieben durch
COI in die linke viscerale Pleura von acht solcher Mäuse implantiert.
Kurz gesagt wurden die Mäuse
durch Einatmen von isofluoran anästhesiert,
und es wurde ein kleiner, transversaler 1 cm Einschnitt entlang
des vierten Interkostalzwischenraums in die linke laterale Brust
gemacht, was zu einem vollständigen
Kollaps der Lunge führte.
Fünf Tumorstücke wurden
mit einer chirurgischen 7-0 Nylonnaht zusammengenäht und durch
einen Knoten fixiert. Die Lunge wurde mit einer Pinzette angehoben, und
der Tumor mit einer Naht in den unteren Teil der Lunge eingenäht, wonach
die Lunge in die Brusthöhle
zurückgegeben,
und die Muskeln und Haut mit einer einzelnen Schicht von 6-0 Seidennähten geschlossen
wurden. Die Lunge wurde wieder aufgebläht, indem Luft mit einer 23er-Nadel
aus der Brusthöhle
entzogen wurde. Den Mäusen
wurden dann 1 × 107 Verpackungszellen, die den retroviralen
Vektor GFP-Retrovirus pLEIN in PT67 Zellen enthielten, injiziert.
Dieses Virusverpackungssystem ist von Clontech, San Diego, Kalifornien,
erhältlich.
pLEIN enthält ein
Insert der kodierenden Sequenz von EGFP, einer rotverschobenen Variante
des Wildtyp GFP, die auf hellere Fluoreszenz und höhere Expression
in Säugerzellen
hin optimiert wurde. Sie hat ein Anregungsmaximum von 488 nm und
ein Emissionsmaximum bei 507 nm. Diese Mutante enthält einen
doppelten Aminosäureaustausch,
an Position 64 von Phe nach Leu und an Position 65 von Ser nach
Thr. Sie wurde von Comack, B. et al. Gene (1996) 173: 31–38 beschrieben.
Es gibt mehr als 190 stumme Basenaustäusche, um die im Menschen bevorzugte
Kodonbenutzung zu maximieren wie von Haas, J. et al. Curr Biol (1996)
6: 315–324
beschrieben. So enthält pLEIN
die vorstehend beschriebene kodierende Sequenz von GFP, die in die
multiple Klonierungsstelle von pLXIN eingefügt ist, um ein dicistronisches
Expressionssystem zu erhalten, welches die koordinierte Translation
des GFP und einer Neomycinresistenz erlaubt. Die Tumorzellen konnten
drei Tage nach Injektion der Zellen in die Bauchhöhle der
Mäuse,
in den seminalen Vesikeln durch Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie
gesehen werden.
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Beispiel 4
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Beobachten der Angiogenese
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Eine
Suspension, die 1 × 107 der in Beispiel 1 beschriebenen Klon-38
Zellen enthielt, wurde in die Bauchhöhle einer Maus injiziert. Fünf Tage
später wurde
der Maus Rhodamin in den Schwanz injiziert, die Maus dann anästhesiert
und die Bauchhöhle
ausreichend weit geöffnet,
um den Tumor sichtbar zu machen. Die Erholung von diesem chirurgischen
Eingriff ist unproblematisch. In manchen Fällen ist das öffnen der
Bauchhöhle
unnötig,
da die intraperitonealen Tumore durch die unversehrte Haut sichtbar
gemacht werden können.
Tumore waren in der Bauchhöhle
sichtbar und die Angiogenese war, angezeigt durch die Rhodaminfluoreszenz,
beobachtbar. Ähnliche
Ergebnisse wurden in Tumoren gefunden, die im Omentum, in der Wand
des Dünndarms
und im Mesenterium wuchsen.
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In
einem analogen Experiment wurde eine Suspension, die 1 × 107 der in Beispiel 1 beschriebenen Klon-26
Zellen enthielt, in die Bauchhöhle
einer Maus injiziert. Nach einem Tag bildeten sich Tumore im Mesenterium
und in der Kolonwand. Diese wurden durch Anästhesieren der Maus und eine
minimale Öffnung
des Abdomens beobachtet. Beobachtungen einer ähnlich behandelten Maus am
Tag 3 zeigten Tumore in der Wand des Dünndarms, im Omentum sowie in
der Kolonwand und dem Mesenterium. Am Tag 5 wurden einer ähnlich behandelten
Maus 100 μl
2 × 10–3 M
Rhodamin in den Schwanz injiziert und es konnten einige Gefäße in dem
im Mesenterium wachsenden Tumor gesehen werden. Nach Tag 60 wurden
zahlreiche Gefäße in dem
in der Kolonwand wachsenden Tumor gesehen.
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Beispiel 5
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Konstruktion von Metastasemodellen
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Unter
Verwendung der in Beispiel 2 beschriebenen, markierten, menschlichen
Krebszelllinien wurden Mausmodelle für verschiedene Krebsarten etabliert.
Die Zelllinien werden mit einer einzelnen Dosis von 107 GFP
exprimierenden menschlichen Tumorzellen, die durch Trypsinisierung
geerntet, dreimal mit kaltem, Serum enthaltenden Medium gewaschen
und dann auf Eis gehalten wurden, in sechs Wochen alte weibliche „nu/nu" Mäuse implantiert.
Die Zellen werden innerhalb von 40 Minuten nach der Ernte in den
Subkutanzwischenraum in der Flanke des Tieres in einem Gesamtvolumen
von 0,4 ml injiziert. Die Nacktmäuse
werden drei Wochen nach Injektion der Tumorzellen geopfert, um die
Tumorfragmente zu ernten. Diese Tumorfragmente werden dann für die chirurgische
Implantation in das entsprechende Gewebe (chirurgische orthotope
Implantation (COI)) in Nacktmäuse
als Empfänger
verwendet.
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Die
Empfängermäuse werden
zunächst
anästhesiert
und dann durch Verwendung etablierter COI-Techniken mit Fragmenten
des subkutan gewachsenen Kolonkrebs, Lungenkrebs, Brustkrebs, Prostatakrebs
oder Melanom implantiert. Die Größe der Fragmente
ist in allen Fällen,
mit Ausnahme des Melanoms, 1 mm3; für das Melanom
werden 0,025 mm3 Fragmente aus dem menschlichen,
subkutanen Melanomtumor LOX-GFP präpariert, und 5–6 Fragmente
implantiert. Das Fortschreiten der Metastasierung wird dann durch
FOTB mit einem Leica MZ12 Stereomikroskop mit einer Quecksilberdampflampe beobachtet.
GFP wird mit einem D425/60 Bandpassfilter und einem 470DCXR dichroischen
Spiegel angeregt; die Fluoreszenz wird durch einen GG475 Longpassfilter
(Chroms Technology, Brattleboro, VT) hindurch emittiert und von
einer thermoelektrisch gekühlten
ST-133 Micromass High-Speed Controlled Camera – TEA/CCD-1317K1 (Princeton
Instruments, Trenton, NJ) mit einem 1317×1035 Pixel Chip gesammelt.
Die Bilder werden mit der ImagePro+ 3.1 Software
(Media Cybernetics, Silver Spring, MD) bearbeitet und analysiert.
Hochauflösende
Bilder werden von einem Computer oder kontinuierlich durch den Videoausgang
auf eine Videokassette aufgenommen.
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Im
Kolonkrebsmodell wird ein kleiner Einschnitt entlang der Mittellinie
in das Abdomen gemacht und der kolorektale Teil des Darms nach außen gelegt.
Die Serosa wird entfernt und 8–15
Tumorfragmentstücke
implantiert. Eine chirurgische 8-0 Naht wird verwendet, um die kleinen
Tumorstücke
zu durchstechen und sie an die Darmwand zu nähen. Der Darm wird in die Bauchhöhle zurückgelegt
und die Bauchwand verschlossen. Die Tiere werden dann auf Metastasen
hin beobachtet.
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Im
Lungenkrebsmodell wird ein kleiner transversaler 1 cm Einschnitt
an der linken seitlichen Brust entlang des vierten Interkostalzwischenraums
gemacht; dies führt
zum vollständigen
Kollaps der Lunge. Fünf
mit einer chirurgischen 8-0 Nylonnaht zusammengenähte Tumorstücke werden
durch einen Knoten fixiert; die Lunge wird mit einer Pinzette herausgenommen
und der Tumor mit einer Naht in den unteren Teil der Lunge genäht. Nach
Zurücklegen
der Lunge in die Brusthöhle
werden die Brustmuskeln und Haut geschlossen. Die Lunge wird durch
Entnahme von Luft aus der Brusthöhle
mit einer 23er Nadel wieder aufgebläht. Die Tiere können dann
entweder durch FOTB oder durch Entnahme verschiedener Gewebe auf
Metastasierung hin beobachtet werden.
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Beim
Brustkrebs wird ein 1,5 cm langer Einschnitt entlang der medialen
Seite des Nippels vorgenommen und das Fettpolster nach stumpfer
Sektion freigelegt. Ein kleiner Einschnitt wird vorgenommen und
eine kleine Tasche gebildet, um zwei Fragmente des Tumorgewebes
aufzunehmen; eine 8-0 Naht wird gemacht, um die Tasche zu schließen. Die
Hautschicht wird dann verschlossen. Die Tiere werden dann durch
FOTB oder Gewebeentnahme beobachtet.
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Beim
Prostatakarzinom wird eine Öffnung oberhalb
der Schambeinfuge gemacht, um die Prostatadrüse freizulegen. Die den dorsalen
Teil der Prostata umgebende Faszie und die dorsalen seitlichen Lappen
der Drüse
werden durch einen kleinen Einschnitt getrennt. Fünf zufällig gewählte Fragmente werden
mittels einer 8-0 Nylonnaht in den Einschnitt genäht. Die
zwei Teile der getrennten Lappen werden zusammengenäht und die
umgebende Faszie verwendet, um diesen Teil der Drüse einzuwickeln
und den Einschnitt zu festigen. Das Abdomen wird dann verschlossen
und die Tiere zur Beobachtung behalten.
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Beim
Melanom werden 5–6
Fragmente mit einer 13 × ¼ Krebsimplantationsnadel
(Popger & Sons,
New Hyde Park, NY) unter die Haut in die Flanke transplantiert.
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Bilder,
die Metastasen an verschiedenen Stellen im Tier zeigen, können wie
oben beschrieben erhalten werden.
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Die
wie oben beschrieben behandelten Tiere können dann verwendet werden,
um potentielle Protokolle zur Behandlung von Krebs und zur Verhinderung
von Metastasierung zu evaluieren. Das Voranschreiten von Metastasierung
der fluoreszenten Tumore in Tieren, denen die Protokolle verabreicht
wurden, wird mit ähnlichen
Tieren, die keine Behandlung erhalten haben, verglichen. Die Wirksamkeit
des Protokolls kann dann direkt beobachtet werden.