JP2002534398A - マーカーとして緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）を使用する転移モデル - Google Patents

マーカーとして緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）を使用する転移モデル

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Abstract

(57)【要約】 インタクトな動物モデルにおける種々の位置にて蛍光を観察する工程を包含する、原発性腫瘍の転移の進行を追跡する方法が、記載される。ＧＦＰ産生腫瘍を含む動物は、転移の機構を研究するため、ならびに候補となるプロトコルおよび薬物を評価するために有用である。さらに、腫瘍をすでに保有する被験体は、ＧＦＰを含む内因性腫瘍を改変するように処理されて、臨床適用を可能にする。詳細には、本発明は、原発性腫瘍の転移を阻害するための候補となるプロトコルまたは薬物を評価するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、腫瘍進行の研究に関する。具体的には、本発明は、脊椎動物系にお
ける腫瘍の転移を研究するためのモデル系、ならびに候補となる薬物を評価する
ためのモデルおよび方法に関する。
【０００２】 （背景技術） 腫瘍組織が転移する能力は、悪性疾患の生命を脅かす局面の主要な部分を構成
することが長く認識されてきた。転移は、原発性腫瘍とは異なる部位での続発性
腫瘍の増殖である。従って、原発性腫瘍の外科的除去にもかかわらず、この状態
の進行を停止させることは可能ではないかもしれない。転移が生じる機構の理解
は、続発性腫瘍の増殖が制御され得るプロトコルの開発に重要である。転移の機
構を理解するために、多くの宿主細胞のバックグランドに対する少数の腫瘍細胞
の同定を可能にし、その結果、続発性腫瘍塞栓および微小転移が、リアルタイム
の経過にわたって観察され得る、モデルを提供することが必要である。
【０００３】 他の研究者らは、外部が蛍光標識された腫瘍細胞を使用して、インビトロでの
腫瘍転移における管外遊出および初期の播種工程を実証した。Ｋｈｏｋｈａ，Ｒ
．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ（１９９５）１４：２７９
〜３０１；Ｋｏｏｐ，Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９５）５５：２５２
０〜２５２３。さらに、Ｍａｒｇｏｌｉｓ，Ｌ．Ｂ．ら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃ
ｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ（１９９５）３１：２２１〜２２６は、組織培養にお
ける宿主マウス肺において、外部が蛍光標識された肺腫瘍細胞の移動を可視化し
得た。しかし、全ての場合、長期の観察は、外因性蛍光標識の限界に起因して可
能ではなかった。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子のレトロウイルス移入は
、インビトロで、ヒト癌細胞の安定なトランスフェクト体（Ｌｅｖｙ．Ｊ．Ｐ．
ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９６）１４：６１０〜６１４）
ならびに造血細胞の安定なトランスフェクト体（Ｇｒｉｇｎａｎｉ，Ｆ．ら、Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９８）５８：１４〜１９およびＣｈｅｎｇ，Ｌ．ら、
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９７）４：１０１３〜１０２２によって）を生
じることが示されている。
【０００４】 β−ガラクトシダーゼ遺伝子をマーカーとして使用して、このようなモデルを
提供しようとする試みがなされている（Ｌｉｎ，Ｗ．Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ（１９９０）５０：２８０８〜２８１７；Ｌｉｎ，Ｗ．Ｃ．ら、Ｉｎｖａｓ
ｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ（１９９２）１２：１９７〜２０９）。
しかし、このマーカーは、満足のいくものであることが証明されていなかった。
なぜなら、新鮮な組織または処理された組織が、使用され得ないからである。本
発明は、生きている新鮮な組織における腫瘍の侵襲および微小転移形成の可視化
を可能にするマーカーを提供する。さらに、適切な対比（ｃｏｎｔｒａｓｔ）媒
体を提供することによって、本発明の方法は、樹立されかつ増殖している腫瘍に
おける脈管形成を可視化するために適応され得る。本発明の方法は、腫瘍の増殖
および転移のモデルに適用され得るのみではなく、レトロウイルスベクターの使
用を通して、腫瘍を保有するヒト被験体における臨床データを得るためにもまた
用いられ得る。
【０００５】 本発明は、マーカーとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を利用する。融合Ｄ
ＮＡの発現を主にモニターする、このタンパク質の異種発現は、米国特許第５，
４９１，０８４号に開示された。この文献は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣ．ｅｌｅｇ
ａｎｓにおけるＧＦＰの発現を記載し、そして一般的な細胞がＧＦＰを発現する
ように改変され得ることを想定する。この文献に従う、このような発現は、融合
ＤＮＡの発現をモニターするための方法のみではなく、細胞内のタンパク質局在
化をモニターする手段もまた可能にする。
【０００６】 転移モデルを提供する本発明の局面が、一連の刊行物において報告および記載
されている。Ｃｈｉｓｈｉｍａ，Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１
９９７）５７：２０４２〜２０４７は、ヒト化緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）お
よびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＧＨＦＲ）の遺伝子を含む二重シストロン性（
ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ベクターの構築を記載している。このベクターは、ク
ローン３８を得るためにＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトされた。クローン
３８は、安定なＧＦＰ発現を示し、この発現は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の
存在下で維持された。クローン３８細胞は、腫瘍フラグメントを得るためにマウ
ス中に注入され、このフラグメントは、次いで、ヌードマウスにおける卵巣漿膜
上に外科的同所移殖（ＳＯＩ）によって移植された。このモデルにおいて転移が
続いて起こり得る。
【０００７】 Ｃｈｉｓｈｉｍａ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃｅｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
（１９９７）９４：１１５７３〜１１５７６は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手した
、コドンを最適化したｈＧＦＰ−Ｓ６５Ｔクローンを、Ａｎｉｐ９７３ヒト肺腺
癌細胞にトランスフェクトすることによる、クローン２６の調製を記載している
。クローン２６が、ヌードマウスに静脈内に注入され、そして得られた腫瘍が、
組織培養された。
【０００８】 Ｃｈｉｓｈｉｍａ．Ｔ．ら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ（１９
９７）１５：５４７〜５５２およびＣｈｉｓｈｉｍａ，Ｔ．ら、Ａｎｔｉｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９７）１７：２３７７〜２３８４は、クローン２６を用い
る同様の研究を記載しており、この研究では、この細胞は、ヌードマウスの皮下
に接種され、これにより、可視化された腫瘍を生じ、次いで、この腫瘍は、ＳＯ
Ｉによってヌードマウスの内臓胸膜に移殖された。転移は、このモデルにおいて
同様に観察された。
【０００９】 Ｃｈｉｓｈｉｍａ，Ｔ．ら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ
（１９９７）３３：７４５〜７４８は、クローン２６の組織培養物、およびＧＦ
Ｐにより放射される蛍光を使用する増殖の可視化を記載している。
【００１０】 Ｙａｎｇ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９８）５８：４２１７〜４２
２１は、安定な高ＧＦＰ発現クローンを得るために、増強されたＧＦＰを含むレ
トロウイルス発現ベクターを用いるヒト肺癌細胞株Ｈ４６０の形質導入を記載し
ている。この細胞株由来の細胞は、ヌードマウスに注入され、そして得られる皮
下で増殖している標識された腫瘍は、ＳＯＩによって、ヌードマウスの左肺に移
殖された。次いで、蛍光は、側副（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ）肺、胸膜および骨格
系全体における転移から観察され得た。
【００１１】 Ｙａｎｇ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（印刷中）は、前立腺腫瘍について
のモデルを使用し、かつヌードマウスにおける骨格系の全体で蛍光を示す、同様
の研究を報告している。
【００１２】 前述の刊行物の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【００１３】 前述に加えて、Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９７）
４：１０１３〜１０２２は、レトロウイルスプロモーターの制御下でＧＦＰ遺伝
子を使用する、造血幹細胞の改変を記載している。この著者らは、ヒト幹細胞が
増強された形態のＧＦＰを使用することによる困難性のみを伴って、この系でト
ランスフェクトされることを記述しているが、満足のいく明るさが達成され得る
。
【００１４】 さらに、Ｇｒｉｇｎａｎｉ，Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９８）５８
：１４〜１９は、ヒト造血前駆細胞への高効率遺伝子移入をもたらすＧＦＰを発
現するハイブリッドＥＢＶ／レトロウイルスベクターの使用を報告している。
【００１５】 種々の色を提供するために種々の改変形態のＧＦＰを含むベクターが、Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈにより市販されている。哺乳動物細胞での発現に意図されるＣｌｏｎ
ｔｅｃｈベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下に
ＧＦＰを配置している。
【００１６】 （発明の開示） 本発明は、現実的かつリアルタイムの設定において原発性腫瘍からの転移の形
成の詳細な研究を可能にするモデルを提供する。安定かつ容易な可視化マーカー
として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用することによって、このような転移
の進行が、モデル化され得、そして機構が、インタクトな動物において解明され
得る。
【００１７】 従って、１つの局面において、本発明は、原発性腫瘍の転移の進行に従う方法
に関し、この方法は、リアルタイム蛍光光学腫瘍画像化（ＦＯＴＩ）によって脊
椎動物（この動物は、ＧＦＰを発現する腫瘍細胞を含むように改変されている）
の全体において蛍光を可視化することを包含する。
【００１８】 脊椎動物は、モデル系（例えば、免疫無防備な動物または同系の動物）を構成
し得、ここで緑色蛍光タンパク質を発現するように改変された腫瘍細胞または腫
瘍が、動物に導入されている。このモデル系は、転移を阻害するそれらの能力に
ついて、候補となる薬物またはプロトコルを評価するために使用され得る。ある
いは、被験体は、ヒトまたは他の脊椎動物の被験体であり得、腫瘍を天然に含む
が、腫瘍がウイルス感染、またはレトロウイルスベクターでのトランスフェクシ
ョンに供されており、上記ＧＦＰを生成する。このような患者または被験体に投
与された薬物の効力は、疾患の経過が評価され得ると同様に、被験体の転移を解
明することによって評価され得る。
【００１９】 本発明はまた、固形腫瘍における脈管形成を観察しかつ追跡する方法を含み、
この方法は、被験体において、ＧＦＰを発現するように改変される上記腫瘍を観
察することを包含し、ここでは、この被験体が、この観察を可能にする対比色素
を投与されている。
【００２０】 （発明の実施の形態） 本発明は、腫瘍一般の転移の機構を研究するため、および固形腫瘍における新
脈管形成を研究するためのモデル系を提供する。腫瘍細胞を標識するための可視
的なマーカーである緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を利用して、その結果、腫瘍
に遠位の組織におけるその移動および局在化後に、移動および局在化の進行が追
跡され得る。さらに、対比色素（例えば、ローダミン）を被験体に投与すること
により、ＧＦＰで標識された固形腫瘍中の血管の増殖がまた、観察され得る。
【００２１】 インタクトな動物において蛍光細胞の移動を観察するのに十分な強度が達成さ
れ得るので、転移の進行は、インタクトな被験体においてリアルタイムで観察さ
れ得る。動物が開口（切開）されるこの方法のいずれかを使用して、可能性のあ
る抗転移薬物の効力である、モデル系での評価における、転移を観察し得る。潜
在的に転移性の癌を有する患者に提供された処置の成功または失敗もまた、本発
明の材料および方法を用いて追跡され得る。
【００２２】 本発明の種々の局面において用いられる標識は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ
）である。このタンパク質をコードするネイティブな遺伝子は、生物発光クラゲ
（ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ）であるＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｒｉａ（Ｍｏｒｉｎ
，Ｊ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９７２）７７：３１３〜３１８）
からクローニングされた。この遺伝子の利用可能性は、遺伝子発現のためのマー
カーとしてＧＦＰを用いることを可能にした。ＧＦＰ自体は、２７ｋＤの分子量
を有する２８３アミノ酸のタンパク質である。それは、そのネイティブな供給源
からさらなるタンパク質を必要とせず、また蛍光発光するためにそのネイティブ
な供給源においてのみ利用可能な基質または補因子も必要としない。（Ｐｒａｓ
ｈｅｒ、Ｄ．Ｃ．ら、Ｇｅｎｅ（１９９２）１１１：２２９〜２３３；Ｙａｎｇ
，Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９６）１４：１２５２〜
１２５６；Ｃｏｄｙ，Ｃ．Ｗ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９３）３２
：１２１２〜１２１８）。ＧＦＰ遺伝子の変異体は、発現を増強するために、そ
して励起および蛍光を改変するために有用であることが見出されている。ＧＦＰ
−Ｓ６５Ｔ（ここで、６５のセリンはトレオニンと置換されている）は、本発明
において特に有用であり、そして４９０ｎｍで単一の励起ピークを有する。（Ｈ
ｅｉｍ，Ｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７３：６６３〜６６４）；米国特許
第５，６２５，０４８号）。他の変異体がまた、Ｄｅｌａｇｒａｄｅ，Ｓら、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９５）１３：１５１〜１５４；Ｃｏｒｍａｃｋ
、Ｂら、Ｇｅｎｅ（１９９６）１７３：３３〜３８およびＣｒａｍｅｒ、Ａら、
Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９６）１４：３１５〜３１９に開示
されている。さらなる変異体がまた、米国特許第５，６２５，０４８号に開示さ
れている。適切な改変により、ＧＦＰにより放射される光のスペクトルが変更さ
れ得る。従って、用語「ＧＦＰ」が、本出願において使用されるが、この定義の
中に含まれるタンパク質は、必ずしも外見が緑ではない。ＧＦｐの種々の形態が
緑以外の色を示し、そしてこれらは、また、「ＧＦＰ」定義内に含まれ、そして
本発明の方法および材料において有用である。さらに、本明細書において、「Ｇ
ＦＰ」の定義内にはいる緑色蛍光タンパク質は、他の生物体（例えば、ウミシイ
タケ（ｓｅａ ｐａｎｓｙ）であるＲｅｎｉｌｌａ ｐｅｒｉｆｏｒｍｉｓ）か
ら単離されている。ＧＦＰ遺伝子の任意の適切かつ便利な形態は、本発明のモデ
ルにおいて有用な腫瘍細胞を改変するために、および内因性腫瘍のレトロウイル
スによる形質転換のために用いられ得る。特定のヒト化されたｈＧＦＰ−Ｓ６５
Ｔクローンが例示のために以下に記載される実施例に用いられる。
【００２３】 一般に、ＧＦＰを用いる、細胞を標識するための技術は、米国特許第５，４９
１，０８４号（前出）に開示されている。
【００２４】 １つの適用において、本発明の方法は、腫瘍の転移的増殖に対する、種々の治
療候補のプロトコルおよび物質の効果を研究するためのモデル系を提供する。
【００２５】 一般的に、このモデルは、腫瘍組織を含むように、脊椎動物（好ましくは、哺
乳動物）を改変する工程を包含する。ここでこの腫瘍細胞は、それ自体が、ＧＦ
Ｐについての発現系を含むように改変されている。この腫瘍細胞は、細胞株から
生じ得る。ここで腫瘍細胞は、ＧＦＰおよび必要に応じて不死化因子（例えば、
ＳＶ４０ Ｔ抗原）についての発現系を含むように改変されている。腫瘍は、Ｇ
ＦＰ発現系を含む形質転換された細胞を投与する工程、およびこれらの形質転換
細胞が腫瘍を形成することを可能にする工程により、このような脊椎動物系にお
いて形成され得る。代表的には、このような投与は、皮下であり、そしてこの腫
瘍は固形物体として形成される。このように形成された腫瘍は、任意の適切な宿
主組織に移植され得、そして進行、転移および発達させられ得る。
【００２６】 従って、最初の腫瘍を増殖するための適切な手順は、ＧＦＰを産生する腫瘍細
胞：例えば、ＣＨＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、癌性細胞株および肉腫細胞株、十
分に樹立された細胞株（例えば、ヒト肺腺癌株Ａｎｉｐ ９７３、または肺癌細
胞株Ｈ４６０）、ならびにＧＦＰ含有ヒト乳癌株ＭＤＡ−ＭＢ４６８およびＭＤ
Ａ−ＭＢ４３５；ヒト前立腺癌株ＰＣ３およびＤＵ−１４５，ヒトグリア芽細胞
腫株３２４、マウス黒色腫Ｂ１６および当該分野で利用可能になり得る他の細胞
、ならびに本発明の方法により不死化される細胞、の経皮注射を包含する。投与
される細胞は、ＧＦＰのための発現系を含むように改変されている。投与後、固
形腫瘍は、代表的には皮下注射の部位で、一般に発達する。これらの細胞が移植
される動物は、免疫無防備状態かまたは移植された細胞と同系であるかのいずれ
かであるべきである。次いで、これらの腫瘍（それ自体が蛍光性である）は、取
り出され、そしてモデルの脊椎動物への移植に用いられる。
【００２７】 脊椎動物（特に哺乳動物）への、固形腫瘍（いま、ＧＦＰで標識されている）
の移植のための技術は、所望の部位、代表的には腫瘍細胞が由来する部位への外
科的同所移植（ＳＯＩ）による直接移植を含む。適切な部位としては、肺、肝臓
、膵臓、胃、乳房、卵巣、前立腺、骨髄、脳および悪性腫瘍に感受性の他の組織
が挙げられる。再度、この被験体は、免疫無防備状態であるかまたは腫瘍と同系
であるかのいずれかであるべきである。一旦、この固形腫瘍が移植されれば、こ
の脊椎動物は、転移を研究するためのモデル系となる。従って、腫瘍は進行およ
び発達され、そしてこの脊椎動物は、もとの移植部位から遠位の部位でＧＦＰ標
識細胞の出現についてモニタリングされる。このモニタリングは、脊椎動物全体
においてリアルタイムで行われる。なぜなら、この腫瘍は、十分に明るく、動物
を開口（切開）することが必要でないからである（その腫瘍は、皮膚を通じて直
接、見られ得、同様に転移位置でもみられ得る）。ＧＦＰ裸眼で可視であり、こ
の組織を染色する発色系は必要ない。薬物モニタリングプロトコルにおけるモデ
ル系のために、インタクトな動物における観察が好ましいが、この動物は切開さ
れ得、そして／または組織は、所望の場合切り出され得る。コントロール動物と
の比較もまた所望される。
【００２８】 蛍光光学腫瘍画像化（ＦＯＴＩ）を通じて、インタクトな動物における腫瘍細
胞の移動を可視化することが特に便利である。これは、特に、可能性のある抗転
移薬物の評価において、モデル系における、連続的な転移の進行のリアルタイム
の観察およびモニタリングを可能にする。従って、薬物を投与されなかったコン
トロールに比較して、候補薬物を投与された試験動物において直接観察された転
移の相対的な欠失は、この候補の有効性およびその処置としての可能性を示す。
癌が処置される被験体において、ＦＯＴＩの有効性により、プロトコルを改変す
るかまたは改変しないことの適否という情報を連続的に受けるべき本発明の処置
プロトコルが可能になる。
【００２９】 モデルとしての使用に適切な脊椎動物被験体は、好ましくは哺乳動物被験体、
最も好ましくウサギ、ラット、マウスなどのような都合の良い実験動物である。
ヒト被験体へのより緊密な類似のために、霊長類も用いられ得る。有用な被験体
は、障害された免疫系を有する被験体（例えば、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマ
ウス）のような、特に腫瘍発達に感受性である被験体である。免疫系の無防備状
態は、薬物の投与、または当該分野で一般に公知の他の技術により任意の脊椎動
物において達成され得る。任意の適切な脊椎動物被験体が用いられ得る。選択は
、最終的な目的のシステムに対する便利さおよび類似性により主に決定される。
【００３０】 移植されるべき腫瘍細胞において作動可能である適切な発現系が用いられ得る
。種々の型の腫瘍細胞において発現をもたらす多数のベクターが市販されている
。ベクターの性質は、腫瘍の性質および腫瘍の起源を見出す脊椎動物によって変
化し得る。しかし、ＧＦＰがモデル系における転移を可視化するために用いられ
る場合、レトロウイルスまたはこのモデルの性質を複雑にし得る他のウイルスプ
ロモーターを使用しないベクターを利用することが好ましい。
【００３１】 これらのモデル系のために腫瘍を樹立することにおいて有用である細胞株を提
供するために、ＳＶ４０Ｔ抗原を有する細胞を提供する発現ベクターを使用する
ことがまたしばしば、利点がある。この抗原の存在は、培養物の不死化を保証す
る。従って、本発明において特に有用なのは、ＧＦＰおよびＳＶ４０Ｔ抗原の両
方の産生を生じる発現系を含むベクターである。
【００３２】 腫瘍生成に効果的である形質転換細胞をトランスフェクトおよび改変するため
に、任意の適切なトランスフェクション方法（例えば、リポソーム、リン酸カル
シウム沈殿、エレクトロポレーションおよび遺伝子銃の使用）が用いられ得る。
リポフェクチンが好ましい。
【００３３】 対照的に、本発明の方法を使用して、ヒト癌患者のような被験体において天然
に存在する腫瘍における転移を可視化する場合、レトロウイルスプロモーターま
たは他のウイルスプロモーターを使用するベクターが好ましい。そのようなベク
ターの使用は、ＧＦＰについての発現系の、既に存在する腫瘍への挿入を可能に
する。さらに、その発現系は、転移の診断および処置を同時に可能にする治療タ
ンパク質のような、他の有用なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み
得る。そのような適切なタンパク質の中には、メチオニナーゼが含まれる（例え
ば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／１１３１１およびＰＣＴ／ＵＳ９６／０９９３５を参照
のこと）。そのようなタンパク質は、ＧＦＰとの融合物としてか、または独立し
て、ジシストロン性発現系もしくは独立の発現系のいずれか（一方は、治療タン
パク質について、そして他方はＧＤＰについて）を用いて、産生され得る。
【００３４】 ＧＦＰのための発現系に基づくレトロウイルス（ベクター）は、すでに、Ｇｒ
ｉｇｉｎａｎｉ，Ｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９８）５８：１４−１９お
よびＣｈｅｎｇ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９７）４：１０１３
−１０２２によって記載されている。これらの報告において、そのレトロウイル
ス発現系自体を使用して、造血前駆細胞をトランスフェクトするか、またはパッ
ケージング細胞を用いてウイルス含有上清を提供した。この上清を直接哺乳動物
細胞の感染に用い得る。従って、本発明の方法において、脊椎動物被験体に含ま
れる腫瘍は、代表的に、改変され、そしてパッケージングされてＧＦＰについて
の発現系を含ませたウイルスを用いて感染される。ウイルスでのインサイチュ感
染によって、その腫瘍がＧＦＰおよび実際、標識自体を生成する能力がもたらさ
れる。
【００３５】 哺乳動物細胞においてタンパク質を産生するにおいて有用な種々のレトロウイ
ルス系は、当該分野において公知である。例としては、市販のベクターおよびパ
ッケージ系（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒ
ｎｉａにより販売されるもの（そのＲｅｔｒｏ−ＸベクターｐＬＮＣＸおよびｐ
ＬＸＳＮを含む。これらは、種々のプロモーターの下で、複数のクローニング部
位へと挿入することによってＧＦＰの発現を可能にする。これらのベクターは、
Ψ＊（拡張されたウイルスパッケージングシグナルを含む）および選択のための
抗生物質耐性遺伝子を含む。多数のこれらの系が遺伝子治療において使用するた
めに開発されており、これらには、レトロウイルス供給源に由来する５’と３’
とのＬＴＲの間にサンドウィッチされた複数クローニング部位を提供し、それゆ
えヒト患者の腫瘍を標識するに置いて有用であるベクターが含まれる。
【００３６】 従って、レトロウイルスベクターベースのベクター（例えば、図１ａ〜１ｂに
示されるもの）は、パッケージング細胞中にトランスフェクトされ得、そして標
的化された癌細胞に直接移入され得るか、またはパッケージング細胞由来の上清
を用いて、そのレトロウイルスを腫瘍細胞に感染させ得る。レトロウイルス細胞
およびパッケージング細胞の好ましい組み合わせとしては、ＰＴ−６７パッケー
ジング細胞中のＧＦＰレトロウイルスベクターｐＬＥＩＮが挙げられる。そのパ
ッケージング細胞の結腸癌細胞との同時培養物は、ＧＦＰレトロウイルスのその
癌細胞への移入を生じる。
【００３７】 組織培養技術およびＰＴ−６７パッケージング細胞生成ＧＦＰ−ｐＬＥＩＮウ
イルス由来の上清を用いて、ヒト癌細胞組織をＧＦＰに関連する蛍光を表示させ
る首尾よい改変が実証されている。インビボでの使用のために、そのウイルスが
投与され、好ましくは、その腫瘍へ局所的に投与され、これが、パッケージング
細胞またはウイルス含有上清のいずれかの注射後数時間以内に観察され得る。悪
性細胞を、その緑色で識別し得、ときに、これは、その腫瘍が皮膚を通してみる
ことができるのに充分明るい。
【００３８】 モデル系または脊椎動物、代表的には哺乳動物、およびより代表的にはヒトの
被験体（すでに、腫瘍に罹患している）のいずれかにおける腫瘍転移および増殖
の直接の観察に加えて、本発明の方法は、固形腫瘍における新脈管形成を観察す
るために適合され得る。その腫瘍は、それ自体が、上記のようにＧＦＰで標識さ
れる。次いで、その被験体に、対比色素を、代表的には注射、好ましくは静脈注
射によって投与し、これによって、腫瘍における血管が観察されることを可能に
する。適切な色素としては、ローダミンおよび他の対比色素が挙げられる。ＧＦ
Ｐの緑色と対照色を形成する任意の色素が使用され得る。好ましくは、その色素
は、ポリエチレングリコールのような不活性ポリマーに結合されて、その色素が
血管に滞留する時間を延長する。充分な量の色素が提供されて、容易な可視化を
可能にする：必要とされる色素の量は、色素の選択、腫瘍の位置、バックグラウ
ンドＧＦＰの性質、および観察に使用される方法に依存する。数分以内に、腸間
膜、結腸壁および網ような領域内の固形腫瘍へと成長する血管が観察され得る。
観察は、実質的な時間をかけて継続され得る；例えば、数時間後の新脈管形成が
なお、この方法を用いることによって観察される。
【００３９】 以下の実施例は、本発明を例示することを意図するが、限定は意図しない。
【００４０】 （実施例１：ＧＦＰを生成する腫瘍細胞の調製） Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ、Ｓ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：４６４
６−４６５４に記載されるヒト化ｈＧＦＰ−Ｓ６５Ｔクローンを、緑色蛍光タン
パク質をコードする配列として使用した。このコドン最適化された遺伝子を、Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，
ＣＡ）から購入し、そしてＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅ，ＭＡから購入し、そしてＫａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９９１）１９：４４８５−４４９０に記載されるジ
シストロン性発現ベクター（ｐＥＤ−ｍｔｘ’）へと連結した；ｈＧＦＰ−Ｓ６
５ＴをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして平滑末端化した。ｈＧＦＰコード領域全
体を、ＸｂａＩで切り出し、次いで、ＰｓｔＩで消化し、平滑末端化し次いでＸ
ｂａＩでさらに消化したｐＥＤ−ｍｔｘl中に単一の方向にサブクローニングし
た。
【００４１】 ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０％仔ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１０
０μＭ非必須アミノ酸を含むＤＭＥＭ中で培養した。ほぼコンフルエントな細胞
を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥTM試薬（ＧＩＢＣＯ）および飽和量のプラスミ
ドの沈降混合物とともに６時間インキュベートし、次いで新鮮な培地を補充した
。細胞を、４８時間後にトリプシン／ＥＤＴＡによって採集し、そして１：１５
で１．５μＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）を含む選択培地中へと継代培養した
。安定に組み込まれたプラスミドを有する細胞を、ＭＴＸ含有培地中で選択し、
そしてクローニングシリンダ（Ｂｅｌ−Ａｒｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐｅｑｕａ
ｎｎｏｃｋ，ＮＪ）を用いてＥＤＴＡによって単離した。増殖および移入の後、
クローン３８を、その高い強度のＧＦＰ蛍光および安定性のために選択した。
【００４２】 類似の様式において、Ｈａｒｂｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
，Ｃｈｉｎａから得たヒト肺癌細胞株であるＡｎｉｐ ９７３細胞を、ＤＭＥＭ
の代わりにＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）を用いることを除いて上記のＣＨＯ
Ｋ１細胞についてと同様に培養した。トランスフェクション、選択および増殖お
よび移入を上記のように行った。クローン２６を、その高い強度のＧＦＰ蛍光お
よび安定性のために選択した。
【００４３】 （実施例２：標識された腫瘍細胞株のＧＦＰおよび調製のためのレトロウイル
ス発現ベクターの構築） 図１ａおよび１ｂは、ＳＶ４０プロモーターの制御下にあるＧＦＰのための発
現ベクターの構築を示す。この構築物は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能な市販
のｐＥＧＦＰシリーズのベクターを使用する。細菌発現ベクターおよび哺乳動物
発現ベクターの両方は、さらなるタンパク質およびＧＦＰの産生を、融合タンパ
ク質としてかまたはジシストロン性系においてのいずれかで産生し得るものが利
用可能である。図１ａは、メチオニナーゼとのＧＦＰの融合物についての、発現
ベクターｐＧＦＰ／Ｍｅｔの構築を示す。図１ｂは、ＳＶ４０Ｔ抗原とＧＦＰと
の融合タンパク質の産生のためのｐＧＦＰ／ＳＶ４０の構築を示す。
【００４４】 実施例６に記載されるベクターｐＬＥＩＮ系を用いる所望のスペクトル特性の
ＧＦＰコード配列を含む市販のベクターを、ヒト乳癌、ヒト前立腺癌、ヒト神経
膠芽腫およびマウス黒色腫のような腫瘍由来の細胞株へとトランスフェクトした
。この様式で、緑色蛍光タンパク質で標識した、ヒト乳癌細胞株ＭＦ−７、ＭＤ
Ａ−ＭＢ４６８およびＭＤＡ−ＭＢ４３５、ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ３およびＤ
Ｕ１４５、ヒト神経膠芽腫細胞株３２４、ヒト肺癌細胞Ａｎｉｐ−７３およびＨ
４６０、ヒト結腸癌細胞株Ｃｏｌｏ−２０５、ＨＣＴ１５およびＷｉＤｒ、ヒト
胃癌細胞株ＮＶＧＣ−４、ヒト腎臓癌細胞株ＳＮ１２Ｃ、ヒト舌癌細胞株ＳＣＣ
−２５、ヒト黒色腫ＬＯＸおよびＳＫ−ｍｅｌ−５、細胞株ＣＨＯ−Ｋ１からの
標識されたチャイニーズハムスター卵巣細胞およびマウス黒色腫細胞株Ｂ１６が
樹立された。
【００４５】 ＳＶ４０ Ｔ抗原タンパク質は、恒久細胞株を確立するために培養された細胞
を不死化するために有用である。従って、ベクターｐＧＦＰ／ＳＶ４０は、一連
の主要細胞株培養物へとトランスフェクトされて、蛍光不死化された細胞株を提
供する。
【００４６】 （実施例３：樹立された腫瘍のインビボ標識） ヒト肺癌細胞株Ａｎｉｐ９７３から得られた標識されていない腫瘍を、マウス
中で以下のとおりに樹立した。腫瘍を、０．４ｍｌの単回用量の１０7のＡｎｉ
ｐ９７３細胞を、トリプシン処置および冷血清含有培地を３回用いて洗浄を行う
ことによって４０分の採取内に皮下注射した６週齢Ｂａｌｂ／Ｃ ｎｕ／ｎｕ雄
性マウス中で増殖させた。この細胞を、注射の前に氷上に維持した。この動物を
、腫瘍がおよそ１．２ｃｍ直径に達したときに屠殺した。１．２ｃｍ腫瘍は、約
５週間後の形成された。
【００４７】 腫瘍片（１ｍｍ3）を、ＳＯＩによってＡｓｔｏｕｌ，Ｐ．ら，Ａｎｔｉｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９４）１４：８５−９２；Ａｓｔｏｕｌ，Ｐ
．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９４）５６：９−１５（この両方が本明
細書において参考として援用される）に記載されるような８匹のマウスの左の肺
胸膜移植した。手短には、そのマウスを、イソフルラン吸入によって麻酔し、肋
間の空間の４番目を介して、小さな１ｃｍにわたる切り込みを左の側方の胸に作
製し、完全な肺の虚脱を引き起こす。５つの腫瘍片を、７−０ナイロン外科用縫
合糸を用いて縫い合わせ、１つの結び目を作製することによって固定した。肺を
ピンセットで取り出し、そして腫瘍を１つの縫合糸で肺の下部に縫い合わせ、そ
の後、肺を胸腔に返し、そして筋肉および皮膚を６−０絹縫合糸の単一層を用い
て封着した。肺を２３ゲージの針を用いて胸腔から空気を取り出すことによって
、再膨張させた。次いで、マウスにＰＴ６７細胞に含まれるレトロウイルスベク
ターＧＦＰレトロウイルスｐＬＥＩＮ１を含む１×１０7のパッケージング細胞
を注射した。このウイルスパッケージング系は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ Ｄ
ｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能である。ｐＬＥＩＮは、ＥＧＦＰ
（哺乳動物においてより明るい蛍光およびより高い発現について最適化された野
生型ＧＦＰの赤方偏移改変体）のコード配列の挿入物を含む。これは、４８８ｎ
ｍにおいて最大励起、および５０７ｎｍにおいて最大発光を有する。この変異体
は、６４位においてＰｈｅからＬｅｕへの、６５位においてＳｅｒからＴｈｒの
二連のアミノ酸置換を含む。これは、Ｃｏｍａｃｋ、Ｂら、Ｇｅｎｅ（１９９６
）１７３；３１−３８において記載されている。Ｈａａｓ Ｊ．ら、Ｃｕｒｒ
Ｂｉｏｌ（１９９６）６：３１５−３２４によって記載されるようなヒトコドン
慣用選択を最大化する１９０を超えるサイレントな塩基変化が存在する。従って
、ｐＬＥＩＮは、ｐＬＸＩＮの複数クローニング部位に挿入された上記のＧＦＰ
コード配列を含み、ジシストロン性発現系を得、それによって、ＧＦＰおよびネ
オマイシン耐性の調和された翻訳を可能にする。マウスの腹腔へのその細胞の注
射後３日で、腫瘍細胞を、明野顕微鏡および蛍光顕微鏡の下で、精嚢中に見るこ
とができた。
【００４８】 （実施例４：新脈管形成の観察） １×１０7のクローン３８細胞を含む懸濁物（実施例１に記載される）を、マ
ウスの腹腔に注射した。５日後、マウスの尻尾にローダミンを注射し、次いでそ
のマウスを麻酔し、そして腹腔を充分に開口して腫瘍を可視化させた。この手術
からの回復はすぐであった。いくつかの場合において、開腹は、不要である。な
ぜなら、腹腔内の腫瘍が生の皮膚を通して可視化され得るからである。腫瘍は、
腹腔において可視化され、そして新脈管形成が、ローダミン蛍光によって同定さ
れるように明らかになった。類似の結果が、小腸壁における網および腸間膜にお
いて増殖する腫瘍中に見られた。
【００４９】 類似の実験において、１×１０7細胞のクローン２６を含む懸濁物（実施例１
に記載される）を、マウスの腹腔中に注射した。１日後、腫瘍が腸間膜中および
結腸壁に出現した。これらを、マウスを麻酔することおよび腹を最小限開口する
ことによって観察した。類似の処置をしたマウスの３日目の観察によって、小腸
の壁および網ならびに結腸壁および腸間膜における腫瘍を示した。５日目に、類
似の処置をしたマウスの尻尾に、１００μｌの２×１０-3Ｍのローダミンを注射
し、そして数本の血管が、腸間膜中に成長する腫瘍においてみることができた。
６０日後、多数の血管が、結腸壁において成長する腫瘍において見られた。
【００５０】 （実施例５：転移モデルの構築） 実施例２に記載される標識されたヒト癌細胞株を用いて、種々の型の癌につい
てのマウスモデルを樹立した。この細胞株を、１０7ＧＦＰ発現ヒト腫瘍細胞を
単回用量で６週齢のｎｕ／ｎｕ雌性マウスに移植し、これを、トリプシン処置に
よって採集し、そして冷血清含有培地で３回洗浄し、次いで氷上に維持した。採
集の４０分以内に０．４ｍｌの総容量で動物の側腹部中の皮下空間に注射する。
このヌードマウスを腫瘍細胞注射から３週間後に屠殺して、腫瘍断片を採集する
。次いで、これらの腫瘍断片を、レシピエントとしてのヌードマウスにおいて、
対応する組織（外科的歯科矯正術移植（ＳＯＩ））中への外科的移植のために使
用する。
【００５１】 レシピエントマウスをまず麻酔し、次いで樹立されたＳＯＩ技術を用いて皮下
で成長した結腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌または黒色腫の断片を移植する。多く
の場合、この黒色腫を除いて、この断片のサイズは、１ｍｍ3であり；黒色腫に
ついて０．０２５ｍｍ3断片をヒト黒色腫ＬＯＸ−ＧＦＰ皮下腫瘍から調製し、
そして５〜６断片を移植した。次いで、転移の進行を、水銀ランプ供給源を有す
るＬｅｉｃａ Ｓｔｅｒｅｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＭＺ１２を備えるＦＯＴＩ
を用いて観察する。ＧＦＰを、Ｄ４２５／６０帯域のフィルタおよび４７０ＤＣ
ＸＲ二色性鏡を用いて切り出し；蛍光は、ＧＧ４７５長径フィルタ（Ｃｈｒｏｍ
ａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅ−ｂｏｒｏ，ＶＴ）を通じて発光さ
れ、そして１３１７ｘ１０３５ピクセルチップを備える、熱電気学的に冷却され
たＳＴ−１３３ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ Ｃａｍｅｒａ−−ＴＥＡ／ＣＣＤ−１３１７Ｋ１（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｒｅｎｔｏｎ，ＮＪ）によって収集する。画像を
ＩｍａｇｅＰｒｏ+ ３．１ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅ
ｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）を用いて処置および分析する。
高解像度の画像を、コンピュータによって捕捉するか、またはビデオ出力を通じ
てビデオテープに連続的に捕捉する。
【００５２】 結腸癌モデルにおいて、小中線切込みを、腹に作製し、そして腸の結腸直腸部
分を外部に出した。漿膜を取り出し、そして８−１５の腫瘍断片の片を移植した
。８−０外科用縫合糸を用いて、小さな腫瘍片を貫通させ、それらを腸壁へと縫
い合わせた。腸を腹腔に戻し、そして腹壁を封着した。次いで、この動物を、転
移について観察した。
【００５３】 肺癌モデルについて、小さな１ｃｍにわたる切込みを、肋間の第四空間を介し
て左の側方の胸に作製し；肺の完全な虚脱がもたらされる。８−０ナイロン外科
的縫合糸を用いて縫い合わされた５つの腫瘍片を、１つの結び目を作製すること
によって固定する；肺をピンセットによって取り出し、そして腫瘍を肺の下部へ
と１つの縫合糸で縫い合わせる。肺を胸腔へと戻した後、胸の筋肉および皮膚を
封着する。肺を、２３ゲージの針を用いて胸の腔から空気を取り出すことによっ
て再膨張させる。次いで、この動物を、ＦＯＴＩによるか、または種々の組織を
切り出すことによるかのいずれかで転移について観察し得る。
【００５４】 乳癌について、１．５ｍの切り込みを、乳頭の中線側に沿って作製し、そして
平滑末端切除の後、脂肪パッドを暴露させる。小さな切込みを作製し、そして小
さなポケットを形成させて、腫瘍組織の２つの断片を収容させる；８−０縫合糸
をそのポケットの付近へとやる。次いで皮膚層を封着する。次いで、この動物を
、ＦＯＴＩまたは組織切り出しによって観察する。
【００５５】 前立腺癌について、開口を恥骨結合の上で作製して、前立腺を露出させる。前
立腺の背側部分および前立腺の背側の側方の葉の周りの筋膜を、小さな切込みに
よって分離する。５つの無作為化した断片を切り込み中に８−０ナイロン縫合糸
を用いて作製する。分離された葉の２つの部分を縫い合わせ、そして周りの筋膜
を用いて前立腺のこの部分を包んでその切込みを合同させた。次いで、腹を閉じ
、そして動物を観察のために維持する。
【００５６】 黒色腫について、１３×１／４の癌移植針（Ｐｏｐｐｅｒ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ
ｅｗ Ｈｙｄｅ Ｐａｒｋ，ＮＹ）を用いて、５〜６断片を側腹部へ皮下に移植
する。
【００５７】 画像は上記のように得ることができ、その動物における種々の位置への転移が
示される。
【００５８】 次いで、上記のように処置した動物を用いて、癌の処置および転移の阻害のた
めの可能なプロトコルを評価する。このプロトコルで投与された動物における蛍
光腫瘍の転移の進行は、処置を受けない類似の動物と比較する。次いで、このプ
ロトコルの効力が直接観察され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１ａは、本発明に有用な発現ベクターの構築を示す。
【図１Ｂ】 図１ｂは、本発明に有用な発現ベクターの構築を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 33/58 Ｚ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA29 BB20 CB02 CB17 FA18 FB12 JA04 JA06 2G054 AB01 AB05 BB20 CA21 GA04 GB04 JA02 JA04 JA20 4B024 AA01 AA12 BA80 CA02 DA02 EA02 FA02 FA10 GA23 HA11 4B063 QA19 QQ08 QQ43 QQ58 QQ79 QR32 QR48 QR77 QR79 QX02 4C085 HH11 KA26 KB99 LL18

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 原発性腫瘍の転移を阻害するための候補となるプロトコルま
    たは薬物を評価するための方法であって、該方法は、以下： 原発性腫瘍が転移した場合に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を高レベルで安
    定に発現する該原発性腫瘍を含む動物に該プロトコルまたは薬物を投与する工程
    であって、該動物が、該原発性腫瘍に対して免疫無防備であるかまたは同系であ
    り、そして該原発性腫瘍が、該動物に対するＧＦＰの発現系を含むレトロウイル
    スベクターを投与することによって、該発現系を含むように改変されているか、
    または該原発性腫瘍が、外科同所移植により移殖され、そして該ＧＦＰの１つの
    発現系を含む、工程； 該処置された動物における種々の位置にて、該蛍光の存在、非存在または強度
    を観察することによって転移の進行をモニターする工程； 緑色蛍光タンパク質を発現する同様の腫瘍を含むコントロール動物において腫
    瘍の進行をモニターする工程；および 該コントロール動物において腫瘍の進行と、該処置された動物において転移の
    進行とを比較する工程； を包含し、それによって、該コントロール動物と比較したときの、該処置された
    動物における腫瘍の進行の減少が、転移の阻害において有効であるとして該プロ
    トコルまたは薬物を同定する、方法。
  2. 【請求項２】 前記原発性腫瘍が、前記動物に対して前記発現系を含むレト
    ロウイルスベクターを投与することによって、ＧＦＰの発現系を含むように改変
    されている、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記動物がウサギ、ラットまたはマウスである、請求項１ま
    たは２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記モニターする工程が、インタクトな動物における蛍光光
    学腫瘍画像化（ＦＯＴＩ）によってである、請求項１〜３のいずれか１項に記載
    の方法。
  5. 【請求項５】 原発性腫瘍の転移の阻害のための候補となるプロトコルまた
    は薬物を評価するための方法であって、該方法が、以下： 原発性腫瘍が転移した場合に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を高レベルで安
    定に発現する該原発性腫瘍を含む動物に、該プロトコルまたは薬物を投与する工
    程であって、該原発性腫瘍が、該動物に対して該発現系を含むレトロウイルスベ
    クターを投与することによって、ＧＦＰの発現系を含むように改変されている、
    工程、 該処置された動物における種々の位置にて、該蛍光の存在、非存在または強度
    を観察することによって転移の進行をモニターする工程、 を包含し、それによって、該処置された動物における転移の進行の減少が、転移
    の阻害に有効であるとして該プロトコルまたは薬物を同定する、方法。
  6. 【請求項６】 前記モニターする工程が、インタクトな動物における蛍光光
    学腫瘍画像化（ＦＯＴＩ）によってである、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 インタクトな動物における原発性腫瘍の転移をモニターする
    ための方法であって、該方法は、以下： 該インタクトな動物における種々の位置にて、時間の関数として蛍光の存在、
    非存在または強度を観察することによって、該原発性腫瘍を含む動物における転
    移の進行をモニターする工程であって、該原発性腫瘍が転移した場合に、該原発
    性腫瘍が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を高レベルで安定に発現し、そして該原
    発性腫瘍が内因性であり、かつ該動物に対して、該発現系を含むレトロウイルス
    ベクターを投与することによって、該原発性腫瘍にＧＦＰの発現系が提供されて
    いる、工程、 を包含する、方法。
  8. 【請求項８】 前記発現系がウイルスプロモーターを含む、請求項７に記載
    の方法。
  9. 【請求項９】 前記動物がヒトである、請求項７または８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記原発性腫瘍が、外科的同所移植によって移殖され、そ
    して前記ＧＦＰの１つの発現系を含み、そして前記モニターする工程が、前記イ
    ンタクトな動物における蛍光光学腫瘍画像化（ＦＯＴＩ）によってである、請求
    項１〜３に記載の方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7280680B2 (en) 2002-03-04 2007-10-09 Riken Method and apparatus for observing three-dimensional localizations of in vivo expressed genes as well as method and apparatus for observing minute three-dimensional localizations of in vivo expressed genes
JP2016021931A (ja) * 2014-07-22 2016-02-08 国立大学法人福井大学 子宮肉腫転移モデル動物

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050005310A1 (en) * 1999-07-12 2005-01-06 Genentech, Inc. Expression vectors and methods
KR100868200B1 (ko) * 2000-03-17 2008-11-12 안티캔서, 인코포레이티드 유전자 발현의 전신 광학 영상화 및 이를 사용하는 방법
US7244232B2 (en) * 2001-03-07 2007-07-17 Biomed Solutions, Llc Process for identifying cancerous and/or metastatic cells of a living organism
US20030031628A1 (en) * 2001-07-09 2003-02-13 Ming Zhao Imaging infection using fluorescent protein as a marker
EP1281767A3 (en) * 2001-07-31 2003-05-28 Aladar A. Szalay Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of tumors
DE60237459D1 (de) * 2001-09-10 2010-10-07 Anticancer Inc Verbesserte beobachtungsgenauigkeit bei der absiedelung von tumoren
CA2470411C (en) * 2001-12-31 2015-07-07 Anticancer, Inc. System for monitoring bacterial tumor treatment
EP1369491A1 (en) * 2002-06-05 2003-12-10 Aladar A. Szalay Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of diseases associated with wounded or inflamed tissue
US20030228261A1 (en) * 2002-06-05 2003-12-11 Aladar Szalay Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of diseases associated with wounded or inflamed tissue
DE60330468D1 (de) 2002-08-21 2010-01-21 Revivicor Inc Schweine ohne jegliche expression funktioneller alpha-1,3-galactosyltransferase
US9453251B2 (en) 2002-10-08 2016-09-27 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
JP2006512061A (ja) * 2002-11-14 2006-04-13 ジェネンテック・インコーポレーテッド イントロン融合コンストラクトおよび高発現産生細胞系を選択するための使用方法
JP4658809B2 (ja) * 2003-02-07 2011-03-23 アンチキャンサー インコーポレーテッド Ｇｆｐおよびその他の蛍光タンパク質トランスジェニックヌードマウス
JP2006521116A (ja) 2003-03-27 2006-09-21 ピーティーシー セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗真菌性および／または抗増殖性分子を同定するためのｔＲＮＡスプライシング経路の酵素の標的化
CA2520415A1 (en) 2003-03-27 2004-10-14 Ptc Therapeutics, Inc. Methods of identifying compounds that target trna splicing endonuclease and uses of said compounds as anti-proliferative agents
AU2004243886A1 (en) * 2003-05-27 2004-12-09 Anticancer, Inc. Imageable animal model of SARS infection
AU2004246547B2 (en) * 2003-06-09 2008-10-30 Toku Pte Ltd System and method for providing a service
CN100562570C (zh) 2003-06-18 2009-11-25 吉恩勒克斯公司 修饰的重组痘苗病毒及其它微生物,及其应用
US7321791B2 (en) 2003-09-23 2008-01-22 Cambridge Research And Instrumentation, Inc. Spectral imaging of deep tissue
US8634607B2 (en) 2003-09-23 2014-01-21 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Spectral imaging of biological samples
US7155274B1 (en) 2003-11-21 2006-12-26 Imaging Diagnostic Systems, Inc. Optical computed tomography scanner for small laboratory animals
WO2005099363A2 (en) 2004-03-26 2005-10-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of diagnosing, preventing and treating cancer metastasis
CN101031655A (zh) 2004-07-26 2007-09-05 陶氏环球技术公司 通过株工程改进蛋白表达的方法
CN101151623B (zh) 2005-01-27 2010-06-23 剑桥研究和仪器设备股份有限公司 对样本图像的特征进行分类的方法和设备
EP1924686A4 (en) 2005-08-09 2009-11-11 Revivicor Inc TRANSGENIC NAILS EXPRESSING CTLA4-IG AND USES THEREOF
WO2007070784A2 (en) * 2005-12-12 2007-06-21 The Uab Research Foundation Fluorescent detection of cancer and fluorescent guided surgical removal
EP2037270A3 (en) 2006-03-31 2009-03-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Tumor models employing green fluorescent protein
TW200819540A (en) 2006-07-11 2008-05-01 Genelux Corp Methods and compositions for detection of microorganisms and cells and treatment of diseases and disorders
WO2008100292A2 (en) 2006-10-16 2008-08-21 Genelux Corporation Modified vaccinia virus strains for use in diagnostic and therapeutic methods
US20100093061A1 (en) * 2006-12-20 2010-04-15 Bodie Elizabeth A Assays for Improved Fungal Strains
WO2008134461A2 (en) 2007-04-27 2008-11-06 Dow Global Technologies, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
US9580719B2 (en) 2007-04-27 2017-02-28 Pfenex, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
US20090117034A1 (en) * 2007-06-15 2009-05-07 Nanhai Chen Microorganisms for imaging and/or treatment of tumors
JP2010539951A (ja) * 2007-10-01 2010-12-24 アンチキャンサー インコーポレーテッド イメージング可能なげっ歯類動物喘息モデル
EP2300023A2 (en) * 2008-05-16 2011-03-30 Genelux Corporation Microorganisms for preventing and treating neoplasms accompanying cellular therapy
WO2010006168A2 (en) * 2008-07-09 2010-01-14 University Of Rochester Methods of treating cancer using and agent that modulates activity of the calcitonin-gene related peptide ("cgrp") receptor
CA2836299A1 (en) 2011-04-15 2012-10-18 Genelux Corporation Clonal strains of attenuated vaccinia viruses and methods of use thereof
EP2764119A2 (en) 2011-10-05 2014-08-13 Genelux Corporation Method for detecting replication or colonization of a biological therapeutic
USD809116S1 (en) 2015-11-02 2018-01-30 Pura Scents Dispenser
CA3133710C (en) 2015-11-02 2023-10-24 Pura Scents, Inc. Scent dispensation
USD816506S1 (en) 2015-11-02 2018-05-01 Pura Scents, Inc. Vial for a scent dispenser
US20200270557A1 (en) * 2017-09-18 2020-08-27 President And Fellows Of Harvard College Human in vitro orthotopic and metastatic models of cancer
CN116539862B (zh) * 2022-07-20 2024-03-12 成都诺医德医学检验实验室有限公司 一种基于类器官共生长平台测试肿瘤转移能力的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5491084A (en) * 1993-09-10 1996-02-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green-fluorescent protein
US5650135A (en) 1994-07-01 1997-07-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Non-invasive localization of a light-emitting conjugate in a mammal
US5874304A (en) * 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
WO1997045550A2 (en) 1996-05-31 1997-12-04 Baxter International Inc. Mini-adenoviral vector
WO1998049336A1 (en) 1997-04-28 1998-11-05 Anticancer, Inc. Metastasis models using green fluorescent protein (gfp) as a marker

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7280680B2 (en) 2002-03-04 2007-10-09 Riken Method and apparatus for observing three-dimensional localizations of in vivo expressed genes as well as method and apparatus for observing minute three-dimensional localizations of in vivo expressed genes
JP2016021931A (ja) * 2014-07-22 2016-02-08 国立大学法人福井大学 子宮肉腫転移モデル動物

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