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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verbindungen zur Abgabe von
Wirkstoffen, wie biologisch oder chemisch aktive Wirkstoffe, an
ein Ziel. Diese Verbindungen sind gut geeignet zum Bilden von nicht-kovalenten
Mischungen mit Wirkstoffen für
orale, intrakolonische und andere Verabreichungswege an Tiere. Verfahren
zur Herstellung und Verabreichung solcher Zusammensetzungen werden
ebenfalls beschrieben.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Übliche Maßnahmen
zur Abgabe von Wirkstoffen sind häufig sehr begrenzt durch biologische,
chemische und physikalische Schranken. Typischerweise werden diese
Schranken auferlegt durch die Umgebung, durch welche die Abgabe
erfolgt, die Umgebung des Ziels für die Abgabe und/oder das Ziel
selbst. Biologisch und chemisch aktive Wirkstoffe sind insbesondere
anfällig
für solche
Schranken.
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Bei
der Abgabe von biologisch aktiven und chemisch aktiven pharmakologischen
und therapeutischen Wirkstoffen an Tiere werden Schranken durch
den Körper
auferlegt. Beispiele physikalischer Schranken sind die Haut, Lipid-Doppelschichten
und verschiedene Organmembranen, die relativ undurchlässig für bestimmte Wirkstoffe
sind, aber durchquert werden müssen,
bevor sie ein Ziel, wie das Kreislaufsystem, erreichen. Chemische
Schranken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf pH-Schwankungen in
dem Gastrointestinaltrakt (GI-Trakt) und auf abbauende Enzyme.
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Diese
Schranken sind von besonderer Signifikanz beim Design von oralen
Abgabesystemen. Die orale Abgabe von zahlreichen biologisch oder
chemisch aktiven Wirkstoffen würde
der Verabreichungsweg der Wahl an Tiere sein, falls keine biologischen,
chemischen und physikalischen Schranken existierten. Unter den zahlreichen
Wirkstoffen, die nicht typischerweise einer oralen Verabreichung
zugänglich
sind, sind biologisch oder chemisch aktive Peptide, wie Calcitonin
und Insulin, Polysaccharide und insbesondere Mucopolysaccharide einschließlich aber
nicht beschränkt
auf Heparin, Heparinoide, Antibiotika und andere organische Substanzen. Diese
Wirkstoffe können
in dem Gastrointestinaltrakt durch Säurehydrolyse, Enzyme und Ähnliches
rasch unwirksam gemacht oder zerstört werden. Darüber hinaus
kann die Größe und Struktur
von makromolekularen Wirkstoffen die Absorption verhindern.
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Frühere Verfahren
zum oralen Verabreichen anfälliger
pharmakologischer Wirkstoffe haben sich sowohl auf die Co-Verabreichung
von Adjuvanzien (z. B. Resorcinole und nicht-ionische oberflächenaktive
Stoffe, wie Polyoxyethylenoleylether und n-Hexadecylpolyethylenether),
um künstlich
die Durchlässigkeit
von Darmwänden
zu erhöhen,
als auch auf die Co-Verabreichung von enzymatischen Inhibitoren
(z. B. pankreatische Trypsin-Inhibitoren, Diisopropylfluorphosphat
(DFF) und Trasylol) verlassen, um den enzymatischen Abbau zu hemmen.
Liposomen sind ebenfalls als Wirkstoffabgabesysteme für Insulin
und Heparin beschrieben worden. Eine Verwendung solcher Wirkstoffabgabesysteme
in weitem Umfang ist jedoch ausgeschlossen, da (1) die Systeme toxische
Mengen von Adjuvanzien oder Inhibitoren erfordern, (2) geeignete
Cargos mit niedrigem Molekulargewicht, d. h. Wirkstoffe, nicht erhältlich sind,
(3) die Systeme eine ungenügende
Stabilität
und eine unzulängliche
Lebensdauer aufweisen, (4) die Systeme schwierig herzustellen sind,
(5) die Systeme den Wirkstoff (Cargo) nicht schützen können, (6) die Systeme den Wirkstoff
nachteilig verändern
oder (7) die Systeme die Absorption des Wirkstoffs nicht erlauben
oder nicht fördern
können.
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In
letzter Zeit sind Proteinoidmikrokugeln zur Abgabe von pharmazeutischen
Wirkstoffen verwendet worden, vgl. zum Beispiel die
US-Patentschriften Nr. 5,401,516 ,
5,443,841 und Re. 35,862.
Darüber
hinaus sind bestimmte modifizierte Aminosäuren verwendet worden, um pharmazeutische
Wirkstoffe abzugeben, vgl. z. B. die
US-Patentschriften
Nr. 5,629,020 ,
5,643,957 ,
5,766,633 ,
5,776,888 ,
5,863,944 und
5,866,536 .
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WO 96/12473 und
WO 97/36480 beschreiben
modifizierte Aminosäureverbindungen,
die bei der Abgabe von Wirkstoffen verwendbar sind.
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WO 96/12474 beschreibt
Zusammensetzungen und Verfahren zur oralen Abgabe von Antigenen,
worin das Antigen und ein Adjuvans mit einer acylierten Aminosäure oder
Polyaminosäure
und einer sulfonierten Aminosäure
oder Polyaminosäure
oder einem Salz der Vorstehenden kombiniert werden.
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WO 96/12475 beschreibt
modifizierte Aminosäureverbindungen,
die in Verfahren zum Transportieren eines biologisch aktiven Wirkstoffs
durch eine Zellmembran oder eine Lipiddoppelschicht verwendbar sind.
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WO 96/30036 beschreibt
modifizierte Aminosäuren,
die bei der Abgabe von Wirkstoffen verwendbar sind.
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WO 00/07979 beschreibt
Verbindungen in Zusammensetzungen zur Abgabe von aktiven Wirkstoffen, die
auf modifizierten Aminosäureverbindungen
basieren.
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Es
besteht jedoch noch ein Bedürfnis
nach einfachen, billigen Abgabesystemen, die in einfacher Weise
hergestellt werden und die einen breiten Bereich von Wirkstoffen
durch verschiedene Abgabewege abgeben können.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Verbindungen und Zusammensetzungen
bereit, welche die Abgabe von Wirkstoffen erleichtern.
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Verbindungen
zur Wirkstoffabgabe der vorliegenden Erfindung umfassen solche der
allgemeinen Formeln:
und Salze
davon und eine Mischung davon.
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Die
Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit, die wenigstens
eine der Verbindungen zur Wirkstoffabgabe der vorstehend aufgeführten Formeln
und wenigstens einen Wirkstoff umfasst. Diese Zusammensetzungen
geben Wirkstoffe an ausgewählte
biologische Systeme mit erhöhter
oder verbesserter Bioverfügbarkeit
des Wirkstoffs im Vergleich zu der Verabreichung des Wirkstoffs
ohne die Verbindung zur Wirkstoffabgabe ab.
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Ebenfalls
bereitgestellt werden Einheitdosis-Verabreichungsformen, welche
die Zusammensetzungen enthalten. Die Einheitsdosisverabreichung
kann in Form einer Flüssigkeit
oder eines Feststoffs, wie eine Tablette, Kapsel oder Teilchen einschließlich ein
Pulver oder Sachet, vorliegen.
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Eine
andere Ausführungsformen
ist ein Verfahren zum Verabreichen eines Wirkstoffs an ein Tier,
das den Wirkstoff benötigt,
durch Verabreichen einer Zusammensetzung, die wenigstens eine der
vorstehend aufgeführten
Verbindungen zur Wirkstoffabgabe und den Wirkstoff enthält, an das
Tier. Bevorzugte Verabreichungswege umfassen die oralen und intrakolonischen
Wege.
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Eine
noch andere Ausführungsform
ist ein Verfahren zum Behandeln einer Erkrankung oder zum Erreichen
einer erwünschten
physiologischen Wirkung in einem Tier durch Verabreichen der Zusammensetzung der
vorliegenden Erfindung.
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Eine
noch andere Ausführungsform
ist ein Verfahren zum Herstellen einer Zusammensetzung der vorliegenden
Erfindung durch Vermischen wenigstens einer Verbindung zur Wirkstoffabgabe
der vorstehenden Formel und wenigstens eines Wirkstoffs.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Verbindung zur Wirkstoffabgabe
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Die
Verbindung zur Wirkstoffabgabe können
in Form der Carbonsäure
oder Salzen davon vorliegen. Geeignete Salze umfassen, sind aber
nicht beschränkt
auf organische und anorganische Salze, z. B. Alkalimetallsalze,
wie Natrium, Kalium und Lithium, Erdalkalimetallsalze, wie Magnesium,
Calcium oder Barium, Ammoniumsalze, basische Aminosäuren, wie
Lysin oder Arginin, und organische Amine, wie Dimethylamin oder
Pyridin. Bevorzugt sind die Salze Natriumsalze. Die Salze können ein-
oder mehrwertige Salze, wie Mononatriumsalze und Dinatriumsalze,
sein. Die Salze können
auch Solvate einschließlich
Ethanolsolvate und Hydrate sein.
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Salze
der Verbindung zur Wirkstoffabgabe der vorliegenden Erfindung können nach
in der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. So können z.
B. Natriumsalze durch Auflösen
der Verbindung zur Wirkstoffabgabe in Ethanol und Zusetzen von wässrigem
Natriumhydroxid hergestellt werden.
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Zusätzlich können Polyaminosäuren und
Peptide, die ein oder mehrere dieser Verbindungen enthalten, verwendet
werden.
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Eine
Aminosäure
ist eine Carbonsäure
mit wenigstens einer freien Amingruppe und umfasst natürlich vorkommende
und synthetische Aminosäuren.
Polyaminosäuren
sind entweder Peptide (welche zwei oder mehr Aminosäuren sind,
die durch eine Peptidbindung verbunden sind) oder sind zwei oder
mehr Aminosäuren,
die durch eine Bindung verbunden sind, die von anderen Gruppen gebildet
wird, die z. B. durch eine Ester- oder eine Anhydridbindung gebunden
sein können.
Peptide können
in der Länge
von Dipeptiden mit zwei Aminosäuren
bis zu Polypeptiden mit einigen hundert Aminosäuren variieren. Eine oder mehrere
der Aminosäuren oder
Peptid-Einheiten können
acyliert oder sulfoniert sein.
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Die
hierin beschriebenen Verbindungen können von Aminosäuren abgeleitet
sein und können
in einfacher Weise aus Aminosäuren
durch Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind,
auf der Grundlage der vorliegenden Beschreibung und den Verfahren,
die in
WO96/30036 ,
WO97/36480 ,
US 5,643,957 und
US 5,650,386 beschrieben sind. So
können
die Verbindungen z. B. hergestellt werden durch Umsetzen der einzelnen
Aminosäure
mit dem geeigneten Acylierungs- oder Aminmodifizierungsmittel, das
mit einer freien Aminokomponente, die in der Aminosäure vorhanden
ist, unter Bildung von Amiden reagiert. Schutzgruppen können verwendet
werden, um unerwünschte
Nebenreaktionen zu vermeiden, wie dem Fachmann bekannt ist.
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Die
Verbindung zur Wirkstoffabgabe kann durch Kristallisation oder durch
Fraktionierung auf einem oder mehreren festen chromatografischen
Trägern,
allein oder in einem Tandem verbunden, gereinigt werden. Geeignete
Lösemittelsysteme
zur Umkristallisation umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
Acetonitril, Methanol und Tetrahydrofuran.
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Die
Fraktionierung kann auf einem geeigneten chromatografischen Träger, wie
Aluminiumoxid, unter Verwendung von Methanol/n-Propanol-Mischungen
als mobile Phase, als Umkehrphasen-Chromatografie unter Verwendung
von Trifluoressigsäure/Acetonitril-Mischungen als mobile
Phase und als Ionen-Austauschchromatografie unter Verwendung von
Wasser oder eines geeigneten Puffers als mobile Phase durchgeführt werden.
Wenn eine Anionaustauschchromatografie durchgeführt wird, wird bevorzugt ein
0 bis 500 mM Natriumchloridgradient verwendet.
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Wirkstoffe
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Wirkstoffe,
die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind,
umfassen biologisch aktive Wirkstoffe und chemisch aktive Wirkstoffe
einschließlich
aber nicht beschränkt
auf Pestizide, pharmakologische Wirkstoffe und therapeutische Wirkstoffe.
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Biologisch
oder chemisch aktive Wirkstoffe, die zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung geeignet sind, umfassen z. B., sind aber nicht beschränkt auf
Proteine, Polypeptide, Peptide, Hormone, Polysaccharide und insbesondere
Mischungen von Mucopolysacchariden, Kohlehydrate, Lipide, kleine
polare organische Moleküle
(z. B. polare organische Moleküle
mit einem Molekulargewicht von 500 Dalton oder weniger), andere organische
Verbindungen und insbesondere Verbindungen, die selbst nicht durch
die gastrointestinale Mucosa hindurchgehen (oder die nur zu einem
Teil der verabreichten Dosis hindurchgehen) und/oder für eine chemische
Spaltung durch Säuren
und Enzyme in dem Gastrointestinaltrakt empfindlich sind, oder jede
Kombination davon.
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Weitere
Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden, einschließlich synthetische, natürliche oder
rekombinante Quellen davon: Wachstumshormone, einschließlich humane
Wachstumshormone (hGH), rekombinante humane Wachstumshormone (rhGH),
Rinder-Wachstumshormone und Schweine-Wachstumshormone, Wachstumshormon
freisetzende Hormone, Wachstumshormon freisetzender Faktor, Interferone,
einschließlich α, β- und γ-Interleukine,
einschließlich
Interleukin-1 und Interleukin-2, Insulin, einschließlich vom
Schwein, vom Rind, vom Menschen, und humane rekombinante, optional
mit Gegenionen, einschließlich
Zink, Natrium, Calcium und Ammonium, insulinartiger Wachstumsfaktor,
einschließlich
IGF-1, Heparin, einschließlich
unfraktioniertes Heparin, Heparinoide, Dermatane, Chondroitine,
Heparin mit niedrigem Molekulargewicht, Heparin mit sehr niedrigem
Molekulargewicht und Heparin mit ultraniedrigem Molekulargewicht,
Calcitonin, einschließlich
vom Lachs, vom Aal, vom Schwein und vom Menschen, Erythropoietin,
atrialer naturetischer Faktor, Antigene, monoklonale Antikörper, Somatostatin,
Proteaseinhibitoren, Adrenocorticotropin, Gonadotropin freisetzendes
Hormon, Oxytocin, Leutinisierungshormon freisetzendes Hormon, follikelstimulierendes
Hormon, Glucocerebrosidase, Thrombopoietin, Filgrastim, Prostaglandine,
Cyclosporin, Vasopressin, Natriumchromolyn (Natrium- oder Dinatriumchromoglycat),
Vancomycin, Desferrioxamin (DFO), Bisphosphonate, einschließlich Alendronat,
Tiludronat, Etidronat, Clodronat, Pamidronat, Olpadronat und Incadronat,
Parathyroidhormon (PTH), einschließlich seiner Fragmente, antimikrobielle
Substanzen, einschließlich Antibiotika
(einschließlich
grampositiv wirkende, bakteriozide, lipopeptidale und cyclische
peptidale Antibiotika und Daptomycin), antibakterielle und antifungische
Wirkstoffe, Vitamine, Analoge, Fragmente, Mimetika oder polyethylenglycol(PEG)-modifizierte Derivate
dieser Verbindungen oder jede Kombination davon.
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Abgabesysteme
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Die
Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst eine oder mehrere
Verbindungen zur Wirkstoffabgabe der vorliegenden Erfindung und
einen oder mehrere Wirkstoffe. In einer Ausführungsform können eine
oder mehrere der Verbindungen zur Wirkstoffabgabe oder Salze dieser
Verbindungen oder Polyaminosäuren
oder Peptide, von welchen diese Verbindungen oder Salze eine oder
mehrere der Einheiten davon bilden, als Verbindung zur Wirkstoffabgabe
verwendet werden durch Vermischen mit dem Wirkstoff vor der Verabreichung
zur Bildung einer Verabreichungszusammensetzung.
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Die
Verabreichungszusammensetzungen können in Form einer Flüssigkeit
vorliegen. Das Lösungsmedium
kann Wasser (z. B. für
Lachs-Calcitonin, Parathyroidhormon und Erythropoietin) 25-%iges
wässriges Propylenglycol
(z. B. für
Heparin) und Phosphatpuffer (z. B. für rhGH) sein. Andere Dosiervehikel
umfassen Polyethylenglycol. Dosierlösungen können durch Vermischen einer
Lösung
der Verbindung zur Wirkstoffabgabe mit einer Lösung des Wirkstoffs unmittelbar
vor der Verabreichung hergestellt werden. Alternativ kann eine Lösung der
Verbindung zur Wirkstoffabgabe (oder des Wirkstoffs) mit der festen
Form des Wirkstoffs (oder der Verbindung zur Wirkstoffabgabe) vermischt
werden. Die Verbindung zur Wirkstoffabgabe und der Wirkstoff können auch
als trockene Pulver vermischt werden. Die Verbindung zur Wirkstoffabgabe
und der Wirkstoff können
auch während
des Herstellungsverfahrens vermischt werden.
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Die
Dosierlösungen
können
optional Zusätze,
wie Phosphatpuffersalze, Citronensäure, Glycole oder andere Dispergiermittel,
enthalten. Stabilisierende Zusätze
können
in die Lösung
eingearbeitet werden, bevorzugt in einer Konzentration in dem Bereich
zwischen etwa 0,1 und 20% (Gewicht/Volumen).
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Die
Verabreichungszusammensetzungen können alternativ in Form eines
Feststoffs, wie eine Tablette, eine Kapsel oder ein Teilchen, wie
ein Pulver oder Sachet, vorliegen. Feste Dosierformen können durch Vermischen
der festen Form der Verbindung mit der festen Form des Wirkstoffs
hergestellt werden. Alternativ kann ein Feststoff aus einer Lösung einer
Verbindung und des Wirkstoffs durch in der Technik bekannte Verfahren
erhalten werden, wie Gefriertrocknen (Lyophilisierung), Ausfällung, Kristallisation
und feste Dispersion.
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Die
Verabreichungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch
einen oder mehrere Enzyminhibitoren enthalten. Solche Enzyminhibitoren
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Verbindungen, wie Actinonin oder Epiactinonin und Derivate davon.
Andere Enzyminhibitoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
Aprotinin (Trasylol) und Bowman-Birk-Inhibitor.
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Die
Menge des Wirkstoffs, der in einer Verabreichungszusammensetzung
der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist eine Menge, die wirksam
ist, um den Zweck des besonderen Wirkstoffs für die Zielindikation zu erfüllen. Die
Menge von Wirkstoff in den Zusammensetzungen ist typischerweise
eine pharmakologisch, biologisch, therapeutisch oder chemisch wirksame
Menge. Die Menge kann jedoch kleiner sein als die Menge, wenn die
Zusammensetzung in einer Einheitsdosis-Verabreichungsform verwendet
wird, da die Einheitsdosis-Verabreichungsform eine Mehrzahl von
Verbindungen zur Wirkstoffabgabe/aktiven Wirkstoffzusammensetzungen
oder eine aufgeteilte, pharmakologisch, biologisch, therapeutisch
oder chemisch wirksame Menge enthalten kann. Die gesamte wirksame
Menge kann dann in kumulativen Einheiten, die insgesamt eine wirksame
Menge des Wirkstoffs enthalten, verabreicht werden.
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Die
Gesamtmenge des zu verwendenden Wirkstoffs kann nach Verfahren,
die dem Fachmann bekannt sind, bestimmt werden. Da die Zusammensetzungen
der Erfindung Wirkstoffe wirksamer abgeben können als Zusammensetzungen,
die den Wirkstoff allein enthalten, können jedoch geringere Mengen
von biologisch oder chemisch aktiven Wirkstoffen als solche, die
in früheren
Einheitsdosis-Verabreichungsformen oder Abgabesystemen verwendet
wurden, an den Patienten verabreicht werden, wobei noch die gleichen
Konzentrationen im Blut und/oder die gleichen therapeutischen Wirkungen
erreicht werden.
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Die
vorliegend beschriebenen Verbindungen zur Wirkstoffabgabe erleichtern
sowohl die Abgabe von biologisch und chemisch wirksamen Wirkstoffen,
insbesondere in oralen, intranasalen, sublingualen, intraduodenalen,
subkutanen, buccalen, intrakolonischen, rektalen, vagnialen, mukosalen,
pulmonaren, transdermalen, intradermalen, parenteralen, intravenösen, intramuskulären und
okularen Systemen als auch das Überwinden
der Blut-Hirn-Schranke.
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Einheitsdosis-Verabreichungsformen
können
auch jede Form oder Kombination von Exzipienzien, Verdünnungsmitteln,
Sprengmitteln, Gleitmitteln, Weichmachern, Färbemitteln, Aromastoffen, Geschmacksmarkierungsmitteln,
Zuckern, Süßungsmitteln,
Salzen oder Dosierungsvehikeln enthalten, einschließlich aber nicht
beschränkt
auf Wasser, 1,2-Propandiol,
Ethanol, Olivenöl
oder jede Kombination davon.
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Die
Verbindungen und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindungen
sind verwendbar zum Verabreichen von biologisch und chemisch aktiven
Wirkstoffen an irgendwelche Tiere, einschließlich aber nicht beschränkt auf
Vögel,
Hühner,
Säuger
wie Nager, Kühe,
Schweine, Hunde, Katzen, Primaten und insbesondere Menschen, und
Insekten.
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Das
System ist besonders vorteilhaft zur Abgabe von chemisch oder biologisch
aktiven Wirkstoffen, die sonst durch Bedingungen, die auftreten,
bevor der Wirkstoff seinen Zielbereich erreicht (d. h. der Bereich, in
welchem der Wirkstoff der Abgabezusammensetzung freizusetzen ist)
und in dem Körper
des Tieres, an welches sie zu verabreichen sind, zerstört oder
weniger wirksam gemacht werden. Insbesondere sind die Verbindungen
und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendbar bei
der oralen Verabreichung von Wirkstoffen, insbesondere solche, die
gewöhnlich
nicht oral verabreichbar sind, oder solche, für welche eine verbesserte Verabreichung
erwünscht
ist.
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Die
Zusammensetzungen, welche die Verbindungen und Wirkstoffe enthalten,
finden Verwendung bei der Verabreichung von Wirkstoffen auf ausgewählte biologische
Systeme und in einer erhöhten
oder verbesserten Bioverfügbarkeit
des Wirkstoffs im Vergleich mit der Verabreichung des Wirkstoffs
ohne das Abgabemittel. Die Abgabe kann ver bessert werden durch Abgeben
von mehr Wirkstoff über
einen Zeitraum oder durch Abgeben des Wirkstoffs in einem besonderen
Zeitraum (derart, dass eine schnellere oder verzögerte Abgabe bewirkt wird)
und über
einen Zeitraum (wie eine verzögerte
Abgabe).
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Eine
andere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung oder
Verhinderung einer Erkrankung oder zum Erreichen einer erwünschten
physiologischen Wirkung, wie solche, die in der nachstehenden Tabelle
aufgeführt
sind, in einem Tier durch Verabreichen der Zusammensetzung der vorliegenden
Erfindung. Spezielle Indikationen für Wirkstoffe finden sich in
(Physician's Desk
Reference) (54. Auflage, 2000, Medical Economics Company, Inc. Montvale,
NJ), was hierin durch Bezug eingeschlossen ist. Die Wirkstoffe in
der nachstehenden Tabelle umfassen ihre Analogen, Fragmente, und
mit Polyethylenglycol modifizierten Derivate.
| Wirkstoff | Erkrankung
und physiologische Wirkung |
| Wachstumshormone | Wachstumsstörungen |
| Interferone | virale
Infektion, chronischer Krebs und multiple Sklerose |
| Interleukine | virale
Infektion, Krebs |
| Insulin,
insulinartiger Wachstumsfaktor | Diabetes |
| Heparin | Thrombose,
Verhinderung von Blutkoagulation |
| Calcitonin | Osteoporose,
Erkrankungen des Knochens |
| Erythropoietin | Anämie |
| Atrialer
naturetischer Faktor | Gefäßerweiterung |
| Antigene | Infektion |
| Monoklonale
Antikörper | Verhinderung
von Transplantatabstoßung,
Krebs |
| Somatostatin | blutendes
Geschwür,
erosive Gastritis |
| Proteaseinhibitoren | Aids |
| Adrenocorticotropin | hoher
Cholesteringehalt
(um Cholesterin zu erniedrigen) |
| Gonadotropin
freisetzendes Hormon | ovulatorische
Funktionsstörung
(um die Ovulation zu stimulieren) |
| Oxytocin | Wehenfunktionsstörung
(um
Kontraktionen zu stimulieren) |
| Leutinisierendes
Hormon freisetzendes Hormon, follikelstimulierendes Hormon | Regulieren
der reproduktiven Funktion |
| Glucocerebrosidase | Gaucher-Erkrankung
(um
Lipoprotein zu metabolisieren) |
| Thrombopoietin | Thrombocytopenie |
| Filgrastim | Verringerung
der Infektion bei Chemotherapie-Patienten |
| Prostaglandine | Bluthochdruck |
| Cyclosporin | Transplantatabstoßung |
| Vasopressin | Bettnässen, antidiuretisch |
| Cromolyn-Natrium,
Vancomycin | Asthma,
Allergien |
| Desferrioxamine
(DFO) | Eisenüberladung |
| Parathyroidhormon | Osteoporose |
| | Erkrankungen
des Knochens |
| antimikrobielle
Mittel | Infektion,
einschließlich
gram-positive bakterielle Infektion |
| Vitamine | Vitaminmangelerscheinungen |
| Bisphosphonate | Osteoporose,
Paget
Erkrankung, hemmt Osteoklasten |
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So
ist z. B. eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Behandeln eines Patienten,
der an Diabetes leidet oder dafür
empfänglich
ist, durch Verabreichen von Insulin und wenigstens einer der Verbindungen
zur Wirkstoffabgabe der vorliegenden Erfindung.
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Nach
der Verabreichung wird der Wirkstoff, der in der Zusammensetzung
oder der Einheitsdosis-Verabreichungsform vorhanden ist, in den
Kreislauf aufgenommen. Die Bioverfügbarkeit des Wirkstoffs wird
in einfacher Weise bestimmt durch Messen einer bekannten pharmakologischen
Aktivität
im Blut, z. B. ein Anstieg der durch Heparin hervorgerufenen Blutgerinnungszeit
oder ein Abfall der durch Calcitonin hervorgerufenen Calciumkonzentrationen
im Kreislauf. Alternativ können
die Kreislaufwerte des Wirkstoffs selbst direkt gemessen werden,
z. B. Insulinkonzentrationen im Serum.
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BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
folgenden Beispiele erläutern
die Erfindung ohne Beschränkung.
Sämtliche
Teile beziehen sich auf das Gewicht, falls nicht anders angegeben.
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Die
kernmagnetischen Proton-Resonanz-Analysen (1H-NMR)
für die
nachstehend aufgeführten
Verbindungen wurden mit einem 300 MHz Bruker-Spektrometer unter
Verwen dung von Dimethylsulfoxid (DMSO-d6 als
Lösemittel
durchgeführt,
falls nicht anders angegeben.
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Beispiel 1 – Verbindungsherstellung
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Herstellung der Verbindung 1
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5-Methoxysalicylsäure (30,0
g, 0,1786 mol) und Methylenchlorid (350 ml) wurden in einen 1 Liter-Rundkolben
eingebracht, der mit einer Argonspülung und einem magnetischen
Rührstab
ausgerüstet
war. Die erhaltende gelb-braune Reaktionsmischung wurde in einem
Eis-Wasser-Bad auf 0°C
abgekühlt.
Triethylamin (39,68 g, 0,3929 mol) wurde in einer Portion zugesetzt,
gefolgt von einer tropfenweisen Zugabe von Acetylchlorid (15,42
g, 0,1964 mol) über
eine Zeit von 35 Minuten. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht
auf Raumtemperatur erwärmen
gelassen, und dann wurden 350 ml Methylenchlorid zugesetzt. Die
Mischung wurde mit 300 ml-Portionen von 0,5 HCl und dann mit zwei
300 ml-Portionen Wasser gewaschen. An diesem Punkt wurde festgestellt,
dass ein gelb-brauner Feststoff ausgefallen war. Dieser Feststoff
wurde durch Filtration isoliert, aus Methylenchlorid umkristallisiert
und unter vermindertem Druck getrocknet. Es wurden 26,24 g 5-Methoxyacetylsalicylsäure isoliert.
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Die
vorstehend hergestellte 5-Methoxyacetylsäure (26,24 g, 0,1250 mol) wurde
in einen 500 ml-Rundkolben eingebracht, der mit einer Argonspülung und
einem magnetischen Rührstab
ausgerüstet
war. Dann wurden Methylenchlorid (125 ml) und einige Tropfen Dimethylformamid
zugesetzt. Ein 60 ml-Zugabetrichter wurde am oberen Ende des Kolbens
angebracht, und Thionylchlorid (22,30 g, 0,1874 mol) wurde tropfenweise während einer
Zeit von 25 Minuten zugesetzt. Der Zugabetrichter wurde durch einen
Kühler
ersetzt, und die Reaktionsmischung wurde etwa 1 Stunde unter Rückfluss
erwärmt.
Das Erwärmen
wurde beendet, und die Mischung wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Überschüssiges Thionylchlorid
und Methylenchlorid wurden unter vermindertem Druck entfernt unter
Erhalt von 29,00 g 5-Methoxyacetylsalicyloylchlorid.
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Eine
Mischung von 8-Aminocaprylsäure
(23,89 g, 0,1503 mol) in Methylenchlorid (375 ml) wurde mit Chlortrimethylsilan
(32,76 g, 0,3005 mol) behandelt und 90 Minuten unter Rückfluss
erwärmt.
Die Reaktionsmischung wurde auf 0°C
abgekühlt
und dann mit Triethylamin (22,76 g, 0,2254 mol) behandelt. Nachdem
diese Mischung etwa 5 Minuten gerührt war, wurde eine Lösung von
5-Methoxyacetylsalicyloylchlorid (29,00 g, 0,1503 mol) in Methylenchlorid
(50 ml) tropfenweise zu der Reaktionsmischung während einer Zeit von 35 Minuten
zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei 0°C und dann
18 h bei 25°C
rühren
gelassen. Methylenchlorid wurde unter vermindertem Druck entfernt,
und eine 2 N NaOH-Lösung
(200 ml) wurde zu dem Rückstand
zugesetzt. Diese Mischung wurde 1 h rühren gelassen, bevor die Mischung
auf pH = 1 mit einer Schwefelsäurelösung (1
N) angesäuert
wurde. Die erhaltene Mischung wurde zweimal mit 200 ml Portionen Ethylacetat
extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatschichten wurden mit Natriumsulfat
getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert. Der erhaltene
gelb-braune Feststoff wurde aus einer Ethanol:Wasser-Lösung im
Verhältnis
1:1 umkristallisiert unter Erhalt von 30,70 g als weißer Feststoff,
Schmelzpunkt = 96–99°C.
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Herstellung des Natriumsalzes der Verbindung
2
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In
einem 250 ml-Dreihalsrundkolben wurden 9,0 g (131 mmol) Natriumnitrat,
15,0 g (14 mmol) 10-Bromdecylphthalimid und 150 ml DMSO eingebracht.
Die Reaktionsmischung wurde etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, zu
welcher Zeit 24,36 ml (426 mmol) Eisessig während 10 Minuten tropfenweise
zugesetzt wurden. Die Reaktionsmischung wurde gerührt und
etwa 2 h auf 65°C
erwärmt,
dann auf Raumtemperatur abgekühlt
und über
Nacht gerührt.
Die Reaktionsmischung wurde in 200 ml Ethylacetat gegossen. Die organische
Phase wurde mit zwei 100 ml-Portionen 0,5 N wässriger Schwefelsäure gewaschen
und dann mit zwei 100 ml-Portionen 2 NaOH extrahiert. Die wässrige Phase
wurde auf 0°C
abgekühlt
und dann mit 2 N HCl auf pH = 4 angesäuert. Der erhaltene Feststoff
wurde durch Filtration gesammelt und aus Ethanol:Aceton:Wasser (etwa
1:1:1) umkristallisiert.
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In
einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben wurden 6,46 g (19,3 mmol) des vorstehend
erhaltenen Feststoffs eingebracht. Der Feststoff wurde in 120 ml
heißem
Ethanol aufgelöst,
und die erhaltene Lösung
wurde durch ein Celitkissen filtriert. Zu dem Filtrat wurden 2,27
ml 8,5 N NaOH (19,6 mmol) zugesetzt, und die erhaltene Mischung
wurde 1 Stunde gerührt.
Die Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck auf etwa die
Hälfte
des ursprünglichen
Volumens konzentriert, mit 200 ml Heptan verdünnt, und der erhaltene Feststoff
wurde durch Filtration gesammelt. Der Feststoff wurde in einen 500
ml-Erlenmeyer-Kolben eingebracht, in 120 ml heißem Ethanol gelöst, und
die erhaltene Lösung
wurde durch ein Celitkissen filtriert. Zu dem Filtrat wurden 2,11 ml
8,5 NaOH (18 mmol) zugesetzt, und die erhaltene Mischung wurde eine
Stunde gerührt.
Hexane wurden zugesetzt, und der erhaltene Feststoff wurde durch
Filtration gesammelt und unter vermindertem Druck über Nacht
getrocknet unter Erhalt von 9,53 (91%) des Produkts als Natriumsalz.
Schmelzpunkt: 180–200°C. Verbrennungsanalyse:
%C: 56,06 (berechnet), 55,84 (gefunden); %H: 6,16 (berechnet), 6,11
(gefunden); %N: 3,63 (berechnet), 3,49 (gefunden); %Na: 11,94 (berechnet),
11,40 (gefunden). 1H-NMR-Analyse (d6-DMSO); δ 11,1,
t, 1H (NH); δ 7,7
dd, 1H (H ortho COONa); δ 7,38-7,18,
m, 3H (verbleibender aromatischer H); ü 3,16, q, 2H (CH2 α zu Amid); ül. 89, t,
2H (CH2 α zu
COONa); ü 1,43,
m, 4H (CH2 β zu Amid, CH2 β zu COONa); ü 1,43, m,
6H (verbleibendes aliphatisches CH2).
-
Herstellung der Verbindung 3
-
Eine
Aufschlämmung
von 11-Aminoundecansäure
(5,00 g, 25 mmol) in Methylenchlorid (25 ml) wurde mit Chlortrimethylsilan
(6,35 ml, 5,43 g, 50 mmol) behandelt und 90 Minuten unter Rückfluss
erwärmt.
Die Reaktionsmischung wurde auf 0°C
abgekühlt
und wurde dann mit Triethylamin (5,23 ml, 3,79 g, 37,5 mmol) behandelt.
Nachdem diese Mischung etwa 5 Minuten gerührt war, wurde eine Lösung von
o-Anisoylchlorid (3,72 ml, 4,27 g, 25 mmol) in Methylenchlorid (10
ml) tropfenweise zu der Reaktionsmischung während einer Zeit von 15 Minuten
zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei 0°C und dann
18 Stunden bei 25°C rühren gelassen.
Methylenchlorid wurde unter vermindertem Druck entfernt, und 100
ml gesättigte NaHCO3-Lösung
wurde zu dem Rückstand
zugesetzt. Diese Mischung wurde 1 h rühren gelassen, bevor die Mischung
mit Chlorwasserstoffsäurelösung (1
N) auf pH = 1 angesäuert
wurde. Der erhaltene weiße
Feststoff wurde abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet.
Der erhaltene weiße
Feststoff wurde mit Ethylacetat und Wasser im Verhältnis 1/1
gewaschen. Die unlöslichen
Anteile und das konzentrierte Ethylacetat wurden vereinigt und 24
h bei 25°C
unter vermindertem Druck getrocknet. Die Ausbeute des Produkts betrug
6,24 g (76,6%), Schmelzpunkt = 88,5–91°C.
-
Herstellung der Verbindung 4
-
Essigsäureanhydrid
(7,10 ml, 7,69 g, 75,0 mmol, 1,04 Äq), 3,5-Dichlorsalicylsäure (15,0
g, 72,5 mmol, 1,00 Äq)
und Xylole (40 ml) wurden in einen 250 ml-Dreihalskolben eingebracht,
der mit einem magnetischen Rührstab,
einem Thermometer und einer Dean-Stark-Falle
mit Kühler
ausgerüstet
war. Der Kolben wurde in einen Heizmantel verbracht, und die Erwärmung der
molkigen weißen
Mischung begann. Die Reaktionsmischung wurde eine klare Lösung bei
etwa 100°C.
Die meisten der flüchtigen
organischen Bestandteile (Xylole und Essigsäure) wurden während drei
Stunden (135–146°C) in die
Dean-Stark-Falle
destilliert. Die Destillation wurde eine weitere Stunde fortgesetzt
(insgesamt destillierten 50 ml), während welcher Zeit die Kolbentemperatur
langsam auf 165°C
anstieg und das Destillat sich bis zum Tröpfeln verlangsamte. Der Rückstand
wurde in noch heißem
Zustand in eine Aluminiumschale gegossen. Nach dem Abkühlen war
ein brüchiges
gelbes Glas gebildet. Der Feststoff wurde zu einem feinen Pulver
zerrieben. Das hergestellte Oligo(3,5-dichlorsalicylat) wurde ohne weitere
Reinigung verwendet.
-
Eine
Aufschlämmung
von 3,0 g (16,0 mmol, 1,1 Äq)
10-Aminodecansäure,
9 ml (18,0 mmol, 1,13 Äq) 2
N wässrigem
Natriumhydroxid und 30 ml Dioxan wurde zu einer weißen Aufschlämmung von
3,97 g (20,8 mmol, 1,3 Äq)
Oligo(3,5-dichlorsalicylat) und 30 ml Dioxan in einem 250 ml-Rundkolben
eingebracht, der mit einem magnetischen Rührstab und einem Rückflusskühler ausgerüstet war.
Die Reaktionsmischung wurde 20 h auf 90°C erwärmt (zu welcher Zeit keine
weitere Änderung
durch HPLC beobachtet wurde). Die Reaktionsmischung wurde auf 25°C abgekühlt und
mit 2 N wässriger
Chlorwasserstoffsäure
auf pH = 1 angesäuert.
Die Mischung wurde unter vermindertem Druck (60°C, 50 mm) konzentriert. Der
erhaltene Feststoff wurde aus Ethanol-Wasser umkristallisiert, mit
Aktivkohle entfärbt,
war aber noch nicht rein. Eine Säulenchromatografie unter
Verwendung von Hexanen/Ethylacetat-1% Essigsäure im Verhältnis 5:1 als Eluiermittel
ergab eine Fraktion als Säure
und eine andere als Ethylester. Der Ethylester wurde unter Verwendung
von 4 ml 2 N wässrigem Natriumhydroxid
zu der Säure
hydrolysiert und mit 2 N wässriger
Chlorwasserstoffsäure
angesäuert.
Die Säure wurde
durch Filtration isoliert. Die vereinigten Säureteile wurden mit Methylenchlorid
und Hexanen angerieben und ergaben 1,22 g N-(3,5-Dichlorsalicyloyl)-10-aminodecansäure.
-
Herstellung des Natriumsalzes der Verbindung
5
-
Schwefelsäure (14,5
ml) wurde langsam zu einer Lösung
von 3-Fluor-4-nitrotoluol (10,0 g, 64 mmol) in Essigsäure (75
ml) bei 5°C
zugesetzt. Chromtrioxid (17,92 g, 180 mmol) wurde langsam während 1
Stunde zugesetzt. Die Reaktion wurde unter 10°C für weitere 2 Stunden gehalten
und dann in Eiswasser (700 ml) gegossen, und der erhaltene gelbe
Feststoff wurde abfiltriert. Der Feststoff wurde in 2% NaHCO3 15 Minuten gerührt, filtriert, unter verwendetem
Druck getrocknet, dann 15 Minuten unter Rückfluss in einer Lösung von
Wasser (60 ml), konzentrierter HCl (40 ml) und Ethanol (11 ml) erwärmt. Der
gelbe Feststoff wurde durch Filtration isoliert. 3,16 g 4-Nitro-2-fluorbenzaldehyd
(29,2% Ausbeute).
-
Eine
Suspension von 4-Nitro-2-fluorbenzaldehyd (3,16 g, 18,7 mmol), Malonsäure (2,14
g, 21 mmol), Pyridin (katalytische Menge) und Ethanol (10 ml) wurde
6 Stunden unter Rückfluss
erwärmt.
Die Suspension wurde eine klare Lösung beim Erwärmen. Beim
Abkühlen
auf Raumtemperatur fiel Feststoff aus und wurde durch Filtration
getrocknet. Der Feststoff wurde mit kaltem Ethanol (15°C) und dann
mit 1 N HCl gewaschen und getrocknet und ergab 3,32 g 4-Nitro-2-fluorzimtsäure (90%
Ausbeute).
-
4-Nitro-2-fluorzimtsäure (3,32
g, 17 mmol) wurde in Ethylacetat (50 ml) und Ethanol (10 ml) in
dem Reaktionskolben eines PAR-Reaktors aufgelöst. Pd/C (100 mg) wurde zugesetzt,
und der Reaktor wurde mit 100 psi Wasserstoff beaufschlagt. Der
Reaktor wurde nach 3 Stunden wieder auf 100 psi beaufschlagt, und
die Reaktionsmischung wurde über
Nacht gerührt.
Die Reaktionsmischung wurde durch ein Celitbett filtriert und das Produkt
wurde unter vermindertem Druck isoliert, 2,53 g 3-(4-Amino-2-fluorphenyl)propionsäure (81,2%).
-
Eine
Aufschlämmung
von 3-(4-Amino-2-fluorphenyl)propionsäure (2,53 g, 13,8 mmol) in
Methylenchlorid (100 ml) wurde mit Chlortrimethylsilan (3,50 ml,
2,99 g, 27,6 mmol) behandelt und wurde 2,25 Stunden unter Rückfluss
erwärmt.
Die Reaktionsmischung wurde auf 0°C
abgekühlt
und wurde dann mit Triethylamin (5,77 ml, 4,19 g, 41,4 mmol) behandelt.
Nachdem diese Mischung etwa 20 Minuten gerührt war, wurde eine Lösung von
Acetylsalicyloylchlorid (2,74 g, 13,8 mmol) in Methylenchlorid (20
ml) tropfenweise zu der Reaktionsmischung während einer Zeit von 15 Minuten
zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei 0°C und dann
18 Stunden bei 25°C
rühren
gelassen. Methylenchlorid wurde unter vermindertem Druck entfernt, und
100 ml NaOH-Lösung
(2 N) wurde zu dem Rückstand
zugesetzt und 1 Stunde gerührt,
bevor die Mischung mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäurelösung auf
pH = 1 angesäuert
wurde. Der erhaltene Feststoff wurde aus einer Ethanol/Wasser-Mischung
im Verhältnis
1/1 umkristallisiert und ergab einen weißen Feststoff, der unter vermindertem
Druck bei 25°C
getrocknet wurde und 1,88 g, 43,7% ergab. Der Feststoff wurde in
Ethanol (10 ml) unter Erwärmen
aufgelöst.
Eine Lösung
von NaOH (0,25 g NaOH in 0,75 ml Wasser) wurde zu der warmen Ethanollösung zugesetzt.
Das Volumen wurde unter vermindertem Druck auf die Hälfte reduziert.
Das Konzentrat wurde in Heptan bei 0°C gerührt und dann unter vermindertem
Druck konzentriert und ergab 1,8 g Natrium-3-(4-salicyloylamino-3-fluorphenyl)propionat
als gelbbraunen Feststoff (82% Ausbeute).
-
Herstellung des Natriumsalzes der Verbindung
6
-
Eine
Mischung von O-Acetyl(5-fluor-3-methylsalicylsäure) (2,05 g, 9,8 mmol) und
SOCl2 (0,8 ml, 10,97 mmol) in 12 ml Methylenchlorid
wurde 3 Stunden unter Rückfluss
erwärmt.
Die Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert
und dann in THF (10 ml) aufgelöst.
Die Säurechloridlösung wurde
dann tropfenweise zu einer gekühlten, gerührten Mischung
von (3-(4-Aminophenyl)propionsäure
(1,63 g, 9,87 mmol) in THF (35 ml) und NaOH (0,81 g, 20,2 mmol)
in H2O (16,2 ml) zugesetzt. Die erhaltene
Mischung wurde bei 0°C
und dann 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Wässrige NaOH-Lösung (2,0
N, 20 ml) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde 0,5 Stunden gerührt. Die
Mischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert, und der erhaltene
Rückstand
wurde angesäuert.
Der erhaltene Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, gründlich mit
Wasser gewaschen und aus Methanol/Aceton/Wasser umkristallisiert.
Ein heller gelbbrauner Feststoff (freie Säure der Verbindung) wurde isoliert
(12,1 g, 68%), Schmelzpunkt 165–166°C.
-
Eine
Lösung
des freien Säurederivats
der Verbindung (2,1 g, 6,62 mmol) in Ethanol (20 ml) wurde tropfenweise
zu einer Lösung
von NaHCO3, (0,59 g, 7,02 mmol) in H2O (5 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde 0,5 h
gerührt
und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand
wurde in Aceton aufgelöst.
Ethylacetat wurde zugesetzt, bis die Mischung wolkig wurde. Die
Mischung wurde über
Nacht im Kühlschrank
aufbewahrt. Es bildeten sich Kristalle und wurden abfiltriert und
getrocknet unter Erhalt von 2,2 g (98%) Produkt als Natriumsalz,
Schmelzpunkt 240°C
unter Zersetzung; 1H-NMR (DMSO) δ 2,05 (s,
3H), 2,46 (t, 2H), 2,76 (t, 2H), 6,86 (dd, 1H), 7,12 (d, 2H) 7,31
(dd, 1H) 7,58 (d, 2H).
-
Herstellung des Natriumsalzes der Verbindung
7
-
In
einen 250 ml-Rundkolben wurden 10 g (61 mmol) Isatosäureanhydrid,
10,1 g (61 mmol) 3-(4-Aminophenyl)propionsäure, 75 ml 1,4-Dioxan und 15
ml Wasser eingebracht. Die Reaktionsmischung wurde gerührt und
etwa 7 Stunden unter Rückfluss
erwärmt,
dann auf Raumtemperatur abgekühlt
und über
Nacht gerührt.
Die Reaktionsmischung wurde auf 0°C
abgekühlt
und dann mit 50 ml Wasser verdünnt.
Der erhaltene Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, über Nacht
in einem Vakuumofen getrocknet und wie er war in der nächsten Reaktion
verwendet.
-
In
einen Rundkolben wurden 3,0 g (11 mmol) des vorstehend erhaltenen
Feststoffs eingebracht. Dieser wurde auf 0°C abgekühlt. Getrennt wurde ein Essigsäure-Ameisensäure-Anhydrid-Komplex
auf die folgende Weise hergestellt: Essigsäureanhydrid (1,0 ml) wurde
auf 0°C
abgekühlt.
Dazu wurden 0,5 ml eiskalte Ameisensäure zugesetzt. Die erhaltene
Mischung wurde eine Stunde bei 0°C
gerührt,
zu welcher Zeit Methylenchlorid zugesetzt wurde. Der kalte Essigsäure-Ameisensäure-Anhydrid-Komplex
wurde zu dem in der ersten Reaktion erhaltenen kalten Feststoff
zugesetzt. Die erhaltene Mischung wurde 2 bis 3 Stunden bei 0°C gerührt, dann
nach und nach auf Raumtemperatur erwärmt und 3 Tage gerührt. 2 N
HCl wurde zu der Reaktionsmischung zugesetzt, die dann einen gummi artigen
Feststoff bildete. Ethylacetat wurde dann zugesetzt, wobei sich
eine Emulsion bildete, die durch einen Scheidetrichter filtriert
wurde. Der Feststoff wurde isoliert und aus Ethanol:Aceton:Wasser
(im Verhältnis
von etwa 1:1:1) umkristallisiert unter Erhalt der freien Säure (Schmelzpunkt
200–204°C).
-
In
einen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben wurden 1,21 g (2,9 mmol) des vorstehend
erhaltenen Feststoffs eingebracht. Der Feststoff wurde in 100 ml
heißem
Ethanol aufgelöst,
und die erhaltene Lösung
wurde durch ein Celitkissen filtriert. Zu dem Filtrat wurden 0,47
ml 8,5 N NaOH (4,0 mmol) zugesetzt, und die erhaltene Mischung wurde
30 Minuten gerührt.
Die Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck auf etwa die
Hälfte
des ursprünglichen
Volumens konzentriert, mit 30 bis 50 ml Heptan verdünnt, und
der erhaltene Feststoff wurde durch Filtration gesammelt. Der Feststoff
wurde unter vermindertem Druck über
Nacht getrocknet und ergab 1,05 g (79%) Produkt als Natriumsalz.
Schmelzpunkt: > 260°C (es wurde
die obere Grenze des Instruments verwendet). Verbrennungsanalyse:
%C: 60,12 (berechnet), 161,70 (gefunden); %H: 4,85 (berechnet), 4,64
(gefunden); %N: 8,25 (berechnet), 8,20 (gefunden); %Na: 6,77 (berechnet),
5,78 (gefunden).
-
Herstellung der Verbindung 8
-
Eine
Mischung von O-Acetyl-5-methoxysalicylsäure (2,47 g, 12,5 mmol) und
SOCl2 (2,0 ml, 27,4 mmol) in 15 ml Methylenchlorid
wurde vier Stunden unter Rückfluss
erwärmt.
Die Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert
und dann in THF (15 ml) aufgelöst.
Die Säurechloridlösung wurde
dann tropfenweise zu einer gekühlten,
gerührten
Mischung von 3-(4-Aminophenyl)propionsäure (2,06 g, 12,47 mmol) in
THF (50 ml) und NaOH (1,03 g, 25,75 mmol) in H2O
(20,0 ml) zugesetzt. Die erhaltene Mischung wurde bei 0°C und dann
18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Wässrige NaOH-Lösung (2,0
N, 20 ml) wurden zugesetzt, und die Mischung wurde 0,5 Stunden gerührt. Die
Mischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert, und der erhaltene
Rückstand
wurde angesäuert.
Der erhaltene Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, gründlich mit
Wasser gewaschen und aus Methanol/Aceton/Wasser umkristallisiert
unter Erhalt des Produkts als schwach gelber Feststoff (2,0 g, 51%),
Schmelzpunkt 216–218°C.
-
Herstellung der Verbindung 9
-
Eine
Mischung von O-Acetyl-5-methoxysalicylsäure (2,20 g, 11,10 mmol) und
SOCl2 (2,0 ml, 27,4 mmol) in 10 ml Methylenchlorid
wurde 3 Stunden unter Rückfluss
erwärmt.
Die Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert
und dann in THF (10 ml) aufgelöst.
Die Säurechloridlösung wurde
dann tropfenweise zu einer gekühlten,
gerührten
Mischung von 4-(4-Aminophenyl)butansäure (2,00 g, 11,16 mmol) in
THF (50 ml) und NaOH (0,93 g, 23,25 mmol) in H2O
(19,0 ml) zugesetzt. Die erhaltene Mischung wurde bei 0°C und dann
18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Wässrige NaOH-Lösung (2,0
N, 20 ml) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde 0,5 Stunden gerührt. Die
Mischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert, und der erhaltene
Rückstand
wurde angesäuert.
Der erhaltene Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, gründlich mit
Wasser gewaschen und aus Methanol/Aceton/H2O
umkristallisiert unter Erhalt des Produkts als orangefarbener Feststoff
(2,3 g, 63%), Schmelzpunkt 189–190°C.
-
Herstellung der Verbindung 10
-
Zu
einer Aufschlämmung
von 3,68 g (22,3 mmol) 3-(4-Aminophenyl)propionsäure in 30 ml Methylenchlorid
wurden 5,66 ml Chlortrimethylsilan (44,6 mmol) tropfenweise mit
einer Spritze zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde etwa 3 Stunden
unter Rückfluss
erwärmt
und dann auf 0°C
abgekühlt.
Triethylamin (9,32 ml, 66,9 mmol) wurde tropfenweise zu der kalten
Reaktionsmischung zugesetzt und etwa 15 Minuten gerührt. Eine
Aufschlämmung
von 5,0 g (22,3 mmol) Diphensäureanhydrid
in 30 ml Methylenchlorid wurde tropfenweise zu der kalten Reaktionsmischung
zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei 0°C und dann über Nacht
bei Raumtemperatur rühren
gelassen. Die organische Phase wurde zweimal mit 2 N HCl, einmal mit
Wasser und einmal mit Kochsalzlösung
gewaschen, dann über
Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert.
Der erhaltene weißliche
Feststoff wurde aus Methylenchlorid-Hexanen umkristallisiert unter
Erhalt von 1,61 g (18%) des Produkts. Schmelzpunkt: 165–170°C. Verbrennungsanalyse:
%C: 70,95 (berechnet), 70,29 (gefunden); %H: 4,88 (berechnet), 4,99
(gefunden); %N 3,59 (berechnet), 3,51 (gefunden); 1H-NMR-Analyse:
(d6-DMSO); δ 12,5, s, 2H (COOH); δ 9,85, t,
1H (NH); 87,83-7,08 m, 12H (aromatisches H); 82,72, t, 2H (CH2 α zu
COOH); ü 2,46,
t, 2H (CH2 β zu COOH).
-
Herstellung der Verbindung 11
-
Eine
Aufschlämmung
von 3-(4-Aminophenyl)propionsäure
(7,27 g, 44 mmol) in Methylenchlorid (100 ml) wurde mit Chlortrimethylsilan
(11,17 ml, 88 mmol) behandelt und wurde 90 Minuten unter Rückfluss
erwärmt.
Die Reaktionsmischung wurde auf 0°C
abgekühlt
und wurde dann mit Triethylamin (18,4 ml, 132 mmol) behandelt. Nachdem
diese Mischung etwa 5 Minuten gerührt war, wurde eine Lösung von
4-Methoxy-2-acetylbenzoyl chlorid (10,0 g, 44 mmol) in Methylenchlorid
(20 ml) tropfenweise zu der Reaktionsmischung während einer Zeit von 15 Minuten
zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei 0°C und dann
18 h bei 25°C
rühren
gelassen. Methylenchlorid wurde unter vermindertem Druck entfernt,
und 100 ml 2 N NaOH wurden zu dem Rückstand zugesetzt. Diese Mischung
wurde 2 h rühren
gelassen, bevor die Mischung mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäurelösung (pH
= 1) angesäuert
wurde. Der erhaltene Feststoff wurde abfiltriert und unter vermindertem
Druck getrocknet. Der Feststoff wurde in Ethanol/Wasser im Verhältnis 1/1
umkristallisiert und unter vermindertem Druck bei 25°C getrocknet.
Die Ausbeute des Produkts betrug 8,51 g, 61,3%.
-
Herstellung der Verbindung 12
-
Eine
Aufschlämmung
von 4-Chlor-3-nitrozimtsäure
(12,2 g, 53,2 mmol), Ethylalkohol (50 ml) und Ethylacetat (20 ml)
wurde mit 5% Platinsulfid auf Kohlenstoff (0,6 g) behandelt und
wurde in einen Parr-Autoklav eingebracht. Der Autoklav wurde mit
Wasserstoff beaufschlagt und über
Nacht auf 50°C
erwärmt.
Nach dem Abkühlen
auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung durch Celite filtriert
und wurde unter vermindertem Druck unter Erhalt von 10,6 g 3-(4-Chlor-3-aminophenyl)propionsäure konzentriert.
-
Eine
Mischung von 3-(4-Chlor-3-aminophenyl)propionsäure (4,85 g, 26,5 mmol) in
Methylenchlorid (60 ml) wurde mit Chlortrimethylsilan (5,75 g, 53,0
mmol) behandelt und 90 Minuten unter Rückfluss erwärmt. Die Reaktionsmischung
wurde auf 0°C
abgekühlt
und dann mit Triethylamin (8,04 g, 79,5 mmol) behandelt. In einen
getrennten Rundkolben wurden 4-Methoxy-2-acetylsalicylsäure (13,91
g, 66,3 mmol), Methylenchlorid (50 ml) und einige Tropfen Dimethylformamid
eingebracht. Oxalylchlorid (11,55 g, 132,5 mmol) wurden dann tropfenweise
zu dieser Mischung zugesetzt. Nachdem die Zugabe vollständig war,
wurde die Mischung etwa 1 h bei Raumtemperatur rühren gelassen, bevor das Lösemittel
unter vermindertem Druck entfernt wurde. Der Rückstand wurde dann in Methylenchlorid
aufgenommen und zu der Mischung in dem ersten Rundkolben tropfenweise
zugesetzt. Diese Mischung wurde über
Nacht auf Raumtemperatur kommen gelassen. Die Reaktionsmischung
wurde dann mit zwei Portionen 2 N HCl-Lösung extrahiert und wurde mit
einer Portion Wasser und einer Portion Kochsalzlösung gewaschen. Die organische
Schicht wurde über
Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert,
was einen Feststoff ergab, der in 2 N NaOH-Lösung aufgenommen wurde. Diese
Mischung wurde etwa 1 h gerührt,
bevor sie mit 49-%iger H2SO4-Lösung angesäuert und dann
in einem Eis-Wasser-Bad
abgekühlt
wurde. Der erhaltene orangefarbene Feststoff wurde durch Filtration isoliert
und wurde aus einer Lösung
von Ethylacetat und Hexan umkristallisiert. Das Produkt wurde in
einer Ausbeute von 3,54 g isoliert. Schmelzpunkt = 195–200°C.
-
Beispiel 2
-
Orale Abgabe von Lachs-Calcitonin (sCT)
-
Orale
Dosierungszusammensetzungen (PO-Zusammensetzungen) der Verbindung
zur Wirkstoffabgabe und von Lachs-Calcitonin (sCT) in Wasser wurden
hergestellt. Typischerweise wurden 450 mg Verbindung zu 2,0 ml Wasser
zugesetzt. Es wurde entweder das Natriumsalz der Verbindung verwendet,
oder die freie Säure
wurde unter Rühren
der erhaltenen Lösung
und Zugabe eines Äquivalents
Natriumhydroxid (1,0 N) und Verdünnen
mit Wasser in das Natriumsalz umgewandelt. Die Lösung wurde verwirbelt, dann
erwärmt (etwa
37°C) und
mit Ultraschall behandelt. Der pH wurde auf etwa 7 (6,5 bis 8,5)
mit NaOH oder HCl eingestellt. 90 mg sCT aus einer Vorratslösung wurden
zu der Lösung
zugesetzt. Dann wurde Wasser zugesetzt, um das Gesamtvolumen auf
etwa 3,0 ml zu bringen (variiert entsprechend der Löslichkeit
der Verbindung zur Wirkstoffabgabe). Die Enddosis der Verbindung
zur Wirkstoffabgabe, die sCT-Dosis und die Volumen-Dosismengen sind
nachstehend in der Tabelle 1 aufgeführt.
-
Die
typischen Dosierungs- und Probenprotokolle waren wie folgt. Männliche
Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 200 bis 250 g wurden
24 Stunden hungern gelassen und dann wurden Ketamin (44 mg/kg) und
Chlorpromazin (1,5 mg/kg) 15 Minuten vor der Dosierung verabreicht.
Einer Dosierungsgruppe von fünf
Ratten wurde eine der Dosierungslösungen verabreicht. Für die orale
Dosierung wurde ein 11 cm Rusch 8 French-Katheter an eine 1 ml-Spritze
mit einer Pipettenspitze angepasst. Die Spritze wurde mit Dosierlösung durch
Aufziehen der Lösung
durch den Katheter befüllt,
der dann trockengerieben wurde. Der Katheter wurde in die Speiseröhre eingebracht,
wobei 1 cm der Leitung nach den Schneidezähnen der Ratte belassen wurde.
Die Lösung
wurde durch Drücken
des Kolbens der Spritze verabreicht.
-
Blutproben
wurden in Reihen von der Schwanzarterie gesammelt, typischerweise
zur Zeit = 0, 10, 20, 30, 60 und 90 Minuten. Serum-sCT wurde durch
Prüfen
mit einem EIA-Kit
(Kit Nr. EIAS-6003 von Peninsula Laboratories, Inc., San Carlos,
CA) bestimmt, indem das Standardprotokoll von dem Kit wie folgt
modifiziert wurde: inkubiert mit 50 μl Peptid-Antikörper für 2 Stunden unter Schütteln im
Dunkeln, die Platte gewaschen, Serum und biotinyliertes Peptid zugesetzt
und mit 4 ml Puffer verdünnt
und über
Nacht im Dunkeln geschüttelt. Zahlen
wurden entsprechend den Grundlinienwerten eingestellt, die zur Zeit
= 0 erhalten wurden. Die Ergebnisse von den fünf Ratten in jeder Dosierungsgruppe
wurden für
jeden Zeitpunkt gemittelt. Das Maximum ist nachstehend in der Tabelle
1 wiedergegeben. Tabelle 1. Orale Verabreichung von Lachs-Calcitonin
(sCT)
| Verbindung | Volumendosis (ml/kg) | Verbindungsdosis
(mg/kg) | sCT-Dosis (μg/kg) | Mittlere
Spitze Serum sCT (pg/ml ± SD)(SE) | AUC |
| 2 | 1 | 150 | 30 | 80 ± 75 (37) | 1777 |
| 2 | 1 | 150 | 30 | 1232 ± 143 (64) | 4611 |
| 3 | 1 | 150 | 30 | 40 ± 38 (17) | n/a |
| 9 | 1 | 150 | 30 | 143 ± 121 (60) | 6775 |
| 9 | 1 | 150 | 30 | 15 ± 34 (15) | 0 |
| 10 | 1 | 150 | 30 | 213 ± 48 (24) | 10364 |
| 11 | 1 | 150 | 30 | 123 ± 141 (37) | n/a |
| 12 | 1 | 150 | 30 | 184 ± 179 | 1840 |
| 12 | 1 | 150 | 30 | 43,50 ± 60,54 | 0 |
| n/a – nicht
erhältlich |
-
Orale/intrakolonale Abgabe von Heparin
-
Dosierlösungen für orale
Sonden (PO) und/oder Intrakolon-Dosierlösungen (IC), die eine Verbindung zur
Wirkstoffabgabe und Heparin-Natrium USP in 25-%igem wässrigem
Propylenglycol enthielten, wurden hergestellt. Entweder wurde das
Natriumsalz der Verbindung verwendet, oder die freie Säure wurde
mit einem Äquivalent
Natriumhydroxid in das Natriumsalz umgewandelt. Typischerweise wurden
die Verbindung zur Wirkstoffabgabe und Heparin (etwa 166 bis 182
IU/mg) durch Verwirbeln als trockene Pulver vermischt. Diese trockene
Mischung wurde in 25% (Vol./Vol.) wässrigem Polypropylen aufgelöst, verwirbelt
und in ein Ultraschallgerät
(etwa 37°C)
verbracht. Der pH wurde auf etwa 7 (etwa 6,5 bis 8,5) mit wässrigem
NaOH (2 N) eingestellt. Die Dosierlösung wurde zum Herstellen einer
klaren Lösung
mit Ultraschall behandelt. Das Endvolumen wurde auf 3,0 ml eingestellt.
Die Enddosis der Verbindung zur Wirkstoffabgabe, die Heparindosis
und die Volumendosismengen sind nachstehend in der Tabelle 2 aufgeführt.
-
Die
typischen Dosierungs- und Probenprotokolle waren wie folgt. Männliche
Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 275 bis 350 g wurden
24 Stunden hungern gelassen und wurden mit Ketamin-Hydrochlorid
(88 mg/kg) intramuskulär
unmittelbar vor dem Dosieren anästhesiert.
Einer Dosierungsgruppe von fünf Ratten
wurde eine der Dosierlösungen
verabreicht. Für
die Dosierung mit einer oralen Sonde (PO) wurde ein 11 cm Rusch
8 French-Katheter an eine 1 ml-Spritze mit einer Pipettenspitze
angepasst. Die Spritze wurde mit der Dosierlösung durch Aufziehen der Lösung durch
den Katheter befüllt,
der dann trockengerieben wurde. Der Katheter wurde in die Speiseröhre eingebracht,
wobei 1 cm des Rohrs nach den Schneidezähnen der Ratte belassen wurde.
Die Lösung
wurde durch Drücken
des Kolbens der Spritze verabreicht. Für die Intrakolondosierung (IC)
wurde ein 7,5 cm 8 fr Rusch-Katheter an eine 1 ml Spritze mit einer
Pipettenspitze angepasst. Der Dosierkatheter wurde in das Kolon
durch den Anus eingeführt,
bis das Rohr nicht mehr sichtbar war. Die Dosierlösung wurde
langsam in das Kolon eingeführt.
-
Mit
Citrat versetzte Blutproben wurden durch Herzpunktion nach der Verabreichung
von Ketamin (88 mg/kg) gesammelt, typischerweise zur Zeit von 0,25,
0,5, 1,0 und 1,5 Stunden. Die Heparinaktivität wurde bestimmt durch Verwenden
der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (APTT) nach dem Verfahren
von Henry, J. B., Clinical Diagnosis and Management by Laboratory
Methods, Philadelphia, PA, W. B. Saunders (1979). Frühere Studien
zeigten Grundlinienwerte von etwa 20 sec. Die Ergebnisse von fünf Ratten
in jeder Gruppe wurden für
jeden Zeitpunkt gemittelt. Das Maximum ist nachstehend in der Tabelle
2 wiedergegeben. Tabelle 2. Orale/intrakolonale Abgabe
von Heparin
| Verbindung | Verabreichungsart | Volumendosis (ml/kg) | Verbindungsdosis
(mg/kg) | Heparindosis (mg/kg) | Mittlere
Spitze APTT (sec) ± SD) |
| 1 | PO | 3 | 200 | 100 | 65,5 ± 9,1 |
| 1 | PO | 3 | 200 | 100 | 58,2 ± 55,2 |
| 1 | IC | 1 | 50 | 25 | 102,3 ± 130,4 |
| 3 | IC | 1 | 50 | 25 | 44,2 ± 16,2 |
| 4 | IC | 1 | 50 | 25 | 94 ± 47,5 |
| 5 | PO | 3 | 200 | 100 | 32,6 ± 5 |
| 5 | IC | 1 | 50 | 25 | 89,9 ± 68,6 |
| 6 | PO | 3 | 200 | 100 | 33,8 ± 18,7 |
| 6 | IC | 1 | 50 | 25 | 90,6 ± 50,9 |
| 7 | IC | 1 | 50 | 25 | 28,6 ± 6,1 |
| 8 | IC | 1 | 50 | 100 | 266,4 ± 165,7 |
| 9 | IC | 1 | 50 | 100 | 192,8 ± 50,9 |
-
Orale/intrakolonale Abgabe von rekombinantem
menschlichem Wachstumshormon (rhGH)
-
Dosierlösungen für orale
Sonden (PO) und/oder Intrakolon-Dosierlösungen (IC) der Verbindung
zur Wirkstoffabgabe und rhGH in Phosphatpuffer wurden hergestellt.
Eine Lösung
der Verbindung wurde entweder mit dem Natriumsalz der Verbindung
oder durch Umwandeln der freien Säure in ihr Natriumsalz hergestellt. Typischerweise
wurde eine Lösung
der Verbindung in Phosphatpuffer hergestellt und gerührt, wobei
ein Äquivalent
Natriumhydroxid (1,0 N) zugesetzt wurde, wenn das Natriumsalz hergestellt
wurde. Die Enddosierlösungen
wurden hergestellt durch Vermischen der Verbindung mit einer rhGH-Vorratslösung (15
mg rhGH/ml) und Verdünnen
auf das erwünschte
Volumen (gewöhnlich
3,0 ml). Die Verbindungen und die rhGH-Dosismengen sind nachstehend
in der Tabelle 3 aufgeführt.
-
Die
typischen Dosier- und Probenprotokolle waren wie folgt. Männliche
Sprague-Dawley-Ratten
mit einem Gewicht zwischen 200 bis 250 g wurden 24 Stunden hungern
gelassen, und Ketamin (44 mg/kg) und Chlorpromazin (1,5 mg/kg) wurden
ihnen 15 Minuten vor dem Dosieren verabreicht. Einer Dosierungsgruppe von
fünf Ratten
wurde eine der Dosierlösungen
verabreicht. Für
die Dosierung durch eine orale Sonde (PO) wurde ein 11 cm Rusch
8 French-Katheter an eine 1 ml Spritze mit einer Pipettenspitze
angepasst. Die Spritze wurde mit Dosierlösung durch Aufziehen der Lösung durch
den Katheter befüllt,
der dann trockengerieben wurde. Der Katheter wurde in die Speiseröhre eingebracht,
wobei 1 cm Rohr nach den Schneidezähnen der Ratte belassen wurde.
Die Lösung
wurde durch Drücken
des Kolbens der Spritze verabreicht. Für die Intrakolondosierung (IC)
wurde ein 7,5 cm Rusch-Katheter-Rohr (French 8 oder 6) an eine Spritze
mit einer Eppendorf-Pipettenspitze angepasst. Die Spritze wurde
mit der Dosierlösung
durch Aufziehen der Lösung
durch das Katheterrohr befüllt.
Das Katheterrohr wurde trockengerieben. K-Y-Gel wurde auf die Spitze
aufgetragen, um einen Kontakt mit dem Auge des Rohrs zu vermeiden,
und das Rohr wurde durch den Anus in das Kolon eingeführt, bis
das Rohr nicht mehr sichtbar war. Die Lösung wurde durch Drücken des
Kolbens der Spritze injiziert, und das Rohr wurde entfernt.
-
Blutproben
wurden in Reihen aus der Schwanzarterie gesammelt, typischerweise
zur Zeit = 0, 15, 30, 45, 60 und 90 Minuten für die orale Dosierung und 0,
10, 20, 30, 60 und 90 Minuten für
die IC-Dosierung. Die fünf
Proben von jedem Zeitpunkt wurden vereinigt. Die rhGH-Konzentrationen
des Serums wurden durch einen rhGH-Immunoassay-Testkit (Kit Nr.
K1F4015 von Genzyme Corporation Inc., Cambridge, MA) quantifiziert. Frühere Studien
zeigten Grundlinienwerte von etwa Null.
-
Die
maximale Konzentration für
jede Gruppe ist nachstehend in der Tabelle 3 wiedergegeben. Tabelle 3. Orale/intrakolonale Abgabe
von rhGH an Ratten
| Verbindung | Verabreichungsart | Volumendosis (ml/kg) | Verbindungsdosis
(mg/kg) | rhGH
Dose (mg/kg) | Mittlere
Spitze Serum sCT (ng/ml) |
| 1 | PO | 1 | 200 | 3 | 19,4 |
| 2 | PO | 1 | 200 | 3 | 6,39 |
| 3 | PO | 1 | 200 | 3 | 0 |
| 11 | PO | 1 | 200 | 3 | 0 |
| 12 | PO | 1 | 200 | 3 | 189 |
| 12 | PO | 1 | 200 | 3 | 32,86 |
| 12 | PO | 1 | 200 | 3 | 15,13 |
-
Orale/intrakolonale Abgabe von Parathyroidhormon
(PTH 1–34)
-
Es
wurden Dosierlösungen
für orale
Sonden (PO) und/oder Intrakolon-Dosierlösungen (IC) der Verbindung
zur Wirkstoffabgabe und von humanen Parathyroidhormonresten 1–34 (PTH)
in Wasser hergestellt. Eine Lösung
der Verbindung wurde entweder mit dem Natriumsalz der Verbindung
oder durch Umwandeln der freien Säure in ihr Natriumsalz hergestellt.
Typischerweise wurde eine Lösung
der Verbindung in Wasser hergestellt und gerührt, wobei ein Äquivalent
Natriumhydroxid (1,0 N) zugesetzt wurde, wenn das Natriumsalz hergestellt
wurde. Die Enddosierungslösungen
wurden hergestellt durch Vermischen der Verbindung mit einer PTH-Vorratslösung (typischerweise
mit einer Konzentration von 5 mg PTH/ml) und Verdünnen auf
das erwünschte
Volumen (gewöhnlich
3,0 ml). Die Endverbindung PTH und die Volumendosismengen sind nachstehend
in der Tabelle 4 aufgeführt.
-
Die
typischen Dosierungs- und Probenprotokolle waren wie folgt. Männliche
Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 200 bis 250 g wurden
24 Stunden hungern gelassen, und Ketamin (44 mg/kg) und Chlorpromazin
(1,5 mg/kg) wurden ihnen 15 Minuten vor dem Dosieren verabreicht.
Einer Dosierungsgruppe von fünf
Ratten wurde eine der Dosierlösungen
verabreicht. Für
die Dosierung mit einer oralen Sonde (PO) wurde ein 11 cm Rusch
8 French-Katheter an eine 1 ml-Spritze mit einer Pipettenspitze
angepasst. Die Spritze wurde mit Dosierlösung durch Aufziehen der Lösung durch
den Katheter befüllt,
der dann trockengerieben wurde. Der Katheter wurde in die Speiseröhre eingebracht,
wobei 1 cm des Rohrs nach den Schneidezähnen der Ratte belassen wurde.
Die Lösung
wurde durch Drücken
des Kolbens der Spritze verabreicht. Für Intrakolon-Dosierung (IC)
wurde ein 7,5 cm Rusch-Katheter (French 8 oder 6) an eine Spritze
mit einer Eppendorf-Pipettenspitze angepasst. Die Spritze wurde
mit der Dosierlösung
durch Aufziehen der Lösung
durch das Katheterrohr befüllt.
Das Katheterrohr wurde trockengerieben. KY-Gel wurde auf die Spitze
aufgebracht, um einen Kontakt mit dem Auge des Rohrs zu verhindern,
und das Rohr wurde durch den Anus in das Kolon eingeführt, bis
das Rohr nicht mehr sichtbar war. Die Lösung wurde durch Drücken des
Kolbens der Spritze injiziert, und das Rohr wurde entfernt.
-
Blutproben
wurden in Reihen aus der Schwanzarterie gesammelt, typischerweise
zur Zeit = 0, 15, 30, 45, 60 und 90 Minuten für die orale Dosierung und 0,
10, 20, 30, 60 und 90 Minuten für
die IC-Dosierung. PTH-Konzentrationen im Serum wurden durch einen
PTH-Radioimmunoassay-Kit
(Kit Nr. RIK 6101 von Peninsula Laboratories, Inc. San Carlos, CA)
quantifiziert. Frühere
Studien zeigten Grundlinienwerte von etwa 0 an. Die Ergebnisse der
fünf Ratten
in jeder Gruppe wurden für
jeden Zeitpunkt gemittelt. Das Maximum ist nachstehend in der Tabelle
4 wiedergegeben. Tabelle 4. Orale/intrakolonale Abgabe
von PTH an Ratten
| Verbindung | Verabreichungsart | Volumendosis (ml/kg) | Verbindungsdosis
(mg/kg) | PTH-Dose (mg/kg) | Mittlere
Spitze Serum [PTH] (pg/ml) ± SD |
| 1 | PO | 1 | 100 | 200 | 347 ± 377 |
| 1 | PO | 1 | 100 | 200 | 917 ± 175 |
| 1 | PO | 1 | 100 | 200 | 890 ± 1123 |
| 1 | PO | 1 | 100 | 200 | 484 ± 776 |
| 1 | PO | 1 | 100 | 200 | 2302 ± 1717 |
| 2 | PO | 1 | 100 | 200 | 40 ± 51 |
| 2 | PO | 1 | 100 | 200 | 441 ± 424 |
| 3 | PO | 1 | 100 | 200 | 0 |
| 3 | PO | 1 | 100 | 200 | 51 ± 122 |
| 4 | PO | 1 | 100 | 200 | 0 |
| 5 | PO | 1 | 100 | 200 | 246 ± 293 |
| 5 | PO | 1 | 100 | 200 | 588 ± 118 |
| 6 | PO | 1 | 100 | 200 | 183 ± 176 |
| 6 | PO | 1 | 100 | 200 | 464 ± 171 |
| 6 | PO | 1 | 100 | 200 | 1005 ± 630 |
| 6 | PO | 1 | 100 | 200 | 57 ± 86 |
| 7 | PO | 1 | 100 | 200 | 204 ± 142 |
| 8 | PO | 1 | 100 | 200 | 705 ± 118 |
| 8 | PO | 1 | 100 | 200 | 55 ± 51 |
| 9 | PO | 1 | 100 | 200 | 668 ± 103 |
| 10 | PO | 1 | 100 | 200 | 704 ± 80 |
| 10 | PO | 1 | 100 | 200 | 454 ± 680 |
| 11 | PO | 1 | 100 | 200 | 76 ± 65 |
| 12 | PO | 1 | 100 | 200 | 65 ± 146 |
-
Orale Verabreichung von Interferon
-
Dosierungslösungen der
Verbindung zur Wirkstoffabgabe und von humanem Interferon (IFN)
wurden in entionisiertem Wasser hergestellt. Die freie Säure der
Verbindung zur Wirkstoffabgabe wurde in das Natriumsalz mit einem Äquivalent
Natriumhydroxid umgewandelt. Typischerweise wurde eine Lösung der
Verbindung zur Wirkstoffabgabe in Was ser hergestellt und gerührt, wobei
ein Äquivalent
Natriumhydroxid (1,0 N) zugesetzt wurde, wenn das Natriumsalz hergestellt
wurde. Diese Mischung wurde verwirbelt und in ein Ultraschallgerät (etwa
37°C) verbracht.
Der pH wurde auf etwa 7 bis 8,5 mit wässrigem NaOH eingestellt. Die
Mischung wurde zum Herstellen einer gleichmäßigen Suspension oder Lösung verwirbelt,
wobei auch eine Ultraschallbehandlung und Wärme verwendet wurden, falls
notwendig. Zusätzliches
NaOH wurde zugesetzt, falls notwendig, um eine gleichmäßige Löslichkeit
zu erreichen, und der pH wurde wieder auf etwa 7 bis 8,5 eingestellt.
Die Lösung
der Verbindung zur Wirkstoffabgabe wurde mit einer IFN-Vorratslösung (etwa
22,0 bis 27,5 mg/ml in mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung) vermischt
und auf das erwünschte
Volumen (gewöhnlich
3,0 ml) verdünnt.
Die Enddosen der Verbindung zur Wirkstoffabgabe und des IFN und
die Dosisvolumina sind nachstehend in der Tabelle 5 aufgeführt.
-
Die
typischen Dosierungs- und Probenprotokolle waren wie folgt. Männliche
Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 200 bis 250 g wurden
24 Stunden hungern gelassen, und ihnen wurde Ketamin (44 mg/kg)
und Chlorpromazin (1,5 mg/kg) 15 Minuten vor dem Dosieren und wiederum,
wie zum Aufrechterhalten der Anästhesie
benötigt,
verabreicht. Einer Dosierungsgruppe von fünf Tieren wurde eine der Dosierlösungen verabreicht.
Ein 11 cm Rusch 8 French-Katheter wurde an eine 1 ml-Spritze mit
einer Pipettenspitze angepasst. Die Spritze wurde mit Dosierungslösung durch
Aufziehen der Lösung
durch den Katheter befüllt, der
dann trockengerieben wurde. Der Katheter wurde in die Speiseröhre eingebracht,
wobei 1 cm des Rohrs nach den Schneidezähnen belassen wurde. Die Dosierlösung wurde
durch Drücken
des Kolbens der Spritze verabreicht.
-
Blutproben
wurden in Reihen aus der Schwanzarterie gesammelt, typischerweise
zur Zeit = 0, 15, 30, 45, 60 und 90 Minuten. Die IFN-Konzentrationen
im Serum wurden unter Verwendung eines Cytoscreen Immunoassay-Kit
für humanes
IFN-α (Katalog
Nr. KHC4012 von Biosource International, Camarillo, CA) quantifiziert.
Frühere
Studien zeigten Grundlinienwerte von etwa Null an. Ergebnisse von
den Tieren in jeder Gruppe wurden für jeden Zeitpunkt gemittelt.
Das Maximum dieser Mittelwerte (der mittlere Spitzenwert der IFN-Konzentration
im Serum) ist nachstehend in der Tabelle 5 wiedergegeben. Tabelle 5. Orale Verabreichung von Interferon
| Verbindung
zur Wirkstoffabgabe | Dosis
der Verbindung zur Wirkstoffabgabe (mg/kg) | IFN-Dosis
(mg/kg) | Volumendosis (ml/kg) | Mittlere
Spitze Serum [IFN] (ng/ml) ± SD |
| 1 | 200 | 1 | 1 | 1,8 ± 1,2 |
| 1 | 400 | 1 | 1 | 0,32 ± 0,46 |
-
Beispiel 6 – Orale Verabreichung von Insulin
-
Orale
Dosierungszusammensetzungen (PO) der Verbindung zur Wirkstoffabgabe
und von menschlichem Zinkinsulin (Minimum 26 IU/mg, erhältlich von
Calbiochem – Novabiochem
Corp., La Jolla, CA) wurden in entionisiertem Wasser hergestellt.
Typischerweise wurden 500 mg der Verbindung zur Wirkstoffabgabe
zu 1,5 ml Wasser zugesetzt. Die freie Säure der Verbindung zur Wirkstoffabgabe
wurde in das Natriumsalz durch Rühren
der erhaltenen Lösung
und Zusetzen von einem Äquivalent
Natriumhydroxid umgewandelt. Die Lösung wurde verwirbelt, dann
erwärmt
(etwa 37°C)
und mit Ultraschall behandelt. Der pH wurde auf etwa 7 bis 8,5 mit
NaOH oder HCl eingestellt. Zusätzliches
NaOH wurde zugesetzt, falls notwendig, um eine gleichmäßige Löslichkeit
zu erreichen, und der pH wurde wieder auf 7 bis 8,5 eingestellt.
Dann wurde Wasser zugesetzt, um das Gesamtvolumen auf etwa 2,4 ml
zu bringen, und verwirbelt. Etwa 1,25 mg aus einer Insulin-Vorratslösung (15
mg/ml, hergestellt aus 0,5409 g Insulin und 18 ml entionisiertem
Wasser, Einstellen mit HCl und NaOH auf pH 8,15, und um eine klare
Lösung
zu erhalten, wurden 40 ml konzentrierter HCl, 25 ml 10 N NaOH und
50 ml 1 N NaOH verwendet) wurden zu der Lösung zugesetzt und durch Umdrehen
vermischt. Die Lösung kann
unmittelbar in dem Dosierungsprotokoll verwendet werden, oder alternativ
kann die Lösung
in ein Wasserbad von 37°C
für eine
Stunde vor dem Dosieren eingebracht werden. Die Enddosis der Verbindung
zur Wirkstoffabgabe, die insulindosis und die Dosisvolumen-Mengen
sind nachstehend in der Tabelle 6 aufgeführt.
-
Die
typischen Dosierungs- und Probenprotokolle waren wie folgt. Männliche
Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen etwa 200 bis 250
g wurden 24 Stunden hungern gelassen, und ihnen wurden Ketamin (44
mg/kg) und Chlorpromazin (1,5 mg/kg) 15 Minuten vor dem Dosieren
und wiederum, wie zum Aufrechterhalten der Anästhesie benötigt, verabreicht. Einer Dosierungsgruppe
von fünf
Tieren wurde eine der Dosierlösungen
verabreicht. Für
die orale Dosierung wurde ein 11 cm Rusch 8 French-Katheter an eine
1 ml-Spritze mit einer Pipettenspitze angepasst. Die Spritze wurde
mit Dosierlösung durch
Aufziehen der Lösung durch
den Katheter befüllt,
der dann trockengerieben wurde. Der Katheter wurde in die Speiseröhre eingebracht,
wobei 1 cm des Rohrs nach den Schneidezähnen belassen wurde. Die Dosierlösung wurde
durch Drücken
des Kolbens der Spritze verabreicht.
-
Blutproben
wurden in Reihen aus der Schwanzarterie gesammelt, typischerweise
zur Zeit = 15, 30, 60, 120 und 180 Minuten. Seruminsulinwerte wurden
bestimmt mit einem Insulin ELISA Test Kit (Kit Nr. DSL-10-1600 von
Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Webster, TX), wobei das Standardprotokoll
modifiziert wurde, um die Empfindlichkeit und den linearen Bereich
der Standardkurve für
die Volumina und Konzentrationen der in dem vorliegenden Protokoll
verwendeten Proben zu optimieren. Serumkonzentrationen von Humaninsulin
(μU/ml)
wurden für
jeden Zeitpunkt für
jedes der fünf
Tiere in jeder Dosierungsgruppe gemessen. Die fünf Werte für jeden Zeitpunkt wurden gemittelt,
und die Ergebnisse wurden als Seruminsulinkonzentration gegen die
Zeit aufgetragen. (Frühere
Versuche zeigten keine messbaren Werte von Humaninsulin nach oraler
Dosierung mit Humaninsulin allein.) Das Maximum (die Spitze) und
die Fläche
unter der Kurve (AUC) sind nachstehend in der Tabelle 6 wiedergegeben. Tabelle 6. Orale Abgabe von Insulin
| Verbindung
zur Wirkstoffabgabe | Dosis
der Verbindung zur Wirkstoffabgabe (mg/kg) | Insulin-Dosis (mg/kg) | Volumendosis (ml/kg) | Mittlere
Spitze Serum [INS] ± SD |
| 1 | 100 | 3 | 1 | 100 ± 128 |
| 1 | 100 | 3 | 0,5 | 46 ± 55 |
| 1 | 100 | 3 | 0,5 | 8 ± 5 |
| 1 | 100 | 3 | 0,5 | 854 ± 1219 |
| 1 | 100 | 3 | 0,5 | 71 ± 128 |
| 1 | 100 | 3 | 0,5 | 262 ± 231 |
| 1 | 100 | 3 | 0,5 | 117 ± 208 |
| 1 | 100 | 2 | 0,5 | 95 ± 97 |
| 1 | 100 | 1 | 0,5 | 18 ± 9 |
| 1 | 100 | 0,5 | 0,5 | 30 ± 56 |
| 1 | 100 | 0,25 | 0,5 | 54 ± 84 |
| 1 | 200 | 3 | 1 | 1941 ± 1337 |
| 1 | 100 | 3 | 1 | 139 ± 114 |
| 1 | 100 | 3 | 0,5 | 632 ± 1213 |
| 1 | 200 | 3 | 1 | 1983 ± 1926 |
| 1 | 100 | 3 | 1 | 340 ± 84 |
| 1 | 100 | 3 | 0,5 | 644 ± 728 |
| 1 | 200 | 0,5 | 1 | 65 ± 76 |
| 1 | 200 | 3 | 1 | 1590 ± 338 |
-
Die
vorstehend genannten Patentschriften, Anmeldungen, Prüfverfahren
und Veröffentlichungen
sind hierdurch durch Bezug in ihrer Gesamtheit eingeschlossen.
und Salze davon und eine Mischung davon.
und Salzen davon.